DE2511698A1

DE2511698A1 - Testverfahren auf schwangerschaft

Info

Publication number: DE2511698A1
Application number: DE19752511698
Authority: DE
Inventors: Brij B Saxena
Original assignee: Carter Wallace Inc
Current assignee: Meda Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1974-03-22
Filing date: 1975-03-18
Publication date: 1975-11-06
Also published as: US4016250A; JPS514895A; GB1508221A; AU7917575A; FR2265099A1; JPS6119268B2; FR2265099B1; CA1067002A; DE2511698C2; AU502577B2

Description

DR.-ING. G. REEBLING

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C 257-14/lYlB

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ihre Nachricht vom 899 Lindau (Bodensee)

Rennerle 10 Postfach 3160

12. lYlärz 1975

Carter—Wallace, Inc.,

767, Fifth Avenue, Nbu/ York, N.Y. 10022/USA

Testuerfahren auf Schwangerschaft

Die vorliegende Erfindung betrifft ein V/erfahren und eine Anordnung für die Bestimmung des menschlichen Hormons Choriongonadotropin und ganz besonders ein fundamental neues Uerfahren und Anordnung für die Bestimmung der Schwangerschaft bei der Frau.

Tasts für die Bestimmung der Schwangerschaft sind im allgemeinen auf die Bestimmung von Hormonen basiert, welche

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durch die sich entwickelnde Plazenta erzeugt werden, wie beispielsweise gonatropische Hormone, die ähnlich jenen sind, die durch die vordere Hypophyse erzeugt werden und Steroidhormone ähnlich jenen des Ovars und der Nebenniere. Heute verwendete Schwangerschaftstests sind beinahe ausschließlich auf eine Untersuchung auf das plazentale Hormon basiert, das menschliche Choriongonadotropin. Dieses Hormon wird nur während der Schwangerschaft in Körparflüssigkeiten (Blutserum und Urin) festgestellt, mit der Ausnahme von verschiedenen anderen der seltenen hormonerzeugenden Zuständen des Körpers. Die Internationale Einheit von menschlichem Choriongonadotropin wurde 1938 angenommen und ist definiert als die spezifische gonadotropische Aktivität von 0,1 mg eines getrockneten Musters, das an dem Nationalen Gesundheitsinstitut, London/England, gehalten wird.

Die frühestan Tests auf Schwangerschaft uiaren basiert auf biologische in vivo-Uerfahren zum Bestimmen des Worhandenseins von menschlichem Choriongonadotropin. Zum Beispiel war der früheste Test, der Aschheim-Zondek—Test, basiert auf die Fähigkeit von menschlichem Choriongonadotropin, subcutan injizieict in Mäuse, um corpora lutea zu erzeugen. Der Friedman-Test ist ein anderer biologischer Test, in welchem eine Urinprobe der vermuteten Schwangerschaft i_n die Ohrvene eines erwachsenen weiblichen Kaninchen injiziert wird, welches drei bis vier U/ochen isoliert gewesen ist und

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48 Stunden nach dar Injektion werden die Ovarien auf unterbrochene hämorrhagische Follikel geprüft, welche eine pasiti\/e Reaktion anzeigen. Ein won Kupperman 1943 entwickelter u/eniger bekannter Test umfaßt die Injektion des Urins eines Patienten in eine «leibliche Ratte mit anschließender Inspektion des Ouars auf Zeichen von Hyperämie. Obvuohl zwei Stunden notwendig sind zum Ausführen dieses Testes, ist er beträchtlich kürzer als die 48 Stunden, die für den Fried^e. -Test
erforderlich sind und die nahezu fünf Tage, die für dBn
Aschheim—Z_ondek—Test benötigt werden, ist dieser Test nicht sehr zuverlässig, da er einen geübten Fachmann erfordert,
um einen leicht gelben, negativen Ouar von einem geröteten, positiven Ouar zu unterscheiden, um einen hohen Grad an
Genauigkeit zu erreichen. Ein durch Galli und Mainini in
den späten 1940er Oahren entwickelter Test erfordert nur
etu/a zwei Stunden, um den Test auszuführen; jedoch dieser
Test umfaßt die Injektion von Urin des Patienten in Frösche mit der anschließenden Beobachtung des Ausstoßens von
Spermen, und diese Tiere sind verhältnismäßig unempfindlich, verglichen mit Kaninchen, !Klausen und Ratten.

All die obigen biologischen Tests leiden an schwerwiegenden Nachteilen, einschließlich der Verfügbarkeit der Tiere,
der Notwendigkeit, eine große Kolonie von Tieren zu halten
und der verhältnismäßig langen Zeiträume des Untersuchens,
des häufigen Ergebens von falschen positiven und negativen

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Ergebnissen und am »nichtigsten die Tatsache, daß ein pDsitiuBi Test mit nur 95 % Zuvarlässlgkaitsgiad nui nach einem Zeitraum uon 25 bis 3D Tagen erreicht mexden kann, dai auf dia Dvulation folgt.

Eins zaaita Generation von SchaangBischaftstssts, die mährend der fiiihan 1960er Oahrs entwickelt aurdsn, sind als Immunologische oder immunochamlschB Uexfahian geksnnzaiEh— nst. Da raanschliches ChDxlongonadotxopln sin PxotBlnhorinon Ist, jjilxkt as antiganisch In siner hotBrologen Art. Wenn damgeinäS menschliches Choriongonadotropin durch geeignete Techniken In Bin angemessenes Testtiei injiziert -ujiid, aro typischsten ein Kaninchen, aiid in dam Tier ein Äntlkörpex zu menschlichem Choriongonadotropin erzeugt. In zeltigen Tests, die dieses Prinzip verwendeten, Ist versucht «jorden, dia Antigen—Antikörper—Dixektniederschlagsreaktion zu vbx— inenden, nach luelcher sich ein sichtbarer Niederschlag als ein Ergebnis der Kombination von menschlichem Choriongonadotropin und seinem Antikörper bilden ajürde, um das ¥o.rhan— densein dieses Hormons nachzuweisen. Üblichere Verfahren umfaßten sogenannte indirekte Bestinunungsverfahran, mle beispielsifleise der Latexpartikeiobjektträger—Test von Brody und Carlstrom und Hämagglutlnations— und Inhibitions— test von U/ide und Gemzel. In dem früheren Verfahren uiird ein Antiserum dem Urin eines Patienten zugesetzt, uiorauf ein Latexträger folgt, welcher mit menschlichem Choriongona-

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dotropin beschichtet morden ist. llienn die Urinprobe von einer schwangeren Frau ist und menschliches Choriongonadotropin enthält, werden die Antikörper in dem Antiserum neutralisiert und werden deshalb nicht rrrit dem auf dem Träger geschichteten menschlichen Choriongonadotropin reagieren, um Agglutination herzustellen. In dem letzteren Testverfanren wird ein ähnliches Prinzip verwendet, ausgenommen, daß der Indikator menschliches Choriongonadotropin enthält, das mit roten Blutzellen konjugiert oder mit roten Blutzellen formalinisiert ist. Der erste Test wird in einem Zeitraum von nur etwa 2 Minuten ausgeführt, wohingegen der zweite etwa 2 Stunden benötigt. Entweder der Urin oder das Blut des Patienten werden für diese Testverfahren benötigt.

