DE2643829A1 - PROCEDURE FOR DETERMINING THE PRESENCE OF ANTIGENT ASSOCIATED WITH HEPATITIS - Google Patents

PROCEDURE FOR DETERMINING THE PRESENCE OF ANTIGENT ASSOCIATED WITH HEPATITIS

Info

Publication number
DE2643829A1
DE2643829A1 DE19762643829 DE2643829A DE2643829A1 DE 2643829 A1 DE2643829 A1 DE 2643829A1 DE 19762643829 DE19762643829 DE 19762643829 DE 2643829 A DE2643829 A DE 2643829A DE 2643829 A1 DE2643829 A1 DE 2643829A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
hepatitis
antibodies
sample
antibody
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
DE19762643829
Other languages
German (de)
Inventor
Milton Anken
Seymour P Halbert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cordis Corp
Original Assignee
Cordis Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US06/617,743 external-priority patent/US4474878A/en
Priority claimed from US05/617,745 external-priority patent/US4157280A/en
Application filed by Cordis Corp filed Critical Cordis Corp
Publication of DE2643829A1 publication Critical patent/DE2643829A1/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545Synthetic resin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

D* ·ΙΝ» DIPL.-ΙΝβ. M. SC. DIPI PHY·. DR. D * · ΙΝ »DIPL.-ΙΝβ. M. SC. DIPI PHY ·. DR. HÖGER - STELLRECHT - GRIESSBACH - HAECKERHÖGER - LEGAL RIGHTS - GRIESSBACH - HAECKER PATENTANWÄLTE IN STUTTGARTPATENT LAWYERS IN STUTTGART

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27.September 1976September 27, 1976

Cordis Corporation Miami, Florida, 33137 U.S.A.Cordis Corporation Miami, Florida, 33137 U.S.A.

Verfahren zum Feststellen der Anwesenheit eines der Hepatitis zuzuordnenden AntigensMethod for determining the presence of an antigen attributable to hepatitis

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Feststellen der Anwesenheit eines der Hepatitis zuzuordnenden Antigens in einer Probe.The invention relates to a method for determining the Presence of an antigen assigned to hepatitis in a sample.

Hepatitis, d.h. Leberentzündung B tritt meistens als Folge einer Infektion oder eines Verschlusses der Gallenkanäle aufo ManHepatitis, ie inflammation of the liver B , occurs mostly as a result of an infection or a blockage of the biliary ducts o Man

9815/0819815/081

A 41 952 b u - 163A 41 952 b u - 163

27. September 1976September 27, 1976

nimmt an, dass es zwei verschiedene Arten einer Virus-Hepatitis gibt, von denen eine eine längere Inkubationszeit hat als die andere. Wenn ein Patient an Hepatitis erkrankte und sie sich bekanntermassen parenteral zugezogen hatte, dann nannte man diese Art der Hepatitis in der Vergangenheit "Serum-Hepatitis". Wenn jedoch der Patient sich die Hepatitis nicht bekanntermassen parenteral, sondern oral zugezogen hatte, nannte man diese Art der Hepatitis "infektiös". Es ist jedoch berichtet worden, dass abgesehen davon, dass sie überlappende Inkubationszeiten haben, man sich die "infektiöse Hepatitis" auch parenteral, und die sogenannte "Serum-Hepatitis" auch oral zuziehen kann. Daher sollten die Ausdrücke "Serum-Hepatitis" und "infektiöse Hepatitis" nicht zur Unterscheidung dieser zwei Formen der Hepatitis verwendet werden, obwohl man annehmen kann, dass es zwei verschiedene, von mindestens zwei unterschiedlichen Wirkstoffen erzeugte Formen der Hepatitis gibt. Aus diesem Grund hat man vorgeschlagen, die Ausdrücke "Hepatitis A" für die der "infektiösen Hepatitis" ähnliche Form und "Hepatitis B" für die der "Serum-Hepatitis" ähnliche Form zu verwenden.suggests that there are two different types of viral hepatitis, one of which has a longer incubation period than that other. If a patient contracted hepatitis and was known to have contracted it parenterally, then one called this type of hepatitis in the past "serum hepatitis". However, if the patient has no known hepatitis parenterally, but rather orally, this type of hepatitis was called "infectious". It is reported, however That, in addition to having overlapping incubation times, is called "infectious hepatitis" too parenterally, and so-called "serum hepatitis" can also be contracted orally. Therefore, the terms "serum hepatitis" and "infectious hepatitis" cannot be used to distinguish these two forms of hepatitis, although one may assume It is possible that there are two different forms of hepatitis caused by at least two different active substances. For this reason it has been proposed to use the terms "hepatitis A" for the form similar to "infectious hepatitis" and "Hepatitis B" to be used for the form similar to "serum hepatitis".

Die vorliegende Erfindung ist vorzugsweise auf den Nachweis des Antigens oder der Antigene gerichtet, die der Hepatitis vom Typ B zuzuordnen sind. Patienten, die an dieser Form der der Serum-Hepatitis äusserst ähnlichen Hepatitis erkranken, haben diese Antigene oft in ihrem Blut, unabhängig davon, auf welchem Wege sie sich die Hepatitis zugezogen haben. An dieser Stelle soll darauf hingewiesen werden, dass es keinen zuverlässigen Nachweis für die Anwesenheit eines der Hepatitis A oder einer hypothetischen Hepatitis C zuzuordnenden Antigens gibt.The present invention is preferably directed to the detection of the antigen or antigens that are related to hepatitis of type B are to be assigned. Patients who develop this form of hepatitis, which is very similar to serum hepatitis these antigens are often in their blood regardless of how they got the hepatitis. At this point It should be noted that there is no reliable evidence for the presence of any of the hepatitis A or any other hypothetical hepatitis C antigen.

I0981S/0812I0981S / 0812

A 41 952
u - 163
A 41 952
u - 163

27. September 1976 - if- 7R1LtRJQ September 27, 1976 - if- 7R 1 LtRJQ

Die Erkrankung an "Serum-Hepatitis" oder Hepatitis B stellt ein ernstes und nicht zu vernachlässigendes klinisches Problem dar. Wegen der Bedeutung dieses Problemes ist eine Vielzahl von Nachweismethoden für Hepatitis entwickelt worden. Zu diesen gehören "Mikro-Ouchterlony", Immunodiffusion, Komplementbindung (complement fixation), Immunoelektro-Osmophorese, Hämagglutination und Hämagglutinations-Inhibition, Elektronenmikroskopie und Radioimmunonachweis in der festen Phase. Eine kurze Beschreibung jeder dieser Methoden findet sich in British Medical Bulletin, 1972, Band 28, Nr. 2 (Viral Hepatitis), Seiten 138 bis 141.The disease represents "serum hepatitis" or hepatitis B. poses a serious and not negligible clinical problem. Because of the importance of this problem, there are many of detection methods for hepatitis have been developed. To this include "micro-Ouchterlony", immunodiffusion, complement fixation (complement fixation), immunoelectro-osmophoresis, hemagglutination and hemagglutination inhibition, electron microscopy, and radioimmuno detection in the solid phase. A short description each of these methods can be found in British Medical Bulletin, 1972, Vol. 28, No. 2 (Viral Hepatitis), p. 138 to 141.

Die Immuno-Elektro-Osmophorese oder Gegenelektrophorese (counterelectrophoresis CEP) stellt eine schnelle und einfache Methode für den Nachweis des Hepatitis-Antigens und seines Antikörpers dar. Allerdings ist diese Technik etwas weniger empfindlich als beispielsweise die Komplementbindung. Ihr hauptsächlicher Vorteil liegt darin, dass der Nachweis in zwei Stunden beendet werden kann. Wegen der geringen Empfindlichkeit wird der CEP-Methode jedoch von der Food and Drug Administration,(Lebens- und Arzneimittelbehörde) nicht länger zugestimmt.Immuno-electro-osmophoresis or counter-electrophoresis (counterelectrophoresis CEP) provides a quick and easy method for the detection of the hepatitis antigen and its Antibody. However, this technique is somewhat less sensitive than, for example, complement fixation. you The main advantage is that the verification can be completed in two hours. Because of the low sensitivity However, the CEP method is no longer used by the Food and Drug Administration agreed.

Die Anwendungsmöglichkeit des Radio-immuno -nachweises (radioimmunoassay RIA) für diagnostische Routineuntersuchungen ist als etwas beschränkt anzusehen, und zwar nicht nur wegen der relativ komplizierten, spezialisierten und teuren Ausrüstung, die für die Durchführung des Tests nötig ist, sondern auch wegen der äussersten Vorsicht, mit welcher beim Umgang mit radioaktiven Isotopen vorgegangen werden muss. Die MarkierungThe possibility of using the radio-immuno-detection (radioimmunoassay RIA) for routine diagnostic examinations is considered somewhat limited, and not just because of the but also relatively complicated, specialized and expensive equipment that is necessary for performing the test because of the extreme care that must be taken when handling radioactive isotopes. The mark

709815/0812709815/0812

AA. 41 952 b41 952 b 19761976 - Jt - Jt UU - 163- 163 22 2727 . September. September

2643.8282643.828

mit radioaktiven Isotopen stellt ein ernsthaftes Gesundheitsrisiko dar, erfordert dauernde Überwachung und eine Erlaubnis der Atomenergiebehörden (für Benutzer und Hersteller) und wirft schliesslich Probleme bei der Beseitigung der Abfälle auf. Trotzdem ist diese Technik für den Immunonachweis im Augenblick recht weit verbreitet.with radioactive isotopes poses a serious health risk, requires constant monitoring and a permit the atomic energy authorities (for users and manufacturers) and finally raises problems with the disposal of the waste. Even so, this technique for immunodetection is fairly widespread at the moment.

Alle immunologischen Nachweismethoden hängen natürlich von einer Grundcharakteristik aller Antikörper und Antigene ab, nämlich ihrer Fähigkeit mit einem spezifischen komplementären Antigen oder Antikörper zu reagieren. Wenn ein Antikörper einem sein Antigen enthaltenden Serum zugesetzt wird, bilden der Antikörper und das Antigen eine Verbindung oder einen Komplex und können aus der Lösung ausfallen. In den meisten der oben erwähnten Testverfahren wird die Anwesenheit des Antigens in menschlichen Seren unter Verwendung dieses einfachen Vorganges nachgewiesen.All immunological detection methods naturally depend on a basic characteristic of all antibodies and antigens, namely, their ability to react with a specific complementary antigen or antibody. When an antibody is added to a serum containing its antigen, the antibody and the antigen form a compound or a compound Complex and can fall out of solution. In most of the testing procedures mentioned above, the presence of the Antigen detected in human sera using this simple process.

Man hat bereits markierte Antikörper zur Identifikation verschiedener Antigene benutzt. Wenn ein in bekannter Weise mit einem bestimmten Antigen spezifisch reagierender Antikörper aus dem Globulin-Teil des Serums oder Plasmas eines Gasttieres isoliert wird, welches zur Bildung dieses Antikörpers angeregt worden ist, kann der Antikörper in bekannter Weise markiert werden. Indem man den Antikörper mit einer Markiersubstanz verbindet, z.B. - wie oben erwähnt - mit einer physikalisch nachweisbaren Substanz wie einem Radioisotop pder mit fluoreszierenden Chemikalien, kann die Gegenwart des Antikörpers nachgewiesen werden. Bei der diagnostischen Anwendung wird sichYou already have labeled antibodies to identify different ones Used antigens. When an antibody which reacts specifically with a certain antigen in a known manner from the globulin portion of the serum or plasma of a host animal is isolated which has been stimulated to form this antibody, the antibody can be labeled in a known manner will. By combining the antibody with a marker, e.g. - as mentioned above - with a physical one detectable substance such as a radioisotope or with fluorescent chemicals, the presence of the antibody can be detected will. In the diagnostic application it will be

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 . - *Γ - 9RA*ift9QSeptember 27, 1976. - * Γ - 9RA * ift9Q

der markierte Antikörper selbst an das nachzuweisende Antigen anlagern, sofern dieses Gegen-Antigen in einer vorbereiteten Probe vorliegt. Die Anwesenheit des Antigens in der Probe kann dann, durch den Nachweis des markierten Antikörpers in der Probe bestätigt werden.the labeled antibody attach itself to the antigen to be detected, provided that this counter-antigen is in a prepared one Sample is present. The presence of the antigen in the sample can then be confirmed by the detection of the labeled antibody in the Sample to be confirmed.

Für diagnostische Zwecke sollte ein markierter Antikörper genügend spezifisch für ein bestimmtes Antigen sein, so dass er nur mit den Antigenen reagiert, deren Nachweis gewünscht wird. Kreuzreaktionen mit anderen, ähnlich aufgebauten Antigenen, die jedoch ganz verschiedene und insignifikante Konsequenzen haben, müssen vermieden werden. Aus diesem Grunde ist es klar, dass sowohl die Herkunft als auch die Präparation des Antikörpers in jedem Immunonachweis recht kritisch sind.For diagnostic purposes, a labeled antibody should be used be specific enough for a particular antigen that it only reacts with the antigens that it is desired to detect will. Cross-reactions with other, similarly structured antigens, but with very different and insignificant consequences must be avoided. This is why It is clear that both the origin and the preparation of the antibody are quite critical in any immunodetection.

Wie bereits ausgeführt, umfasst eine der Methoden zum Nachweis des der Hepatitis zuzuordnenden Antigens den Radio-Immunonachweis in der festen Phase. Ein derartiges Verfahren ist in dem US-Patent Nr. 3,867,517 beschrieben. Danach wird bei der Durchführung dieses Nachweises zunächst ein einseitig geschlossenes Rohr oder ein mit diesem zusammen zu verwendender Einsatz aus gegossenem Polystyrol mit einer Antikörper-Schicht belegt. Dies erreicht man dadurch, dass man das zu belegende Teil mit einer Antikörper-Lösung zusammenbringt oder inkubiert. Anschliessend wird die unbekannte Probe mit dem derart beschichteten Röhrchen oder Einsatz zusammengebracht, damit die Antikörper mit den in der Probe anwesenden Antigenen reagieren. Das Röhrchen wird dann gewaschen und mit Antikörpern zusammengebracht, die mit dem radioaktiven Isotop J-125 markiert sind. Anschliessend wird es wieder gewaschen, um alle nichtgebundenen,As already stated, one of the methods for detecting the antigen to be assigned to hepatitis comprises radio-immunodetection in the solid phase. One such method is described in U.S. Patent No. 3,867,517. After that, the Implementation of this proof initially a unilaterally closed Tube or an insert to be used together with this made of cast polystyrene covered with an antibody layer. This is achieved by using the part to be covered an antibody solution or incubated. Afterward the unknown sample is brought together with the tube or insert coated in this way, so that the antibodies react with the antigens present in the sample. The tube is then washed and exposed to antibodies, marked with the radioactive isotope J-125. It is then washed again to remove all unbound,

709815/0812709815/0812

A 41 952 b
-u - 163
27. September 1976 - Jr- A Λ
A 41 952 b
-u - 163
Sep. 27, 1976 - Jr- A Λ

markierten Antikörper zu entfernen. Wenn sich in der Probe Antigene befinden, wird also ein Sandwich aus dem Polystyrolröhrchen (oder Einsatz), dem Antikörper, dem Antigen und dem mit J-125 markierten Antikörper gebildet. Die von dem mit J-125 markierten Antikörper ausgesandte Strahlung wird dann gezählt und mit einer Vergleichsprobe verglichen.remove labeled antibody. If there are antigens in the sample, the polystyrene tube becomes a sandwich (or insert), the antibody, the antigen and the antibody labeled with J-125. The one with the J-125 Radiation emitted by labeled antibodies is then counted and compared with a reference sample.

Es ist auch berichtet worden, dass bei der Durchführung des Radio-Immunonachweises eine Polytetrafluoräthylen-Scheibe nützlich sein kann, auf welche ein substituiertes Polystyrol, z.B. Isothiocyanostyrol, geschichtet oder "gepfropft" ist. Dieses Polystyrol ist eine unlösliche Substanz mit spezifisch ausgebildeten Oberflächen von protein-reaktiven Gruppen, die verwendet werden können, um im Bionachweisverfahren als Reagenzien Proteine kovalent zu binden.It has also been reported that a polytetrafluoroethylene disc was used when performing radioimmunodetection on which a substituted polystyrene, e.g., isothiocyanostyrene, is layered or "grafted" may be useful. This polystyrene is an insoluble substance with specifically formed surfaces of protein-reactive groups that can be used to covalently bind proteins as reagents in the bio-detection method.

In jüngster Zeit ist eine wichtige Alternative zum Markieren von Antikörpern mit Radioisotopen oder fluoreszierenden Chemikalien entwickelt worden. Diese besteht darin, Antikörper mit einem Enzym zu markieren. Ein derartiges Verfahren ist in den US-Patenten 3,654,090 und 3,791,932 beschrieben. Ein enzymgebundener Immunonachweis für Alphafetoprotein nach der kompetitiven oder der Sandwich-Methode ist in Clinica Chemica Acta, Band 48 (1973), Seiten 15-18, beschrieben.Recently, an important alternative is to label antibodies with radioisotopes or fluorescent chemicals has been developed. This consists of labeling antibodies with an enzyme. One such method is in US Pat U.S. Patents 3,654,090 and 3,791,932. An enzyme-linked immunodetection for alphafetoprotein after competitive or the sandwich method is described in Clinica Chemica Acta, Volume 48 (1973), pages 15-18.

Im Vergleich mit dem Radio-Immunonachweis, bietet die Markierung mit Enzymen eine Reihe von wichtigen Vorteilen. So nimmt z.B. jedes enzym-markierte Molekül in der .Endmischung am Nachweis bzw. an der Messung teil. Bei der Radioisotop-Markierung andererseits nimmt nur ein geringer Teil der markierten MoleküleIn comparison with the radio-immunodetection, the marking offers with enzymes have a number of important advantages. For example, every enzyme-labeled molecule in the final mixture takes part in the detection or participate in the measurement. With radioisotope labeling, on the other hand, only a small fraction of the labeled molecules take up

90981S/0Ö1290981S / 0Ö12

A 41 952 b u - 163A 41 952 b u - 163

27. September 1976September 27, 1976

9IR/"3 IR 9 Q9IR / "3 IR 9 Q

an der eigentlichen Messung teil, da während der Messzeit nur ein sehr kleiner Teil der Radioisotope in der Endmischung zerfällt. Bei der Markierung mit Enzymen nimmt jedes markierte Molekül wiederholt am Nachweis bzw. der Messung teil, da das Enzym viele Substratmoleküle beeinflusst, die dann nachweisbare Endprodukte bilden. Derartige Reaktionen können bis zu 100 mal in der Minute stattfinden, wodurch die Empfindlichkeit erheblich vergrössert wird. Ein Radioisotop zerfällt dagegen nur einmal während der Messung, anschliessend nimmt es am Nachweis nicht mehr teil. Ein enzym-markiertes Reagenz hat ausserdem eine lange Lebensdauer, während die isotopen-markierten Reagenzien laufend zerfallen und dadurch ernsthafte Aufbewahrungsprobleme aufwerfen. Enzym-markierte Reagenzien stellen auch nur minimale Gesundheitsrisiken dar, während beim Umgang mit Radioisotopen und damit markierten Molekülen erhebliche Gesundheitsrisiken auftreten. Schliesslich kann man bei einem Immunonachweis mit enzym-markierten Molekülen eine einfache und relativ billige Ausrüstung verwenden. Im Gegensatz dazu hängt der Erfolg des Radioimmuno-Nachweises von der Effizienz des Zerfallsnachweises und damit von der Qualität einer sehr teuren Nachweisapparatur ab.participate in the actual measurement, since only a very small part of the radioisotopes in the final mixture disintegrates during the measurement time. When labeling with enzymes, each labeled molecule takes part repeatedly in the detection or measurement, since the Enzyme affects many substrate molecules, which then form detectable end products. Such reactions can take up to 100 times per minute, which increases the sensitivity considerably. A radioisotope, on the other hand, decays only once during the measurement, afterwards it no longer takes part in the verification. An enzyme-labeled reagent also has long life, while the isotope-labeled reagents continually disintegrate, causing serious storage problems raise. Enzyme-labeled reagents also pose minimal health risks while handling Considerable health risks arise with radioisotopes and molecules labeled with them. After all, you can with one Immunodetection with enzyme-labeled molecules a simple one and use relatively cheap equipment. In contrast, the success of radioimmuno-detection depends on its efficiency the decay detection and thus on the quality of a very expensive detection apparatus.

