DE2646678A1

DE2646678A1 - Verfahren zur herstellung eines entfetteten heparin-gewebes

Info

Publication number: DE2646678A1
Application number: DE19762646678
Authority: DE
Inventors: Vernon Kirkpatrick Collins; Sen Charles Edward Isdale; William Edward Melby
Original assignee: AH Robins Co Inc
Current assignee: AH Robins Co Inc
Priority date: 1975-10-31
Filing date: 1976-10-15
Publication date: 1977-05-05
Also published as: AU1918976A; AU512446B2; JPS6115047B2; DK490576A; IE44543L; JPS5257309A; FR2339625A1; IT1075976B; FR2339625B1; CA1078767A; DE2646678C2; IE44543B1; GB1505237A

Description

Die Erfindung "bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren aur Herstellung eines entfetteten Heparin-Gev/ebes und auf das Produkt dieses Verfahrens. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines entfetteten Heparin-Gewebes, bei den vor der Trocknung und Entfettung mit einem aseotropischen Lösungsmittel das gefrorenesHeparin führende tierische Gewebe unter geregelten Bedingungen hinsichtlich der Temperatur und Zeit getempert wird. Das Grew = "je wird zuerst in Teilchen zerkleinert, wie z.B. durch Zermahlen oder durch dere Maßnahmen,während es sich im gefrorenen oder teilwel-

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se gefrorenen Zustand "befindet, aufgetaut und in einen Wärmeaustauscher erwärmt, "bei 7,2 Ms 35⁰C (45 Ms 95⁰E) während 2 bis 15 h, jedoch nicht wesentlich über diese Zeit fermentiert, da sonst ein starkes Schäumen und Gasen beginnt, und danach der Einwirkung eines siedenden azeotropischen Lösungsmittels unterworfen, um im wesentlichen Gewebewasser und —fett zu entfernen. Das getrocknete und entfettete Gewebe ist besonders zur Verwendung bei den Heparin-Gewinnungsverfahren geeignet.

Bisher wurde vor der Trocknung und Entfettung von Heparin-Geweben mit einem azeotropischen Lösungsmittel gefrorenes, Heparin führendes, tierisches Gewebe getempert, indem man festgefrorene Blöcke des Gewebes in Beuteln oder Kästen allmählich auftauen und während einer Zeitdauer von 2 bis 8 Tagen bei Umgebungstenperatur von 15,6 bis 48,9°C (6o bis 12o°P) erwärmen ließ, während das Gewebe sich in diesen Behältern befand, wobei man annahm, daß während dieser Zeit eine optimale Konditionierung des Gewebes für die Heparin-Ereigabe bei der darauffolgenden Heparin-Gewinnung eintrat. Das Gewebe ist jedoch gegen enzymatisch^ Wirkung sehr empfindlich und einer Zersetzung durch unerwünschtes Bakterienwachstum und einem Verfaulen von Gewebe unterworfen. Die Außenseite eines gefrorenen Blocks von Gewebe, das diesen älteren Temperverfahren unterworfen wurde, konnte tatsächlich verfaulen oder verwesen, bevor das Innere einen aufgetauten Zustand erreicht hatte. Dies führte zur Erzeugung von schädlichen, unerwünschten Gerüchen, die während der 2- bis 8-Tagedauer sich in der gesamten Umgebung der Tenperanlage ausbreiteten.Diose lange Zeitdauer, welche für das Tenpern erforderlich war, führte zu einer schlechten Ausnutzung des Raums mit dementsprechend hohen Gesamtkosten, Blutflüssigkeits- und Abwasserbeseitigungsproblemen und einem getemperten Gewebe, das infolge nichtgleich-

