DE2629808C2 - Verfahren zur Stabilitätsverbesserung von Dehydrogenasen - Google Patents
Verfahren zur Stabilitätsverbesserung von DehydrogenasenInfo
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Description
Dehydrogenasen und andere Enzyme werden in zahlreichen
biochemischen, insbesondere quantitativ-analytischen Verfahren verwendet. Beispielsweise ist es aus
»Methoden der enzymatischen Analyse«, H. U. Bergmeyer
Verlag Chemie Weinheim. 3. neubearbeitete und erweiterte Auflage 1974. Band II, Seiten 1545 bis 1551
bekannt. Äthanol etwa in Blut oder Urin quantitativ in
der Welse zu bestimmen, daß man der älhanolhaltigen
Lösung Nikotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) als
Coen/ym unü außerdem Mkohol-Dehydrogenase (ADH) als katalysierendes Enzym /uset/t und dabei Acetaldehyd
und die reduzierte Form des Nikotinamid-adenindinudeolids
(NADH) bekommt. Da die Bildung von NADH. gemessen an der Extinktionszunahme bei 340
(334. y>>) ran, der Äthanolmenge in der Bestimmungslösung
proportional ist. Iflßt steh durch Bestimmung der
Extinktion für NADH mit Hilfe eines Spektralpholometcrs
der Äthanolgehalt in der Bestimmungslösung quantitativ
ermitteln
Dehvdroeenasen sind größtenteils mehr oder weniger empfindlich und verlieren daher schnell ihre Aktivität.
Daher ist es allgemein üblich, derartige Enzyme in wäßriger Lösung zu verwenden und die Lösung kurz vor der
Verwendung anzusetzen. Dies gilt insbesondere für die AJkoboJ-Dehydrogenase, die besonders empfindlich ist.
so daß bereits geringste Konzentrationen an Inhibitoren zur sofortigen Umsetzung mit den freien SH-Gruppen Im
Molekül uno zu einer Schädigung des Enzyms führen. Zu den Inhibitoren der ADH zühlen alle Schwermetalllonen,
Chlorldlonen und andere Verbindungen.
Aus der oben zitierten Lltcratursteile in »Methoden der
enzymatischen Analyse« ist es bekannt, der Behandlungslösung zur Verbesserung der Stabilität Puffer zuzusetzen,
insbesondere Natriumpyrophosphat, doch können auch andere Phosphatpuffer. Tris- oder Tram-Puffer verwendet
werden. Aus der US-PS 34 93 467 ist es weiterhin bekannt, der Behandlungslösung bei der Äthanolbestimmung
außer einem Phosphatpuffer noch Albumin und Glycin zuzusstzen.
In neuerer Zelt ist man mehr und mehr bestrebt, derartige
Verfahren nicht mii gelösten Enzymen, sondern mit
ίο trägergebundenen Enzymen durchzuführen, da in diesem
Fall das Enzym immer wieder verwendet werden kann. Derartige Methoden verlangen aber eine sehr viel höhere
Stabilität des Enzyms als bei Verwendung in wäßriger Lösung, da die trägergebundenen Enzyme potentiellen
is Inhibitoren sehr viel länger ausgesetzt sind. Aus diesem
Grund war es bisher nicht möglich, bestimmte Dehydrogenasen in trägergebundener Form zu verwenden, was
insbesondere für die Alkohol-Dehydrogen .se gilt.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, die Stabilität von Dehydrogenasen und
besonders von Alkohol-Dehydrogenase in Berührung mit der Behandlungslösung weiter zu verbessern, so daß man
die Dehydrogenasen über längere Zeiträume in Berührung mit der Behandlungslösung belassen kann. Die
Lösung dieser Aufgabe ist Voraussetzung für die Verwendung der Dehydrogenasen in trägergebundenem
Zustand.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Stabilitätsverbesserung
von Dehydrogenasen, insbesondere Alkohol-Dehydrogenase, in wäßriger Lösung oder trägergebundenem
Zustand durch Zugabe von Phosphatpuffer, Albumin und GI>cin zu der mit der Dehydrogenase in Berührung
stehenden Behandlungslösung ist dadurch gekennzeichnet, daß man zu der Behandlungslösung zusätzlich
Cystein in einem Molverhältnis von Cystein zu Glycin von 0,0001 bis 0,1 : 1 zugibt. Die Patentansprüche 2 bis 5
nennen Ausgestaltungen der Erfindung.
Überraschenderweise wurde nämlich gefunden, daß die Kombination von Phosphatpuffer, Albumin, Glycin
■w und Cystein in der Behandlungslösung, mit der die
Dehydrogenasen in Berührung stehen, eine sprunghafte Stabilitätsverbesserung für die Dehydrogenasen erbringt,
so daß es möglich ist. entweder wäßrige Lösungen der Dehydrogenasen über längere Zeiträume stehenzulassen
■»5 oder, was wichtiger ist. die Dehydrogenasen in trägergebundene
Zustand einzusetzen.