Obwohl der Nachweis eines der Hepatitis zuzuordnenden Antigens im Blut einer Person nicht gleichbedeutend ist mit einer Krankheitsgeschichte der Hepatitis, haben Untersuchungen gezeigt, dass dann eine hohe Häufigkeit einer Hepatitis-Erkrankung auftritt, wenn ein Patient Blut erhalten hat, in welchem durch Tests die Gegenwart von der Hepatitis zuzuordnenden Antigenen festgestellt worden ist. Da die Entscheidung, ob bestimmte in einem Blutzentrum erhältliche Blutreserven verwendet werdenAlthough finding an antigen related to hepatitis in a person's blood is not synonymous with a history of the disease hepatitis, studies have shown that a high incidence of hepatitis occurs when a patient has received blood in which tests for the presence of hepatitis-related antigens has been established. Because the decision whether to use certain blood reserves available at a blood center

709816/0012709816/0012

A 41 952 b u - 163A 41 952 b u - 163

27. September 19 76September 27, 19 76

können, oft in relativ kurzer Zeit getroffen werden muss, ist ein empfindlicher, schneller und leicht durchzuführender Übersichtstest für Hepatitis, der ohne teure Apparaturen auskommt, von äusserster Wichtigkeit. Obwohl die verschiedenen in der Vergangenheit für den Nachweis der Hepatitisantigene verwendeten Tests bis zu einem bestimmten Grad zufriedenstellend waren, sind sie doch alle mit einem oder mehreren Nachteilen behaftet.can, often has to be taken in a relatively short time a sensitive, quick and easy-to-perform overview test for hepatitis that does not require expensive equipment, of the utmost importance. Although the different ones used in the past for the detection of hepatitis antigens Tests have been satisfactory to a certain extent, but they all have one or more drawbacks afflicted.

In jedem Jahr sterben Tausende an Hepatitis oder müssen in ein Krankenhaus eingewiesen werden. Man hat lange angenommen, dass der Ausgangspunkt, um diese Krankheit unter Kontrolle zu bringen, darin liegen müsste, eine Technik zur Untersuchung des Blutes zu entwickeln, die weltweit zur Verfügung gestellt werden und einfach und routinemässig ausgeführt werden könnte. Obwohl inzwischen eine ganze Anzahl von derartigen Nachweismethoden vorhanden sind, haben sie doch die Anforderung dieses Idealtests bisher nicht erfüllen können, da sie relativ unempfindlich sind/ mit langen und detaillierten Verfahren verbunden sind, die Verwendung komplizierter, in den meisten hämatologischen Laboratorien nicht ohne weiteres verfügbarer Geräte und Ausrüstungen erfordern oder nur mit Reagenzien durchgeführt werden können, die hochgradig unstabil sind und daher weder über einen längeren Zeitraum aufbewahrt noch ohne Gesundheitsrisiko gehandhabt werden können. Every year thousands die from hepatitis or have to be hospitalized. It has long been believed that in order to get this disease under control, the starting point would have to be to develop a technique for examining the blood that could be made available worldwide and easily and routinely performed. Although a number of such detection methods are now available, they have not yet been able to meet the requirements of this ideal test, as they are relatively insensitive / involve long and detailed procedures, the use of which is more complicated and not readily available in most hematological laboratories Devices and equipment require or can only be carried out with reagents that are highly unstable and therefore cannot be stored for long periods of time or handled without risk to health.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis von der Hepatitis zuzuordnenden Antigenen vorzuschlagen, welches schnell, einfach, genau und routinemässig in Körperflüssigkeiten die Anwesenheit der Antigene feststellt. Diese AufgabeIt is the object of the invention to propose a method for the detection of antigens to be assigned to hepatitis, which quickly, easily, accurately and routinely determines the presence of antigens in body fluids. This task

— 9 —- 9 -

709816/0312709816/0312

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 19 76 - «Γ-September 27, 19 76 - «Γ-

■ ■ 2843829■ ■ 2843829

wird erfindungsgemass durch ein Verfahren, gelöst, welches die folgenden Schritte umfasst:is achieved according to the invention by a method, which the includes the following steps:

(a) Zusammenbringen (Inkubation) der Probe mit einem(a) Bringing (incubating) the sample with a

; unbeweglich an einem unlöslichen Körper gehaltenen, mit dem Hepatitis-Antigen reaktionsfähigen Antikörper, wobei sich bei dem Zusammenbringen eine Bindung zwischen Antikörper und in der Probe vorliegendem Antigen ausbildet und ein unlöslicher Körper mit daran gebundenem Antigen entsteht, falls Hepatitis-Antigene in der Probe vorliegen,; held immovably on an insoluble body, antibodies reactive with the hepatitis antigen, which when brought together a bond between Antibodies and antigen present in the sample forms and an insoluble body with bound to it Antigen is produced if there are hepatitis antigens in the sample,

(b) Trennen des unlöslichen Körpers von jeglicher nichtgebundenen Substanz, (b) separating the insoluble body from any unbound substance,

(c) Zusammenbringen (Inkubation) des unlöslichen Körpers mit einer markierte, mit den Hepatitis-Antigenen reaktionsfähige Antikörper enthaltenden Lösung, wobei die markierten Antikörper mittels eines Enzyms markiert sind, welches derart auf ein Substrat einwirken kann, dass ein nachweisbares Reaktionsprodukt entsteht, und wobei das Zusammenbringen derart geführt wird, dass die markierten Antikörper mit jedem im Schritt (a)mit einem Antikörper an dem unlöslichen Körper gebundenen Antigen eine Bindung eingehen können,(c) Bringing together (incubating) the insoluble body with a labeled solution containing antibodies reactive with the hepatitis antigens, the labeled antibodies are labeled by means of an enzyme which can act on a substrate in such a way that that a detectable reaction product is formed, and wherein the bringing together is carried out such that the labeled antibodies with each in step (a) with an antibody can bind to the insoluble body bound antigen,

Cd) Trennen des unlöslichen Körpers von der die enzym-markierten Antikörper enthaltenden Lösung, um jeglichen ungebundenen, markierten Antikörper davon zu entfernen,Cd) Separating the insoluble body from that of the enzyme-labeled Antibody-containing solution to remove any unbound, labeled antibody therefrom,

- 10 -- 10 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

(e) Zusammenbringen (Inkubation) des unlöslichen Körpers mit einer Substratlösung, auf die das Enzym des markierten Antikörpers einwirkt und dadurch eine chemische Veränderung des Substrates herbeiführt, bei welcher ein nachweisbares Reaktionsprodukt gebildet wird,(e) Bringing (incubating) the insoluble body into contact with a substrate solution to which the enzyme of the labeled Antibody acts and thereby brings about a chemical change in the substrate, in which a detectable reaction product is formed,

(f) Nachweisen jeglichen in der Lösung vorliegenden Reaktionsproduktes, um die Anwesenheit von Hepatitis-Antigenen nachzuweisen.(f) detecting any reaction product present in the solution, to detect the presence of hepatitis antigens.

Weitere bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemässen Verfahrens sind Gegenstand der Unteranspriiche.Further preferred embodiments of the method according to the invention are the subject of the subclaims.

Die Erfindung stellt also einen direkten Immunonachweis für der Hepatitis zuzuordnende Antigene dar, wobei das "Sandwich"-Prinzip angewandt wird. Bei der Durchführung des Nachweises wird das nachzuweisende Antigen zwischen mit ihm reagierenden Antikörperschichten eingelagert. Eine Antikörperschicht ist mit einem Enzym markiert. Die andere Antikörperschicht ist kovalent an einen unlöslichen Körper gebunden. Das Enzym wird mit einem chemischen Substrat zusammengebracht, welches in Anwesenheit des Enzym-Katalysators eine chemische Veränderung erfährt und dabei ein Reaktionsprodukt bildet. Die Gegenwart des Hepatitis-Antigens wird durch die Gegenwart des Reaktionsproduktes nachgewiesen. The invention thus represents direct immunodetection for antigens to be assigned to hepatitis, using the "sandwich" principle is applied. When performing the detection, the antigen to be detected is between those reacting with it Antibody layers embedded. An antibody layer is labeled with an enzyme. The other antibody layer is covalently bound to an insoluble body. The enzyme is brought into contact with a chemical substrate contained in The presence of the enzyme catalyst undergoes a chemical change and thereby forms a reaction product. The presence of the hepatitis antigen is detected by the presence of the reaction product.

Gemäss der Erfindung ist auch vorgesehen, eine Nachweiseinheit oder ein Nachweisset für Hepatitis-Antigene zu schaffen. Die drei wichtigsten Reaktionspartner des Testsets sind der unlösliche, polymere feste Körper, an welchen mit Hepatitis-AntigenenAccording to the invention, a detection unit is also provided or to create a detection kit for hepatitis antigens. The three most important reaction partners of the test set are the insoluble, polymeric solid bodies to which hepatitis antigens are attached

- 11 -- 11 -

7098 1 5/08 1 27098 1 5/08 1 2

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 . - VT - 2643829September 27, 1976. - VT - 2643829

reaktive Antikörper gebunden sind, die enzym-markierten Hepatitis-Antikörper und ein Enzymsubstrat, welches unter dem katalytischen Einfluss des Enzyms chemisch verändert wird und dabei ein nachweisbares Endprodukt bildet. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Enzym, mit welchem der sich mit dem Antigen verbindende Antikörper markiert ist, eine Alkali-Phosphatase und das Enzymsubstrat p-Nitrophenylphosphat. Das Testset kann auch Kontrollseren enthalten, u.a. bezüglich der Anwesenheit von Hepatitits-Antigenen negative, schwach positive und stark positive Seren, eine Lösung von Pferdeglobulin, welches der Testprobe zugesetzt wird, um die Häufigkeit nichtspezifischer Reaktionen zwischen der Testprobe undreactive antibodies are bound to the enzyme-labeled hepatitis antibodies and an enzyme substrate which is chemically changed under the catalytic influence of the enzyme and thereby forms a verifiable end product. In a preferred embodiment of the invention, the enzyme with which the antibody that binds to the antigen is labeled, an alkali phosphatase and the enzyme substrate p-nitrophenyl phosphate. The test set can also contain control sera, e.g. negative for the presence of hepatitis antigens, weak positive and strongly positive sera, a solution of horse globulin, which is added to the test sample to reduce the frequency of non-specific reactions between the test sample and

(herdem unlöslichen, polymeren Körper\abzusetzen, einen Puffer, um den pH-Wert der Enzymsubstratlösung in dem für die Reaktion günstigsten Bereich zu halten, und eine Vielzahl von Fläschchen, deren Grosse so gewählt ist, dass der Kontakt zwischen dem unlöslichen Körper und den kleinen Mengen der beim Zusammenbringen verwendeten Reaktionspartner gefördert wird. Wenn Alkali-Phosphatase und p-Nitrophenylphosphat als Enzym-Enzymsubstrat-System verwendet werden, ist der Puffer eine wässrige 0,028 molare Na2CO3- und 0,001 molare Mg++-Lösung. ( A buffer to keep the pH of the enzyme substrate solution in the most favorable range for the reaction, and a large number of vials, the size of which is selected so that contact between the insoluble body and the When alkali phosphatase and p-nitrophenyl phosphate are used as the enzyme-enzyme substrate system, the buffer is an aqueous 0.028 molar Na 2 CO 3 and 0.001 molar Mg ++ solution.

Im Rahmen der Erfindung wird ein immunologisch aktiver, gereinigter 'Hepatitis-Antikörper zur Verwendung bei Immunonachweisen vorgeschlagen, der mit einem Funktional-Enzym, wie beispielsweise Alkali-Phosphatase, konjugiert, d.h. chemisch gebunden ist.In the context of the invention, an immunologically active, purified 'Suggested hepatitis antibodies for use in immunodetection using a functional enzyme such as Alkali phosphatase, conjugated, i.e. chemically bound.

Im Rahmen der Erfindung wird weiterhin ein scheibenförmiger, unlöslicher Körper oder eine Matrix für die Verwendung beiIn the context of the invention, a disk-shaped, insoluble body or matrix for use in

- 12 -- 12 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

Immunonachweisen vorgeschlagen. Die Matrix weist eine Vielzahl von mit Proteinen reagierenden Gruppen auf, die gleichmässig auf ihrer Oberfläche angelagert oder "aufgepfropft" sind. Gereinigte Hepatitis-Antikörper sind mit diesen reaktiven Gruppen kovalent gebunden und bilden so eine äussere Schicht von Hepatitis-Antikörpern.Immunodetections suggested. The matrix has a multitude of groups which react with proteins and which are evenly attached or "grafted" onto their surface. Purified hepatitis antibodies are covalently bound to these reactive groups and thus form an outer layer of hepatitis antibodies.

Bei dem Immunonachweis wird der unlösliche Körper in ein Fläschchen mit flachem Boden eingelegt und mit einer flüssigen Probe gerade bedeckt. Damit der Test reproduzierbar wird, ist es wichtig, dass die Antigene in der Probe mit der gesamten Oberfläche der mit Antikörpern beschichteten Scheibe in Berührung kommen. Der Erfinder hat festgestellt, dass die Verwendung einer flachen oder an der Oberfläche eben ausgebildeten Scheibe zu einem Empfindlichkeitsverlust geführt hat. Daher sind die zwei gegenüberliegenden Oberflächen der Scheibe erfindungsgemäss verformt, insbesondere ungleichmässig verformt, um den Kontakt der Scheibenoberfläche mit dem Boden des Fläschchens oder Gläschens gering zu halten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Oberflächen der Scheibe waffelähnlich ausgebildet, in dem man die Scheibe vor der Anlagerung der Antikörper durch Pressen laufen lässt.In the immunodetection, the insoluble body is placed in a flat-bottomed vial and filled with a liquid one Sample just covered. In order for the test to be reproducible, it is important that the antigens in the sample are compatible with the whole Come into contact with the surface of the antibody-coated disc. The inventor has found that the use a flat or flat disk on the surface has led to a loss of sensitivity. Therefore are the two opposite surfaces of the disc according to the invention deformed, in particular irregularly deformed, to the contact of the disc surface with the bottom of the vial or to keep the glass small. In a preferred embodiment of the invention, the surfaces of the Wafer-like disc in which the disc is pressed before the antibodies are deposited.

Die beschriebenen Ausführungsbeispiele sind auf den Nachweis des Antigens gerichtet, das der Hepatitis B zuzuordnen ist. Es gibt jedoch keinen Grund, warum das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht auch zum Nachweis von Antigenen verwendet werden könnte, die anderen Typen der Hepatitis zuzuordnen sind, falls man die Antigene dieser Hepatitis-Typen erst einmal identifiziert hat.The exemplary embodiments described are aimed at detecting the antigen that can be assigned to hepatitis B. However, there is no reason why the method of the present invention cannot also be used for the detection of antigens could be assigned to the other types of hepatitis, once the antigens of these types of hepatitis are identified Has.

- 13 -- 13 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 b u - 163A 41 952 b u - 163

27. September 1976September 27, 1976

Wenn man, wie erfindungsgemäss vorgeschlagen, ein Testset mit den notwendigen Reagenzien, den Reaktxonsgefässen und dergleichen und zusätzlich mit Standardkontrollproben, nämlich bezüglich der Hepatitis-Antigene -negativen, schwach und stark positiven Proben, ausrüstet, kann man damit vorteilhaft Fehler bei der Durchführung des Testes weitgehend ausschliessen. Ausserdem wird dadurch die Genauigkeit und Empfindlichkeit des Tests erhöht. Besonders vorteilhaft ist dabei, wenn das Testset Laborausrüstung enthält, mit welcher die einzelnen Schritte des Verfahrens standardisiert werden können»If one, as proposed according to the invention, a test set with the necessary reagents, the reaction vessels and the like and additionally with standard control samples, namely with regard to the hepatitis antigens -negatives, weak and strong positive samples, one can thus advantageously largely rule out errors when carrying out the test. It also increases the accuracy and sensitivity of the test. It is particularly advantageous if the test set contains laboratory equipment with which the individual steps the process can be standardized »

Besonders vorteilhaft ist es, wenn bei dem Verfahren ein Hepatitis-Antikörper-Enzym-Komplex verwendet wird, in dem sowohl der Antikörper als auch das Enzym ihre interessierenden chemischen Eigenschaften behalten. Die erfindungsgemäss vorgeschlagenen Komplexe können lange aufgehoben werden, ohne dass sie ihre immunologischen oder katalytischen Eigenschaften verlieren; ausserdem sind sie gegenüber den der Hepatitis zugeordneten Antigenen hochgradig reaktionsfreudig.It is particularly advantageous if a hepatitis-antibody-enzyme complex is used in the method is used in which both the antibody and the enzyme have their chemical of interest Retain properties. The complexes proposed according to the invention can be abolished for a long time without them lose their immunological or catalytic properties; in addition, they are compared to those associated with hepatitis Antigens highly reactive.

Vorzugsweise werden an die Hepatitis-Antikörper Enzyme gebunden, die eine Reaktion mit hoher Reaktionsgeschwindigkeit katalysieren können, so dass die Konzentration des Endproduktes mit Hilfe eines photometrischen Nachweisgerätes genau bestimmt werden kann.Preferably, enzymes are bound to the hepatitis antibodies, which catalyze a reaction with a high reaction rate so that the concentration of the end product is precisely determined with the help of a photometric detection device can be.

Die unlösliche Matrix trägt erfindungsgemäss eine hohe Konzentration von gereinigten, über die gesamte Oberfläche gleichmassig verteilten Hepatitis-Antikörpern. Diese sind an die Matrix gebunden, so dass sie weder durch mechanische noch durchAccording to the invention, the insoluble matrix has a high concentration of purified hepatitis antibodies evenly distributed over the entire surface. These are to the Matrix bound so that they are neither mechanical nor by

- 14 -- 14 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

27. September 1976September 27, 1976

chemische Kräfte, denen sie während des Verfahrens unterworfen sein mögen, von der Stelle bewegt werden können. Die Anbindung an die Matrix ist dabei so gewählt, dass die Funktion des Antikörpers erhalten bleibt, d.h., dass er weiterhin an der immunologischen Reaktion teilnehmen kann und durch die Anbindung an die Matrix immuno-chemisch unverändert bleibt.chemical forces to which they are subjected during the procedure may be, can be moved from the place. The connection to the matrix is chosen so that the function of the Antibody is retained, i.e. that it can continue to participate in the immunological reaction and through the attachment to the matrix remains immunochemically unchanged.