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förmigen Gewebezerfalls, das nicht genügend biochemisch gleichförmig von einer Partie zur anderen v;ar, was su einer Unzugänglichkeit des Heparins und einer sich daraus ergebenden Notwendigkeit zur dauernden Einstellung während der späteren Behandlung bei der Heparin-Isolierung führte. Außerdem "verursacht die unerwünschte bakterielle Zersetzung, wie bekannt, einen hohen Pyrogen-Gehalt, und es waren erhöhte Anstrengungen zur Pyrogen-Entfernung erforderlich. Nach diesem früheren Verfahren getemperte G-ewebe, die dann einer azeotropischen Behandlung zum Trocknen oder Entwässern und Entfetten unterworfen wurden, enthielten gewöhnlich wenigstens o,5 Gew.^ Fett, selbst unter den günstigsten Umständen, und allgemein lag der Fettgehalt in dem Bereich von l,o bis 2_fofo. Ferner waren die entfetteten-dehydratisierten Gewebeteilchen schwierig zu benetzen und schwammen während langer Zeit in üblichen Lösungen, die in der Anfangsstufe des Heparin-Gewinnungsverfahrens benutzt wurden, und die Mischungen waren danach bei dem Vez'fahren schwierig zu handhaben und zu filtrieren. Das gemäß der Erfindung hergestellte entfettete-dehydratisierte Gewebe ist von ungewöhnlich hoher Qualität und enthält nur etwa o,l bis o,2 Gew.^ Fett und wird leicht bei dem obenbeschriebenen Heparin-Gewinnungsverfahren benetzt, und Mischungen werden leichter filtriert. Andere Anzeichen zur verbesserten Qualität des Produkts gemäß der Erfindung sind helle Farbe, geringer Geruch, gutes Gefüge, Homogenität und niedriger Gehalt an restlichem Lösungsmittel. Außerdem ist mehr Fett aus dem Lösungsmittel für eine gegebene Menge von Heparin führendem Gewebe wieder gewinnbar, was ein.Vorteil ist. Offenbar ist die neue Kombination von stufen bei dem Verfahren gemäß der Erfindung hinsichtlich der Zerkleinerung des gefrorenen Gewebes, des schnellen Auftauens und Srvur-mens des Gewebes, des Fermentierens unter geregelten Bedingungen und der aseotropischen Behandlung für die ver-

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"besserte Benetzbarkeit verantwortlich, ferner und gleichermaßen wichtig können infolge der Regelung der Bedingungen während der Temperung die dabei erhältliche Heparin-Ausbeute ond der Gehalt an dem entfetteten Gewebe gemäß der . Erfindung soviel wie etwa lo?£ höher als "bei dem entfetteten Gewebe gemäß-.dem zuvor beschriebenen Stand der Technik sein.

In der US-PS 2 539 544 ist die Zerkleinerung von gefrorenem Gewebe in einer.Hammermühle vor der azeotropischen Extraktion und sofort nach Mahlen und Suspendieren des gemahlenen Gewebes in einem Lösungsmittel beschrieben. Gemäß der Erfindung wird das Gewebe aufgetaut und erwärmt, indem man es durch einen Wärmeaustauscher führt und danach fermentiert.

Der Ausdruck "Temperung", wie er hier verwendet wird, bezieht sieh auf die Erhöhung der Temperatur von gefrorenem, Heparin führenden tierischem Gewebe und seine Konditionierung für die weitere Heparin-Gewinnungsbehandlung. Der Ausdruck "Heparin führendes, tierisches Gewebe" bezieht sich auf solche tierischen Gewebe, die reich an Heparin und zur Heparin-Herstellung geeignet sind, wie Lunge, Gehirn, Leber, Innereien oder billige FLeisehteile von Tieren. Der Ausdruck "teilchenförmig (particulate)" oder Ableitungen davon beziehen sich auf den zerteilten Zustand des Gewebes, d.h. eine Größe bis zu etwa 6,35 mm I-Iaschen (etwa 1/4 inch),oder auf das Zerteilen größerer Stücke, die vorgebrochen oder geflockt worden sind. Der Ausdruck "Fermentierung" bezieht sich auf die kombinierte Wirkung von Enzymen, die in dem Gewebe vorhanden sind, und Enzymen, die durch das V/achstum von in dem tierischen Gewebe vorhandenen Bakterien oder Mikroorganismen erzeugt werden, oder von zur Beschleunigung des Freisetzens von Heparin zugesetzten Enzymen oder Bakterien. Der Ausdruck "azeotro—

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pe oder azeotropische Behandlung" "bezieht sich darauf, daß das Gewebe der Siedewirkung eines Lösungsmittels, das ein Azeotrop mit Wasser bildet, unterworfen wird, um dieses im wesentlichen zu entfernen und welches das Gewebefett in den Lösungsmittelstrom extrahiert, und das darauf folgende Sammeln und Waschen des dehydratisieren Gewebes auf einem Euter mit Lösungsmittel.