In Binem unlängst entwickelten Schwangerschaftstestverfahren wird auf einer lYiodxfikation des grundlegenden immunologischen Mechanismus werden radiologische Anordnungen verwendet, um das Vorhandensein von menschlichem Choriongonadotropin in dem Blut (oder Urin) des Patienten nachzuweisen und/oder zu messen. Siehe z.B. Goldstein et al in Fert. Steril., Band 23, Seite 817 (1972). In diesen Radioimmunountersuchungstests wird der Antikörper in Berührung mit einem Gemisch der zu untersuchenden Körperflüssigkeit des Patienten angebracht und eine bekannte Menge von menschlichem Choriongonadotropin versehen mit einem radioaktiven Isotop, und das menschliche Choriongonadotropin in der

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Testprobe und das mit Etikett uarsahana menschliche Choriongonadotropin kämpfen für die Uiachsaluiirkung mit dem menschlichen Choriongonadotropin-Antikörpar. Der Antikörper u/ird dann von der Flüssigkeit getrennt und entweder die Fraktion uiird radiologisch analysiert, um dia jeweiligen Proportionen des beschrifteten und unbaschrifteten menschlichen Choriongonadotropin zu bestimmen, welches an die Antikörper gebunden wurde, und die Konzentration des menschlichen Choriongonadotropine in dar Probe kann von dieser Information berechnet werden, da dia Proportion von beschriftetem und unbeschriftatam menschlichem Chroiongonadotropin in beiden Fraktionen dieselbe Proportion sein wird. Die Radioimmununtersuchungstechniken haben eine wichtige Begrenzung des immunochemischen Schwangerschaftstests überwunden, nämlich die dar Empfindlichkeit. Radioimmununtersuchungstechniken sind mehrtausendmals empfindlicher als >die oben beschriebenen indirekten Tests und erlauben demgemäß eine Bestimmung der Schwangarschaft v/iel zeitiger als die 25 bis 30 Tage, die dar Ovulation folgen, was mit dem Latexpartikelobjektträgertest und'dam Hämagglutinationstest erforderlich war. Jedoch selbst hier wird die Schwangerschaft nach dem zehnten oder zwölften der Ovulation folgenden Tag mit einem Grad der Wahrscheinlichkeit von 95 % durch das Radioimmun— untersuchungsverfahren bestimmt, diese Tests haben den Nachteil, daß sie mehr Zeit erfordern, um den Test auszuführen, typischerwaise etwa 24 bis 48 Stunden.

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Dedoch der schwerwiegendste N_achteil bei allen froher bekannten Schwangerschafts—Untersuchungstachniken i die häufige Anzeige von falschen positiven und negativen Ergebnissen. In den» Fall des immunocheftischen Schmsmger— schaftstests ist diese Schwierigkeit dem nichtspezif ischera Immunansprechen zuzuschreiben, bezogen auf nichtspezifische Antikörper—Antigeoreaktionen. Zum Beispiel die Anwesenheit eines gemeinsamen Hormons, nichtspezifische Alpha—Um unreinheit unter follikelstimulierenden Hormon, Luteinisierungshormon, menschliches Choriongonadotropin und thyroid stimulierendes Hormon und Gleichwertigkeiten in der Aeinosäure— Folge der hormonspezifischen Beta-Untereinheiten haben weitere Schwierigkeiten verursacht beim Herstellen spezifischer Antiseren zur Verwendung in den imtnunocheraiscihen Techniken. Diese Schwierigkeiten werden in Radioimeun— untersuchungsverfahren infolge des hohen Empfindlichkeits— grades dieser Techniken verstärkt. Diese zuletzt eruähnte Nachteil ist teilweise umgangen worden durch Herstellen von Antiseren, die der Beta—Untereinheit von menschlichen Choriongonadotropin spezifisch sind; diese manipulation erfordert jedoch die Verwendung von wertvollem material, Immunisierung, Auswahl und Reinigung, um spezifische Antikörper zu erhalten, weiche Verfahren zeitraubend, teuer und sehr beschwerlich sind. Ungeachtet dieser Vorkehrungen ist das Ziel von annähernd 100 % Zuverlässigkeit hei der Feststellung von Schwangerschaft durch Radioimmununter—

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suchung nicht erreicht worden.

Ferner besteht ein erster Bedarf nach einer Anordnung zum Feststellen ektopischer Schwangerschaften zu dem frühestmöglichen Augenblick. Solche Schwangerschaften haben negative Hämagglutination oder Latexobjektträgertests in 40 bis 60 % aller Patienten, selbst nach dem 25 bis Tage-Zeitraum, der der Ovulation folge und erforderlich ist, um diese Tests auszuführen. Der Grund dafür betrifft die Annahme, daß die immunochemischen Schwangerschaftsuntersuchungstechniken für die Entdeckung einer Schwangerschaft sorgen, nur nachdem die Implantation des befruchteten Eis stattgefunden hat. Wie oben beschrieben, leiden alle bisher bekannten Schwangerschaftsuntersuchungsverfahren an diesem Nachteil, daß sie nicht vor der Nidation effektiv !Herden. Ein Test, welcher das Worhandensein einer Schwangerschaft während des Zeitraumes zwischen der Befruchtung des Eis und der Implantation des befruchteten Eies bestimmen könnte, würde unschätzbar sein bei der Behandlung von z.B. drohender Abtreibung bei Frauen, die gewöhnlich abortieren, Fällen, die künstliche Insemination umfassen und im Zusammenhang mit neuen Empfängnis verhütenden Verfahren, welche eine Schwangerschaft vor der Implantation effektiv beenden.

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Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein V/erfahren für die Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin, Luteinisierungshormon und dem menschlichen Choriongonadotropin ähnliche Materialien in einer wässrigen Probe v/orzusehen.

Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in dem Vorsehen eines Schwangerschaftstestverfahrens, welches annähernd 100 % Zuverlässigkeit beim Bestimmen der Schwangerschaft herstellt.

Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Bestimmung von Schwangorschaft vorzusehen, ujorin der schwangere Zustand vor der Implantation des befruchteten Eis in der Uiand des Uterus festgestellt wird.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in dem Vorsehen eines Schwangerschaftsfeststellverfahrens, nach welchem eine Schwangerschaft so zeitig wie dem vierten der Ovulation folgenden Tag festgestellt werden kann.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Anordnung zum Bestimmung der Anwesenheit des menschlichen Hormons Choriongonadotropin in einer wässrigen Probe vorzusehen, insbesondere für den Zweck des Erkennens der Schwangerschaft bei der Frau durch Untersuchen einer Probe von Körperflüssigkeit.

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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in dem Vorsehen des besonderen Rezeptors, der in dein oben angeführten Radiorezeptoruntersuchun^verfahren verwendet ujird.

Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein V/erfahren zum Herstellen des spezifischen Rezeptors vorzusehen, der bei dem oben angeführten Radiorezeptoruntersuchungsverfahren verwendet wird.