Die nachfolgende Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung dient im Zusammenhang mit der Zeichnung der näheren Erläuterung. Es zeigen:The following description of preferred embodiments of the invention is used in conjunction with the drawing for more detailed information Explanation. Show it:

Fig. 1 ein Flussdiagramm der einzelnen Schritte des erfindungsgemässen Verfahrens;1 shows a flow chart of the individual steps of the method according to the invention;

Fig. 2 eine perspektivische Ansicht eines unlöslichen Körpers gemäss der Erfindung;Fig. 2 is a perspective view of an insoluble body according to the invention;

Fig. 3 eine Ansicht eines Reaktionsgefässes während der ersten Phase des erfindungsgemässen Verfahrens; 3 shows a view of a reaction vessel during the first phase of the method according to the invention;

Fig. 4 eine Ansicht eines Reaktionsgefässes während der zweiten Phase des erfindungsgemässen Verfahrens; 4 shows a view of a reaction vessel during the second phase of the method according to the invention;

Fig. 5 eine Ansicht eines Reaktionsgefässes während der dritten Phase des erfindungsgemässen Verfahrens ; und5 shows a view of a reaction vessel during the third phase of the method according to the invention ; and

Fig. 6 eine schematische Darstellung der Sandwich-Struktur, die während des erfindungsgemässen Verfahrens aufgebaut wird.6 shows a schematic representation of the sandwich structure, which is built up during the process according to the invention.

- 15 -- 15 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 - ^f- 2643829Sept. 27, 1976 - ^ f- 2643829

Die Erfindung ist im folgenden zunächst allgemein beschrieben und im folgenden dann detailliert. Das erfindungsgemässe Verfahren zum Nachweis von der Hepatitis zuzuordnenden Antigenen wird in vier nacheinanderfolgenden Schritten durchgeführt, wie in Fig. 1 schematisch dargestellt ist.The invention is first described in general below and then detailed below. The method according to the invention for the detection of antigens to be assigned to hepatitis is carried out in four successive steps, such as in Fig. 1 is shown schematically.

Im ersten Schritt des erfindungsgemässen Verfahrens lässt man die auf einem unlöslichen Körper 10 (Fig. 2) unbeweglich angeordneten Antikörper mit dem im Testserum befindlichen Antigen reagieren, wie dies in Fig. 3 dargestellt ist. Durch diese Reaktion werden die Antigene unbeweglich an den unlöslichen Körper gebunden, so dass bei der Reaktion mit einem enzymmarkierten Antikörper beim nächsten Verfahrensschritt, wie in Fig. 4 gezeigt, auch der markierte Antikörper unbeweglich gebunden wird. Wie in Fig. 5 dargestellt, wird das Enzym mit einem geeigneten Substrat zusammengebracht, welches unter dem Einfluss des Enzymes reagiert und dabei eine Farbänderung erfährt. Diese Farbänderung dient als Nachweis für die Gegenwart von der Hepatitis zuzuordnenden Antigenen in der Probe. Der letzte Verfahrensschritt besteht darin, den Grad der Verfärbung festzustellen und diesen Wert mit einer Standardprobe zu vergleichen.In the first step of the inventive method one leaves the antibodies arranged immovably on an insoluble body 10 (FIG. 2) with the antigen in the test serum react as shown in FIG. 3. This reaction makes the antigens immobile on the insoluble ones Body bound, so that when reacting with an enzyme-labeled antibody in the next process step, as in 4, the labeled antibody is also immovably bound. As shown in Fig. 5, the enzyme is with brought together a suitable substrate, which reacts under the influence of the enzyme and undergoes a color change in the process. This change in color serves as evidence of the presence of the hepatitis-related antigens in the sample. Of the The final step is to determine the degree of discoloration and this value with a standard sample to compare.

Das erfindungsgemässe Nachweisset enthält alle für den oben beschriebenen Test nötigen Materialien und ist für 100 Tests bestimmt. Grössere und kleinere Sets können selbstverständlich dadurch hergestellt werden, dass die Menge der Reaktionspartner proportional vergrössert oder verkleinert wird. Das Set wird üblicherweise in einem Behälter vertrieben, der die Reaktionspartner und die Kontrollsubstanzen enthält, die bis zum Gebrauch The detection set according to the invention contains all of the above required materials and is intended for 100 tests. Larger and smaller sets can of course be made can be produced by proportionally increasing or decreasing the amount of reactants. The set will usually sold in a container containing the reactants and control substances until use

- 16 -- 16 -

70 9815/081270 9815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 - >β" -September 27, 1976 -> β "-

bei Temperaturen von 2 bis 8 C aufbewahrt werden sollen. Ausserdem sind Gläschen oder Fläschchen in einer Menge vorgesehen, die für 100 Tests ausreicht.should be kept at temperatures of 2 to 8 C. In addition, jars or bottles are provided in a quantity which is sufficient for 100 tests.

100 bis 105 Polymerscheiben mit waffelähnlichen Oberflächen, wie sie in Fig. 2 dargestellt sind, sind beigefügt. Sie tragen eine Schicht von Antikörpern, die mit Hepatitis-Antigenen reagieren können; die Antikörperschicht ist auf der Oberfläche der Scheiben gebunden und lyophilisiert. Die genaue Natur dieser unlöslichen, festen Scheiben und die Art und Weise, wie sie hergestellt werden, werden weiter unten erläutert.100 to 105 polymer discs with waffle-like surfaces, as shown in Fig. 2 are attached. They carry a layer of antibodies that react with hepatitis antigens can; the antibody layer is bound and lyophilized on the surface of the discs. The exact nature of this insoluble solid disks and how they are made are discussed below.

Der zweite Reaktionspartner in dem Set umfasst eine Probe einer Verbindung von Hepatitis-Antikörpern mit Alkaliphosphatase. Die genaue Natur dieses Reaktionspartners, das Verfahren zur Herstellung und andere alternativ verwendbare Reagenzien werden weiter unten beschrieben. Dieser Reaktionspartner wird als gebrauchsfertige Lösung geliefert.The second reactant in the kit comprises a sample of a compound of hepatitis antibodies with alkaline phosphatase. The exact nature of this reactant, method of preparation, and other alternatively useful reagents are discussed described below. This reactant is supplied as a ready-to-use solution.

Ein dritter, in dem erfindungsgemässen Testset enthaltener Reaktionspartner besteht in 400 mg eines p-Nitrophenylphosphat-Enzym-Substrates. Diese Substanz ist in pulvriger Form stabil, wird jedoch relativ unstabil, wenn sie in einem Puffer aufgelöst ist, um eine Lösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml zu bilden. Daher muss die Lösung jedesmal unmittelbar vor der Verwendung hergestellt werden.A third one contained in the test set according to the invention Reaction partner consists of 400 mg of a p-nitrophenyl phosphate enzyme substrate. This substance is stable in powder form, but becomes relatively unstable when dissolved in a buffer is to form a solution with a concentration of 1 mg / ml. Therefore, the solution must always be immediately before the Use to be made.

Die anderen während des erfindungsgemässen Verfahrens verwendeten Materialien umfassen eine bestimmte Menge von Pferdeglobulin, Probenverdünnung, verschiedenen Pufferlösungen und verschiedenen Waschlösungen. Die exakte Natur und die HerstellungThe others used during the process of the invention Materials include a specific amount of equine globulin, sample dilution, various buffer solutions, and various Washing solutions. The exact nature and manufacture

- 17 -- 17 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 b
u - 163
A 41 952 b
u - 163

27. September 1976 -YT- 9RA ^89QSeptember 27, 1976 -YT- 9RA ^ 89Q

dieser Reagenzien und Materialien werden weiter unten beschrieben. of these reagents and materials are described below.

A. Herstellung des Antikörpers A. Preparation of the antibody

Um das erfindungsgemässe Verfahren durchführen zu können, muss man Antikörper haben, die mit dem Antigen oder den Aritigenen reagieren, die der Hepatitis zuzuordnen sind. Es wird darauf hingewiesen, dass ein derartiger Antikörper existiert und die vorliegende Erfindung daher nicht auf die Verwendung eines bestimmten Antikörpers beschränkt werden soll.In order to be able to carry out the method according to the invention, must you have antibodies that react with the antigen or the aritigens that can be assigned to hepatitis. It will care pointed out that such an antibody exists and the present invention therefore does not refer to the use of one specific antibody should be restricted.

Ein reaktionsfähiger Antikörper kann dadurch präpariert werden, dass Blut von einem Gasttier gereinigt wird, dem eine bekannte Antigenprobe injiziert worden ist.. Ein mit einem Hepatitis-Antigen reagierender Antikörper kann im wesentlichen mit dem im britischen Patent 1,387,625 beschriebenen Verfahren präpariert werden.A reactive antibody can be prepared by purifying blood from a host animal that a known Antigen sample has been injected .. One with a hepatitis antigen reactive antibody can be prepared essentially by the method described in British Patent 1,387,625 will.

Die Präparation von Hepatitis-Antikörpern hängt zunächst einmal davon ab,Blut zu erhalten, welches bekanntermaßen positiv bezüqLichfder Hepatitis zuzuordnendenAntigenenist. Daher müssen Blutproben aus verschiedenen Quellen zuerst einmal auf ihre Eignung untersucht werden, die Präparation immunospezifischer, gereinigter Antikörper gemäss der Erfindung zu erlauben.The preparation of hepatitis antibodies depends first of all from receiving blood which is known to be positive antigens to be assigned to hepatitis. Therefore must Blood samples from different sources on hers first Suitability to be examined to allow the preparation of immunospecific, purified antibodies according to the invention.

Ein Blutgefässegment mit Blut, von dem man glaubt, daß es bezüglich Hepatitis-Antigenenpositiv ist, wird bei einer Temperatur von 2 bis 8°C in einer aufrechten Position gehalten, damit sich die Blutzellen in der unteren Hälfte absetzen. Das PlasmaA segment of blood vessels with blood believed to relate to Hepatitis antigen positive is kept in an upright position at a temperature of 2 to 8 ° C so the blood cells settle in the lower half. The plasma

- 18 -- 18 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

wird von den Zellen abgetrennt und der Titer des unverdünnten Plasmas und einer im Verhältnis 1:16 verdünnten Probe in, normaler Salzlösung wird mit Hilfe der bekannten Technik Ser~~ Counterelektrophorese (CEP) gegen einen Standardantikörper bestimmt. Wenn sowohl die unverdünnte Plasmaprobe als auch die im Verhältnis 1:16 verdünnte Probe positiv sind, wird das Blut als brauchbar für die Präparierung von gereinigten Antikörpern angesehen. Diese Präparierung wird im folgenden beschrieben.is separated from the cells and the titer of the undiluted plasma and a sample diluted 1:16 in, normal saline solution is ser ~~ Counterelectrophoresis (CEP) determined against a standard antibody. If both the undiluted plasma sample and the If the sample diluted 1:16 are positive, the blood is considered usable for the preparation of purified antibodies viewed. This preparation is described below.

Teil der aus dem Blut isolierten Antigene wird entweder zur Anregung der Antikörperproduktion in den Gasttieren verwendet oder zur Reinigung der von dem Tier produzierten Antikörper. Bevor die Antigene zu einem der angegebenen Zwecke verwendet werden können, müssen sie einem vorherigen Isolierungsprozess unterworfen werden.Part of the antigens isolated from the blood is either used to stimulate antibody production in the host animals or to purify the antibodies produced by the animal. Before using the antigens for any of the specified purposes they must be subjected to a prior isolation process.

Das Plasma wird in einen sterilen Vakuumbehälter gebracht und durch Zugabe einer 5 molaren CaCl^-Lösung ausgeklumpt, wobei 0,75 ml CaCl auf 200 ml Plasma zugegeben werden. Diese Lösung wird dann etwa eine Stunde lang in einem Wasserbad bei etwa 37°C gehalten, bis ein Klumpen geformt ist. Nachdem sich ein fester Klumpen gebildet hat, wird das Plasma bei -20°C gefroren und bei 2 bis 8°C wieder aufgetaut, um die Schrumpfung oder Retraktion des Klumpens zu ermöglichen. Das Serum wird von dem Klumpen getrennt und falls nötig gefiltert und ist dann fertig für die Präparierung eines Hepatitis-Antigen-Klümpchens oder -pellets für die Immunisierung oder für die Verwendung in immuno-absorbierenden Kolumnen.The plasma is placed in a sterile vacuum container and clumped out by adding a 5 molar CaCl ^ solution, with 0.75 ml CaCl are added to 200 ml plasma. This solution is then placed in a water bath for about an hour at about Maintained 37 ° C until a lump is formed. After a solid lump has formed, the plasma is frozen at -20 ° C and thawed again at 2 to 8 ° C to allow the lump to shrink or retract. The serum will separated from the lump and, if necessary, filtered and is then ready to prepare a hepatitis antigen clot or pellets for immunization or for use in immuno-absorbent columns.

- 19 -- 19 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 b .A 41 952 b.

u - 163u - 163

27. September 1976 . - *0* - 2643829September 27, 1976. - * 0 * - 2643829

(1) Zubereitung des Antigen-Pellets oder Antigenklümpchens für die Immunisierung (1) Prepare the antigen pellet or antigen glob for immunization

Hepatitis positive Seren, die dem oben geschilderten Prozess unterworfen waren, werden bei 10000 Upm 30 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert. Der obenauf schwimmende Teil oder der überstand wird nach dem Zentrifugieren in Ultrazentrifugen-Röhrchen verteilt und beispielsweise in einer Beckman L2-65B Ultra-. zentrifuge bei 40000 bis 50000 Upm 4-20 Stunden bei 4°C zentrifugiert. Der überstand in jedem Röhrchen wird abgegossen und weggeworfen; der klümpchenförmige Rückstand oder das Pellet, welches die Antigene enthält, wird vorweg mit einer normalen (0,15 molaren) Salzlösung ausgewaschen.Hepatitis positive sera following the process outlined above are centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C. The part floating on top or the protruding part is distributed in ultracentrifuge tubes after centrifugation and, for example, in a Beckman L2-65B Ultra-. centrifuge at 40,000 to 50,000 rpm for 4-20 hours at 4 ° C. The supernatant in each tube is poured off and thrown away; the lumpy residue or pellet containing the antigens is treated in advance with a normal Washed out (0.15 molar) saline solution.

Eine kleine Menge einer normalen Salzlösung wird dann jedem Zentrifugenröhrchen zugesetzt und der Inhalt einer Sonikatiön· unterworfen, um das Klümpchen aufzubrechen. Die Suspensionen in den Sonikator-Röhrchen werden dann zusammengegeben und gleichmässig in saubere, mit normaler Salzlösung gefüllte Röhrchen verteilt. Diese Lösung wird wieder in der Beckman L2-65B-Zentrifuge bei 40000 bis 50000 Upm 4-20 Stunden bei 4°C zentrifugiert, wie es oben beschrieben ist.A small amount of normal saline is then added to each centrifuge tube and the contents of a sonication subject to break up the lump. The suspensions in the sonicator tubes are then combined and evenly distributed in clean tubes filled with normal saline solution. This solution is again in the Beckman L2-65B centrifuge centrifuged at 40,000 to 50,000 rpm for 4-20 hours at 4 ° C as described above.

Der in dem voranstehenden Absatz beschriebene Vorgang kann 5-mal oder öfter wiederholt werden.The process described in the previous paragraph can To be repeated 5 times or more.

Das Klümpchen- oder Pelletmaterial wird nach dem Entfernen des Überstandes aus jedem Zentrifugierröhrchen in einer möglichsi kleinen Menge einer normalen Salzlösung zusammengegeben. Eine Probe wird mit einer Standard-Hepatitis-Antikörper-Probe ver-The lump or pellet material is placed in a possible after removing the supernatant from each centrifuge tube a small amount of normal saline solution. A sample is mixed with a standard hepatitis antibody sample

- 20 -- 20 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 - >θ-- 2BA3829September 27, 1976 -> θ-- 2BA3829

glichen. Wenn sich bei der Counterelektrophorese (CEP) ein Pellet-Titer von 1:25 oder höher ergibt, kann das Pellet oder Klümpchen für die Immunisierung verwendet werden. Das zusammengegebene Antigenklümpchen kann in gleichgrosse 3 ml-Mengen geteilt und bei -20°C für den zukünftigen Gebrauch eingefroren werden.resembled. If counterelectrophoresis (CEP) shows a pellet titer of 1:25 or higher, the pellet may or Lumps are used for immunization. The combined Antigen clumps can be divided into 3 ml equal amounts and frozen at -20 ° C for future use will.

(2) Herstellung und Vorreinigung der Hepatitis-Antikörper (2) Production and pre-purification of the hepatitis antibodies

Eine Probe des in der oben beschriebenen Weise präparierten Antigenklümpchens oder -pellets wird am Morgen der Immunisierung zu einer gleichen Menge eines kompletten FREUND-Adjuvans zugegeben, und eine Emulsion wird entsprechend den den Fachleuten geläufigen Verfahren zubereitet. Das Antigen wird dann einem Gasttier, z.B. einem Pferd in der an sich bekannten Weise injiziert, um die Produktion von Hepatitis-Antikörpern anzuregen. Den immunisierten Pferden wird Blut abgenommen oder sie werden einer Plasmapherese unterworfen, wobei bekannte Techniken angewandt werden. Alternativ oder zusätzlich können Zubereitungen ohne Adjuvans bei anderer Zufügung der Immunisierungsmittel verwendet werden.A sample of the antigen clot or pellet prepared as described above is taken on the morning of immunization to an equal amount of a complete FREUND adjuvant is added and an emulsion is prepared according to methods known to those skilled in the art. The antigen will then a host animal, e.g. a horse, in the manner known per se, in order to stimulate the production of hepatitis antibodies. The immunized horses are blood drawn or they are subjected to plasmapheresis, known Techniques are applied. Alternatively or in addition, preparations without adjuvant can be used with the addition of the immunizing agents in a different manner be used.

Das abgenommene Blut muss zur Isolierung der Hepatitis-Antikörper vor dem endgültigen Immuno-Absorptions-Reinigungsschritt behandelt werden. Diese Vorwegreinigung wird in drei Schritten ausgeführt. Zuerst wird das Plasma von dem Gasttier rekalzifiziert. Dann wird das Serum mit einer ausreichenden Menge eines normalen menschlichen Plasmas (NHP) gemischt, um andere als der Hepatitis zugeordnete Antikörper dadurch auszufällen, dass die Bildung unlöslicher Antigen-Antikörper-Komplexe ein-The collected blood must be used for isolation of the hepatitis antibodies prior to the final immuno-absorption purification step be treated. This preliminary cleaning is carried out in three steps. First, the plasma is recalcified from the host animal. Then the serum is mixed with a sufficient amount of normal human plasma (NHP) to prevent others than to precipitate antibodies associated with hepatitis by the fact that the formation of insoluble antigen-antibody complexes

- 21 -- 21 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 - >Γ - 2643829September 27, 1976 -> Γ - 2643829

is-is-

geleitet wird. Das absorbierte Antiserum wird mit Hilfe der CEP auf Hepatitis-Antikörper untersucht. Schliesslich werden die mit den Hepatitis-Antigenen reagierenden Antikörper mit Ammoniumsulfat ausgefällt. Dieses Material kann bis zum Gebrauch eingefroren werden.is directed. The absorbed antiserum is with the help of the CEP tested for hepatitis antibodies. Eventually be the antibodies reacting with the hepatitis antigens are precipitated with ammonium sulfate. This material can be used up to be frozen.

