DE2406156A1

DE2406156A1 - Verfahren und vorrichtung zur herstellung eines fluessigkeits-gradienten, insbesondere zum waschen von blutkoerperchen

Info

Publication number: DE2406156A1
Application number: DE19742406156
Authority: DE
Inventors: John E Joyce
Original assignee: INT EQUIPMENT CO
Current assignee: INT EQUIPMENT CO
Priority date: 1973-02-08
Filing date: 1974-02-08
Publication date: 1974-08-15
Also published as: FR2217059A1; GB1404120A; GB1404119A; GB1404118A; FR2217059B1; US3815618A

Description

Patentanwälte

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t Manchen 22, Steiiudorfatr. 13

65-22.159P(22.l6OH) 8. .2. 1974

INTERNATIONAL EQUIPMENT COMPANY

Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung

eines Flüssigkeits-Gradienten, insbesondere zum Waschen von Blutkörperchen

Die im folgenden beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen sind besonders gut zum Waschen roter Blutkörperchen mit zwei unterschiedlichen Flüssigkeiten geeignet, die anschließend weiter untersucht werden sollen.

Bevor ein Patient von einem Spender eine Bluttransfusion erhalten kann, muß das Spenderblut untersucht werden, um sicherzustellen, daß es mit dem Blut des Patienten verträglich ist. Um das Blut auf seine Verträglichkeit untersuchen zu können, müssen die Blutkörperchen gewaschen und das sie umgebende Plasma oder Serum vollständig abgeschieden werden . Dieses Waschen geschieht normalerweise durch wiederholtes Ver-

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setzen der Blutkörperchen mit einer Salzlösung. Das Versetzen bzw. Verdünnen muß so lange wiederholt werden, bis eine Blutprobe ausreichend frei von Plasma oder Serum ist, so daß ein wirkungsvoller Test " mit "Coomb'schem" Serum oder einem anderen Reagens durchgeführt werden kann. Solche Versetzungen erfordern häufig mehr als vier Wasch- und Abgießstufen, bevor "Coomb'sches" Serum oder Vergleichsreagentien zugesetzt werden können.

Die Erfindung liefert ein Mittel zum Abstreifen bzw. Abscheiden des Plasma oder Serums von den roten Blutkörperchen durch Hindurchbewegen der roten Blutkörperchen durch eine Flüssigkeit, deren Dichte sich kontinuierlich gemäß einem vorgegebenen Gradienten ändert. Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann ein Versuchs- röhrchen mit zwei Flüssigkeiten von unterschiedlicher Dichte derart gefüllt werden, daß die Konzentration einer ersten oder weniger dichten Flüssigkeit im Bereich des Röhrchenoberteils am größten ist, während die Konzentration einer zweiten, dichteren Flüssigkeit am Röhrchenboden ein Maximum aufweist.

Schwimmen rote Blutkörperchen auf einer Flüssigkeit in einem Teströhrchen, die einen derartigen Dichte-Gradienten aufweist, und wird zentrifugiert, dann bewegen sich die roten Blutkörperchen im Teströhrchen durch die Flüssigkeit mit sich ändernder Dichte, die das gesamte Plasma von den roten Blutkörperchen abstreift, bevor diese den Boden des Teströhrchens erreichen. Wenn das Teströhrchen aus der Zentrifuge herausgenommen und die Gradientenflüssigkeit abgegossen wird, verbleiben die roten Blutkörperchen an seinem Boden und können ohne zusätzliche Behandlung weiter untersucht werden.

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Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines bestimmten Dichte-Gradienten in einer Flüssigkeit zu schaffen, mit der u.a. rote Blutkörperchen von dem sie umgebenden Plasma befreit werden können. Ferner soll eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens geschaffen werden, mit der ein vorbestimmter und regelbarer Konzentrations- und/oder Volumen-Gradient in einer Flüssigkeit aus zwei verschiedenen Flüssigkeiten erzeugt bzw. eingestellt werden kann, wobei dieser Flüssigkeitsgradient den Waschvorgang von roten Blutkörperchen in einer einzigen Zentrifugier-Stufe ermöglicht.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Flüssigkeits-Gradienten wird die Menge einer aus einer Kammer oder Zelle ausfließenden Flüssigkeit gegenüber der aus einer zweiten Kammer ausfließenden Flüssigkeit kontinuierlich geändert, wobei diese Mengenänderung der beiden Flüssigkeiten eine sich kontinuierlich ändernde Zusammensetzung der Misch-Flüssigkeit μηα damit den Flüssigkeitsgradienten ergibt. Bei dem Verfahren zum Waschen der roten Blutkörperchen werden die Blutkörperchen durch die stationäre Flüssigkeit mit dem eingestellten Gradienten zum Boden eines Behälters bewegt, wobei am Boden des Behälters die Flüssigkeit eine höhere "Dichte als im oberen Behälterbereich aufweist.