Das Cystein ist als .Stabilitätsverbesserer in Kombination
mit den anderen genannten Komponenten bereits in sehr geringen Konzentrationen wirksam. Zweckmäßig
M setzt man Cystein und Glycin der Behandlungslösung in
einem Molverhältnis von Cystein zu Glycin von 0,001 bis 0.02 : I zu. Betrachtet man die Konzentration der
Bestandteile in der Behandlungslösung, so ist es zweckmäßig, eine Behandlungslösung zu verwenden, die das
w Cystein in einer Konzentration von 0,1 bis 20, vorzugsweise
i bis 10. besonders 2 bis 6 mg pro Liter enthält. Das Glycin enthält die Behandlungslösung /weckmäßig
in einer Konzentration von 0,1 bis 10 aber vorzugsweise von 1 bis 5 g je Liter. Das Albumin enthält sie zweckmä-
b0 ßlg in einer Konzentration von 0,1 bis 5, vorzugsweise
von 0,5 bis 1 g je Liier.
Der Phosphatpuffer, vorzugsweise Natriumpyropbosphat,
wird der Behandlungslösung in üblichen, aus dem Stand der Technik bekannten Konzentrationen zugesetzt,
um den bekanntermaßen für das betreffende Enzym erforderlichen pH-Wert zu bekommen. Für Alkohol-Dehydrogenase
Hegt das pH-Optimum beispielsweise bei pH 8,5.
Wie erwähnt, gehören zu den Inhibitoren insbesondere der Alkohol-Dehydrogenase alle Schwermetallionen, die
sich in den meisten Bestimmungslösungen finden, wie in Blut, im Serum, im Urin oder in alkoholischen Getränken,
wie im Wein Aus diesem Grund ist es bevorzugt, der Behandlungslösung zusätzlich noch wenigstens einen
wasserlöslichen Komplexbildner für mehrwertige Metallionen
zuzusetzen. Derartige Komplexbildner sind beispielsweise Äthylendiaminietr.iessigsäure. verschiedene
Metallsalze derselben, wie das Dinatrfumsalz, Magnesiuni-Dikaliumsalz
oder Zink-Dinatriumsalz, sowie Nitrilotriessigsäure.
Äthylendiamintetraessigsäure ist für die Erfindung der bevorzugt verwendete Komplexbildner.
Bei der Zugabe des Komplexbildners ist zu beachten, daß dieser der Behandlungslösung in einer Konzentration
zugegeben wird, die nicht selbst inhibierend auf die Dehydrogenase einwirkt. Beispielsweise zählt Äthylendiamintetraessigsäure
(EDTA) zu den inhibitoren für Alkohol-Dehydrogenase. wenn sie in bestimmten Konzentrationen
eingesetzt wird. Bei der Zugabe von 0,1 Mol EDTA je Litei der Behandlungslösung tritt bereits eine
etwa 10%ige Inhiblenng ein. Es ist daher zweckmäßig,
den Komplexbildner, insbesondere die EDTA in einer Menge von 0,0001 bis 0,01, vorzugsweise in einer Menge
von 0,01 bis 0,05 Mol je Liter Behandlungslösung zuzugeben.
Insbesondere bei Verwendung trägergebundener
Dehydrogenasen ist es weiterhin bevorzugt, der Behandlungslösung ein Bakteri^statikum zuzusetzen, c'as der
Stabilisierung insbesondere des Trägers selbst dient, fcs
können an sich bekannte Bakteriostatika hier/u verwendet
werden, d-jh ist es bevorzugt. Natriumazid
(NaNi) zu verwenden. Da auch Azide an sich inhibierende
Wirkung auf Dehydrogerisen /cVjen können, ist
es zweckmäßig, das BakteriostatiK-im NaNi nur in Konzentrationen
von etwa 0,0001 bisO.Oi, vorzugsweise von
0,01 bis 0,05 Mo! je Ilter Behandlungslösung /u/ugeben
In diesem Konzenlrationsbereich wurde auch bei Alkohol -üehydrogenase keine inhibierende Wirkung des Natriumazids
beobachtet.
Wenn man eine solche Behandlungslösung, wie sie
oben bezüglich der verschiedenen Komponenten beschrieben wurde, zur quantitativen Bestimmung von
Äthanol mit Hilfe von Alkohol-Dehydrogenase verwendet, wobei Acetaldehyd gebildet wird, ist es erforderlich
oder zumindest zweckmäßig, zur Beschleunigung der Reaktion durch Gleichgewichtsverschiebung den Acetaldehyd
aus dem Reaktionsmedium abzufangen. Es sind verschiedene Abfangmittel hierzu bekannt, wie beispielsweise
Semicarbazid oder die aus der US-PS 34 93 467 bekannten Hydroxylaminderivate, nämlich Aminooxyalkansäuren
und Aminooxysullonsäuren. Als besonders geeignet erwies sich jedoch nunmehr als Abfangmittel
Serin, wie DL-Serin, das beispielsweise In Mengen von 0,001 bis 1 MoI pro Liter, vorzugsweise von 0,01 bis 0,5
Mol pro Liter Behandlungslösung eingesetzt werden kann.