(3) Herstellung von Aktivkohle-Immunoabsorber-Kolumnen (3) Production of Activated Carbon Immunoabsorbent Columns

Zur Zubereitung des gereinigten, zur Produktion des erfindungsgemässen Reaktionspartners oder Reagenz verwendeten Antikörpers wird der in der vorbeschriebenen Weise gewonnene Hepatitis-Antikörper einem immunospezifisehen Extraktionsprozess unterzogen. Zur allgemeinen Diskussion dieses Verfahrens wird auf das britische Patent 1,387,625 (Bradish et al) vom 19.März 1975 verwiesen, welches den Titel trägt "Immunospezifische Trennung von Antigenen und Antikörpern". Durch die Nennung dieser Patentschrift wird deren Offenbarung in die vorliegende Anmeldung übernommen.For the preparation of the purified, for the production of the inventive Reaction partner or reagent used antibody is the hepatitis antibody obtained in the manner described above subjected to an immunospecific extraction process. For a general discussion of this procedure, see British Patent 1,387,625 (Bradish et al) dated March 19, 1975 referenced, which is entitled "Immunospecific Separation of Antigens and Antibodies". By mentioning this patent specification their disclosure is incorporated into the present application.

Im allgemeinen nützt der in der vorliegenden Erfindung benutzte Reinigungsprozess die Fähigkeit der mit Hepatitis- Antigenen reagierenden Antikörper aus, mit diesen Antikörpern Komplexe zu bilden. Diese Komplexbildung führt zum Ausschluss anderer fremder Antikörper und Proteine, die in den aus dem entnommenen Blut gewonnenen Antikörper-Proben unweigerlich anwesend sind.In general, the purification process used in the present invention utilizes the ability of those with hepatitis antigens reacting antibodies to form complexes with these antibodies. This complex formation leads to the exclusion of others foreign antibodies and proteins that are inevitably present in the antibody samples obtained from the blood drawn.

Eine Kolumne wird dadurch hergestellt, dass vorgewaschene, sorbierende Kohle mittels bekannter Techniken in ein Glas- oder Plastikrohr gepackt wird. Eine Vereinigung von Antigenen wird aus mindestens sechs verschiedenen Serum-Proben bereitet,umA column is created by pre-washed, sorbent charcoal is packed into a glass or plastic tube using known techniques. An association of antigens becomes prepared from at least six different serum samples

- 22 -- 22 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976September 27, 1976

eine Mischung verschiedener Hepatitis-Antigene zu erhalten. Diese Vereinigung wird dann auf eine Protein-Konzentration zwischen 1 und 2 mg Protein pro ml Lösungsmittel eingestellt, wobei dies mit Hilfe von UV-Absorption bestimmt wird.get a mixture of different hepatitis antigens. This association is then applied to a protein concentration set between 1 and 2 mg protein per ml of solvent, this being determined with the aid of UV absorption.

um das Antigen an die Kohle zu binden, wird diese verdünnte Lösung mit einer Flussrate von etwa 300 bis 1000 ml pro Stunde eingeführt. Etwa 75 mg Protein sollten pro Gramm Aktivkohle (Holzkohle) in der Kolumne angelagert werden. Der Ausfluss der Kolumnen wird in 500 ml grossen gleichen Teilen aufgefangen, von denen jeder auf den Proteingehalt geprüft wird. Die Kolumne kann als mit dem Antigen gesättigt angesehen werden, wenn der Ausfluss einen Proteingehalt aufweist, der etwa dem des Ausgangsiriaterials gleich ist. Das Bett wird durch einen durch die Kolumne fliessenden Strom von mit Phosphat gepufferter Salzlösung (phosphate buffered saline PBS) gewaschen, bis der Ausfluss bei einer Wellenlänge von 280 nm keine wesentliche nachweisbare Absorption mehr zeigt.in order to bind the antigen to the charcoal, it is diluted Solution introduced at a flow rate of about 300 to 1000 ml per hour. Around 75 mg of protein should be per gram of activated charcoal (Charcoal) are deposited in the column. The outflow from the columns is collected in equal parts of 500 ml, each of which is checked for protein content. The column can be viewed as saturated with the antigen when the discharge has a protein content approximately equal to that of the starting material. The bed is through one the column flowing stream of phosphate buffered saline (PBS) washed until the Outflow at a wavelength of 280 nm no longer shows any significant detectable absorption.

Um jegliche lose angelagerte Proteine auszuwaschen, wird das Kohlebett mit frisch zubereiteter 5-molarer Natriumjodidlösung gespült, die 200 mg Natriumthiosulfat pro Liter enthält. Anschliessend wird die Natriumjodidlösung aus der Kolumne gespült, indem eine ausreichende Menge PBS durch diese geschickt wird. Nach einer letzten Waschung des Bettes mit PBS, welches 1 mg pro ml Natriumazid (Schutzmittel) enthält, kann die Kolumne bei einer Temperatur von 2 bis 8°C bis zum Gebrauch aufbewahrt werden.In order to wash out any loosely attached proteins, the coal bed is filled with freshly prepared 5 molar sodium iodide solution rinsed, which contains 200 mg sodium thiosulfate per liter. Afterward the sodium iodide solution is flushed out of the column, by passing a sufficient amount of PBS through them. After a final wash of the bed with PBS, which Contains 1 mg per ml of sodium azide (protective agent), the column can be stored at a temperature of 2 to 8 ° C until use will.

- 23 -- 23 -

709815/0812709815/0812

AA. 41 952 b41 952 b 19761976 UU - 163- 163 2727 . September. September

Zubereitung des Antikörpers für die Verwendung in einer Enzym-Verbindung und zusammen mit einem unlöslichen festen KörperPreparation of the antibody for use in an enzyme compound and together with an insoluble solid

Die in der oben beschriebenen Weise gereinigten Antikörper werden von Ammoniumsulfat befreit und mit PBS verdünnt, wobei auf einen Teil Antikörper zwei Teile Pufferlösung kommen. Die Kolumne wird aufgestellt und so angeordnet, dass die Fraktionen gesammelt werden können. Die Antikörper-Lösung wird der Kolumne kontinuierlich mit einer Flussmenge von etwa 200 ml pro Stunde zugefügt. Der Ausfluss wird gesammelt und auf den Gehalt von Protein und Hepatitis-Antikörpern geprüft, um festzustellen, wann die Kolumne mit Antikörpern gesättigt ist. Sobald die Sättigung erreicht ist, wird das Kolumnenbett mit PBS ausgewaschen, um lose absorbierte Proteine zu entfernen.The antibodies purified in the manner described above are freed from ammonium sulfate and diluted with PBS, whereby for one part of antibody, two parts of buffer solution are added. The column is drawn up and arranged so that the political groups can be collected. The antibody solution is fed continuously with a flow rate of about 200 ml per column Hour added. The discharge is collected and checked for protein and hepatitis antibodies to determine when the column is saturated with antibodies. As soon as saturation is reached, the column bed is washed out with PBS, to remove loosely absorbed proteins.

In diesem Stadium haben die auf der Kohlekolumne unbeweglich angelagerten Antigene mit den mit ihnen reagierenden Antikörpernjeine Bindung gebildet. Andere fremde Proteine und Antikörper, die mit den absorbierten Antigenen nicht spezifisch reagieren, sind durch die Kolumne hindurchgelaufen und von Antikörpern getrennt worden.At this stage, the immobile antigens attached to the coal column have none with the antibodies that react with them Bond formed. Other foreign proteins and antibodies not specific to the absorbed antigens react have passed through the column and been separated from antibodies.

Um diese Antikörper-Antigen-Bindung aufzubrechen und die gereinigten Antikörper auszuspülen/ wird eine unmittelbar vor der Verwendung zubereitete 5-molare Natriumjodidlösung in die Kolumne eingeführt. Die Natriumjodidmenge sollte so ausreichend bemessen sein, dass alle in der Kolumne gebundenen Antikörper entfernt werden können. Der Durchfluss durch die Kolumne wird auf mindestens 200 ml pro Stunde eingestellt, und die ausge-In order to break this antibody-antigen bond and to rinse out the purified antibodies / a 5 molar sodium iodide solution prepared immediately before use is introduced into the column. The amount of sodium iodide should be sufficient to remove all antibodies bound in the column. The flow through the column is set to at least 200 ml per hour, and the

- 24 -- 24 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

waschene Flüssigkeit wird in Fraktionen eines angemessenen Volumens gesammelt. Die insgesamt gesammelte Menge sollte wenigstens so gross sein wie die der zugeführten Natriumjodidlösung. washed liquid is collected in fractions of an appropriate volume. The total amount collected should be at least as large as that of the sodium iodide solution supplied.

Wenn jede Fraktion der gereinigten Antikörper gesammelt ist, wird sie einer zweifachen Filterung unterzogen, zuerst durch eine 0,45 ,u-Membran und dann durch eine 0,22 ,u-Membran. Das Filtrat wird im Verhältnis 1:3 mit destilliertem Wasser von 2 bis 8°C verdünnt, z.B. werden 200 ml des Filtrates zu 400 ml destilliertem Wasser dazugegeben. Diese verdünnten Antikörperfraktionen werden dann beispielsweise in einen AMICON-Konzentrator mit einer XM-50-Membran gegeben und konzentriert.When each fraction of the purified antibodies is collected, it is subjected to a double filtering, first through a 0.45, u membrane and then through a 0.22, u membrane. That The filtrate is diluted in a ratio of 1: 3 with distilled water from 2 to 8 ° C, e.g. 200 ml of the filtrate become 400 ml added distilled water. These diluted antibody fractions are then for example in an AMICON concentrator given with an XM-50 membrane and concentrated.

In einem letzten Reinigungsschritt werden die konzentrierten, gereinigten Antikörper dialysiert. Nach der Dialyse werden die Antikörper entfernt und zentrifugiert. Der Überstand wird mindestens 24 Stunden lang gegen eine O1 01-molare Natriumphosphat-Lösung dialysiert, während die erste Dialyse gegen PBS ausgeführt wird. Nach Beendigung dieser letzten Dialyse wird die Antikörper-Konzentration gemessen»In a final purification step, the concentrated, purified antibodies are dialyzed. After dialysis, the antibodies are removed and centrifuged. The supernatant is dialyzed at least 24 hours against a 1 O 01-molar sodium phosphate solution, while the first dialysis against PBS is performed. After the end of this last dialysis, the antibody concentration is measured »

Die Antikörper werden dann mit Hilfe der CEP-Technik auf ihre Aktivität im Vergleich mit einem Standardantigen untersucht, um den Antikörpergehalt zu bestimmen. Wenn dieser annehmbar istwerden sie in einen liophylen Zustand überführt und bis zur Benutzung aufbewahrt.The antibodies are then examined for their activity in comparison with a standard antigen with the aid of the CEP technique in order to determine the antibody content. If this is acceptable, they are brought into a liophyllous state and kept until they are used.

- 25 -- 25 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163 .u - 163.

27. September 1976 - »Τ - September 27, 1976 - »Τ -

B. Zubereitung des Antikörper-Enzym-Komplexes B. Preparation of the antibody-enzyme complex

Alkaliphosphatase aus den Eingeweiden von Kälbern (intestinale Alkaliphosphatase von Kälbern) wird mit einer Lösung des wieder aufgenommenen Antikörpers in einem Verhältnis von Enzym zu Antikörper wie 3:1 gemischt, bis eine Endkonzentration erreicht ist, bei der mehr als 10 mg Gesamtprotein pro ml Lösung von PBS (pH 7,4) erreicht ist. Die Lösung wird vollständig dialysiert, um NH. -Ionen zu entfernen.Alkaline phosphatase from the intestines of calves (intestinal alkaline phosphatase from calves) is reacted with a solution of the reabsorbed antibody in a ratio of enzyme mixed to antibody like 3: 1 until a final concentration is reached at which more than 10 mg total protein per ml of solution of PBS (pH 7.4) is reached. The solution is fully dialyzed to NH. -Ions to remove.

Die dialysierte Antikörper-Enzym-Mischung wird dann zentrifugiertj, um jegliche unlösliche Substanzen zu entfernen. Der Proteingehalt des Überstandes wird durch Zufügen von PBS-Mg Lösung auf 10 mg/ml eingestellt» Zu dieser Lösung wird 8%-Glutaraldehyd derart zugefügt,, dass 1 ml Glutaraldehyd-Lösung auf 10 ml Antikörper-Enzym-Lösung kommt„ Die Lösung wird 3,5 bis 20 Minuten lang langsam umgerührtwobei die Antikörper und die Enzyme mit Hilfe des Glutaraldehydes eine chemische Verbindung eingehen. Anschliessend wird die Lösung des Komplexes gegen PBS dialysiert, welches zur Entfernung des Glutaraldehydes 0,00r MMg++ enthält.The dialyzed antibody-enzyme mixture is then centrifuged to remove any insoluble matter. The protein content of the supernatant is adjusted to 10 mg / ml by adding PBS-Mg solution. 8% glutaraldehyde is added to this solution in such a way that 1 ml of glutaraldehyde solution is added to 10 ml of antibody-enzyme solution Stirred slowly for 3.5 to 20 minutes " whereby the antibodies and the enzymes form a chemical bond with the help of glutaraldehyde. The solution of the complex is then dialyzed against PBS, which contains 0.00r MMg ++ to remove the glutaraldehyde.

Das dialysierte Material wird anschliessend zentrifugiert, und der überstand wird durch Zufügen einer wässrigen Lösung verdünnt, die 0-,05-rmolar in Bezug auf Tris (Hydroxymethyl)-Aminometan (pH8)-Puffer, 1% normalem menschlichem Albumin (Kristallin), 0,02% NaN3 und 0,001-molar in MgCl2 ist.The dialyzed material is then centrifuged and the supernatant is diluted by adding an aqueous solution that is 0.05 µmolar in terms of tris (hydroxymethyl) aminometane (pH8) buffer, 1% normal human albumin (crystalline), 0 , 02% NaN 3 and 0.001 molar in MgCl 2 .

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind neben oder zusätzlich zu Alkaliphosphatase andere Enzyme verwendbar. In der Tat gibtIn the context of the present invention, other enzymes can be used in addition to or in addition to alkali metal phosphatase. Indeed there

- 26 -- 26 -

709 815/0812709 815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 19 76 -JHTSeptember 27, 19 76 -YHT

es eine fast endlose Liste von Enzymen, die sich !covalent mit dem Antikörper verbinden. Aus der Zahl der verschiedenen Enzyme gibt die folgende Aufsteilung besonders interessante Enzyme an.there is an almost endless list of enzymes that are! covalent with connect to the antibody. From the number of different enzymes, the following breakdown indicates particularly interesting enzymes.

1. Älkohol-Dehydrogenase1. Alcohol dehydrogenase

2. Glyzerol-Dehydrogenase2. Glycerol dehydrogenase

3. Glyoxylat-Reduktase3. Glyoxylate reductase

4. L-Laktat-Dehydrogenase4. L-lactate dehydrogenase

5. Malat-Dehydrogenase5. Malate dehydrogenase

6. Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase6. Glucose-6-phosphate dehydrogenase

7. Mannitol-1-Phosphat-Dehydrogenase7. Mannitol-1-phosphate dehydrogenase

8. Glukose-Oxiäase8. Glucose Oxyase

9ο Galaktose-Oxidase 10» L-Aminosäure-Oxidase 11. D-Aminosäure-Oxidase 12o Polyphenol-Oxidase 13o Askorbat-Oxidase9ο galactose oxidase 10 »L-amino acid oxidase 11. D-amino acid oxidase 12o polyphenol oxidase 13o ascorbate oxidase

14. Katalase14. Catalase

15. Peroxidase15. Peroxidase

16. Cholinesterase16. Cholinesterase

17. Phospholipase C17. Phospholipase C

18. «C - Amylase18. «C - amylase

19. Lysozyme19. Lysozymes

20. ß -Galaktosidase20. β-galactosidase

21. Amyloglukosidase21. Amyloglucosidase

22. ß -Glukuronidase22. β- Glucuronidase

23. Karboxypeptxdase A23. Carboxypeptxdase A

24. Urease24. urease

25. Anorganische Pyrophosphatase25. Inorganic pyrophosphatase

26. Aldolase26. Aldolase

27. Kohlensaure Anhydrase (carbonic anhydrase)27. Carbonic anhydrase

28. Histidase.28. Histidase.

- 27 -- 27 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 - -«Τ- 2643829September 27, 1976 - - «Τ- 2643829

Das zum Markieren des Antikörpers verwendete Enzym wird unter Berücksichtigung einer Reihe von Gesichtspunkten ausgewählt. Dazu gehören die Stabilität des Enzyms, die leichte Nachweisbarkeit des Enzyms, die Fähigkeit des Enzyms, die Bedingungen der kovalenten Bindung mit dem Antikörper auszuhalten, die Verfügbarkeit des Enzyms und seine Kosten.The enzyme used to label the antibody is under Chosen taking into account a number of considerations. These include the stability of the enzyme and its easy detection of the enzyme, the ability of the enzyme to withstand the conditions of covalent bond with the antibody that Availability of the enzyme and its cost.

C. Zubereitung eines mit Antikörpern beschichteten, unlöslichen KörpersC. Preparation of an Antibody Coated Insoluble Body

Der nächste Schritt in der Zubereitung der Reaktionspartner ist die kovalente Bindung eines Teils der gereinigten Antikörper an einen unlöslichen Körper. Zu diesem Zweck muss der unlösliche Körper mit reaktiven Gruppen oder Anlagerungsstellen versehen sein, die mit dem spezifischen, in den Bionachweis benutzten Antikörper reagieren.The next step in the preparation of the reactants is the covalent attachment of a portion of the purified antibodies to an insoluble body. For this purpose, the insoluble body must have reactive groups or attachment sites that react with the specific antibody used in the bio-detection.

Im US-Patent 3,700,609 (G.W.Tregear et al) mit dem Titel "Gepfropfte Kopolymere", deren Offenbarung auf diesem Wege zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird, ist eine unlösliche, fortlaufende Polymersubstanz beschrieben, welche ein polymeres"Rückgrad'Cbackbone) oder Gerüst aufweist,U.S. Patent 3,700,609 (G.W.Tregear et al) entitled "Grafted Copolymers" which was disclosed in this way is made the subject of the present application, an insoluble, continuous polymer substance is described, which has a polymeric "backbone" backbone) or framework,

.an welches;.to which;

'Seitenketten anderer Bolymere oder Kopolymere, angehängt sind, Bei geeigneter Wahl der angehängten oder "gepfropften" Polymere ist es möglich, biologische Substanzen chemisch an die unlösliche Matrix zu binden. Eines der in dem oben genannten US-Patent genannten Erzeugnisse ist im Handel in Form einer Scheibe unter dem Handelsnamen PROTAPOL DI/1 von der Firma Imperial Chemical Industries of Australia and New Zealand (ICIANZ) erhältlich.'' Side chains of other polymers or copolymers are attached, With a suitable choice of the attached or "grafted" polymers, it is possible to chemically attach biological substances to the to bind insoluble matrix. One of the products mentioned in the aforementioned US patent is commercially available in the form of a Disk under the trade name PROTAPOL DI / 1 from Imperial Chemical Industries of Australia and New Zealand (ICIANZ) available.