Beim Ausführender obigen Aufgaben ist gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für das Bestimmen des menschlichen Choriongonadotropins vorgesehen worden, Luteinisierungshormon und dem menschlichen Choriongonadotropin ähnlichem Material in einer wässrigen Probe, dais die bekannten Arbeitsgänge des Berührens einer solchen Probe mit einem Mittel umfaßt, das in der Lage ist, wahlweise da_xs Hormon zu binden, das Vorsehen einer Anordnung des Anzeigens, ab eine solche Bindung stattgefunden hat und das Beobachten der anzeigenden Anordnung, um die Anwesenheit des Hormons in der Probe festzustellen, worin die Verbesserung das Bindemittel enthält, das ein Plasmamembranenextrakt von dem corpus luteum eines Tieres ist, welches den Rezeptor für das Hormon des menschlichen Choriongonadotropins besitzt. Das in diesem Verfahren verwendete Anzeigesystem ist eines von jenen, die herkömmlich in ähnlichen immunochemischan Verfahren zum Bestimmen von Proteinen und/oder Polypeptiden

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verwendet u/ird. Zum Beispiel ist der Indikator sin Material, welches mit dem Hormon behandelt worden ist, so daß in der Anwesenheit des gegenwärtigen Rezeptors der Indikator verfärben wird, verfärbbar Agglutinatniederschlag werden wird oder eine andere sichtbare Anzeige der Anwesenheit oder Abwesenheit des Hormons in der behandelten Flüssigkeit gibt, oder vorzugsweise werden die genaueren radiologischen Meß— techniken verwendet. Beim Anwenden dieses Verfahrens für die Bestimmung der Schwangerschaft bei Frauen wird eine Blutoder Urinprobe mit dem oben beschriebenen spezifischen Rezeptor in Berührung gebracht und die Anwesenheit oder Abwesenheit von menschlichem Choriongonadotropin wird in der Probe bestimmt, basiert auf der Menge von bindenden Belegen durch das Anzeigesystem.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für die Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin in einer wässrigen Probe vorgesehen, vorzugsweise das Blutserum oder der Urin Bines Patienten, der eine vermutete Schwangerschaft hat, enthaltend das Berühren eines hochspezifischen Rezeptors für das Hormon des menschlichen Choriongonadotropine, welcher Rezeptor ein Plasmamembranenextrakt von dem corpus luteum eines Tieres ist, das den RezBptor für dieses Hormon besitzt, wobei die wässrige Probe eine Menge von menschlichem Choriongonadotropin besitzt, die daran zugesetzt ist, welche mit

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einem radioaktiven Isotop markiert ist. In diesem Verfahren wird das in der Probe vorhandene mögliche menschliche Choriongonadotropin und ein Teil des radioaktiv markierten menschlichen Choriongonadotropins an den Rezeptor gebunden. Der Rezeptor mit seinem gebundenen menschlichen Choriongonadotropin ujird dann von der wässrigen Probe getrennt,und die Radioaktivität einer oder beider der abgetrennten Fraktionen wird gemessen, um die Konzentration von menschlichem Choriongonadotropin in der wässrigen Probe zu bestimmen, ujobei diese Konzentration eine Funktion der gemessenen Radioaktivität ist. Es ujird bevorzugt, den Rezeptor von dem corpus luteum einer Kuh, eines Schafes, eines Pferdes oder Schweines zu erhalten, insbesondere von einem Tier, welches schwanger ist und am bevorzugtesten ein Tier während des ersten Vierteljahres der Schwangerschaft.

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Reagenz vorgesehen für die chemische Rezeptorbestimmung des Hormons des menschlichen Choriongonadotropins, welche Reagenz in im wesentlichen reiner Form die spezifische Fraktion von Plasmamembranenextrakt von dem corpus luteum eines Tieres enthält, das den Rezeptor für menschlichea Choriongonadotropin besitzt, wobei die spezifische Fraktion eine ist, welche in der Lage ist, biologisch aktives menschliches Choriongonadotropin wahlweise zu binden.

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In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein l/erfahren für die Herstellung einer Reagenz für die chemische Rezeptorbestimmung des Hormons des menschlichen Choriongonadotropins vorgesehen, das die Arbeitsgänge des HerstBllens von fein zerkleinertem Gewebehomogenat vom corpus luteum-Gewebe eines Tieres enthält, welches den Rezeptor für menschliches Choriongonadotropin enthält, das Abscheiden der Plasmamembranen von dem Homogenat und das Ausdehnen der Plasmamembranenfraktion, die in der Lage ist, das biologisch aktive menschliche Choriongonadotropin wahlweise zu binden.

Das vorliegende Testverfahren ist auch geeignet zum Feststellen der Schwangerschaft bei Tieren. Demgemäß mag es verwendet werden, um die Schwangerschaft bei einer der Tierarten festzustellen, worin der spezifische Rezeptor der Erfindung festgestellt ist, d.h. Säugetiere und möglicherweise ausgewählte Nicht-Säugetiere.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung enthält eine Anordnung für die Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin, Luteinisierungshormon cder menschlichem Choriongonadotropin ähnliches material in einer wässrigen Probe,

enthaltend (a) eine erste Reagenz und eine zweite Reagenz; (b) wobei die erste Reagenz in im wesentlichen reiner Form die spezifische Fraktion des Plasmamembranenextraktes von

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dom corpus luteum einer Art enthält, die den Rezeptor für menschliches Choriongonadotropin aufweist, das in der Lag8 ist, biologisch aktives menschlichen Choriongonadotropin wahlweise zu binden; (c) ujobei die zweite Reagenz markiertes menschlichen Choriongonadotropin enthält, das in der L§ge ist, Strahlung zu emittieren und die erste Reagenz dazu beabsichtigt ist, mit der Probe in Berührung gebracht zu werden, die das abzumessende Hormon enthält und mit der zweiten Reagenz, um einen Teil des markierten und nicht markierten Hormons an den Rezeptor zu binden; (d) eine Anordnung zum Wessen des Betrages des markierten Hormons, das an den Rezeptor gebunden ist, wobei die davon emittierte Strahlung eine Funktion der Konzentration des Hormons in der wässrigen Probe ist. Diese Ausführungsform nimmt vorzugsweise die Form einer Schwangerschaftsuntersuchungstasche an.

Weitere Aufgaben, IKlerkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung hervorgehen.

Die Fig. der Zeichnung ist eine logische log-Linearisierung der konkurrenzfähigen H_emmungsreaktion der Radiorezeptoruntersuchung von menschlichem Choriongonadotropin, das als eine Berechnungsnorm für das Verfahren der vorliegenden Erfindung dient.

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Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein neuartiges und sehr spszifischBS Verfahren zur Bestimmung des Hormons des menschlichen Choriongonadotropins offenbart ujordan. Im Gegensatz zu früheren biologischen Tests, welche sich als sehr unpraktisch anniesen haben und zu jüngst entwickelten immunochemischsn Tests, welche auf dam Prinzip dar Antigen-Antikörpsrbindung basiert sind, ist das vorliegende Verfahren auf der Verwendung eines höchst selektiven Rezeptors für menschliches Choriongonadotropin basiert. Der Rezeptor ist von dam Zialgawabe eines geeigneten Tiaras isoliert, wohingegen in dem Fall immunochamischer Verfahren ain Antiserum von dem Blut eines geeigneten Tieres erzeugt wird, welches mit dem Hormon injiziert worden ist, um Antigen-Antikörperreaktion zu erzeugen.

Die Verwendung eines spezifischen Rezeptors, der von dem corpus luteum eines Tieres isoliert ist, tuBlches diesen spezifischen Rszaptor besitzt, überwindet offensichtlich vollständig den Nachteil nichtspezifischer Reaktionen, welche häufig in Zusammenhang mit immunochemischen Verfahren eintreten. In den meisten Fällen erfordert die spezifische RBzeptorbindung das natürliche Strukturschaum eines Hormons in seiner biologisch aktiven Form. Wenn demgemäß das Rezeptor-chemische Tastvarfahran mit dan Anzaigatachniken der Radiountersuchung kombiniert werden, ergibt sich ein RadiorBzaptoruntersuchungsverfahrBn, wslches dan Grad der

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Ansprechempfindlichkeit der RadioimmununtersUGhungstechniken besitzt und gleichzeitig den Grad der Spezifität des Tierexperimentes,~und deshalb zeigt dieses Verfahren größere anhaltende Genauigkeit gegenüber allen bestehenden immunologischen und biologischen Hormontests, insbesondere Tests auf Schujangerschaf t.