Die Vorrichtung zur Herstellung eines einstellbaren Gradienten aus zwei Flüssigkeiten besitzt zwei Zellen, die mit zwei den Gradienten bildenden Flüssigkeiten gefüllt sind. Jede Z^Ie enthält einen Auslaß, durch den die jeweilige Flüssigkeit in eine Gradientenbildungszone abfließt. Im Behälter sind Einrichtungen zur kontinuierlichen Änderung

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der aus einer Zelle ausfließenden Flüssigkeitsmenge gegenüber der aus der anderen Zelle ausfließenden Flüssigkeitsmenge vorgesehen.

Im folgenden werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 a einen Schnitt durch eine erste Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit schematischer Darstellung des Funktionsprinzips,

Fig. 2 einen Schnitt durch eine weitere Ausführung vom Typ nach Fig. 1,

Fig. 3 die zweckmäßige Anordnung eines Proberöhrchens zur Austragsleitung, wenn die dichteste Flüssigkeit zuerst aus der Vorrichtung nach Fig. 2 ausfließt,

Fig. 4 eine perspektivische Darstellung einer anderen Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit auswechselbaren Einsätzen zur Änderung des Konzentrationsgradienten,

Fig. 5 eine weitere Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung im Schnitt,

Fig. 6 bis 9 schematische Darstellungen der Wirkungsweise der Vorrichtung nach Fig. 5.

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Die erfindungsgemäße Vorrichtung 10, deren Funktionsweise in Fig. 1 schematisch dargestellt ist, enthält zwei durch eine Zwischenwand 13 gegeneinander abgetrennte Zellen 12 und 14. Am Boden der Vorrichtung 10 befinden sich Auslässe 15 und 16, durch die je eine Flüssigkeit aus den Zellen 12 und 14 in Leitungen 18 und 20 fließen können. Die Auslässe 15 und 16 besitzen gleiche Ström ungsquerschnitte. Die Leitungen 18 und 20 vereinigen sich in einem Verbindungsteil 22 zu einer einzigen Abflußleitung 24. Ein geeignetes Ventil 17 ist zum Absperren der Abflußleitung 24 beim Füllen der Zellen mit Flüssigkeit vorgesehen.

Zur Erzeugung eines bestimmten Konzentrationsgradienten werden beide Zellen 12 und 14 mit Flüssigkeiten gefüllt. Da der Zweck der Vorrichtung 10 darin besteht, einen bestimmten und regelbaren Konzentrationsgradienten bzw. eine bestimmte Konzentrationsänderung in einem Gefäß, z. B. dem Versuchsröhrchen 26, herbeizuführen, unterscheidet'sich die Flüssigkeit in der Zelle 12 in verschiedener Weise von der Flüssigkeit in der Zelle 14. Zum Waschen von Blutkörperchen unterscheiden sich die Flüssigkeiten in den beiden Zellen gemäß der Erfindung durch unterschiedliche Konzentrationen, wobei gegebenenfalls zwei Rohrzucker-Lösungen unterschiedlicher Konzentration eingesetzt werden. Zur Herstellung von Dichte-Gradienten ist es aus den unten näher beschriebenen Gründen wünschenswert, die Zelle 12 mit der dichteren und die Zelle 14 mit der weniger dichten Flüssigkeit zu fül- ■ len.

Obwohl die Erfindung in erster Linie zur Ausbildung von Dichte-Gradienten bei Flüssigkeiten konzipiert ist, liegt es auf der Hand, daß

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die Vorrichtung zur Erzeugung verschiedener Arten von Flüssigkeitsgradienten eingesetzt werden kann, z.B. daß sie in vorteilhafter Weise zur Erzeugung von Reflektionsgradienten, zur Einstellung sich ändernder Ionenstärken, von Viskositätsgradienten, pH-Gradienten oder optischer Dichte-Gradienten verwendet werden kann.

Zum besseren Verständnis des Funktionsprinzips der Vorrichtung 10 ist in Fig. 1 die Flüssigkeit in der Zelle 12 schematisch durch eine Vielzahl von Vierecken und die Flüssigkeit in der Zelle 14 schematisch durch eine Vielzahl von Kreisen dargestellt. Es leuchtet jedoch ein, daß diese Symbole keinerlei Einfluß auf die Eigenschaften der in den Zellen 12 und 14 enthaltenen Flüssigkeiten haben. Die Kreise und Vierecke sind lediglich Mittel zum leichteren Verständnis, wie die Konzentration oder die VoIiCmengradienten mit Hilfe des erfindungsgemäßen Gerätes eingestellt werden können.