- 28 -- 28 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 - September 27, 1976 -

Das PROTAPOL D1/1 umfasst ein Polytetrafluoräthylen-Rückgrad oder -gerüst, an dessen Oberfläche Isothiocyanopolystyrol-Gruppen gleichmässig angehängt oder aufgepfropft sind. Sie ist zur Verwendung beim Radio-Immunonachweis bestimmt. So wie die Scheiben z.Zt. erhältlich sind, sind sie etwa 0,25 mm dick und haben einen Durchmesser von etwa 12,5 mm.The PROTAPOL D1 / 1 includes a polytetrafluoroethylene backbone or skeleton, on the surface of which isothiocyanopolystyrene groups are evenly attached or grafted on. It is intended for use in radio immunodetection. As the discs currently available, they are approximately 0.25 mm thick and approximately 12.5 mm in diameter.

Entsprechend einer bevorzugten Ausbildung der Matrix gemäss der Erfindung, weist jede Scheibe 10 zwei waffelähnlich geformte Oberflächen 11 auf, die eine erste Gruppe von linear verlaufenden Rippen 12 und eine zweite Gruppe von linear verlaufenden Rippen 14 zeigen, wobei die Rippen 12 und 14 Gitter bilden (Fig. 2). Die Rippen 12 und 14 sind vorzugsweise senkrecht zueinander angeordnet und bilden daher eine Vielzahl von quadratischen Vertiefungen 16. Die Seitenflächen jeder Rippe 12 und 14 verlaufen von nebeneinanderliegenden Paaren von Vertiefungen 16 dachförmig nach oben und bilden an der Spitze der Rippe einen linienförmigen Grat. Es wird darauf hingewiesen, dass die Rippen 12 und 14 zur besseren Verdeutlichung in der Zeichnung stark übertrieben dargestellt sind.According to a preferred embodiment of the matrix according to the invention, each disc 10 has two waffle-like shapes Surfaces 11 on which a first group of linear extending ribs 12 and a second group of linearly extending ribs 14, the ribs 12 and 14 lattice form (Fig. 2). The ribs 12 and 14 are preferably arranged perpendicular to one another and therefore form a plurality of square depressions 16. The side faces of each Ribs 12 and 14 run from adjacent pairs from recesses 16 roof-shaped upwards and form a linear ridge at the tip of the rib. It is on top pointed out that the ribs 12 and 14 are shown greatly exaggerated for better clarity in the drawing.

Diese gewünschte Form der Scheiben wird dadurch erreicht, dass die Scheiben zwischen Walzen hindurchlaufen, die auf ihrer Oberfläche Vorsprünge zum Einprägen der gewünschten Konfiguration, in die Scheiben aufweisen. Die Walzen sind dabei so ausgebildet, dass sie genügend Druck ausüben, um das Polymermaterial in der Scheibe zu verformen, ohne dabei die Scheibe zu durchlöchern. Das ist wichtig,, da die Scheibe eine Reaktionsschicht auf ihrer Oberfläche trägt. Aus diesem Grunde würde eine Durchlöcherung der Scheibe innere Teile derselben frei-This desired shape of the discs is achieved in that the disks pass between rollers which have protrusions on their surface for embossing the desired configuration, have in the slices. The rollers are designed in such a way that they exert enough pressure to move the polymer material to deform in the disc without perforating the disc. This is important, as the disc has a reaction layer on its surface. Because of this, would a perforation of the disc inner parts of the same exposed

- 29 -- 29 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 -W- 2643829September 27, 1976 -W- 2643829

legen, an welcher keine Antikörper gebunden werden können. Ein Freilegen der Polytetrafluoräthylen-Schicht würde daher zu einer Scheibe führen, die eine niedrigere Bindungskapazität hat.place to which no antibodies can be bound. Exposing the polytetrafluoroethylene layer would therefore result in a disc that has a lower binding capacity.

Der Hauptgedanke bei der Ausbildung der Matrix ist der, dass die scheibenförmige Matrix Oberflächen haben soll, die beim Einlegen der Scheibe auf den flachen Boden eines Fläschchens oder Gläschens im wesentlichen vollständig im Kontakt mit der zu untersuchenden Probe sind, d.h., die Berührungsflächen zwischen der Matrix und dem Boden des Fläschchens oder Gläs-The main idea in the formation of the matrix is that the disk-shaped matrix should have surfaces that are at the Place the disc on the flat bottom of a vial or jar essentially completely in contact with the the sample to be examined, i.e. the contact surfaces between the matrix and the bottom of the vial or glass

1>
chens (sollen so klein wie möglich gehalten werden. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemässen Scheibe sind die Oberflächen der Scheibe so ausgebildet, dass sie Gebiete mit hoch- und tiefliegenden Punkten aufweist.
1>
chens (should be kept as small as possible. In another preferred embodiment of the disk according to the invention, the surfaces of the disk are designed in such a way that they have areas with high and low-lying points.

Die in der oben beschriebenen Weise hergestellten und in der lyophilisierten Form vorliegenden Antikörper werden durch Zugabe von 100 ml einer 1-molaren NaHCO' (pH 9,6)-Lösung pro 5,0 mg Antikörper wieder aufgenommen. Zur Anlagerung werden die waffeiförmigen Flächen mit der verdünnten Lösung etwa 8 bis 16 Stunden bei einer Temperatur von 2 bis 8QC unter Bewegung zusammengebracht. Anschliessend wird die Antikörper-Lösung abgegossen, und die Scheiben werden zweimal mit aufeinanderfolgenden Mengen von O,1M NaHCO3, pH 9,6, und phosphat-gepufferter Salzlösung und kaltem {2-8°Cj 0,3%-igen Rinderserum-Albumin in phosphat-gepufferter Salzlösung mit 0,5% TWEEN 20 gewaschen. Nach einer weiteren Waschung mit kristallinem Rinderserum-Albumin und dem Frieren über Trockeneis wird die Lyophilisierung ausgeführt, und die Scheiben werden bei einer TemperaturThe antibodies prepared in the manner described above and present in the lyophilized form are taken up again by adding 100 ml of a 1 molar NaHCO '(pH 9.6) solution per 5.0 mg of antibody. For attachment, the weapon-shaped surfaces are brought together with the diluted solution for about 8 to 16 hours at a temperature of 2 to 8 ° C. with movement. The antibody solution is then poured off, and the discs are washed twice with successive amounts of 0.1M NaHCO 3 , pH 9.6, and phosphate-buffered saline and cold {2-8 ° Cj 0.3% bovine serum albumin Washed in phosphate buffered saline with 0.5% TWEEN 20. After another wash with crystalline bovine serum albumin and freezing over dry ice, lyophilization is carried out and the disks are kept at one temperature

- 30 -- 30 -

709815/0812709815/0812

von 2 bis 8 C bis zum Gebrauch aufbewahrt.stored at 2 to 8 C until use.

Obwohl die Beschreibung sich auf die Zubereitung von Scheiben bezieht, an welche Hepatitis-Antikörper gebunden sind, ist es für den Fachmann klar ersichtlich, dass die erfindungsgemässen Scheiben auch zur unbeweglichen Anlagerung einer fast endlosen Zahl von Proteinen mit Nutzen verwendet werden kann. So ist der gesteigerte Kontakt zwischen der Testprobe und der Scheibe geeignet, die Scheibe bei Tests zu verwenden, die die Bindung folgender Proteine erfordern; Antikörper für Drogen, wie beispielsweise Digoxin, Opiate und Steroide; Antikörper von Naturprodukten, wie beispielsweise Insulin oder anderen Hormonen/ und spezifische Stoffwechselenzyme, die im Blut und anderen Körperflüssigkeiten gefunden werden.Although the description refers to the preparation of disks to which hepatitis antibodies are bound, it is It is clear to the person skilled in the art that the panes according to the invention can also be used for the immovable attachment of an almost endless Number of proteins can be used with benefit. Such is the increased contact between the test sample and the disc suitable for use in tests that require binding of the following proteins; Antibodies for drugs, such as Digoxin, opiates and steroids; Antibodies from natural products such as insulin or other hormones / and specific metabolic enzymes found in the blood and others Body fluids are found.

Beispielexample

Das folgende Verfahren wurde zur Zubereitung von 8000 Scheiben verwendet, von denen jede zuerst unter der Presse behandelt wurde, um die gewünschte und oben beschriebene Formgebung zu erhalten. Für einen Posten von 8000 Scheiben braucht man 40 mg Hepatitis-Antikörper, d.h. 5 mg pro 1000 Scheiben. Der Proteingehalt der wieder aufgenommenen Hepatitis-Antikörper wird auf 0,05 mg/ml in einem endgültigen Volumen von 800 ml in 0,1M NaHCO3 (pH 9,6) eingestellt. Die gesamte Menge von 800 ml der gepufferten Antikörper werden dann in eine 1000 ml-Flasche mit Schraubverschluss eingefüllt, die einen dichten, die 8000 ■Scheiben enthaltenden Behälter enthält, und die Flasche wird 16 Stunden lang gedreht, z.B. über Nacht, und bei einer Temperatur von 2 bis 8°C gehalten, so dass die Scheiben bei jederThe following procedure was used to prepare 8,000 discs, each of which was first press treated to obtain the desired shape described above. For a lot of 8000 slices you need 40 mg of hepatitis antibody, ie 5 mg per 1000 slices. The protein content of the resumed hepatitis antibodies is adjusted to 0.05 mg / ml in a final volume of 800 ml in 0.1M NaHCO 3 (pH 9.6). The entire 800 ml amount of the buffered antibodies are then poured into a 1000 ml screw-top bottle containing a tight container containing 8000 discs, and the bottle is rotated for 16 hours, e.g., overnight, and at one temperature Maintained from 2 to 8 ° C so that the slices at each

- 31 -- 31 -

709815/0812709815/0812

AA. 41 952 b41 952 b 19761976 - 3*- 3 * UU - 163- 163 srsr 2727 . September. September

Umdrehung langsam taumeln» Anschliessend wird die Flüssigkeit aus der Flasche ausgegossen und entfernt, und die Scheiben werden in eine eine grosse öffnung aufweisende 2-Literflasche gegeben.Slowly tumble rotation »Then the liquid poured out of the bottle and removed, and the slices are placed in a 2-liter bottle with a large opening given.

Die Scheiben werden zweimal mit aufeinanderfolgenden 1-Liter-Mengen von kaltem (2-8°C) 0,1M NaHCO3, pH 9,6, gewaschen, wonach der Puffer entfernt wird. Die Scheiben werden dann noch einmal gewaschen, dieses Mal mit zwei aufeinanderfolgenden 1-Liter-Mengen eines kalten Puffers (0,01M Natriumphosphat, 0,15M NaCl, pH 7,4). Wenn der restliche Puffer entfernt ist, werden die Scheiben zum dritten Mal gewaschen, diesmal mit zwei aufeinanderfolgenden 1-Liter-Mengen einer kalten Rinderserum-Albumin-Lösung (0,3%).The disks are washed twice with successive 1 liter quantities of cold (2-8 ° C) 0.1M NaHCO 3 , pH 9.6, after which the buffer is removed. The disks are then washed one more time, this time with two successive 1 liter quantities of cold buffer (0.01M sodium phosphate, 0.15M NaCl, pH 7.4). When the remaining buffer is removed, the disks are washed a third time, this time with two consecutive 1 liter quantities of cold bovine serum albumin solution (0.3%).

Die Scheiben werden schliesslich mit zwei aufeinanderfolgenden 1-Liter-Mengen einer Lösung von kaltem, kristallinem Rinderserum-Albumin (pH 8) bei einer Konzentration von 2 mg/ml gewaschen. Dieser Schritt wird durchgeführt, um für die Proteine auf der Scheibe eine Protein-Umgebung zu schaffen. Nach der Entfernung der restlichen Waschflüssigkeit werden die Scheiben auf Schalen (etwa 23 χ 23 cm) gelegt, die jede mit einem Bogen Filterpapier ausgelegt und mit 200 ml einer Lösung"von kristallinem Rinderserum-Albumin gefüllt sind. Nach dem übertragen der Scheiben werden diese mittels eines Filterpapierbogens abgedeckt. Der Puffer wird dann vollständig entfernt, und die Scheiben werden 30 Minuten lang auf Trockeneis schnellgefroren.The discs are finally filled with two consecutive 1 liter quantities of a solution of cold, crystalline bovine serum albumin (pH 8) at a concentration of 2 mg / ml. This step is done in order for the proteins to create a protein environment on the disc. After removing the remaining washing liquid, the discs are placed on bowls (about 23 χ 23 cm), each with a bow Filter paper laid out and filled with 200 ml of a solution "of crystalline Bovine serum albumin are filled. After the slices have been transferred, they are covered with a sheet of filter paper. The buffer is then completely removed and the slices are quick frozen on dry ice for 30 minutes.

Der Inhalt der Schalen wird dann lyophilisiert und die trockenen Scheiben entfernt und in einem verschlossenen Behälter aufbewahrt. .The contents of the dishes are then lyophilized and the dry ones Slices removed and stored in a sealed container. .

- 32 -- 32 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 - 3ί" -September 27, 1976 - 3ί "-

(1) Zubereitung des Kontrollserums (1) Preparation of the control serum

Um bei dem Immunonachweis sinnvolle Ergebnisse zu erhalten, ist es nötig, negative und positive Kontrollseren vorzusehen, mit welchen eine gegebene Testprobe verglichen werden kann. Die Zubereitung dieser Kontrollseren wird im folgenden im einzelnen beschrieben.In order to obtain meaningful results with the immunodetection, it is necessary to provide negative and positive control sera, with which a given test sample can be compared. The preparation of these control sera is described below in individually described.

Das negative Kontrollserum wird aus menschlichem Plasma hergestellt, das beispielsweise mit der Radio-Immuno-Nachweis-Technik untersucht worden und sich im Bezug auf Antigene, die der Hepatitis zuzuordnen sind, als negativ herausgestellt hat. Zu jeder derartigen, in Bezug auf Hepatitis-Antigene eindeutig negativen Menge wird eine 5M CaCl2-Lösung zugefügt, um ein Zusammenklumpen zu erreichen. Dabei werden etwa 0,75 ml CaCl2-Lösung pro 200 ml Plasma verwendet. Dieses Plasma wird dann in einem Wasserbad bei 37°C gehalten, bis sich ein Klumpen formt. Die ausgeklumpten Plasmateile werden dann bei -20°C gefroren und mindestens 12 Stunden aufbewahrt. Dann werden diese Plasmateile bei 2 bis 8°C aufgetaut, und das Serum wird gesammelt. Wenn das Serum übermässig trübe erscheint, kann es wünschenswert sein, es durch Zentrifugieren zu klären, z.B. bei 9000 Umdrehungen während einer Zeit von 30 Minuten und einer Temperatur von 2 bis 8°C.The negative control serum is produced from human plasma which has been examined, for example, using the radio-immuno-detection technique and which has been found to be negative with regard to antigens that can be assigned to hepatitis. A 5M CaCl 2 solution is added to each such amount, which is clearly negative with regard to hepatitis antigens, in order to achieve clumping. About 0.75 ml of CaCl 2 solution are used per 200 ml of plasma. This plasma is then kept in a water bath at 37 ° C until a lump forms. The clumped plasma parts are then frozen at -20 ° C and stored for at least 12 hours. These plasma pieces are then thawed at 2 to 8 ° C and the serum is collected. If the serum appears excessively cloudy, it may be desirable to clarify it by centrifugation, for example at 9000 revolutions for 30 minutes and at a temperature of 2 to 8 ° C.

20 Gramm Kieselsäure, beispielsweise AEROSIL-380, werden pro Liter Serum zugefügt und mit diesen 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gemischt, um Lipoproteine zu entfernen und das Serum zu stabilisieren. Die Mischung wird dann zentrifugiert und der Niederschlag entfernt. Wenn es gewünscht wird, kann die Kiesel-20 grams of silica, for example AEROSIL-380, are per Liter of serum was added and mixed with this for 2 hours at room temperature to remove lipoproteins and the serum to stabilize. The mixture is then centrifuged and the precipitate removed. If desired, the pebble

- 33 -- 33 -

709815/0 812709815/0 812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 - 3«δ* - 9 β Λ ^-89QSeptember 27, 1976 - 3 «δ * - 9 β Λ ^ -89Q

säure durch Filtration mittels geeigneter Filtermedien entfernt werden.acid can be removed by filtration using suitable filter media.

Der überstand wird dann weiter verarbeitet, indem er filtriert wird, beispielsweise durch MILLIPORE oder HORM-Membranen und -Kissen mit sukzessive abnehmender Porosität,, wobei die letzte eine 0,45/U-Membran ist. Vor der Filtration durch die 0,45 ,u-Membran wird der Flüssigkeit Natriumazid (NaN.,) in ausreichender Menge zugegeben, um eine Konzentration von 0,1 Gewichtsprozent zu erreichen. Wie bekannt, wirkt Natriumazid als Schutzmittel. Die letzte Filtration durch das 0,45 ,u-Filter oder ein Filter mit noch kleineren Poren sollte in'einer laminaren Strömungsumgebung erfolgen; die Ausrüstung und die gesamte Durchführung sollten steril sein.The supernatant is then processed further by filtering it is, for example, by MILLIPORE or HORM membranes and -Cushion with successively decreasing porosity, being the last one is a 0.45 / U membrane. Before filtration through the 0.45, u membrane becomes the liquid sodium azide (NaN.,) in sufficient Amount added to achieve a concentration of 0.1 percent by weight. As is known, sodium azide acts as a Protective agent. The final filtration through the 0.45, u filter or a filter with even smaller pores should be in a laminar Flow environment take place; the equipment and the entire duct should be sterile.

Die sterile Lösung kann dann bei Temperaturen von 2 bis 8°C aufbewahrt werden, bis sie in kleinere Behälter aufgeteilt wird, wie sie für den Immunonachweis eingesetzt werden. In dem bevorzugten, für 100 Tests ausgelegten Set werden 7,5 ml des negativen Kontrollserums geliefert.The sterile solution can then be stored at temperatures of 2 to 8 ° C should be retained until broken into smaller containers such as those used for immunodetection. By doing The preferred 100-test kit provides 7.5 ml of the negative control serum.

Das positive Kontrollserum wird aus rekalzifiziertem Plasma aus Blutmengen gewonnen, welche in Bezug auf der Hepatitis zugeordnete Antigene positiv sind. Von jeder positiven Einheit wird eine 1%-ige Probe abgezweigt, und diese Proben werden zusammengeschüttet, um eine Versuchsprobe zu ergeben. Diese Versuchsprobe wird zuerst 10 Stunden lang bei 60°C wärmebehandelt, um jeglichen Hepatitis erzeugenden Wirkstoff in der Probe zu inaktivieren. Wenn die Versuchsprobe auf Raumtemperatur abgekühlt ist, wird ein Teil entnommen und seinTiter mitThe positive control serum is obtained from recalcified plasma from amounts of blood which are related to the hepatitis associated antigens are positive. A 1% sample is diverted from each positive unit and these samples become poured together to give a test sample. This test sample is first heat-treated for 10 hours at 60 ° C, to inactivate any hepatitis-causing agent in the sample. When the test sample is at room temperature has cooled, a portion is removed and its titer with

- 34 -- 34 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 -3"C-September 27, 1976 -3 "C-

Hilfe der CEP-Technik gegen einen Standard-Antikörper bestimmt, um zu überprüfen, ob die Antigen-Aktivität erhalten geblieben ist. Zu der Versuchsprobe wird dann eine genügende Menge Kieselsäure zugegeben, um eine Konzentration von 20 g pro Liter Serum zu erhalten. Das Serum wird dann mit Hilfe eines Rührers bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt; danach wird bei 9000 üpm 30 Minuten lang bei einer Temperatur von 2 bis 8°C zentrifugiert. Der Niederschlag wird entfernt.Using the CEP technique against a standard antibody determined to check whether the antigen activity has been preserved is. A sufficient amount of silica is then added to the test sample to achieve a concentration of 20 g per liter To obtain serum. The serum is then stirred with the aid of a stirrer at room temperature for 2 hours; after that is at Centrifuged 9000 rpm for 30 minutes at a temperature of 2 to 8 ° C. The precipitate is removed.