LUeil ferner der Rezeptor die biologisch aktive Form des Hormons für die Bindung erfordert, würde die endogene Synthese eines metabolisch schadhaften menschlichen Choriongonadotropine, ujelches normalerujeise gemäß den irnmunochemischen Testverfahren eine positive Reaktion geben würde, aber von welchem angenommen wird, daß es nicht in der Lage ist, die Schwangerschaft auszuhalten, würde keinen Anlaß zu einem falschen positiven Test gemäß dem Testverfahren der vorliegenden Erfindung geben.

Es ist gemäß der vorliegenden Erfindung auch entdeckt worden, daß die Radiorezeptor-Untersuchungstechnik die Entdeckung der Schwangerschaft so zeitig wie am vierten der Ovulation folgenden Tag ermöglicht. Dies stellt tatsächlich einen wichtigen Vorteil auf dem Gebiet der Schwangerschaftsbestimmungstests dar, da bisher der Schwangerschaftszustand nicht früher als etwa am zehnten oder zwölften der Ovulation folgenden Tag entdeckt werden konnte. Dieses Ergebnis ist wichtiger, wenn sich klargemacht wird, daß die riesige

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Vielzahl von Schuiangerschaftstests heute nicht mittels des RadioimmununtBrsuchungsuBrfahrens ausgeführt werden, welches die Bestimmung so zeitig wie zehn oder zujölf der Ovulation folgenden Tage erlaubt, sondern eher mittels Hämagglutinationsoder Latexobjektträgartests, welches vorher dargelegt wurde, um sine Bestimmung der Schwangerschaft nur nach etwa 25 oder 30 der Ovulation folgenden Tags zu erlauben. Radioimmununtersuchungstsst erfordern wenigstens 24 Stunden Arbeitszeit und typischerweise etwa 48 Stunden Prüfzeit, verbunden mit beschwerlichen und teuren Verfahren zum Herstellen ausreichend spezifischer Antikörper oder Antiserum. Andererseits belauft sich die zum Ausführen des Prüfverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung benötigt Zeit auf nicht mehr als eine Stunde und typischerweisa nur etwa eine halbe Stunde. Die praktischen Vorteile, die sich aus einem solchen Schwangerschaftstestverfahren ergeben, welches die Bestimmung des Schwangerschaftszustandes vor der Implantation des befruchteten Eies in dem endometrialen Gewebe erlaubt, sind oben kurz besprochen worden, und diese Vorteile als auch die wichtigen Gewinne in Form von Grundforschung auf dem Gebiet der menschlichen Fortpflanzung, dia sich aus der vorliegenden Erfindung ergeben, sind laicht jenen auf diesem Gebiet bekannten offensichtlich gemacht.

Hinsichtlich der fundamentalen Ähnlichkeiten in dem Bindemechanismus des vorliegenden Rezeptor—chemischen Test-

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mechanismus und dem ujohlbeka nnten immunochemischen Testmechanismus ist es möglich, die früher entwickelten Anzeigemechanismen in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung zu verwenden. Demgemäß kann das Anzeigesystem aus einem Indikatormaterial bestehen, welches mit menschlichem Choriongonadotropin behandelt morden ist, so daß in der Anwesenheit des Rezeptors das Indikatormaterial sich verfärben tuird, agglutinieren, niederschlagen oder ein anderes sichtbares oder chemisches Zeichen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von menschlichem Choriongonadotropin in der wässrigen Probe oder der zu untersuchenden Körperflüssigkeit. Aus dem Obigen geht jedoch hervor, daß die wirksamsten Ergebnisse erreicht werden, wenn eine radiologische Untersuchungstechnik als das Indikatorsystem verwandet wird. Demgemäß stellt die Radiorezeptoruntersuchungs-Ausf ührungsform der vorliegenden Erfindung klar die bevorzugteste Aus/ührungsform dar. Nichts desto weniger ist zu verstehen, daß die vorliegende Erfindung nicht in dem Vorsehen eines besonderen Indikationssystems zur Verwendung in dem betreffenden Verfahren liegt, sondern eher in der fundamentalen und neuartigen Verwendung der chemischen Rezeptortechniken und eines spezifischen Rezeptors, um das Vorhandensein von menschlichem Choriongonadotropin zu bestimmen.

Hinsichtlich des extremen Grades der Spezifität und Sensi— tivität des Radiorezeptoruntersuchungsverfahren der vorlie-

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genden Erfindung ist es möglich, eine zufriedenstellende Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin auf einer äußerst kleinen Probe auszuführen. Zum Beispiel beim Verwenden des Verfahrens der vorliegenden Erfindung als ein Test auf Schwangerschaft ist es möglich, den Test unter Verwendung von nur etwa 0,1 ml des von dem Patienten genommenen Blutes auszuführen. Diese Entnahme von dem Patienten kann mittels eines einfachen Nadelstiches in dem Ende eines Fingers ausgeführt werden. Ferner ist das Verfahren der Erfindung wirksam, um das Vorhandensein von menschlichem Choriongonadotropin in einer wässrigen Probe zu bestimmen und demgemäß kann entweder Blutserum oder eine Urinprobe von einem Patienten zweckmäßig verwendet werden.

Der in dem Testverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete spezifische Rezeptor wird von einem ovarisllen Gewebe erhalten. Uiie oben dargelegt, ist der Rezeptor wesentlich selektiver für menschlichen Choriongonadotropin und dem Choriongonadotropin ähnliche IYIa teria lien, als es ein Choriongonadotropin-Antikörper ist, da der Rezeptor die natürliche Gestaltung des Hormons in seiner biologisch aktiven Form für die Bindung benötigt. Folglich gibt es keine [lilöglichkeit einer nichtspezifischen Immunreaktion. In allen Tieren, welche diesen spezifischen Rezeptor besitzen, ist es leicht in dem ovariellen Gewebe feststellbar, welches das Zielgewebe des Hormons darstellt. Obwohl der Rezeptor

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von einem Säugetier isoliert werden mag und möglicherweise von bestimmten Nicht-Säugetiersn, wird bevorzugt, den Rezeptor von den Ovarien verhältnismäßig großer Tiere zu erhalten, wie beispielsweise Kühe, Schafs, Schweine, Pferde und dgl., hinsichtlich der Tatsache, daß diese Tiere proportional eine größere lYlenge von ovariellem Gewebe haben und ferner eine leichte Versorgung von solchem Gewebe aufgrund der Tatsache besteht, daß diese Tiere kommerziell für ihr Fleisch geschlachtet werden. Die Ovarien von z.B. Ratten sind so klein, um die Verwendung von Tieren dieser Art als eine Quelle des Rezeptors effektiv undurchführbar zu machen, lliie oben besprochen, ist das Testverfahren der Erfindung auch auf Tiere anwendbar, welche den Rezeptor besitzen und deshalb sieht die positive Bewertung der Schwangerschaft in einer gegebenen Art auch ein Verfahren zum Überprüfen der Tiere auf die Anwesenheit des Rezeptors vor.

Vorzugsweise ist das Tier, von welchem der Rezeptor erhalten wird, zum Zeitpunkt des Schlachtens in einem schwangeren Zustand, da zu dieser Zeit die !Klenge von ovariellem Gewebe und die Anzahl von Rezeptorstellen an einem Maximum ist. Das erste Quartal der Schwangerschaft hat sich als die vorteilhafteste Zeit zum Erhalten des Gewebes erwiesen.

Der spezifische Rezeptor der Erfindung wird erhalten durch Abscheiden von reinen Plasmamembranen von dem ovariellen

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Gewebe, ujorauf die Bewertung der verschiedenen Plasmamem— branenfraktionen folgt durch Testen gegen isotopisch bezeichnetes menschliches Choriongonadotropin und U/ählen der Fraktion, weiche die größte Bindung für das Hormon zeigt. Der Rezeptor ist äußerst stabil und kann für lange Zeiträume gespeichert oder selbst in einem zweiten oder anschließenden Testverfahren wieder v/erwendet werden. Das genaue Verfahren zum Erhalten des Rezeptors ist im folgenden ausführlicher beschrieben.