Die vorliegende Erfindung beruht daher hauptsächlich auf der feststellung, daß eine verbesserte 'Temperung von gefrorenem oder teilweise gefrorenem, Heparin führendem, tierischem Gewebe dadurch herbeigeführt werden kann, daß man dieses zu Teilchen zerkleinert und in einen Wärmeaustauscher pumpt, wo es unter geregelten Bedingungen aufgetaut wird, um Gewebe zu erhalten, die nach Fermentierung bei geregelter Temperatur während einer Zeitdauer, die ausreicht, um im wesentlichen eine enzymatisehe Konditionierung des Gewebes zur Verbesserung der Heparin-Zugänglichkeit herbeizuführen, und nach azeotropischer Behandlung einen außergewöhnlich niedrigen Fettgehalt und einen außergewöhnlich hohen Gehalt an zugänglichem Heparin infolge der Regelung der Zeit und der Temperatur während der ganzen Behandlung jeder Menge oder jeder Partie aufweisen und einen sehr niedrigen Pyrogengehalt haben.

Ein Fließbild des Verfahrens gemäß der Erfindung ist in der Zeichnung wiedergegeben. Das bevorzugte Verfahren umfaßt ein Zermahlen von gefrorenem oder teilweise gefrorenem Gewebe und ein rasches Auftauen und Erwärmen des aufgetauten Gewebes in einem Wärxaeaustsascher, ein Fermen tieren des Gewebes bei 7,2 bis 35⁰O (45 bis 95°?) während einer Zeitdauer, die ausreicht, um die Heparin-Zugänglicn keit auf ein Optimum zu bringen, und eine danach erfolgen de azeotropische Behandlung des Gewebes, um Feuchtigkeit

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Fett zu entfernen. Allgemein gesprochen, ist die erforderliche Zeit umso kürzer je höher die Temperatur innerhalb des Bereichs während der Zementierung ist. Aus einem nicht erklärlichen Grund zeigt eine starke Entwicklung von Gas und ein starkes Schäumen das Ende der erwünschten IPermentierungsphase an.

Das Heparin in dem Gewebe, das gemäß der Erfindung getempert ist, kann durch eine Anzahl von Arbeitsweisen gewonnen werden, einschließlich der Verfahren der US-PS 2 797 184 und der US-PS 2 954 321 unter leichter Benetzbarkeit, wobei die Behandlungsvorteile offensichtlich sind.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, allgemein gesprochen, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von getrocknetem und entfettetem Heparin-Gewebe aus gefrorenen, Heparin führendem, tierischem Gewebe zu schaffen, bei welchem insbesondere die ungesunden Bedingungen des Verfaulens und der unangenehme Geruch, der die Verfahren des Standes der Technik begleitet, ausgeschaltet werden und bei welchem mehr von dem JFett extrahiert wird.

Ein anderer Zweck der Erfindung ist die Schaffung eines verbesserten getrockneten und entfetteten Heparin-Gewebes, das zur Heparin-Gewinnung besonders wegen seiner leichten Extrahierbarkeit geeignet ist, weil es bei der Heparin-Gewinnung leicht extrahierbar ist.

Ein anderer Zweck der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung eines getrockneten und entfetteten Heparin-Gewebes, bei dem vor der aseotropischen Behandlung gefrorenes, Heparin führendes, tierisches Gewebe unter geregelten Bedingungen hinsichtlich einer genauen Temperatur jederzeit einschließlich einer ITermentie-

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rungsstufe, in der die mikrobiologische Populatioii gleich mäßig in dem Substrat verteilt und ihr Wachstum gefördert wird, getempert wird, wobei sowohl endogene als auch exogene Enzyme auf das Substrat wirken gelassen werden und ein gleichförmig konditioniertes Produkt mit einem konsistenteren biochemischen Gehalt erzeugt wird, das einen niedrigeren Pyrogengehalt und einen hohen Gehalt an zur Verfügung stehendem Heparin hat und einen äußerst niedrigen Fettgehalt aufweist.

Das bevorzugte Verfahren gemäß der Erfindung zur Erzeugung von getrocknetem und entfettetem Heparin-Gewebe bei der Zubereitung zur Isolierung und Gewinnung von Heparin umfaßt die folgenden Stufen:

(1) Zerteilung des gefrorenen Gewebes auf irgendeine Größe bis zu etwa 6,35 mm Maschengröße (1/4 inch), vorzugsweise 3,175 bis 6,35 mm MaschengröSe (l/S bis 1/4 inch), vorzugsweise unter Verwendung eines Mahlwerks ,

(2) Auftauen und Erwärmen des zerkleinerten Gewebes aus der Stufe 1 in dem Bereich von 7,2 bis 35°C (45 bis 95⁰F), vorzugsweise von 23,9 bis-29,4°C (75 bis 85⁰F unter Verwendung eines Wärmeaustauschers, vorzugswei se eines Gehäuse- und Hohrwäraieaustauschers,