Der Titer des Überstandes wird dann mit Hilfe der CEP-Technik gegen einen Standard-Bezugs-Antikörper bestimmt. Wenn der Titer auf einem ausreichenden Niveau geblieben ist, kann die Gesamtmenge aller Serum-Einheiten zusammengegeben und in der gleichen Weise, wie es für die Versuchsprobe eben beschrieben worden ist, behandelt werden.The titer of the supernatant is then determined using the CEP technique against a standard reference antibody. If the If the titer has remained at a sufficient level, the total amount of all serum units can be added together and in the in the same way as just described for the test sample has been treated.

Die Versuchsprobe und die Hauptprobe werden dann zusammengegeben und mit einer ausreichenden Menge eines negativen Kontrollserums verdünnt, um mit dem pQsitiven Kontrollserum in dem erfindungsgemässen Immunonachweis optimale Resultate zu erzielen. Vorzugsweise sollte die Anzeige des positiven Kontrollserums in dem erfindungsgemässen Test grosser als 2000 sein, gemessen in Absorptionseinheiten χ 1000. Dieses verdünnte positive Kontrollserum wird dann - wie vorher beschrieben durch geeignete Medien gefiltert, wobei die Grosse der Poren sukzessive abnimmt. Vor der letzten Filtration durch eine 0,45 ,u-Membran oder eine Membran mit kleineren Poren werden 0,1 Gewichtsprozent Natriurnazid zugefügt. Wie bei der negativen Kontrollprobe, sollte die letzte Filtration unter aseptischen Bedingungen und bei laminar strömender Umgebung durchgeführt werden.The test sample and the main sample are then combined and mixed with a sufficient amount of a negative control serum diluted in order to achieve optimal results with the positive control serum in the immunodetection according to the invention achieve. The display of the positive control serum in the test according to the invention should preferably be greater than 2000 measured in absorption units χ 1000. This diluted positive control serum is then filtered through suitable media as previously described, taking into account the size of the pores gradually decreases. Before the final filtration, be through a .45, u membrane or a membrane with smaller pores 0.1 weight percent sodium azide added. As with the negative Control sample, the last filtration should be carried out under aseptic conditions and in a laminar flow environment will.

- 35 -- 35 -

7.09815/08127.09815 / 0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 - Vif - Sept. 27, 1976 - Vif -

Das schwach positive Kontrollserum kann durch Verdünnung des stark positiven Kontrollserums mit negativem Serum hergestellt werden. Der sich bei der Durchführung des erfxndungsgema.ssen Nachweisverfahrens ergebende Wert des schwach positiven Serums sollte zwischen 600 und 1000 liegen. In dem für 100 Tests ausgelegten bevorzugten Testset werden 2,5 ml des stark positiven Kontrollserums und 2,5 ml des schwach positiven Kontrollserums beigefügt.The weakly positive control serum can be prepared by diluting the strongly positive control serum with negative serum will. The one in the implementation of the erfxndungsgema.ssen The value of the weakly positive serum resulting from the detection method should be between 600 and 1000. In that for 100 tests The preferred test set designed is 2.5 ml of the strongly positive control serum and 2.5 ml of the weakly positive control serum attached.

D. Unterschiedliche Reaktionssubstanzen und Ausrüstung D. Different reactants and equipment

200 oder mehr gläserne Fläschchen oder Gläschen zum Wegwerfen mit einem flachen Boden werden mitgeliefert, die einen etwas über 12,5 mm grossen Durchmesser haben, d.h., die so gross sind, dass die einen Durchmesser von 12,5 mm aufweisenden Scheiben hineinpassen. 100 dieser Fläschchen oder Gläschen werden für das erste Zusammenbringen der Substanzen (Inkubation) und das Auswaschen verwendet, die anderen 100 für das letzte Zusammenbringen (Inkubation) mit dem Enzym-Substrat. Das Testset erlaubt damit die gleichzeitige Durchführung von 100 Nachweisen.200 or more glass vials or jars for disposal with a flat bottom are included, which is something have a diameter of more than 12.5 mm, i.e. that are so large that those with a diameter of 12.5 mm Fit slices in. 100 of these bottles or jars are used for the first bringing together of the substances (incubation) and the washout used the other 100 for the final contact (incubation) with the enzyme substrate. The test set allows 100 verifications to be carried out at the same time.

Bevor die unlösliche, feste Scheibe in jedes der 100 Fläschchen oder Gläschen eingelegt wird, werden in jedes Gläschen 0,05 ml einer Pferde-Globulin-Probenverdünnung zugefügt, wie weiter unten im einzelnen angegeben ist. Das wird als Vorsichtsmassnahme durchgeführt, um beim ersten Zusammenbringen (Inkubation) der zu untersuchenden Probe mit der unlöslichen Scheibe nichtspezifische Reaktionen zu vermeiden. Obwohl die Antikörperschicht auf der Scheibe gereinigt ist und hochgradigBefore the insoluble, solid disc is inserted into each of the 100 vials or jars, each vial 0.05 ml of a horse globulin sample dilution was added, as detailed below. That is used as a precautionary measure carried out to the first contact (incubation) of the sample to be examined with the insoluble disc avoid non-specific reactions. Although the antibody layer on the disc is purified and high grade

- 36 -- 36 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 -^fT- ociooonSept. 27, 1976 - ^ fT- ociooon

^0 Zb4iöZy^ 0 Zb4iöZy

reaktionsfähig mit Hepatitis-Antigenen ist, findet sich gelegentlich im menschlichen Serum oder Plasma eine Substanz, die mit Pferdeglobulin selbst reagieren kann und damit eine Brücke zwischen der Scheibe und dem enzym-markierten Komplex bildet, wodurch sich eine falsche positive Reaktion ergibt. Das im ersten Schritt zugesetzte Pferdeglobulin bindet diese Substanz, so dass sie nicht mehr frei ist und nicht mehr mit der Scheibe reagieren kann. Wie oben dargelegt, werden die auf der Scheibe gebundenen Antikörper dadurch hergestellt, dass ein Pferd mit der Hepatitis zugeordneten, aus dem menschlichen Blut gesammelten Antigenen immunisiert wird. In dem für 100 Tests bestimmten Testset werden 5,5 ml einer 330 mg Pferdeglobulin enthaltenden phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) mitgeliefert.is reactive with hepatitis antigens, a substance is occasionally found in human serum or plasma which can react with horse globulin itself and thus create a bridge between the disc and the enzyme-labeled complex forms, resulting in a false positive reaction. The horse globulin added in the first step binds these Substance so that it is no longer free and can no longer react with the disc. As stated above, the Antibodies bound on the disc produced by having a horse associated with the hepatitis, from the human Blood collected antigens is immunized. In the test set intended for 100 tests, 5.5 ml of a 330 mg Phosphate-buffered saline (PBS) containing horse globulin is included.

F. Zubereitung des Substrats F. Preparation of the substrate

Das bevorzugte Substrat für die Enzymreaktion im Test ist p-Nitrophenylphosphat, welches mit einer Konzentration von 1 mg/ml in einem Natriumkarbonatpuffer gelöst ist, dessen Konzentration 0,028 molar bezüglich Natriumkarbonat und 0,001 molar bezüglich Magnesium (pH 9,8) ist.The preferred substrate for the enzyme reaction in the test is p-nitrophenyl phosphate, which has a concentration of 1 mg / ml is dissolved in a sodium carbonate buffer, the concentration of which is 0.028 molar with respect to sodium carbonate and 0.001 molar in terms of magnesium (pH 9.8).

An dieser Stelle wird darauf hingewiesen, dass auch andere Substrate mit geeigneten pH-Puffer-Substanzen verwendet werden können, wie sie in Tafel I unten aufgeführt sind.At this point it should be noted that other substrates with suitable pH buffer substances are also used as listed in Table I below.

- 37 -- 37 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 -bA 41 952 -b

u - 163u - 163

27ο September 197627ο September 1976

Tafel ϊBoard ϊ

ß-Glyzerolphosphat (^ -Glyzerolphosphat Pheny!phosphat β-NaphthyIpho sphat p-Nitropheny!phosphatß-glycerol phosphate (^ -glycerol phosphate Pheny! Phosphate β-NaphthyIpho sphat p-nitropheny! phosphate

Phenolphtalein-Phosphat p-Nitrophenyl-Phosphat Thymolphthalein-Phosphat p-Nitrophenyl-Phosphat 4-Methylumbelliferyl-PhosphatPhenolphthalein phosphate p-nitrophenyl phosphate Thymolphthalein phosphate p-nitrophenyl phosphate 4-methylumbelliferyl phosphate

(Serum)7j4 Barbital 8?6 Karbonat-Bikarbonat 9-"Barbital 9,1 2A2M1P, 10.25(Serum) 7j4 Barbital 8 ? 6 carbonate-bicarbonate 9- "barbital 9.1 2A2M1P, 10.25

2A2M1P, 9 ο 90 2Ä2M1P„ 10.17 Karbonat-Bikarbonat 10.0 Diäthanolamin, Karbonat-Bikarbonat,2A2M1P, 9 ο 90 2Ä2M1P "10.17 Carbonate bicarbonate 10.0 Diethanolamine , carbonate bicarbonate,

Di© in der Tafel angegebenen Substrate sind alle organische Phosphatesterο Es ist klarf dass auch andere organische Phosphatester als Substrat für das bevorzugte Enzym Alkali-Phosphat ase verwendet werden können» Auch wenn andere Enzyme verwendet werden als Alkali-Phosphatase„ lassen sich relativ leicht geeignete Substrate finden»Di © indicated in the panel substrates are all organic Phosphatesterο It is clear f that other organic Phosphatester as a substrate for the preferred enzyme alkaline phosphate ase can be used "Even if other enzymes are used as the alkali-phosphatase" are relatively easy to suitable Find substrates »

Verfahrenprocedure

Um den erfindungsgemässen Nachweis durchzuführen, werden 100 Fläschchen oder Gläschen in Gestelle gesetzt und jedes davon wird als zu einer Probe gehörig gekennzeichnet. In jedes Gläschen werden 0,05 ml der Pferdeglobulin-Lösung gegeben, dann werden zu 95 der Gläschen 0s5 ml Probenflüssigkeit gegeben. Gleichzeitig werden 0,5 ml des negativen Kontrollserums in jedes von drei Gläschen gegeben, 0,5 ml des stark positiven Kontrollserums in ein Gläschen und 0,5 ml des schwach positiven Kontrollserums in ein weiteres Gläschen.In order to carry out the detection according to the invention, 100 vials or jars are placed in racks and each of them is marked as belonging to a sample. 0.05 ml of the horse globulin solution are added to each vial, then 5 ml of sample liquid are added to 95 of the vials for 0 s. At the same time, 0.5 ml of the negative control serum is added to each of three vials, 0.5 ml of the strongly positive control serum into one vial and 0.5 ml of the weakly positive control serum into another vial.

- 38 -- 38 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 b u - 163A 41 952 b u - 163

27. September 1976September 27, 1976

In jedes Gläschen, das das Pferdeglobulin und die Probe enthält f auch in die Kontrollgläschen, wird dann eine mit Antikörpern beschichtete Scheibe eingelegt. Die Gläschen werden samt Inhalt eine halbe Stunde lang bei 43°C gehalten (inkubiert) , beispielsweise in einem bewegten Wasserbad. Während dieser Inkubation verbinden sich in der Testprobe anwesende Hepatitis-Antigene mit den Antikörpern auf den Scheiben.Into each vial containing the Pferdeglobulin and the sample F also in the control vial, an antibody-coated disk is then inserted. The vials and their contents are kept (incubated) at 43 ° C. for half an hour, for example in a moving water bath. During this incubation, any hepatitis antigens present in the test sample combine with the antibodies on the discs.

Bevor das Reagens mit den enzym-marklerten Antikörpern in die Gläschen gegeben wird„ in denen sich der unlösliche Körper befindetj muss der überstand der ersten Inkubation entfernt werden» Die unlöslichen Körper müssen ausserdem gewaschen werden, um jegliches ungebundene Antigen zu entfernen. Die Waschlösung ist vorzugsweise eine Oir85%-ige Lösung von Natriumchlorid , pH 6,5 bis 7,5c Nach zwei Waschungen mit jeweils 2,5 ml dieser Lösung v/erden 0,3 ml des Äntikörper-Enzym-Komplexes in jedes Glas gefüllt,-und die Gläser werden wieder bei 43°C eine Stunde lang unter Bewegung aufbewahrt(inkubiert), Während dieser Zeit reagieren die enzym-märkierten Antikörper mit den während der ersten Inkubation an der mit Antikörpern beschichteten Scheibe befestigten Antigenen.Before the reagent with the enzyme-labeled antibodies is added to the vials "in which the insoluble body is located, the supernatant from the first incubation must be removed" The insoluble bodies must also be washed to remove any unbound antigen. The washing solution is preferably an O ir 85% solution of sodium chloride, pH 6.5 to 7,5c After two washes of 2.5 ml of this solution v / ground 0.3 ml of Äntikörper-enzyme complex in each glass filled, -and the jars are again kept at 43 ° C for one hour with agitation (incubated). During this time, the enzyme-labeled antibodies react with the antigens attached to the antibody-coated disk during the first incubation.

Nach der Zugabe der enzym-markierten Antikörper und einer zweiten Inkubation wird der überstand abgesaugt; die Scheiben in jedem Gläschen werden dreimal mit jeweils 2,5 ml der Waschlösung gewaschen. Dadurch werden die Enzym-Antikörper-Komplexe entfernt, die nicht reagiert haben. Jeder unlösliche Körper (Scheibe) wird dann in ein sauberes Gläschen gelegtiund 2,5 ml einer p-Nitrophenylphosphat-Enzym-Substrat-Pufferlösung wird in jedes Gläschen gegeben (1 mg p-Nitrophenylphosphat pro ml).After adding the enzyme-labeled antibodies and a second incubation, the supernatant is sucked off; the slices in each vial are washed three times with 2.5 ml of the washing solution each time. This will remove the enzyme-antibody complexes that did not react. Each insoluble body (wheel) is then placed into a clean vial and 2.5 ml of a i p-nitrophenyl phosphate enzyme substrate buffer solution is added to each vial (1 mg p-nitrophenyl phosphate per ml).

- 39 -- 39 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 - 2* - 2643829September 27, 1976 - 2 * - 2643829

Da der optimale pH-Wert des Alkali-Phosphatase-p-Nitrophenylphosphat-Systems bei 9,8 liegt, wird das Enzymsubstrat in einem Karbonat-Mg -Puffer (pH 9,8 + O4,!) aufgelöst. Dieser Puffer umfasst eine wässrige Lösung, die bezüglich Na-CO-. O,O28M und bezüglich Mg O,QO1M ist. 40 ml Konzentrat werden dem erfindungsgemässen Set beigefügt, die nach Verdünnung auf 400 ml mittels destilliertem Wasser direkt zu den 400 mg p-Nitrophenylphösphat zugegeben werden können. Nach der Zugabe des gepufferten Substrates werden die Gläschen eine Stunde lang bei 43°C und Bewegung einer dritten Inkubation unterzogen. Wenn ein anderer Enzym-Antikörper-Komplex verwendet wird, müssen andere Substrate verwendet werden.Since the optimal pH value of the alkali phosphatase p-nitrophenyl phosphate system is 9.8, the enzyme substrate is dissolved in a carbonate Mg buffer (pH 9.8 + O 4 ,!). This buffer comprises an aqueous solution, which with respect to Na-CO-. O, O28M and with respect to Mg O, QO1M. 40 ml of concentrate are added to the set according to the invention, which can be added directly to the 400 mg of p-nitrophenylphosphate after dilution to 400 ml using distilled water. After the addition of the buffered substrate, the vials are subjected to a third incubation at 43 ° C. with agitation for one hour. If a different enzyme-antibody complex is used, different substrates must be used.

Zwei Tropfen (O,1 ml) einer 3M NaOH-Lösung werden dann in jedes Gläschen gegeben, um die Reaktion zu beenden. Zu diesem Zweck sind jedem Testset 15 ml einer 3M-Natriumhydroxid-Lösung beigegeben.Two drops (0.1 ml) of a 3M NaOH solution are then poured into given each vial to stop the reaction. For this purpose each test set contains 15 ml of a 3M sodium hydroxide solution added.

Die oben beschriebene Enzym-Substrat-Lösung schlägt von einer farblosen Flüssigkeit in eine gelbe Flüssigkeit um, wenn auf der Scheibe Enzym vorhanden ist, d.h., in den Gläschen, die bezüglich Hepatitis-Antigenen positive Proben enthalten.The enzyme-substrate solution described above changes from a colorless liquid to a yellow liquid when exposed enzyme is present on the disc, i.e. in the vials that contain samples positive for hepatitis antigens.

Der oben beschriebene Teil der Negativ-Kontrollseren wird in einem geeigneten Gläschen .zusammengeschüttet und ihre Absorption bei 405 nm mit einem Spektrophotometer gegen den Blind-oder V^rcrleichs"?
'wert von~~äestilliertem Wasser gemessen. Wenn sich bei der negativen Kontrolle weniger als 600 (Absorptionseinheiten χ 1000) ergibt, kann man sie als geeignete Standardproben ansehen, gegen welche die Testergebnisse verglichen werden können. Mit den zusammengeschütteten negativen Kontrollproben
The above-described part of the negative control sera is poured together in a suitable glass and its absorption at 405 nm with a spectrophotometer against the blind or comparison "?
'value of ~~ distilled water measured. If the negative control shows less than 600 (absorption units χ 1000), they can be regarded as suitable standard samples against which the test results can be compared. With the cumulative negative control samples

- 40 -- 40 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 - 4/ff - 2643829September 27, 1976 - 4 / ff - 2643829

gergleichswert
als Blind-oderfwerden nun die Werte der Testproben und der positiven Kontrollproben abgelesen, wobei die Ergebnisse in Absorptionseinheiten χ 1000 registriert werden. Bei manchen Spektrophotometern kann man eine negative Kontrollsubstanz in das Instrument einsetzen, den Ablesewert auf Null justieren und den Wert der Testprobe direkt ablesen. Eine unbekannte Testprobe, deren optische Dichte mal 1000 grosser ist als 100, wenn man die zusammengefügten negativen Kontrollsubstanzen als Nullwert ansieht, wird bezüglich der Hepatitis-Antigene als positiv angesehen. Dieser Wert ist gewählt worden, um nicht reproduzierbare positive Ergebnisse zu eliminieren, die, falls sie sich ergeben, im allgemeinen das Ergebnis eines Fehlers in der Arbeitsweise sind.
equal value
The values of the test samples and the positive control samples are now read as blank or f, the results being recorded in absorption units χ 1000. With some spectrophotometers you can insert a negative control substance into the instrument, adjust the reading to zero and read the value of the test sample directly. An unknown test sample, the optical density of which is 1000 times greater than 100, if the combined negative control substances are regarded as the zero value, is regarded as positive with regard to the hepatitis antigens. This value has been chosen to eliminate non-reproducible positive results which, if they occur, are generally the result of an error in operation.