Da das TestvBrfahren der Erfindung nicht artspezifisch ist, kann es auch verwendet werden, um Schwangerschaft in einem der Tiere zu ermitteln, von welchen festgestellt ist, daß sie den spezifischen Rezeptor der Erfindung besitzen. Selbst wenn somit der Rezeptor, der spezifisch für menschliches Choriongonadotropin in menschen und luteinisierendes Hormon in Menschen und Tieren ist, ist er auch in der Lage, dem menschlichen Choriongonadotropin ähnliche Proteine selektiv zu binden, welche in Tieren eine Rolle entsprechend dem menschlichen Choriongonadotropin in Menschen spielen, d.h. sie entsprechen dem Choriongonadotropin im menschen. Der Vorteil davon besteht darin, daß Standardlaboratoriums— testtiere, wie beispielsweise Affen, Hunde, Kaninchen, mause etc., durch dieses Verfahren getestet werden können, wohingegen getrennte Antikörper für jedes Tier gemäß dem immunchemischen Testverfahren benötigt wurden.

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Bezeichnen des menschlichen Choriongonadotropine mit einem radioaktiven Isotop kann auf die herkömmliche UJeise ausgeführt ujerden mit einem geeigneten, für diesen Zuieck ausge-

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mahlten Isotop, z.B. von I , C , H und dgl.. Ein besonders geeignetes Isotop ist ein radioaktives Isotop won Iod,

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wie beispielsweise I , hinsichtlich der Tatsache, daß das Bezeichnen mit diesem Isotop verhältnismäßig einfach ist und viele Laboratorien die notwendige Einrichtung besitzen, um dieses Isotop zu messen.

Um die vorliegende Erfindung vollständiger zu beschreiben, sind im folgenden verschiedene spezifische Verfahren vorgelegt zum Herstellen der Testreagenzien und Anbringen der Radiorezeptoruntersuchung als auch spezifische Beispiele von klinischen Bestimmungen, die die vorliegende Erfindung verwenden, wobei sich versteht, daß die spezifischen Verfahren lediglich als Veranschaulichung und auf keine Weise als Begrenzung beabsichtigt sind.

I. Radioisotopisches Bezeichnen von Hormon

Hochgereinigtes menschliches Choriongonadotropin (enthaltend 12.000 I.E./mg) wurde für den Test verwendet. Das mensch-

125 liehe Choriongonadotropin wurde mit I bezeichnet durch Verwenden von Lactoperoxydase, hergestellt aus IYIiIch (RZ χ 0,78; Sigma Company, St. Louis, lYlissouri). Zwei mCi

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von I in 20 μΐ von 0,1 IYl. Natriumacetatbuffer eines pH-Wertes von 6,0 wurde in einem Reagenzglas mit 25 jjg von menschlichem Choriongonadotropin gemischt. Eine Teilmenge von 50 ng Lactoperoxydase in 20 μΐ und 200 ng von H^O₂ 10 μΐ UJasser wurden dann dem Reagenzglas zugesetzt. Drei Teilmengen von 100 ng von H^0_? wurden dann in Intervallen von 5 Minuten zugesetzt. Nach 20 Minuten wurde die Reaktion durch den Zusatz von 0,5 ml von 0,15 IYl. NaCl enthaltend 1 % Rinderserumalbumin (BSA) eines pH-UJertes von 7,0 beendet. Das bezeichnete Hormon wurde dann durch GeIfiltrierung auf eine 1x30 cm-SMule von Sephadex G-100 von dem Iod abgeschieden, ausbalanciert mit 0,15 IYl. NaCl, enthaltend 1 % von BSA mit einem pH-Wert von 7,0. Die spezifische Aktivität des bezeichneten menschlichen Choriongonadotropins wurde durch Ausscheidung mit Trichloressigsäure bestimmt. 5 μΐ des rohen Reaktionsgemisches wurde mit 0,05 (Yl. Phosphatbuffer eines pH-Ulertes von 7,5, enthaltend 0,1 % BSA auf 5 ml verdünnt. Einer 200 μΙ-Teilmenge dieser Lösung wurde zugesetzt 400 μΐ Trichloressigsäure auf eine endgültige Konzentration von 10 % Trichloressigsäure. Die ausgefällten Proteine wurden durch Zentrifugieren wiedergewonnen. Die mit dem niederschlagbaren Material verbundene Radioaktivität wurde als gebundenes Protein betrachtet und wurde bei der Berechnung der spezifischen Aktivität des bezeichneten Hormons verwendet. Das rohe Reaktionsgetnisch wurde durch Gelfiltrierung durch eine 1x30 cm-Säule von Sephadex G-50 gereinigt,

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ausbalanciert mit 1 % BSA in 0,9 % NaCl.-..Die spezifische
Aktivität des bei der Radiorazeptoruntersuchungs verwendeten Choriongonadotropins betrug 20 bis 30 jjGi/jjg, Die biologische Aktivität des in dem T&st verwendeten menschlichen Chorion— gonadotropins,bestimmt durch ovarielle Ascorbinsäureverar—
mungsuntersuchung betrug 8.923 Ι.Ε,/mg mit 95 % Vertrauens— grenzen von 5.826 bis 12.250 I.E./mg.

II. Herstellung von Rezeptor

Alle Verfahren bei der Herstellung von PlasmamembranBn
wurden in einem Eisbad oder bei 4 C ausgeführt. FRische
Rinderovarien von zeitiger Schmangerschaft (erstes^Quartals Fötuslänge von Kopf bis Steiß bis zu 22 cm) wurden von
einem Schlachthaus erhalten und in flüssigem Stickstoff bis zur Verarbeitung gespeichert. In einem typischen Experiment wurden 100 g Gewebe von etwa 25 großen corpora lutea mit
einer.scharfen Stahlklinge in kleine Stück©^geschnitten und in 500 ml 10 mffl. Tris-HCl-Buffer eines, pHHBertas von 7,8
ganehlen, enthaltend 1 mm. von fflgCl«, 1 mB. Dithiothreit,
10.000 I.E. von Trasylol (FBA Pharmaceuticals) pro Liter
und 0,25 m". Sucrose. Das Homogenat wurde durch zwei Schichten von Seihtuch gefiltert und die größeren Partikel wurden in 500 ml des Buffers wieder verarbeitet. Das GswBbe wurde
weiter homogenisiert durch 10 bis 15 Hübe in einem Telfon-Glashoraogenisierapparat, Typ C mit einer Spislraumgrüße von

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0,12 bis 0,17 mm bai 4 C. Das Homogenat wurde bai 650 xg 20 Minuten lang in einer gekühlten Sorvallzentrifuge (Reps, Rotor GSA) zentrifugiert, um intakte Zellen, Zellbruch und Kerne zu entfernen. Die 650 xg oben schwimmende Flüssigkeit wurde mieder bei 13.000 g 20 Minuten lang in derselben Zentrifuge zentrifugiert. Die oben schwimmende Flüssigkeit wurde diesmal weggeschüttet und die Kügelchen wurden in 50 bis 70 ml des Tris-HCl-Buffers mit Hilfe des Teflon-Glashomogenisierungsgerätes wieder suspendiert. Diese Suspension wurde in dem Ksrn eines TI-14 zonalen Rotor (Modell Beckman Spinco L3-50) eingespritzt, die bei 3.000 U/min liegt und 500 ml eines linearen Sucrosegradienten enthielt (LKB Untrograd 11.300 Pumpe) von 30 % (w/v) auf 50 % (w/v) Sucrose und 120 ml Polster von 50 % (w/v) Sucrose (Pumpgeschwindigkeit 20 ml/min). Ein überzug von 20 ml wurde nach der Probe eingrspritzt. Zwei Stunden nach der Zentrifugierung bei 45.000 U/min wurde die Zentrifuge verlangsamt und der Rotorinhalt mit 55 % Sucrose bei 20 ml/min ersetzt. Die Plasmamembranen wurden von dem Rotor in der Reihenfolge der zunehmenden Partikelgröße ersetzt und Fraktionen von 12 ml wurden gesammelt und unverzüglich gefroren, bis sie auf bindende und enzomatische Aktivität untersucht wurden. Membranen wurden während drei Monaten gefroren gehalten, ohne sichtbaren V/erluft der Bindungsfähigkeit. Teilmengen der Fraktionen wurden vor dem Gefrieren zur elektronischen Mikroskopie entnommen. Die in der Suspension enthaltene

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Sucrose störte nicht die Bindung das bezeichneten menschlichen Choriongonadotropine.