(3) Fermentieren des erwärmten Gewebes aus der Stufe 2, während man es auf einem Temperaturbereich von 7,2 bis 35⁰C (45 bis 95⁰F) während 2 bis 15 h, vorzugsweise 23,9 bis 29,4⁰C (75 bis 85° ^l') während einer Zeit von 6 bis 8 h, jedoch nicht wesentlich über die ser Zeit hält, da sonst ein Schäumen infolge G-asfrei setzung auftritt, und

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το

(4) azeotropische Behandlung des fermentierten Gewebes aus der Stufe 3 mit einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise Äthylendichlorid, um das fermentierte Gewebe im wesentlichen zu dehydratisieren und zu entfetten.

Das Heparin führende tierische Gewebe für das Verfahren gemäß der Erfindung stammt von der Fleischkonservenanlage, wo es von Tierkörpern oder -gerippen geschnitten und gemäß speziellen Arbeitsweisen zur Konservierung und Erhöhung der Heparin-Werte gehandhabt, in Kästen oder Säcke eingebracht und tiefgefroren wird. Dementsprechend kommen die tierischen Teile bei der Heparin-Gewinnungsanlage in Form von Blöcken einer Art von gefrorenem, agglomeriertem Tierteil, wie z.B. einer Lunge in der Größe und Gestalt der Behälter an. Gewöhnlich ist die Größe der Blöcke von gefrorenen Tierteilen zu groß zur direkten Zerkleinerung in der Anlage, die für diese Technik zur Verfügung steht, und es ist daher notwendig, die Größe der Blöcke durch einige vorhergehende Maßnahmen zu verringern. 'Um dies zu bewerkstelligen, können die tiefgefrorenen Gewebeblöcke mechanisch durch einige Einrichtungen gespalten oder vorgebrochen werden. Vorzugsweise werden jedoch die Blöcke von tiefgefrorenem Gewebe teilweise während etwa 8 h bei Umgebungstemperaturen von 26,7 bis 43,3⁰C (8o bis loo°F) entfrostet und dadurch aus ihrem tiefgefrorenem Zustand in einen weicheren Zustand gebracht, indem die Temperatur der Blöcke um etwa -6,67 bis O⁰C (2o bis 32⁰F) erhöht wird, wonach das weichgefrorene Gewebe bei der Vorbereitung für die Zerkleinerung geschnitzelt oder geflockt werden kann. Wenn die Flockungs- oder Schnitzelarbeitsweisen befolgt werden, ist die bevorzugte Temperatur, auf welche die Gewebeblöcke gebracht v/erden, etwa -3°C (26⁰F), da das Gewebe fest genug ist, um geflockt

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zu werden, sich jedoch in einem etwas erweichten Zustand befindet, der für den Plockungsvorgang geeignet ist. Sine geeignete Plockungsmaschine ist der "Hydrauflaker" (hergestellt von der General Machinery Corporation, Sheboygan, Wisconsin, V.St.A.). In jedem Fall soll das Gewebe nicht so kalt sein, daß das zerkleinerte Gewebe in der nächsten Stufe wieder zu Kugeln und Klumpen gefriert, was ein Pumpen verhindert. Im allgemeinen kann die Teilchengröße des vorgebrochenen oder geflockten, gefrorenen Gewebes von 3,175 bis 5o,8 mm (l/8 bis 2 inch.) variieren.

In der Stufe 1 des Verfahrens arbeiten die Mahlwerke, um die Größe des vorgebrochenen oder geflockten gefrorenen oder teilweise gefrorenen Gewebes auf diejenige heraufzusetzen, die in einem Bereich, wie sie in einem Püree vorhanden ist, bis zu einer maximalen Dimension einer Masehengröße von etwa 6,35 mm (1/4 inch), vorzugsweise einer Maschengröße von 3,175 mm (l/8 inch) liegen. Mahlwerke, die geeignet sind, sind z.B. das "Comitrol"-Mahlwerk (hergestellt von der Urschel Laboratories of Valparaiso, Indiana (V.St.A.)) und das "Autio"-Mahlwerk (hergestellt von der Autio Company, Astoria, Oregon (V.St.A.)).