Bevor irgendeine Strömung durch die Auslässe 15 und 16 der Vorrichtung 10 eintritt, wird die Zelle 12 mit einer geeigneten Flüssigkeit von oben her gefüllt, wie es durch den Pfeil 28 angegeben ist. Die Zelle 14 wird mit einer anderen Flüssigkeit von oben in Richtung des Pfeiles 30 gefüllt.

Die günstigste Wirkung der Vorrichtung 10 tritt dann ein, wenn die Zellen 12 und 14 anfangs bis zum gleichen Pegel gefüllt sind. Die Zellen 12 und 14 werden annähernd gleich bleiben. Bei Flüssigkeiten mit sehr unterschiedlichen Dichten sollen die Pegelhöhen jedoch annähernd umgekehrt proportional zu den Dichten sein. Vor Beginn des Betriebes

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sind die Flüssigkeitspegel in beiden Zellen 12 und 14 auf den gleichen Pegelstand 32 eingestellt. Wird die Ablaufleitung 24 eine bestimmte Zeitspanne dt. geöffnet, dann bleibt der Flüssigkeitspegel in beiden Zellen 12 oder 14 gleich. In einer ersten Zeiteinheit dt., in der die Flüssigkeiten durch die Auslässe 15 und 16 strömen (Pfeile 34) sinken die Flüssigkeitsspiegel in beiden Zellen um einen gleichen Betrag auf den eingezeichneten Pegel 36.

Die Zeitspanne, in der der Flüssigkeitsspiegel vom Pegel 32 zum Pegel 36 aufgrund einer Flüssigkeitsströmung durch die Auslässe 15 und 16 sinkt, ist durch die Klammer dt. in Fig. 1 angegeben. Die Menge und das Verhältnis der in der Anfangszeitspanne dt. durch die Auslässe 15 und 16 ausströmenden Flüssigkeit ist schematisch in dem Versuchsröhrchen 26 durch die Klammer dt. gezeigt. Wie aus Fig. 1 ersichtlich, entspricht die aus der Zelle 14 in das Versuchsröhrchen 26 abgeflossene Flüssigkeit der schematisch durch die Kreise zwischen den Pegeln 32 und 36 angegebenen Menge, wohingegen die aus der Zelle 12 in das Teströhrchen geflossene Flüssigkeitsmenge den Vierecken zwischen den Pegeln 32 und 36 entspricht, wenn der Flüssigkeitspegel in den Zellen 12 und 14 vom Pegel 32 zum Pegel 36 gesunken ist.

Demnach fließt in dieser Zeitspanne dt. ein großes Volumen von weniger dichter Flüssigkeit aus der Zelle 14 in das Teströhrchen 26 gegenüber einem relativ geringen Volumen an Flüssigkeit von höherer Dichte aus der Zelle 12.

Das aus dieser Zelle 12 durch die Abflußleitung 24 strömende

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Volumen der dichteren Flüssigkeit vergrößert sich kontinuierlich mit absinkenden Flüssigkeitspegeln der Zellen 12 und 14, wohingegen das Flüssigkeitsvolujnen aus der Zelle 14 abnimmt, wenn der Pegel in der Zelle 14 sinkt. Diese Beziehung bleibt erhalten, bis beide Zellen 12 und 14 leer sind.

Wie aus Fig. 1 weiter ersichtlich, kehrt sich das Volumenverhältnis während der letzten Zeitspanne dt gegenüber dem Volumenverhältnis in der ersten Zeitspanne dt. um. Das bedeutet, daß die Volumenproportion der in das Versuchsröhrchen 26 abfließenden Flüssigkeiten beim Abströmen der Flüssigkeit aus den Zellen 12 und 14 vom Pegel 38 zum Boden 40 gleich und entgegengesetzt zu der Flüssigkeitsproportion der Anfangs-Zeitspanne ist. Diese Wirkung basiert auf der Tatsache, daß die Zeitspannen dt. und dt gleich sind und die Zwischenwand 13 zur Ausbildung eines linearen Gradienten ausgerichtet ist. Die Erfindung ist jedoch nicht auf Ausrichtung der Zwischenwand 13 zur Erzielung eines derartigen Gradienten beschränkt. Vielmehr können auch die Volumina der Zellen ungleich sein. Die Zellen 12 und 14 mit gleichen Volumina wurden lediglich zum leichtern Verständnis der Erfindung gewählt.