Teilmengen von ovariellem Homogenat und geeignete Teilmengen der von dem kontinuierlichen Sucrosedichtegradienten erhaltenen verschiedenen Fraktionen wurden in 1 IYl. NaOH gelöst, das 0,1 JlS Natriumdodecylsulfat enthielt, um den Proteingehalt durch das Verfahren uon Loujry (θ. Biol. Chem., Band 193, Seite 265, 1951) zu bestimmen unter Verwendung des Rinderserums Albumin als Norm. Teilmengen der verschiedenen Fraktionen wurden auch mit menschlichem Choriongonadotropin

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kombiniert, das mit I bezeichnet mar, und dann wurde der Grad der Bindung in jedem Fall gemessen. Auf dsr Basis der Proteinkonzentration zeigten die Plasmamembranen, die einen spezifischen Rezeptor für das bezeichnete menschliche Choriongonadotropin enthielten, eine 10-fach größere Bindung als das rohe ovarielle Homogenat.

Jede Fraktion wurde auch auf Verunreinigung durch Erforschen ihrer enzymatischen Aktivität analysiert. Oede Fraktion wurde auf 5' Nucleodiase-Aktivität untersucht, durch das Verfahren von Song et al (3. Biol. Chem., Band 262, Seite 694, 1967) und das freigesetzt anorganische Phosphat wurde durch das Verfahren von Fiske et al (J. Biol. Chem., Band 66, Saite 375, 1925). Cytochrom C Raductase wurde nach dem Verfahren von Cooperstein et al untersucht (θ. Biol. Chem.,

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Band 189, Seite 665, 1951).

A^s eine »eitere Probe bezüglich der Reinheit der Plasma— membranen Burden die einzelnen Fraktionen der Elektronen— mikroskopie unterzogen. Eine Teilmenge von jeder Protein— fraktion wurde 24 Stunden lang in 6,25 % Glutaraldehyd in 0,067 III. Cacodylat—Puffer eines pH-ülertes von 7,3 gemischt. Die Proben wurden 5 fllinuten lang in gekühltem 0,25 I. Cacodylat- oder Phosphatpuffer gewaschen, der 1 % OsO, eines pH—Wertes von 7,3 für 2 Stunden enthielt. Anschließend wurden alle Proben durch FlieSenlassen durch eine geordnete Reihe von Alkohol entwässert und in entweder Epon oder Araldite eingebettet. Abschnitte von 0,06 bis 0,09 m* wurden geschnitten und in einer 4 % wässrigen Uranylacetat—Losung gefärbt und durch ein Phillips En—300 Elektronenmikroskop photogra fiert.

Eine Fraktion, die die höchste Bindung mit dem bezeichneten menschlichen Choriongonadotropin zeigte, eine niedrige Enzymaktivität und reine Plasmamembraneη enthielt, wie durch Elektronenraikroskopie gezeigt, wurde bei einer Sucrosedichte von 1,16 (ca. 35 jCw/v) definiert. Geeignete Teilmengen dieser Fraktion wurden in flüssigen Stickstoff gelagert und als der Rezeptor verwendet.

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III. V/erfahren der Radiorezeptoruntersuchung

Die Radiorez8ptoruntersuchung wurde in 10x75 ml Polystyrolrohren gemäß dem in Tabelle I angegebenen Protokoll ausgeführt.

Tabelle I

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Probe Verdünnungs·^ Plasma- I -menschliches

mittel membranen- Choriongonadotropin protein: 40 ug

Bündprobe	100	μΐ	100	μΐ	100	μΐ
HCG³ (ng/ml)
3.0	100	μΐ	100	μι	100
6.2	100	μΐ	100		100	μΐ
12.5	100	μΐ	100	,Ul	100	μΐ
25.0	100	μΐ	100	Ul	100	μι
50.0	100	μι	100	μι	100	,Ul
100.0	100	μι	100	μι	100	μι
Plasma (verdünnt 1 :2 bis 1:50)	100	μΐ	100	μι	100	AJl

¹ 10 mm. Tris-HCl Puffer eines pH-Ulertes uon 7,2, enthaltend 0,1 % BSA, 1 mlYI. CaCl₂ und 20 I.E. Trasylol pro Rohr.

Annähernd (1,5 ng κ 50.000 cpm)
³ 12.000 I.E. pro mg (7).

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Die Inkubation wurde 3D Minuten lang bei 37°C in einer Duba nof f-UJasserbadschüttelvorrichtung ausgeführt. 1 ml von gekühltem Verdünnungsmittel uiurde dann jedem Rohr zugesetzt Die Inhalte der Rohre wurden in einem Vordex-IYlischgerät gemischt und 20 Minuten lang bei 3.000 xg in einer gekühlten Sorvall-Zentrifuge (Modell RC2B; Rotor Typ HS-4) zentrifugiert. Die oben schwimmende Flüssigkeit wurde abgesaugt und die Pillchen wurden in einem Packard-Autogammazähler mit

125

einem Wirkungsgrad von 51 % für I gezählt. Die Standardkurven und die hormoneile Konzentration in den Plasmaproben wurden durch einen zeitteilenden IBM-Computer unter Verwendung von logischen log-Transformationen berechnet.

Eine logische log-Linearisierung der konkurrenzfähigen Inhibitionsreaktion der Radiorezeptoruntersuchung von menschlichem Choriongonadotropin ist in der Fig. dBr hierzu beigefügten Zeichnungen dargestellt. Die Empfindlichkeit der Untersuchung war geringer als 3,0 ng/ml mit einer Genauigkeit von +_ 10 %, Die Zwischenuntersuchungsvariationen, bestimmt durch das Untersuchen einer Plasmasammelstelle bei verschiedenen Verdünnungen in zwölf Untersuchungen luarsn Hh 5 % bzw. jf 15 % durch den Bereich der Untersuchung, um somit den Beleg der hohen Reproduzierbarkeit der Untersuchung vorzusehen. Die Plasmaprobe von einer schwangeren Frau zeigte Dosenansprechbarkeit, identisch der Norm des menschlichen Choriongonadotropins, was die Gültigkeit der Unter-

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suchung bestätigte. Es gab einen vollständigen Mangel an Kreuzreaktion mit hochgereinigten Präparaten von FSH, PRL und HPL, als auch Plasma uon hypothyroiden Objekten, Akromegalien und Frauen während postpartualer Lactation, urn dadurch einen hohen Wirkungsgrad der Radiorezeptoruntersuchung anzuzeigen. Die Radiorezeptoruntersuchung unterschied nicht zwischen menschlichen Choriongonadotropin und lutainisierendem Hormon; jedoch eine Radioimmununtersuchung

125
unter Verwendung uon I bezeichnete FSH, LH und HCG-und

Beta-Antikörper zu deren hormonspezifischen Untereinheiten haben gezeigt, daß es während zeitiger Schwangerschaft keinen Anstieg in den Plasmapegeln uon LH und FSH gibt. Somit beeinträchtigt der Mangel an Unterscheidung zwischen HCG und LH nicht die Bestimmung uon Schwangerschaft, wenn die Radiorezeptoruntersuchung uerwendet wird.