In der Stufe 2 wird das gemahlene, gefrorene oder teilweise gefrorene Gewebe mittels einer Pumpe, wie Giner 1-icyno-Pumpe, einem Wärmeaustauscher zugeführt, der go arbeitet, daß das Gewebe in 3o min oder weniger, vorzugsweise innerhalb etwa 5 min aufgetaut und auf 7,2 bis '55 C (45 bis 95⁰S¹) unter Verwendung einer Y/ärne&ustauscher~Oberflächentemperatur nicht über 6o C (I4o°?) erw"?' .'nt wird. Bei einer Zeit von über etwa 3o min erfolgt eine au große Änderung bei der späteren Verarbeitung. Wärriee/actauseheroberfläeiicii mit einer höheren temperatur als 6o°C (I4o°?) verursachen eine Verschmutzung, der Oberflächen, eine Denaturierung von Protein und eine mikrobiologische Abtötung. Gehäuse- und

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Kohrwärmeaustauscher, "bei denen das Gewebe durch das Rohr geht, sind sehr zufriedenstellend und bevorzugt, Wärmeaustauscher mit abgekratzter oder abgestrichener Oberfläche können jedoch auch zur Anwendung gelangen. Die bevorzugten Gehäuse- und Rohrwärmeaustauscher haben einen Rohrdurchmesser von etwa 19 mm bis etwa 25,4 mm (3/4 bis 1 inch) Durchmesser * und haben dementsprechend ein Oberflächen- :

2 "5 Volumenverhältnis von etwa 164,3 bis 246,3 m je m

(5o to ■ .75 ft. per ft. ). Oberflächen von Rohren in diesem Größenbereich bleiben unverschmutzt bei normalen Pumpgeschwindigkeiten,

In der Stufe 3 wird das warme Gewebe in einem Gefäß mit einer inerten Oberfläche, wie z.B. einem rostfreien Stahlbehälter, auf einer Temperatur von 7,2 bis 35⁰C (45 bis 95⁰P), vorzugsweise 23,9 bis 29,4⁰C ( 75 bis 85⁰F) während einer Zeitdauer gehalten, die ausreicht, um die Heparin-Gewebe infolge einer Fermentierung, welche schon vorhandene Enzyme und Enzyme umfaßt, die durch wachsende Mikroorganismen erzeugt werden, zu konditionieren. Oberhalb etwa 35°C (95⁰P) gehen die Heparin-Werte rasch verloren und unterhalb etwa 7,2⁰C (45°F) ist die Fermentierungsstufe unwirksam. 2 bis 15 h Fernentierungszeit sind bei 7,2 bis 35⁰C (45 bis 95⁰F) erforderlich, und aus unbekannten Gründen wird die Vollendung der nützlichen oder der vorteilhaften Fermentierung durch starkes Gasfreisetzen und Anstieg in den Aufbewahrungsbehältern signalisiert, und eine weitere Fermentierung setzt die Ausbeute an Heparin herab. Die Halte- oder Verweilzeit soll dann oder gerade vor dieser Anzeige gemäß früheren Erfahrungen hinsichtlich der Zeiterfordernis für eine besondere Temperatur beendet werden. Das Zeit-Temperatur-Verhältnis wird durch die folgenden Koordinaten dargestellt, die durch "Versuch und Fehler" erhalten sind,wobei die Gasbildungsphase begonnen hatte:

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Zeit, h Temp. ⁰C (⁰F)

9-lo 23.9

(75)

8 26,7

(8o)

6 29,4

(855

Es ist nicht nötig, zu warten bis eine Gasbildung eintritt, um das überlegene Produkt gemäß der Erfindung zu erhalten. Im allgemeinen ist eine gewisse Variation von Mikroorganismen im Lungengewebe unter den einzelnen Tieren vorhanden. Ein Mahlen und Mischen von vielen Lungenlappen gewährleistet, daß die bakterielle Population derart ist, daß die Fermentierung schliei31ich vor sich geht. Wenn es erwünscht ist, die Fermentierung zu beschleunigen, können Mikroorganismen als Starter zugesetzt werden, z.B. durch Beimpfen des Gewebes bei Beginn der Haltezeitdauer mit Gewebe, das schon feraientiert worden ist. Leber und anderen Geweben fehlen gewöhnlich die hohen Mengen an Mikroorganismen, und sie können solche Anwendung von Startern oder solches Beimpfen erfordern.

In der Stufe 4 wird das fermentierte Gewebe aus der Stufe 3 azeotropischen Behandlungsarbeitsweisen, wie sie in der US-PS 2 619 425 und der US-PS 2 539 544 beschrieben sind, unterworfen. Vorzugsweise wird die azeotropische Behandlung bei Atmosphärendruck unter Verwendung von Äthylendichlorid bei einer Temperatur nicht über 82,2⁰C (l8o°F) durchgeführt. Andere Lösungsmittel wie PropylendiChlorid, Trichloräthylen, Hexan od.dgl. können zur Anwendung gelangen«

Entfettetes Heparin-Gewebe, das nach dem vorstehenden Verfahren erhalten wird, ist durch seinen niedrigen Fett-

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gehalt von etwa o,l bis ο, 3$ und durch seine ausgezeichnete Permeabilität, wie sie durch. Benetzbarkeit und Suspendierbarkeit gemessen wird, gekennzeichnet.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen näher erläutert.