Die Messwerte der Testproben können auch mit den schwach positiven und stark positiven Kontrollproben verglichen werden. Auf diese Weise kann nicht nur die Gegenwart, sondern auch ein Hinweis auf die Konzentration der Hepatitis-Antigene in der Probe erhalten werden.The measured values of the test samples can also be compared with the weakly positive and strongly positive control samples. In this way, not only the presence, but also an indication of the concentration of the hepatitis antigens in of the sample.

BeispieleExamples

Mit jeder Gruppe von unbekannten Substanzen sollten fünf Kontrollmessungen durchgeführt werden, drei mit einem negativen Kontrollserum, eine mit einem stark positiven Kontrollserum und eine mit einem schwach positiven Kontrollserum. Diese Kontrollproben sollten dem gleichen Verfahren und den gleichen Inkubationszeiten unterworfen werden wie die Testproben. Vorsicht: Zur Verhinderung von Kreuz-Kontaminierung sollte für jede Übertragung eine saubere Pipette oder eine Wegwerfspitze verwendet werden.
Folgende Schritte sind durchzuführen: _ 41 _
Five control measurements should be carried out with each group of unknown substances, three with a negative control serum, one with a strongly positive control serum and one with a weakly positive control serum. These control samples should be subjected to the same procedure and incubation times as the test samples. Caution: To avoid cross-contamination, a clean pipette or disposable tip should be used for each transfer.
The following steps must be carried out: _ 41 _

709815/0812709815/0812

A 41 952 b u - 163 27» September T976A 41 952 b u - 163 27 »September T976

1, Aufheizen des Wasserbades auf 43°C„1, heating the water bath to 43 ° C "

2„ Numerieren von zwei Sätzen von Gläschen, damit sie der Kennzeichnung der Testproben und Kontrollproben entsprechen und Einsetzen der Gläschen in einen Gläschenhalter. Der erste Satz dieser Gläschen wird für das Zusammenbringen (Inkubation) der Testproben und Kontrollproben mit den mit Antikörpern beschichteten Scheiben und mit den enzym-markierten Antikörpern verwendet. Der zweite Gläschensatz für die unter Ziff. 12 beschriebene Substrat-Reaktion.2 “Numbering two sets of jars to make them correspond to the labeling of the test samples and control samples and place the vials in a vial holder. The first set of these vials is used for bringing together (incubating) the test samples and Control samples with the discs coated with antibodies and with the enzyme-labeled antibodies used. The second set of vials for the substrate reaction described under item 12.

3. Pipettieren von 0,05 ml (1 Tropfen) des Pferdeglobulin-Reagenz auf den Boden des ersten Satzes von Gläschen. Nichtspezifische, falsche positive Resultate von in manchen menschlichen Seren gegenwärtigen Antikörpern, die mit Pferdeglobulin reagieren, werden durch die Verwendung von Pferdeglobulin als Testprobenverdünnungsmittel mit Vorteil weitgehend eliminiert.3. Pipette 0.05 ml (1 drop) of the equine globulin reagent on the bottom of the first set of jars. Non-specific, false positive results from in Antibodies that react with horse globulin present in some human sera are raised by the Advantageously largely eliminated the use of horse globulin as a test sample diluent.

4. Pipettieren von 0,5 ml von jeder Testprobe auf den Boden der Gläschen des ersten Satzes, wobei auf die entsprechende Probenkennzeichnung zu achten ist; Pipettieren von 0,5 ml der positiven und negativen Kontrollseren auf den Boden der entsprechenden Gläsehen.4. Pipette 0.5 ml of each test sample onto the bottom of the vial of the first set, taking into account the appropriate sample identification must be observed; Pipette 0.5 ml of the positive and negative Control sera on the bottom of the appropriate tubes.

5. Einlegen einer mit Antikörpern beschichteten Scheibe in jedes Gläschen des ersten Satzes. Dabei müssen die Oberflächen der Scheiben sauber gehalten werden. Sie sollten mittels einer sauberen Pinzette oder mittels5. Insert an antibody coated disc in every glass of the first sentence. The surfaces of the panes must be kept clean. she should be done using clean tweezers or by means of

- 42 -- 42 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 b u - 163A 41 952 b u - 163

27. September 1976September 27, 1976

einer spitzen Absaugkanüle transportiert werden, jedoch nicht mit den Fingern berührt werden.be transported with a pointed suction cannula, but not touched with the fingers.

6. Aufbewahren (Inkubieren) der Gläschen bei 43°C in einem Wasserbad während 30 Minuten, wobei die Bewecrungsvorrichtung auf leichte Qewecrung geschaltet ist.6. Store (incubate) the vials at 43 ° C in a water bath for 30 minutes, using the Bewecrungsvorrichtung is switched to slight Qewecrung.

7. Nach dem Zusammenbringen (Inkubieren) der Probe mit der Antikörper-Scheibe vollständiges Absaugen des Überstandes aus jedem Gläschen. Abwaschen der Scheiben, indem 2,5 ml einer isotonischen Salzlösung in jedes Gläschen geschüttet werden. Dieser Vorgang muss wiederholt werden, so dass jede Scheibe zweimal gewaschen wird. Um die gesamte Flüssigkeit abzusaugen, sollte der Gläschenhalter beim Absaugen geneigt werden. Nach dem Zugeben der Waschlösung sollte der Gläschenhalter geschüttelt werden. Die in dem der Absaugvorrichtung zugeordneten Behälter gesammelten unbrauchbaren flüssigen Substanzen sollten vor dem Wegwerfen mindestens eine Stunde bei einer Temperatur von 121°C in einem Autoklaven gehalten werden.7. After the sample has been brought together (incubated) with the antibody disk, the supernatant is completely aspirated from every glass. Wash the slices by pouring 2.5 ml of an isotonic saline solution into each vial will. This process must be repeated so that each disc is washed twice. To the To aspirate all of the liquid, the vial holder should be tilted during aspiration. After adding the Washing solution should be shaken in the vial holder. The one in the container assigned to the suction device Collected unusable liquid substances should be stored for at least one hour before throwing them away Temperature of 121 ° C are kept in an autoclave.

8. Nach dem letzten Waschen und dem Absaugen Zufügen von 0,3 ml der enzym-markierten Antikörper-Lösung in jedes Gläschen.8. After the final wash and aspiration, add 0.3 ml of the enzyme-labeled antibody solution to each Glass.

9. Einstündiges Aufbewahren (Inkubieren) der Gläschen in einem Wasserbad bei 43°C, wobei die auf leichte Bewegung geschaltet ist.9. Store (incubate) the vials for one hour in a water bath at 43 ° C, with the is switched to slight movement.

einem Wasserbad bei 43°C, wobei die Bewegungsvorrichtunga water bath at 43 ° C, with the agitation device

- 43 -- 43 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 - &! - 2643829Sep. 27, 1976 - &! - 2643829

10. Zubereiten des p-Nitropheny!phosphat-Substrates durch Spülen des Inhalts eines Gläschens von p-Nitrophenylphosphat (100 mg) in 100 ml eines verdünnten Substratpuffers. (Der letztere wird durch Hinzufügen von 10 ml von konzentriertem Natrium-Bikarbonat-Puffer zu 90 ml destilliertem Wasser zubereitet). Zur Mischung leicht im Kreise schwenken; die Lösung sollte sofort erfolgen. Beachte: Diese Substratlösung muss an dem Tage zubereitet werden, an dem sie verwendet werden soll. Andernfalls muss sie abgekühlt werden. Eine Lösung, die älter ist als 24 Stunden, sollte weggeschüttet werden.10. Prepare the p-nitropheny! Phosphate substrate Rinse the contents of one vial of p-nitrophenyl phosphate (100 mg) in 100 ml of diluted substrate buffer. (The latter is made by adding 10 ml of concentrated sodium bicarbonate buffer to 90 ml prepared in distilled water). Swirl gently in a circle to mix; the solution should be immediate. Note: This substrate solution must be prepared on the day it is to be used. Otherwise it has to be cooled down. Any solution that is older than 24 hours should be discarded.

11. Absaugen des Überstandes und dreimal Waschen wie in Schritt 7.11. Aspirate the supernatant and wash three times as in Step 7.

12. Transferieren der Scheiben in den zweiten Satz von identisch bezeichneten, sauberen, entsprechend Schritt vorbereiteten Gläschen.12. Transferring the slices to the second set of Identically labeled, clean jars prepared according to step.

13. Hinzufügen von 2,5 ml der p-Nitrophenylphosphat-Substrat-Lösung, wie sie in Schritt 10 zubereitet worden ist, in jedes eine Scheibe enthaltende Gläschen,13. Add 2.5 ml of the p-nitrophenyl phosphate substrate solution, as it was prepared in step 10, in each glass containing a disc,

14. Einstündiges Aufbewahren (Inkubieren) der Gläschen in einem Wasserbad mit 43°C, wobei die auf leichte Bewegung geschaltet ist14. Store (incubate) the vials in a water bath at 43 ° C, which is switched to slight agitation

einem Wasserbad mit 43°C, wobei die Schüttelvorrichtunga water bath at 43 ° C, with the shaker

15. Einbringen von zwei Tropfen einer 3M Natriumhydroxidlösung (etwa insgesamt 0,1 ml) in alle Gläschen, um die Reaktionen zu beenden. Zur guten Durchmischung der15. Add two drops of 3M sodium hydroxide solution (approximately 0.1 ml total) to each vial in order to to end the reactions. For good mixing of the

- 44 -- 44 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 b u - 163A 41 952 b u - 163

27. September 1976September 27, 1976

Reaktionspartner Schütteln des Halters. Innerhalb von vier Stunden nach Beendigung der Reaktionen müssen die Absorptionsmessungen durchgeführt werden.Reactant shaking the holder. Within four hours of the end of the reaction, the Absorption measurements are carried out.

16. Zusammenschütten der drei negativen Kontrollen und Messen der Absorption bei 405 nm in einem Photometer gegen einen Blindwert von destilliertem Wasser. Das Ergebnis wird in Absorptionseinheiten χ 1000 angegeben. Wenn sich bei der negativen Kontrolle ein Wert ergibt, der grosser als 600 ist, ist der Nachweis unbefriedigend und muss wiederholt werden. Wenn ein Durchflussphotometer verv/endet wird und stark positive Proben auftreten, sollte die Küvette vor der Bestimmung der Absorption der nächsten Probe mit destilliertem Wasser ausgespült werden. Wenn Kuvetten verwendet werden, die nicht weggeworfen werden können, muss die Küvette nach jedem positiven Messergebnis mit destilliertem Wasser ausgespült werden.16. Put the three negative controls together and measure the absorbance at 405 nm in a photometer against a blank value of distilled water. The result is given in absorption units χ 1000. If the negative control gives a value that is greater than 600, the evidence is unsatisfactory and must be repeated. If a flow photometer is used / ended and strong positive samples occur, should be removed from the cuvette with distilled water before determining the absorbance of the next sample be rinsed out. If cuvettes are used that cannot be thrown away, the cuvette must be returned rinsed with distilled water for each positive measurement result.

17. Mit der zusammengeschütteten negativen Kontrollsubstanz Justieren des Instrumentes auf Absorption Null. Bestimmen der Absorption jedes Reaktionsgemisches und Aufschreiben der Ergebnisse in Absorptionseinheiten χ 1000. Bei manchen Photometern kann das Instrument bei der zusammengeschütteten negativen Konstrollsubstanz nicht auf Null justiert werden. In diesem Fall muss der Wert der negativen Kontrollsubstanzen vom Wert jeder Probe abgezogen werden.17. Adjust the instrument to absorbance zero with the combined negative control substance. Determine the absorption of each reaction mixture and write down the results in absorption units χ 1000. With some photometers, the instrument cannot work with the negative control substance that has been poured together can be adjusted to zero. In this case, the value of the negative control substances must be different from the value of each sample subtracted from.

- 45 -- 45 -

109815/0812109815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 - 4β*'-September 27, 1976 - 4β * '-

Auswertung der Ergebnisseevaluation of results

Unbekannte Testproben/ deren Messwerte, gemessen in Absorptionseinheiten χ 1000, grosser als 100 sind, wenn man die zusammengeschütteten negativen Kontrollsubstanzen als Blindwert verwendet, sind als reaktiv anzusehen. Es kann wünschenswert sein, den Test bei den Proben zu wiederholen, die als reaktiv angesehen werden. Ehe man ein reaktives Serum als für der Hepatitis zuzuordnende Antigene positiv klassifizieren kann, muss die positive Reaktion durch einen Nachweis mit dem Cordis Bestätigungstestset (Cordis Confirmatory Test Set, Katalog Nr. 783-950) bestätigt werden. Dieser Nachweis muss bei allen reaktiven Proben durchgeführt werden« Ein reaktives Serum, das in dieser Weise durch Neutralisation mit Pferde-Antiserum geprüft worden ist, muss als positiv für Hepatitis-B-Antigene angesehen werden. Wie oben erwähnt, muss die Bestätigungsprüfung zur Auswertung der Ergebnisse unbedingt durchgeführt werden. Der Bestätigungsnachweis wird auch von der Food and Drug Administration und von den Gesetzen vieler "Staaten gefordert. Kurz zusammengefasst wird der Bestätigungsnachweis gemäss der Erfindung folgendermassen durchgeführt: Unknown test samples / their measured values, measured in absorption units χ 1000, greater than 100, if you use the cumulative negative control substances as a blank value, are to be regarded as reactive. It can be desirable be able to repeat the test on samples that are considered reactive. Before using a reactive serum as classify positive for antigens associated with hepatitis the positive reaction must be proven with the Cordis Confirmatory Test Set (Cordis Confirmatory Test Set, Catalog No. 783-950). This proof must for all reactive samples to be carried out «A reactive serum, which is produced in this way by neutralization with equine antiserum must be considered positive for hepatitis B antigens. As mentioned above, the attestation must be taken must be carried out to evaluate the results. Proof of confirmation is also provided by by the Food and Drug Administration and by the laws of many "states. Briefly summarized, the verification of confirmation according to the invention is carried out as follows:

Die positive Testprobe wird zweifach getestet. Nach dem ersten Verfahrensschritt, in welchen die Probe mit der Scheibe in jedem Gläschen zusammengebracht wird, und nach dem Waschen wird eine Scheibe mit für Hepatitis-Antigene spezifischen Antikörpern zusammengebracht? die andere Scheibe wird mit normalen Pferdeserum zusammengebracht. Dieses Zusammenbringen (Inkubation) dauert eine halbe Stunde, daran schliessen sich die gleichen Verfahrensschritte an wie bei dem beschriebenenThe positive test sample is tested in duplicate. After the first Process step in which the sample is brought into contact with the disc in each vial, and after washing becomes a disc with antigens specific for hepatitis Antibodies brought together? the other slice is matched with normal horse serum. This bringing together (Incubation) lasts half an hour, followed by the same procedural steps as described above

- 46 -- 46 -

7Q9815/08127Q9815 / 0812

A 41 952 b
u - 163
A 41 952 b
u - 163

27. September 1976 - Xf - 9RA^R 9 QSept. 27, 1976 - Xf- 9RA ^ R 9 Q

d Od O

Routinenachweis. Wenn die Probe für Hepatitis-Äntigene positiv ist, dann wird die Probe, die mit den Pferde-Antikörpern zusammengebracht worden ist, einen sehr geringen Wert haben, während die Scheibe, die mit normalen Pferdeserum zusammengebracht worden ist einen hohen Wert zeigen wird, der dem bei dem Routinenachweisverfahren aufgefundenen Wert entspricht.Routine evidence. If the sample is positive for hepatitis antigens then the sample that has been brought into contact with the horse antibodies will have a very low value, while the slice that has been combined with normal horse serum will show a high value that corresponds to that corresponds to the value found in the routine verification procedure.

Proben mit geringer Konzentration der Hepatitis-Äntigene haben üblicherweise niedrige Endmesswerte. Die Proben mit hoher Konzentration der Hepatitis-Äntigene haben dagegen hohe Messwerte. Innerhalb eines schmalen Bereiches von Konzentrationsunterschieden wird der Messwert der optischen Dichte etwa eine quantitative Aussage über die Konzentration der in der Probe vorliegenden Hepatitis-Äntigene geben.Have specimens with low levels of hepatitis antigens usually low final readings. The samples with a high concentration of the hepatitis antigens, on the other hand, have high measured values. Within a narrow range of concentration differences, the measured value of the optical density is approximately provide a quantitative statement about the concentration of the hepatitis antigens present in the sample.

Grenzen des VerfahrensLimitations of the procedure

1. Nichtreproduzierbare Reaktivität: Wenn ein wiederholter Nachweis bei einer reaktiven Probe Werte ergibt, die unterhalb des Grenzwertes 100 liegen, ist anzunehmen, dass der Versuch unreproduzierbar reaktiv ist; es ist dann anzunehmen, dass die Probe für Hepatitis-Äntigene negativ ist. Das erste Ergebnis kann dann auf einen Fehler bei der Durchführung des Nachweises zurückzuführen sein, z.B. auf ungenügendes Waschen.1. Non-reproducible reactivity: If repeated detection of a reactive sample shows values that lie below the limit value 100, it can be assumed that the experiment is unreproducibly reactive; it is then assume the sample is negative for hepatitis antigens. The first result can then refer to one Errors in the implementation of the verification can be traced back to, e.g. insufficient washing.

2. Nichtspezifische positive Reaktionen: Nichtspezifische, falsche positive Ergebnisse von Antikörpern, die in manchen menschlichen Seren vorhanden sind und die mit Pferdeglobulin reagieren, werden im wesentlichen durch2. Non-specific positive reactions: Non-specific, false positive results from antibodies contained in Some human sera are present and which react with equine globulin are essentially through

- 47 -- 47 -

709815/0812709815/0812

A 41 952 bA 41 952 b

u - 163u - 163

27. September 1976 - (& - *> R A *ϊ ft 2 QSept. 27, 1976 - (& - *> RA * ϊ ft 2 Q

S-/S- /

die Verwendung von Pferdeglobulin in der Testprobenlösung eliminiert.eliminated the use of horse globulin in the test sample solution.

3. Plasma von Blut, das in EDTA gesammelt wird, sollte nicht verwendet werden.3. Plasma from blood collected in EDTA should not be used.

Es ist darauf hinzuweisen, dass die Verweilzeiten (Inkubationszeiten) für die verschiedenen Verfahrensschritte und die Temperaturen, bei welchen das Zusammenbringen (Inkubation) durchgeführt wird, innerhalb eines grösseren Zeit- und Temperaturbereiches variiert werden können. Die Erfindung soll daher nicht auf bestimmte Zeiten oder Temperaturen des Zusammenbringens (Inkubation) beschränkt werden. So kann beispielsweise die Zeit des Zusammenbringens (Inkubation) des unlöslichen Körpers mit der' Probe zwischen 10 Minuten und 24 Stunden schwanken, wobei die Temperatur der Inkubation zwischen 2°C und 50°C liegen kann. Andererseits kann die Inkubationszeit des unlöslichen Körpers mit dem enzym-markierten Bindungspartner zwischen 30 Minuten und 24 Stunden liegen, wobei die Temperatur der Inkubation des unlöslichen Körpers mit dem enzym-markierten Bindungspartner zwischen 2°C und 5O°C liegen kann.It should be noted that the residence times (incubation times) for the various process steps and the temperatures at which the bringing together (incubation) is carried out, can be varied within a larger time and temperature range. The invention aims to therefore not to specific times or temperatures of the bringing together (Incubation). For example, the time of bringing together (incubation) of the insoluble Body with the 'sample fluctuate between 10 minutes and 24 hours, the temperature of the incubation between 2 ° C and 50 ° C. On the other hand, the incubation period of the insoluble body with the enzyme-labeled binding partner between 30 minutes and 24 hours, wherein the temperature of the incubation of the insoluble body with the enzyme-labeled binding partner should be between 2 ° C and 50 ° C can.