IU. Klinische Tests

100 Objekte, die für die ersten erwarteten Menstruationen überfällig waren, waren potentielle Kandidaten für Mini— aborts und hatten gezogene Blutproben für die Radiorezeptoruntersuchung und 24 Stunden Urin gesammelt für den Agglutinationstest (Pregnosticon-Dri-Dot Test). Physikalische und Beckenuntersuchungen, Änderungen in der Uteringröße und Konsistenz und andere Symptome einer möglichen Schwangerschaft wurden bewertet. UJenn die Radiorezeptoruntersuchung

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positiv war, ungeachtet eines positiven oder negativen Pregnosticontestes, uiurde ein Hfliniabort ausgeführt. Alle Proben ujurden an das pathologische Laboratorium geschickt, um das Vorhandensein von Schwangerschaft zu bestätigen. Drei Patienten abortierten spontan und drei, die ektopische Schwangerschaft entwickelten, werden getrennt besprochen. Die Blutproben wurden bei 2.500 U/min bei 40 C 15 Minuten lang zentrifugiert, und das Plasma oder Serum wurde bis zur Verwendung bei -20 C gespeichert.

Die Radiorezeptoruntersuchung auf menschliches Choriongonadotropin im Blut wurde 77 mal für 72 Patienten ausgeführt, um das Vorhandensein von zeitiger Schwangerschaft zu bestimmen. Die Genauigkeit des Testes wurde durch Vergleichen desselben mit dem Pregnosticon-Dri-Dot-Test bestimmt, das Vorhandensein von Schwangerschaft wurde durch die histopathologische Untersuchung von endometrialen Proben bestätigt, erhalten bei selektivem oder spontanem Abort. Die gewöhnlichen klinischen Kriterien, z.B. die Vergrößerung des Uterus oder das Aussetzen der [Klenstrua tion, lag weiteren Beleg vor, um die Genauigkeit der Radiorezeptoruntersuchung zu bestätigen.

41 Patienten zeigten eine negative Radiorezeptoruntersuchung und 1 falsches positives Pregnosticonergebnis war mit dieser Gruppe verbunden. Alle 41 Objekte wurden durch weitere

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klinische Beobachtung als nicht schwanger bestätigt.

In 14 Fällen von Abort bestätigte die pathologische Diagnose des entnommenen Gewebes das Ergebnis der Radiorezeptoruntersuchung. 7 der 14 lYlinia borte, die deciduales oder
plazentuales Gewebe demonstrierten, welches die Schwangerschaft bestätigte, hatten eine positive Radiorezeptoruntersuchung, aber negativen Pregnosticon-Test.

Der Pregnosticon-Test war auch nicht empfindlich genug, um die zeitige 5^Ghuia ngerschaf t festzustellen, wohingegen die
Radiorezeptoruntersuchung in der Lage war, eine Schwangerschaft so zeitig wie vier auf die Ovulation folgenden Tage zu bestimmen und erwies sich von großem Wert in Fällen von drohendem Abort. Für zeitige drohende Aborte, innerhalb der ersten 7 Wochen einer Schwangerschaft demonstrierten positive Rezeptoruntersuchungen, aber gleichzeitigen negativen Pregnosticon-Tests. Die Patienten abortierten in jedem Fall spontan und der Uteringehalt war wieder genesen, was
chorionisches Gewebe zeigte. In den 4 Schwangerschaften,
welche in spontanem Abort endeten, setzte die Verfärbung
10 bis 14 Tage fort und der Uterus war für die Dauer der
Schwangerschaft nicht genügend vergrößert, was eine
Abnormalität in dem Wachstum und der Entwicklung des
Embryos und der Plazenta nahelegte.

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Von 20 Objekten, die die Fertilitätsklinik aufsuchten, wurden mährend des menstrualen Zyklus täglich Blutproben entnommen für die Bestimmung won FSH und LH durch Radioimmununtersuchung. Auf der Basis von BBT, Plasmapegeln von FSH und LH, urinärer Ausscheidung uon Östrogen und Progesteron und charakteristischen Änderungen in dem zeruikalen Schleim als Beiueis der Ouulation wurde diesen Frauen geraten, schu/anger zu morden. Die Blutproben uon 4 dieser Frauen, die schwanger waren, wurden analysiert, um die Pegel von menschlichem Choriongonadotropin durch die Radiorezeptoruntersuchung festzustellen und die Pegel uon FSH und LH durch Radioimmununtersuchung am Tag der Ouulation und während zeitiger Schwangerschaft. Der Tag der Owulation bei diesen 4 schwangeren Frauen wurde anschließend durch die Bestimmung uon FSH und LH in dem Blut bestätigt. Eine Gesamtzahl uon 15 normalen Schwangerschaften wurden während des die Ouulation und zeitige Schwangerschaft umfassenden Zeitraumes getestet. Eine Zusammenfassung aller behandelten Objekte ist in Tabelle II dargelegt.

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2b11698

Tabelle II

Nr. den ausbleibenden Radiorezeptor- Agglutinations-(ilenstruationen untersuchung Test - Urin folgende Tage Blut

Iflinia borte	8 -	11
3	6 -	14
8	1 -	11
5 *

normale Schwangerschaften
8 14-33 +

7 0-42 +

mögliche Ektopien

1 14 +

spontaner Abort
3 5-17 +

nicht schwanger
43 0 - 4Ü

*5 Nicht-Schwangsrschaften zweimal berichtet

Das Folgende sind zusätzliche fallgeschichtliche Zusammenfassungen, tuelchs dazu disnen, den Wert der Radiorszeptoruntersuchungstechnik weiter zu veranschaulichen.

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- .15 ■-

Eine 23 Jahre alte Para III, Gravida IU wurde 8 Tage nach der ausbleibenden menstrualen Periode gesehen. Der Pregnosticon-Urintest uja r negativ und die Radiorezeptoruntersuchung ma r positiv. Ein am folgender Tag ausgeführter Dfliniabort demonstrierta plazentales Geujebe.

Eine 20 Jahre alte Nulligravida hatte eine intrauterin eingesetzte Vorrichtung und neun iYlonate später ujaren lYlenstruationen 9 Tage spät; die Radiorezeptoruntersuchung uja r positiv. Diese Untersuchung uja r mieder positiv 2 Tage später und ein Hfliniabort zeigte chorionisches Gewebe. Zwei an denselben Tagen ausgeführte Pregnosticon-Tests waren negativ.

Eine 28 Jahre alte Nulligravida mit einem 28 Tage-Zyklus mar 17 Tag spät mit den lYienstruationen; die Radiorezeptoruntersuchung mar postivi und der Pregnosticon-Test u/ar negativ. Einige Tage später trat ein spontaner Abort Bin.