Heparin-Einheiten sind USP-Einheiten.

Beispiel 1

Teilweise aufgetaute, gefrorene Rinderlunge wurde bei -3,89 bis -1,11⁰C (25 bis 3o°F) in einer Menge von etwa 69oo kg (15 19o lbs) unter Verwendung eines Hydrauflaker (Modell FS-β) auf einen Größenbereich von 3,175 bis 6,35 mm (l/8 bis 1/4- inch) Dicke und bis zu lol,6 mm (4 inch ) Länge geflockt. Die geflockte, gefrorene Lunge wurde dann mit einem Comitrol-Mahlwerk (Modell 21oo) mit Öffnungen von 1,524 mm (ο,οβ inch) Größe gemahlen. Die gemahlene, gefrorene oder teilweise gefrorene Lunge wurde mit einer Koyno-Punpe durch Rohre von 19 mm (3/4 inch) Durchmesser eines Gehäuse- und Rohrwärmeaustauschers gepumpt, um die Lunge bei 2ο bis 22,8⁰C (68 bis 73⁰P) aufzutauen und zu erwärmen, wobei die Verweilzeit in dem Wärmeaustauscher etwa 4 min betrug. Die warme, gemahlene Lunge wurde dann in einem Behälter aus rostfreiem Stahl während 6 h bei 21,1 bis 23,9°C (7o bis 75⁰S¹) gehalten. Es war keine äußere Wärme erforderlich, um die Temperatur während der Fermentierung aufrechtzuerhalten, und es wurde auch ein geringer Temperaturanstieg infolge der Reaktionswärme festgestellt. Das Gewebe wurde dann der Siedewirkung von Athylendichlorid bei atmosphärischem Druck unterworfen, bis das Wasser im wesentlichen entfernt worden war. Das entwässerte Gewebe wurde dann auf einem Filter gesammelt und einmal mit wiederdestilliertem Äthylendichlorid gewaschen.

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Das restliche Lösungsmittel wurde durch übliche Lösungsmittelgev/imiungsverfahren entfernt. Es. wurden etwa 1273 kg (2₅8o4 l"bs) getrocknetes und entfettetes Gewebe mit einem Gehalt von 0,18$ Fett und l,6/o Feuchtigkeit erhalten. Eine Aufarbeitung des getrockneten und entfetteten Gewebes zur Gewinnung von nach der Arbeitsweise der US-PS 2 954 521 ergab 158 χ Io Einheiten Heparin/kg an getrockneter und entfetteter Lunge. Die Heparin-Potenz betrug 79 Einheiten je mg.

Beispiel 2

Teilweise aufgetaute, gefrorene Rinderlunge wurde bei -3,33⁰D (26⁰F) in einer Menge von etwa 735o kg (I6,2oo lbs.) geflockt und, wie in Beispiel 1 beschrieben, gemahlen, wobei Öffnungen mit 3_so5 mm (o,12o inch) Größe bei dem Mahlwerk benutzt wurden. Die gemahlene Lunge ^rurde dann in einem Wärmeaustauscher wie in Beispiel 1 aufgetaut und auf 28,3⁰C (83⁰F) erwärmt, wobei die Verweilzeit 4 min betrug. Die warme, gemahlene Lunge wurde dann in einem rostfreien Stahlbehälter während 6 h bei 28,3 bis 29,4⁰C (83 bis 85⁰F) gehalten. Es war kein unerwünschter Geruch zu irgendeiner Zeit vorhanden. Es wurden 717o kg (15j8oo lbs.) getemperte Lunge erhalten. Das Gewebe wurde dann einer Siedewirkung von Äthylendichlorid bei atmosphärischem Druck unterworfen, bis das V/asser im wesentlichen entfernt worden war. Das entfettete-dehydratisierte Gewebe wurde dann auf einem Saugfilter gesammelt und einmal mit reinen Ä'thylendichlorid gewaschen. Das restliche Äthylendichlorid wurde durch übliche Lösungsmittelgewinnungsverfahren entfernt. Es wurden etwa 128o kg (2816 lbs.) an entfettetem Gewebe mit einem Gehalt von o,3 Gew.$ Fett und 2,2 Gew.$ Feuchtigkeit erhalten. Die Aufarbeitung des entfetteten Gewebes zur Gewinnung von Heparin nach dem Verfahren der

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US-PS 2 954 321" ergab 152,7 x Io ^J Einheiten.Heparin je kg an entfettetem-dehydratisiertem Gewebe. Die Heparin-Wirksamkeit "betrug 58,8 Einheiten/mg.