Im übrigen setzt man der Behandlungslösung übliche Stoffe zu, die aus dem Stand der Technik bekannt sind.
So wird für die quantitative Analyse der Behandlungslösung ein Coenzym zugegeben, wie Nikotinamidadenindinucleotid,
wobei die zugegebenen Mengen hierbei dem Stand der Technik entsprechen.
Dieses Beispiel beschreibt die Zusammensetzung einer Behandiungslösung, die als Durchflußlösung in Verbindung
mit trägergebundener Alkohof-Dehydrogenase geeignet ist. Diese Lösung enthält pro Liter:
| 67 | mMoi | Na4P2O7 · 10H2O |
| 0,699 | g | Albumin |
| 30 | mMoi | Glycin |
| 0.036 | ffiMol | Cystein |
| JO | mMoi | Serin (zum Abfangen des Acetaldehyds) |
| 1 | g | NaNj (als Bakteriostatikum) |
| 1 | g | EDTA (zur Komplexierung von Schwermetallionen) |
| 2,1 | mMoi | NAD (als Coenzym) |
Zum Ansetzen der Lösung wurde bidestilliertes Wasser
benutzt. Die Lösung besaß direkt pH 8,5, was dem in der Literatur angegebenen pH-Optimum entspricht.
Verglelchsbelsplel
Zwei Reaktoren mit trägergebundener Alkohol-Dehydrogenase wurden je rait einer Lösung nach dem Beispiel
und mit einer Lösung nach dem Beispiel unter Weglassen von Cystein gelagert. Die Enzymaktivität
wurde nach einer üblichen Methode (H. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie
Weinheim, 3. Auflage 1974, Band H, Seiter. 1545 bis 1551) bestimmt. Die Reaktoren wurden bei Raumtemperatur
(20 bis 25° C) gelagert und die Enzymaktivität im Verlauf der Lagerung überprüft. Aus der nachfolgenden
Tabelle geht die deutlich höhere Stabilität der Alkohol-Dehydrogenase
In der Lösung mit Cystein hervor.
(die bei beiden Reaktoren jeweils am Anfang gemessenen Aktivitäten werden gleich 100% gesetzt)
| Lager/eit | Losung mit Cystein | Lösung ohne Cystein |
| frisch | 1007., | 100% |
| 1 fag | 101% | 98% |
| 2 Tage | 98% | 95% |
| 5 Tage | 97% | 86% |
| 2 Wochen | 94 „ | 77% |
| 4 Wochen | 90"., | 56% |
| 10 Wochen | 84% | 44",, |
Claims (5)
1. Verfahren zur Stabilitätsverbesserung von Dehydrogenasen, insbesondere Alkohol-Dehydrogenase,
in wäßriger Lösung oder trägergebundenem Zustand durch Zugabe von Phosphatpuffer, Albumin
und Glycin zu der mit der Dehydrogenase in Berührung stehenden Behandlungslösung, dadurch gekennzeichnet,
daß man zu der Behandlungslösung zusätzlich Cystein in einem Molverhältnis von
Cystein zu Glycin von 0,0001 bis 0,1 : 1 zugibt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Cystein der Behandlungslösung
in einem Molverhältnis von 0,001 bis 0,02: 1 zusetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man der Behandlungslösung
zusätzlich wenigstens einen wasserlöslichen Komplexbildner für mehrwertige Metallionen in einer Menge
von 0,0001 bis 0,01 MoI je Liter Behandlungslösung zusetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als wasserlöslichen Komplexbildner
für mehrwertige Metallionen Äthylendiamintetraessigsäure
einsetzt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 unter Verwendung von Alkohol-Dehydrogenase bei
der quantitativen Bestimmung von Alkohol, dadurch gekennzeichnet, daß man der Behandlungslösung
noch Serin In einer Menge von 0,001 bis 1 Mol je Liter
Behandlungslösung zusetzt.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE19762629808 DE2629808C2 (de) | 1976-07-02 | 1976-07-02 | Verfahren zur Stabilitätsverbesserung von Dehydrogenasen |
Applications Claiming Priority (1)
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2629808A1 DE2629808A1 (de) | 1978-01-05 |
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Families Citing this family (4)
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| US5141854A (en) * | 1990-12-13 | 1992-08-25 | Hoffman-La Roche, Inc. | Enzymatic composition for ethanol assay |
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1976
- 1976-07-02 DE DE19762629808 patent/DE2629808C2/de not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NICHTS-ERMITTELT |
Also Published As
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