3 Monate später mar sie mieder 5 Tage nach der ersten ausbleibenden menstrualen Periode. Wieder uiar die Radiorezeptoruntersuchung positiv und der Pregnosticon-Tsst war negativ. Der Uterus versäumte zu wachsen, schwarze Verfärbung begann und bestand fort, bis wieder ein spontaner Abort eintrat,

4 Wochen nach dem Ausbleiben des Zyklus. Gewebeprüfung des zweiten Abortes zeigte einen amniotischen Beutel ohne Fötus.

5 0 9 B A 5 / 0 7 0 0

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In einem anderen Fall ujurde eine 30 Jahre alte Grauida I 12 Tage nach einem ausbleibenden Zyklus gesehen. Zu dieser Zeit uiar die Radiorezeptoruntersuc hung positiv und der Pregnosticon-Test war negativ/. Nach 2 Wochen regelwidriger Verfärbung und fraglicher Uterinvergrößerung trat spontaner Abort ein.

Bei zwei Patienten mit vermuteter ektopischer Schwangerschaft zeigte eine eine positive Radiorezeptoruntersuchung und die andere eine negativen Test. Der ersteren wurde bestätigt, eine ununterbrochene Eileiterschwangerschaft zu haben. Beide hatten negative Pregnosticontests. Das Folgende ist eine kurze Beschreibung der ektopischen Schwangerschaft: Eine 40 3ahre alte Para I, Gravida I ließ einen menstrualen Zyklus aus und unverzüglich danach entwickelte sich ein leichter unteradominaler Schmerz und vaginale Uerfärbung, welche 2 Wochen andauerte. Der Hämagglutinationsinhibitionsrohrtest war an dem dem Zutritt folgenden Tag negativ. Die Radiorezeptorunters'uchung an dem zweiten Tag war positiv. Am dritten Tag zeigte die Kürettage kein Vorhandensein von Schwangerschaft; die Cul-de-sac-Punktur war negativ, die Laparoskopie demonstrierte eine ununterbrochen gelassene Ektopie, welche an der folgenden Laparotomie entfernt wurde .

Patentansprüche

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Claims

Patentansprüche

1.J Verfahren für die Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin (HUG), luteinisierendem Horm-on (LH) oder dem menschlichem Choriongonadotropin ähnliches lYlaterial in einer wässrigen Probe, das die Arbeitsgänge des Berührens der Probe mit einem Mittel umfaßt, das in der Lage ist, wahlweise das Hormon zu binden, das Vorsehen einer Anordnung zum Anzeigen, ob die Bindung stattgefunden hat und Beobachten der anzeigenden Vorrichtung, um die Anwesenheit des Hormons in der Probe zu bestimmen, gekennzeichnet durch das Mittel, das in der Lage ist, wahlweise das Hormon zu binden, das ein Plasmamembranenextrakt von dem corpus luteum einer Art ist, die den Rezeptor für menschliches Choriongonadotropin besitzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die anzeigende Anordnung eine messende Radiountersuchungsanordnung enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die messende Radiountersuchungsanord— nung radioisotopisch bezeichnetes menschliches Choriongona— dotropin enthält.

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4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß die Arbeitsgänge des Vorsehens und Beobachtens der anzeigenden Anordnung das Berühren des Rezeptors und der Probe in der Anwesenheit des radioisotopisch bezeichneten menschlichen Choriongonado~ tropins enthalten, uiodurch ein Teil des bezeichneten Hormons und ein Teil des in der Probe vorhandenen unbezeichneten Hormons an den Rezeptor gebunden ist, das Trennen der rezeptorgebundenen Hormone von den ungebundenen Hormonen in der wässrigen Probe und das Messen der Radioaktivität wenigstens des abgeschiedenen Rezeptors oder der wässrigen Probe, um die Konzentration des Hormons als eine Funktion der gemessenen Radioaktivität zu bestimmen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß das radioisotopisch bezeichnete Hormon mit einem Isotop von Iod bezeichnet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch

125 gekennzeichnet , daß das Isotop I ist.

7. Verfahren nach Anspruch 4, d a d u rc h gekennzeichnet , daß die Probe eine Körperflüssigkeit einer menschlichen Frau ist, die im Verdacht steht, schwanger zu sein und wodurch die Ergebnisse des Verfahrens eine Bestimmung des Zuständes der Schwangerschaft vorsehen.

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8. !/erfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß die Körperflüssigkeit aus Blutserum oder Urin gewählt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß die Körperflüssigkeit Blutserum ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß das Blutserum in einer Menge won etwa 0,1 ml verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeic hnet, daß der Rezeptor won dem corpus luteum eines Säugetiers erhalten ujird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß der Rezeptor von dem corpus luteum einer Kuh, eines Schafes, eines Schweines oder eines Pferdes erhalten wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß der Rezeptor von dem corpus luteum einer Kuh erhalten wird.

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14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Rezeptor durch ein Verfahren erhalten wird, enthaltend die Arbeitsgänge des Präparierens eines fein zerkleinerten Gewebehomogenats von corpus luteum-Gewebe , das Abscheiden der Plasmamembranen von dem Homogenat und das Wählen der Plasmamembranenfraktion, die -in der Lage ist, das biologisch aktive menschliche Choriongonadotropin wahlweise zu binden.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor von einer schwangeren Frau erhalten wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Frau in dem ersten Quartal der Schwangerschaft ist.

17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet ,daß die Probe eine Körperflüssigkeit eines weiblichen Säugetieres ist und wodurch die Ergebnisse des Verfahrens eine Bestimmung des Zustandes der Schwangerschaft vorsehen.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet ,daß die Körperflüssigkeit aus Blut oder Urin gewählt wird.

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19. Reagenz für die Rezeptor-chBrnische Bestimmung des. Hormons menschliches Choriongonadotropin, gekennzeichnet durch die im wesentlichen reine Form der spezifischen Fraktion des PlasmamBmbranBnBxtraktss von dem corpus luteutn einer Art, die den Rezeptor für das Hormon menschliches Choriongonadotropin aufweist, wobei die Fraktion in der Lage ist, biologisch aktives menschliches Choriongonadotropin wahlweise zu binden.

20. Verfahren für die Herstellung einer Reagenz für Rezeptor—chemische Bestimmung des Hormons menschliches Choriongonadotropin, gekennzeichnet durch die Arbeitsgänge des Herstellens eines fein verteilten Homogenats aus corpus luteum-Gewebe einer Art, diB den Rezeptor für menschliches Choriongonadotropin aufweist, das Abscheiden der Plasmamembranen von dem Homogenat und das U/ählen der Plasmamembranenfraktion, die in der Lage ist, das biologisch aktive menschliche Choriongonadotropin wahlweise zu binden.

21. Eine Anordnung für das Bestimmen des menschlichen Choriongonadotropine (HCG), luteinisierendes Hormon (LH) oder HCG-ähnliches material in einer wässrigen Probe, gekennzeichnet durch

a) eine erste Reagenz und eine zweite Reagenz;

b) wobei die erste Reagenz in im wesentlichen reiner Form

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die spezifische Fraktion von Plasmamembranenextrakt von dsm corpus luteum einer Art enthält, die den Rezeptor für menschliches Choriongonadotropin aufweist, das in der Lage ist, biologisch aktives menschliches Choriongonadotropin wahlweise zu binden;

c) wobei die zweite Reagenz markiertes menschliches Choriongonadotropin enthält, das in der Lage ist, Strahlung zu emittieren, die erste Reagenz beabsichtigt ist, mit der Probe berührt zu werden, die das! zu messende Hormon enthält und die zweite Reagenz um den Teil des bezichneten und nicht bezeichneten Hormons an den Rezeptor zu binden;

d) eine Anordnung zum Wessen des Betrages des bezeichneten Hormons, das an den Rezepte gebunden ist, wobei die davon emittierte Strahlung eine Funktion der Konzentration des Hormons in der wässrigen Probe ist.

22. Anordnung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet , daß sie die Form einer Werkzeugtasche aufweist.

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