Beispiel 3

545o kg (I2,ooo lbs.) gefrorene Sinderlunge wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, gemahlen und auf 4,44 bis lo,o°C (4o bis 5o P) erwärmt, wobei die Verweilzeit in dem Wärmeaustauscher etwa 2 min betrug. Die gemahlene Lunge wurde dann bei 4,44 bis lo,o°C (4o bis 5o°F) während 6 h gehalten« Es wurden etwa 54oo kg (ll,9oolbs.) an getempertem Rinderlungengewebe erhalten. Das Gewebe wurde danach einer azeotropischen Extraktion mit Äthylendichlorid, wie in Beispiel 1 beschrieben, unterworfen, nach Entfernen des Lösungsmittels wurden etwa 93o kg (2,o46 lbs) entfettetes-dehydratisiertes Gewebe mit einem Gehalt von o,12 Gew.$ Fett und 2,6 Gew.$ Feuchtigkeit erhalten. Die Aufarbeitung des entfetteten Gewebes zur Gewinnung von Heparin nach dem Verfahren der US-PS 2 954 321 ergab 164 x lo^ Einheiten Heparin je kg an entfettetem-dehydratisiertem Gewebe. Die Heparin-Wirksamkeit betrug 48 Einheiten/mg.

Beispiel 4

545o kg (I2,ooo lbs) gefrorene Rinderlunge wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, gemahlen und auf 32,2 bis 43,3°C (9o bis Ho⁰F) in dem Wärmeaustauscher erwärmt, wobei die Verweilzeit etwa 6 min betrug. Die zermahlene Lunge wurde bei 32,2 bis 43,3⁰C (9o bis Ho⁰I¹) während 6 h gehalten. Es wurden etwa 54oo kg (ll,9oo lbs.) an getemperter Rinderlunge erhalten. Das Gewebe wurde einer aseotropischen Extraktion mit Äthylendichlorid, wie in Beispiel 1 beschrieben, unterworfen, ilach Entfernen des Lösungsmittels wurden etwa 795 kg (1,751 lbs.) entfettetes-dehydratisiertes Gewebe mit einem

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Gehalt von 0,08 Gew.^ Fett und 1,2 Gew.$ Feuchtigkeit erhalten. Die Aufarbeitung des entfetteten Gewebes aur Gewinnung von Heparin nach dem Verfahren der US-PS 2 954 ergab 86 χ Io Einheiten Heparin je kg an entfettetem—dehydratisiertem Gewebe. Die Heparin-Wirksamkeit betrug 74 Einhei ten/mg.

Beispiel 5

735o kg (I6,2oo lbs.) gefrorene Rinderlunge wurden zermahlen, aufgetaut und, wie in Eeispiel 1 beschrieben, auf etwa 26⁰C (79⁰S¹) erwärmt, wobei die Verweilzeit in dein Wärmeaustauscher etwa 3 min betrug. Die warme, sermahlene Lunge wurde dann in einem rostfreien Stahlbehälter während 8 h bei etwa 26 bis 26,7⁰C (79 bis 80⁰F) gehalten. Es trat zu keiner Zeit ein unerwünschter Geruch auf. Es wurden etwa 7195 kg (I5.85o lbs.) getemperte Rinderlunge erhalten. Das Gewebe wurde dann einer Siedev.ärkung von Äthylendichlorid bei atmosphärischem Druck unterworfen, bis das Wasser im wesentlichen entfernt worden war. Das entfettete-dehydratisierte Gewebe wurde dann auf einem Filter gesammelt und einmal mit Äthylendichlorid gewaschen. Das restliche Äthylendichlorid wurde durch übliche Lösungsmittelgewinnungsverfahren entfernt. Es wurden etwa 1295 kg (285o lbs.) an entfettetem Gewebe mit einem Gehalt von < o,2 Gew.$ Fett und 2,2 Gew.$ Feuchtigkeit erhalten. Die Aufarbeitung des entfetteten Gewebes

zur Gewinnung von Heparin nach den Verfahren der US-PS

■χ
2 954 321 ergab 155 χ Io Einheiten Heparin .je kg entfettetem-dehydratisiertem Gewebe. Die Heparin-Wirksasikeit betrug 96 Einheiten/mg.