Es ist ferner darauf hinzuweisen, dass das erfindungsgemässe Verfahren dazu verwendet werden kann, die Anwesenheit von der Hepatitis zuzuordnenden Antigenen in jeder Körperflüssigkeit zu bestimmen, in welcher Antigene gegenwärtig sind. So kann dieses Verfahren verwendet werden, um die Anwesenheit dieser Antigene in Serum, Plasma, Plasmabestandteilen, Serumbestandteilen, Urin, Speichel und Zerebrospinal-Flüssigkeit zn bestimmen. It should also be pointed out that the method according to the invention can be used to determine the presence of antigens that can be assigned to hepatitis in any body fluid in which antigens are present. Thus, this method can be used to detect the presence of these antigens in serum, plasma, zn determine plasma components, serum components, urine, saliva and cerebrospinal fluid.

- 48 -- 48 -

09815/081209815/0812

A 41 952 b u - 163A 41 952 b u - 163

27. September 1976September 27, 1976

26438232643823

ErgebnisseResults

Eine repräsentative Angabe von Ergebnissen, die bei der Durchführung erfindungsgemässer Tests erzielt worden sind, sind im folgenden aufgeführt. Die Ergebnisse in Tabelle A sind die Ergebnisse von Nachweisversuchen gemäss der Erfindung für Proben, die sich bei Überprüfung mit der CEP-Methode als Hepatitis-positiv ergeben. Die Werte in Tafel B sind Werte für Testproben, die sich bei der Untersuchung mit der Radio-Immunonachweis-Methode als Hepatitis-positiv, jedoch bei Untersuchung mit der CEP-Methode als Hepatitis-negativ ergeben. Die Werte in Tafel C sind Werte für Testproben, die sich sowohl mit der RIA-Methode als auch mit der CEP-Methode als Hepatitis-negativ herausstellen. Die in den Tabellen A, B und C für die verschiedenen Testproben angegebenen Zahlenwerte sind Wertedie beim Nachweis mit dem erfindungsgemässen Verfahren erhalten worden sind. Die Zahlenwerte sind angegeben in Absorptionseinheiten χ 1000 (O.D.x 1000), wobei die Absorption bei einer Wellenlänge von 405 nm (OD 405) gemessen worden ist.A representative indication of results which have been achieved when carrying out tests according to the invention are given below. The results in Table A are the results of detection tests according to the invention for samples which are found to be positive for hepatitis when checked using the CEP method. The values in Table B are values for test samples which are positive for hepatitis when examined using the radio-immunodetection method, but negative for hepatitis when examined using the CEP method. The values in Table C are values for test samples which were found to be negative for hepatitis using both the RIA method and the CEP method. The numerical values given in Tables A, B and C for the various test samples are values obtained "in the detection of the with the inventive method. The numerical values are given in absorption units χ 1000 (ODx 1000), the absorption having been measured at a wavelength of 405 nm (OD 405).

- 49 -- 49 -

709815/081 2709815/081 2

A 41 952 b u - 163A 41 952 b u - 163

27. September 1976September 27, 1976

- US -- US -

:6Λ3829: 6Λ3829

Tabelle ATable A. Tabelle BTable B. (O.D. χ 1000}
OD4O5
(OD χ 1000}
OD4O5
TabelleTabel CC.
CEP+CEP + RIA+ CEP-RIA + CEP- 27452745 NegNeg Test-
probe
Test-
sample
(O.D.x 1000)
OD 40 5
(ODx 1000)
OD 40 5
Test-
probe
Test-
sample
26752675 Test
probe
test
sample
(O.D. χ 1000)
OD4O5
(OD χ 1000)
OD4O5
7272 28072807 6565 22662266 8888 00 7373 28022802 6868 13541354 8989 00 7979 28152815 6969 265265 9090 00 8282 28222822 7575 953953 9191 2323 121121 28312831 7777 13831383 9292 4242 201201 27682768 8181 16881688 9393 00 202202 27802780 8787 27392739 9494 00 205205 27492749 123123 17411741 9797 '38'38 206206 27582758 124124 285285 9898 00 208208 27952795 125125 24662466 9999 00 209209 28002800 204204 26362636 100100 00 210210 27642764 243243 101101 00 213·213 27762776 261261 102102 00 214214 28042804 103103 00 217217 27952795 104104 00 218218 28002800 203203 00 219219 27462746 207207 00 220220 27182718 211211 88th 226226 26952695 212212 00 228228 27822782 215215 00 232232 27602760 216216 00 234234 27742774 224224 00 235235 27642764 225225 00 238238 27602760 227227 00 239239 27552755 229229 00 244244 27302730 230230 00 250250 27072707 231 '231 ' 00 251251 27612761 233233 4545

- 50 -- 50 -

709815/0812-709815 / 0812-

A 41 952 b u - 163A 41 952 b u - 163

27. September 1976 - SOSep. 27, 1976 - SUN

Tabelle A
(Fortsetzung)
Table A.
(Continuation)
CEP+CEP + Test
probe
test
sample
(O.D.x 1000)
OD4O5
(ODx 1000)
OD4O5
252252 27782778 253253 27832783 254254 27422742 255255 27432743 256256 27842784 260260 27752775

Tabelle C (Fortsetzung) Table C (continued)

N egN eg

Test- (O.D.x 1000) probe OD4O5Test (O.D.x 1000) sample OD4O5

240240 00 241241 00 242242 00

- 51 -- 51 -

709815/0812709815/0812

LeerseiteBlank page

Claims (9)

A 41 952 b u - 163 27. September 19 76 - Patentansprüche:A 41 952 b u - 163 September 27, 19 76 - Claims: 1. Verfahren zum Feststellen der Anwesenheit eines der Hepatitis zuzuordnenden Antigens in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:1. Procedure for determining the presence of one of the Hepatitis-associated antigen in a sample, characterized in that it has the following steps includes: (a) Zusammenbringen (Inkubation) der Probe mit einem unbeweglich an einem unlöslichen Körper gehaltenen, mit dem Hepatitis-Antigen reaktionsfähigen Antikörper, wobei sich bei dem Zusammenbringen eine Bindung zwischen Antikörper(a) Bringing (incubating) the sample with an immobile on an insoluble body held antibodies reactive with the hepatitis antigen, which when brought together a bond between antibodies und in der Probe vorliegendem Antigen ausbildet und ein unlöslicher Körper mit daran gebundenem Antigen entsteht, falls Hepatitis-Antigene in der Probe vorliegen,and forms antigen present in the sample and an insoluble body with bound thereto Antigen is produced if there are hepatitis antigens in the sample, (b) Trennen des unlöslichen Körpers von jeglicher nicht gebundener Substanz,(b) separating the insoluble body from any unbound substance, (c) Zusammenbringen (Inkubation) des unlöslichen Körpers mit einer markierte, mit den Hepatitis-Antigenen reaktionsfähige Antikörper enthaltenden Lösung, wobei die markierten Antikörper mittels eines Enzyms markiert sind, welches derart auf ein Substrat einwirken kann, dass ein nachweisbares Reaktionsprodukt entsteht, und wobei das Zusammenbringen derart geführt wird? dass die markierten Antikörper mit jedem im Schritt(a)mit einem Antikörper an dem unlöslichen Körper gebundenen Antigen eine Bindung(c) Bringing (incubating) the insoluble body into contact with a labeled solution containing antibodies which are reactive with the hepatitis antigens, the labeled antibodies being labeled by means of an enzyme which can act on a substrate in such a way that a detectable reaction product is formed, and where the bringing together is conducted in this way ? that the labeled antibodies bind with any antigen bound to the insoluble body in step (a) with an antibody - 52 -- 52 - 7 0 98-1 5/0817 0 98-1 5/081 A 41 952 bA 41 952 b eingehen können,can enter, (d) Trennen des unlöslichen Körpers von der die enzym-markierten Antikörper enthaltenden Lösung, um jeglichen ungebundenen, markierten Antikörper davon zu entfernen,(d) separating the insoluble body from the solution containing the enzyme-labeled antibodies, to remove any unbound, labeled antibody therefrom, (e) Zusammenbringen (Inkubation) des unlöslichen Körpers mit einer Substratlösung, auf die das Enzym des markierten Antikörpers einwirkt und dadurch eine chemische Veränderung des Substrats herbeiführt, bei welcher ein nachweisbares Reaktionsprodukt gebildet wird, und(e) bringing the insoluble body into contact (incubation) with a substrate solution onto which the The enzyme of the labeled antibody acts and thereby a chemical change in the substrate brings about at which a detectable reaction product is formed, and (f) Nachweisen jeglichen in der Lösung vorliegenden Reaktionsproduktes, um die Anwesenheit von Hepatitis-Antigenen nachzuweisen.(f) Detecting any reaction product present in the solution to determine the presence of Detect hepatitis antigens. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsprodukt durch Messung der optischen Absorption der Substratlösung nachgewiesen wird.2. The method according to claim 1, characterized in that that the reaction product is detected by measuring the optical absorption of the substrate solution. 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die markierten Antikörper immunochemisch aktive Hepatitis-Antikörper umfassen, die mit enzymatisch aktiver Alkaliphosphatase verbunden sind.3. The method according to any one of claims 1 or 2, characterized characterized in that the labeled antibodies comprise immunochemically active hepatitis antibodies which are associated with enzymatically active alkaline phosphatase. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Substratlösung p-Nitrpphenylphosphat enthält.4. The method according to claim 3, characterized in that that the substrate solution contains p-nitrophenyl phosphate. - 53 -- 53 - ?098 15/0812? 098 15/0812 A 41 952 b u - 163A 41 952 b u - 163 27. September 1976September 27, 1976 264382S264382S 5. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der unlösliche Körper eine wasserunlösliche Polymermatrix mit einer auf ihrer Oberfläche angeordneten Schicht reaktiver Gruppen umfasst, die mit einem Hepatitis-Antikörper eine kovalente Bindung eingehen können, und dass die Oberflächen des unlöslichen Körpers verformt sind, um Matrixoberflächen zu erhalten, die beim Einlegen der Matrix in ein Gläschen mit flachem Boden im wesentlichen mit der Lösung im Gläschen in Berührung kommen, während der Flächen-Flächen-Kontakt zwischen der Matrix und dem Gläschenboden möglichst klein gehalten wird.5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the insoluble body a water-insoluble polymer matrix with a layer more reactive on its surface Includes groups that can form a covalent bond with a hepatitis antibody, and that the Surfaces of the insoluble body are deformed in order to obtain matrix surfaces, which upon insertion the matrix in a flat-bottomed vial is essentially in contact with the solution in the vial come, while the surface-surface contact between the matrix and the bottom of the vial is as small as possible is held. 6. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der sich beim Nachweis eines jeden Reaktionsproduktes ergebende Wert mit einem Wert verglichen wird, der sich bei einer Probe ergibt, die bekanntermassen Hepatitis-Antigene enthält. 6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the detection of each reaction product is compared with a value obtained for a sample known to contain hepatitis antigens. 7. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt (a)verwendete Probe eine menschliche Flüssigkeit ist.7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the in step (a) used Sample is a human liquid. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die menschliche Flüssigkeit aus der Serum, Plasma, Plasmakomponenten, Serumkomponenten, Urin, Speichel und Zerebrospinal-Flüssigkeit umfassenden Gruppe ausgewählt wird.8. The method according to claim 7, characterized in that the human fluid from the serum, Including plasma, plasma components, serum components, urine, saliva and cerebrospinal fluid Group is selected. - 54 -- 54 - 7ÖS815/087ÖS815 / 08 A 41 952 b u - 163A 41 952 b u - 163 27. September 1976September 27, 1976 9. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen bestimmt wird, das der Hepatitis B zuzuordnen ist.9. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the antigen that can be assigned to hepatitis B is determined. 9815/0819815/081
DE19762643829 1975-09-29 1976-09-29 PROCEDURE FOR DETERMINING THE PRESENCE OF ANTIGENT ASSOCIATED WITH HEPATITIS Ceased DE2643829A1 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US61774675A 1975-09-29 1975-09-29
US61774475A 1975-09-29 1975-09-29
US06/617,743 US4474878A (en) 1975-09-29 1975-09-29 Sandwich EIA for antigen associated with hepatitis
US05/617,745 US4157280A (en) 1975-09-29 1975-09-29 Test set for detecting the presence of antigens associated with hepatitis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE2643829A1 true DE2643829A1 (en) 1977-04-14

Family

ID=27505141

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19762643829 Ceased DE2643829A1 (en) 1975-09-29 1976-09-29 PROCEDURE FOR DETERMINING THE PRESENCE OF ANTIGENT ASSOCIATED WITH HEPATITIS

Country Status (7)

Country Link
JP (1) JPS5257316A (en)
CA (1) CA1106281A (en)
DE (1) DE2643829A1 (en)
FR (1) FR2325934A1 (en)
GB (1) GB1571196A (en)
NL (1) NL7610801A (en)
SE (1) SE7610683L (en)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2016687B (en) * 1978-03-20 1982-09-08 Abbott Lab Sugar coated reagents for solid phase immunoassay
US4241175A (en) * 1978-12-18 1980-12-23 Merck & Co., Inc. Assay for hepatitis B core antibody
CA1148859A (en) * 1979-06-14 1983-06-28 Lacy R. Overby Simultaneous assay of two hepatitis viruses using a solid phase
DE3477610D1 (en) * 1983-09-14 1989-05-11 Akzo Nv Method for the immunochemical determination of hepatitis b core antigens
JPH0318011U (en) * 1989-07-05 1991-02-22
JP3058673B2 (en) * 1989-11-10 2000-07-04 株式会社明電舎 Method for measuring cytokine and kit for measuring the same
KR101799826B1 (en) * 2016-09-19 2017-11-21 바이오뱅크 주식회사 Multi-unit for conducting biochemistry and immunoassey analysis and testing-Method using thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2262479A1 (en) * 1971-12-21 1973-06-28 Abbott Lab TEST DEVICE FOR DIRECT RADIOIMMUNE TESTING FOR ANTIGENS OR ANTIBODIES THEREOF
US3791932A (en) * 1971-02-10 1974-02-12 Akzona Inc Process for the demonstration and determination of reaction components having specific binding affinity for each other
US3867517A (en) * 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
DE2448411A1 (en) * 1973-10-11 1975-05-22 Miles Lab METHOD AND DEVICE FOR DETERMINING SUBSTANCES WITH A MUTUAL SPECIFIC BINDING AFFAIR

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3654090A (en) * 1968-09-24 1972-04-04 Organon Method for the determination of antigens and antibodies
NL154599B (en) * 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv PROCEDURE FOR DETERMINING AND DETERMINING SPECIFIC BINDING PROTEINS AND THEIR CORRESPONDING BINDABLE SUBSTANCES, AND TEST PACKAGING.
US4034072A (en) * 1975-07-21 1977-07-05 Corning Glass Works Serum hepatitis test

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3791932A (en) * 1971-02-10 1974-02-12 Akzona Inc Process for the demonstration and determination of reaction components having specific binding affinity for each other
DE2262479A1 (en) * 1971-12-21 1973-06-28 Abbott Lab TEST DEVICE FOR DIRECT RADIOIMMUNE TESTING FOR ANTIGENS OR ANTIBODIES THEREOF
US3867517A (en) * 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
DE2448411A1 (en) * 1973-10-11 1975-05-22 Miles Lab METHOD AND DEVICE FOR DETERMINING SUBSTANCES WITH A MUTUAL SPECIFIC BINDING AFFAIR

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Steroid Immunoassay, Proceedings of the 5th Tenovus Workshop Cardiff April 1974, Veröffentlicht Januar 1975, S. 183-188 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA1106281A (en) 1981-08-04
GB1571196A (en) 1980-07-09
NL7610801A (en) 1977-03-31
JPS5257316A (en) 1977-05-11
SE7610683L (en) 1977-06-10
FR2325934A1 (en) 1977-04-22
JPS6224745B2 (en) 1987-05-29
FR2325934B1 (en) 1982-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69522831T2 (en) ASSAYS AND DEVICES FOR DETECTING EXTRAHEPATIC BILIARY ATRESIA
EP0008432B1 (en) Immunological determination process
DE69409401T2 (en) FAST IMMUNOLOGICAL TEST PROCEDURE FOR DETECTING ANTIBODIES OR ANTIGENS INCLUDING SIMULTANEOUS DETECTION OF SAMPLES AND IMMUNOGENIC REACTION
DE68925185T2 (en) Methods for drying mammalian cells for use in solid phase immunoassays and articles containing the same
US4474878A (en) Sandwich EIA for antigen associated with hepatitis
DE69231362T2 (en) SIMULTANEOUS TESTING OF MEDICINAL PRODUCTS AND FINGERPRINT TEST PROCEDURE
DE3136579C2 (en)
DE3872500T2 (en) USE OF A BIOTIN-IMMOBILIZED RECEPTOR IN A TEST DEVICE, TEST SET AND METHOD FOR DETERMINING A LIGAND.
DE2560288C2 (en) Sample holder for the fluorometric determination of substance samples
EP0305337A1 (en) Method for the detection of antigens and/or antibodies, and a kit for carrying out the method
DE2633877A1 (en) PROCEDURES FOR ANTIGENS IN THE SOLID STAGE IMMUNITY TESTING
DE2608667A1 (en) SOLIDS DIAGNOSTIC REAGENT AND METHOD FOR MANUFACTURING THEREOF
DE69626683T2 (en) METHOD FOR DETECTING ANTIPOLYMER ANTIBODIES AND DIAGNOSTIC TEST SET FOR DETECTING SILICONE-DEPENDENT DISEASES
US4642285A (en) Sandwich EIA for antigen
DE68917039T2 (en) Microporous article with stabilized specific binding reagent, procedure for use and a diagnostic test kit.
US4157280A (en) Test set for detecting the presence of antigens associated with hepatitis
DD245727A5 (en) A METHOD FOR DETECTING AND / OR MEASURING CLINICAL PARAMETERS IN THE IMMUNIZATION PROCESS OF ENZYMES
DE2653032A1 (en) RADIOIMMUNE DETECTION METHOD FOR THYROID HORMONE AND SUITABLE REAGENT
DE3117725A1 (en) METHOD FOR DETERMINING MYCOBACTERIES AND PROTEIN AND FINISHED PACK FOR THEIR IMPLEMENTATION
DE69012552T2 (en) AVIDIN-BIOTIN ASSISTED IMMUNASSAY PROCEDURE.
EP0292810A2 (en) One-step immunoassay for the determination of antigen-specific antibodies from one of the immunoglobulin classes A,M,D or E and reagent therefor
DE2134928A1 (en) Biological reagent
JP2990528B2 (en) Rectal mucus test and kit for detection of cancer and precancerous conditions
JPS59155762A (en) Field immunoassay reaction system and method thereof
DE68918643T2 (en) Articles for performing immunoassays using organic dyes, and methods for making and using them.

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
8131 Rejection