Die Vierte der vorstehenden Beispiele sind in der nachstehenden Tabelle I vergleichsweise zusammengefaßt.

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Tabelle I Lungenfermentierung, Extraktion und Heparin-Isolierung

Fermentierung- Ausbeute getrockne- Fett in getrockne- rohes Heparin Heparinbedingungen te, entfettete Lunge t.er, entfetteter Ausbeute Potenz

^ Ur. Temp. ⁰O(⁰F) Zeit, h (a) ¹^* P>) (c)

oo Ί 21,1 - 23,9 6 18,4 o,18

Ξ (7o - 75Γ

ο 2 29,4 6 V 17,4 o,3o

^ (85)

""* 3 4,44 - lo,o 6 17,1 o,12

(4o - 5o)

4 32,2 - 43,3 6 13,9 . 0,08 (9o - Ho)

5 26,7 8 18,o < o,2 (8o)

(a) Gew.fo, bezogen auf Ausgangslunge

(b) Heparin-Einheiten χ lov^S getrocknete und entfettete Lunge

(c) Heparin-Einheiten/mg in rohem Heparin

158	79	CD ■Ο-
153	59 j
164	48
86	74
155	96

Vergleich der Benetzbarkeit von geteiüpertementfettetem Gewebe

Ein Vergleich wurde hinsichtlich der Benetzbarkeit von azeotropisch entfettetem Gewebe, das nach den Verfahren gemäß der Erfindung hergestellt wurde, mit demjenigen von entfettetem Gewebe, das aus getempertem Gewebe nach dem alten Verfahren hergestellt worden war, wobei die Lunge etwa 4 Tage bei Umgebungstemperatur von 26,7 bis 37,8⁰C (8o bis loo°5*) getempert wurde, gemacht. Pur diesen Vergleich wurde eine 2o g-Probe des entfetteten Produkts in 2oo ml Wasser gerührt, bis die Teilchen auf der Außenseite naß erschienen, und das Rühren wurde an- ■ gehalten. Die für die Masse der Teilchen erforderliche Zeit, um unterzusinken, wurde dann aufgezeichnet. Die Werte sind in Tabelle II angegeben.

Tabelle II

	ITetzbarkeitsvergleich
Temper methode	Zeit für Teilchen zum Untersinken auf den Beden (see)
alt neu	> 18o < Io

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Leerseite

Claims

Patentansprüche

(3) das aufgetaute Gewebe aus der Stufe 2 bei geregelter Temperatur während einer Zeitdauer, um im wesentlichen eine enzymatisch^ Konditionierung des Gewebes zur Verbesserung der Zugänglichkeit des Heparins herbeizuführen» fermentiert,

(4) das fermentierte Gewebe aus der Stufe 3 einer azeatropisehen Extraktion mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel unterwirft, um das fermentierte Gewebe im wesentlichen zu dehydratisieren und zu. entfetten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

(1) das Gewebe in Teilchen zerkleinert,

(2) das zerkleinerte Gewebe auftaut und auf eine Temperatur in dem Bereich von 7,2 bis 35⁰C (45 bis 95⁰F) in einem Wärmeaus tauscher erwärmt,

(3) das erwärmte Gewebe aus der Stufe 2 innerhalb eines Temperaturbereichs von 7,2 bis 35 C

(45 bis 95°P) während einer Zeitdauer von 4 bis 8 h fermentiert,

(4) das fermentierte Gewebe aus der Stufe 3 einer azeotropen Extraktion mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel unterwirft, um das fermentierte Gewebe im wesentlichen zu dehydratisieren und zu entfetten.

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3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet» daß das Heparin führende tierische Gewebe Einderlunge ist.
4· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichdaß in der Stufe ;
(65 Ms 85°P) beträgt.

net, daß in der Stufe 3 die Temperatur 18,3 bis 29,4°C
5· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4» dadurch gekennzeichnet, daß der Wärmeaustauscher ein Gehäuse- und Rohrwäriaeaustauscher ist, wobei das Gewebe durch das Rohr bewegt wird.
6· Verfahren nach eines der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe 3 das erwärmte' Gewebe zur Beschleunigung der Fermentierung sit Bakterien beimpft wird.
7· Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel
in der Stufe 3 Äthylendichlorid ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe 1 das Ausgangsge— webe sieh in flockigem Zustand befindet.

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