Es sei darauf hingewiesen, daß die in der Anfangs-Zeitspanne abgegebene große Menge an Flüssigkeit mit geringer Dichte durch die folgenden, schwereren Flüssigkeiten verschoben bzw. bewegt wird. Aus diesem Grunde ist die in der Anfangs-Zeitspanne dt. eingeflossene Flüssigkeitsmenge am oberen Teil des Versuchsröhrchens 26 eingezeichnet.

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Obwohl es auch möglich ist, das Verhältnis der Flüssigkeiten in den Zellen 12 und 14 umzukehren, so daß sich die Flüssigkeit mit höherer Dichte in der Zelle 14 und die Flüssigkeit mit geringerer Dichte in der Z He 12 befinden und dadurch beim kontinuierlichen Ablaufen der schwereren Flüssigkeit die Flüssigkeit mit geringerer Dichte folgt, ist eine derartige Anordnung nach Fig. 1 zum Waschen der Blutkörperchen nicht erwünscht. Wird nämlich die Flüssigkeit mit höherer Dichte zuerst in das Teströhrchen eingelassen, dann durchdringt die folgende Flüssigkeit mit geringerer Dichte die schwerere Flüssigkeit. Ein solches Durchdringen führt zu einer bestimmten Vermischung im Versuchsröhrcheir 26. Naturgemäß ist jedoch jegliche Vermischung eines Flüssigkeitsgradienten unerwünscht, wenn der Konzentrationsgradienten zur Erzielung einer stabilen Sedimentation einer suspendierten Masse von einer Flüssigkeit zur anderen durch Gravitations- oder Zentrifugalkräfte erfolgen soll.

Bei einer zweckmäßigen Anordnung nach Fig. 3, bei welcher die Flüssigkeit mit höherer Dichte zuerst abläuft, endet die Ablaufleitung 24 am oberen Ende des Versuchsröhrchens - Bei dieser Ausführung nach Fig. 3 tritt jedoch ein unerwünschtes Verspritzen auf, wenn das Ende der Abflußleitung 24 einen zu großen Abstand zum Boden des Teströhrchens aufweist. Die Flüssigkeit geringerer Dichte, die der Flüssigkeit höherer Dichte folgt, kann dann nämlich aufspritzen, was zu einer gewissen Vermischung der Flüssigkeiten in dem Versuchsröhrchen 26 führt. Hierzu ist jedoch zu bemerken, daß eine geringe Vermischung der Flüssigkeiten nicht immer ein größeres Problem darstellt. Wie weiter unten bei der Beschreibung des Ausführungsbeispiels nach Fig. 3 dargelegt, ist es darüber hinaus mit benetzbaren Flüssigkeiten und

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einer in Fig. 3 dargestellten Röhrchenlage möglich, die Flüssigkeit ■mit geringerer Dichte zuerst ohne wesentliche Vermischung einzufüllen. Für Blutuntersuchungen ist es jedoch am vorteilhaftesten, die Flüssigkeit mit der niedrigeren Dichte zuerst in der in Fig. 1 dargestellten Weise einzufüllen.

Eine andere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung vom Typ nach Fig. 1 ist in Fig. 2 gezeigt. Die Vorrichtung 10 enthält einige Gefäße 42 zur Aufnahme einer bestimmten Flüssigkeitsmenge . Sie besitzt vier Wände 44 und einen Boden 46. Da in Fig. 2 der vordere Teil weggebrochen ist, ist die Vorderwand nicht dargestellt. Der Behälter bzw. das Gefäß 42 ist durch eine diagonal im Behälter 42 angeordnete Zwischenwand 13 in zwei gleichgroße Zellen 12 und 14 unterteilt. Bei geöffneten Leitungen 18. und 20 fließen die Flüssigkeiten aus den Zellen 12 und 14 in dem Verbindungsstück 22 zusammen und aus diesem in einen Mischer 48. Dieser Mischer 48 kann irgendein herkömmlicher, in der Leitung angeordneter Labormischer sein. In der Praxis ergeben sich auch ausreichende Gradienten, ohne einen Mischer im Ablaufsystem.

Da die Auslässe 15 und 16 gleiche Strömungsquerschnitte und die Leitungen gleiche Durchmesser besitzen, wird beim Absinken des Flüssigkeitspegels in den Zellen 12 und 14 eine größere Flüssigkeitsmenge aus der Zelle 14 mit einer geringeren Flüssigkeitsmenge aus der Zelle 12 vermischt.

Sobald der Flüssigkeitsspiegel im Behälter 42 einen Punkt unterhalb des höchsten Punktes der Leitungen erreicht, wirkt auf die Flüssig-

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keiten eine durch Schwerkraft bedingte Saugwirkung, falls kein größerer Druckabfall im Mischer 48 verursacht wird. Liegt jedoch ein derartiger Druckabfall vor, dann kann eine geeignete Pumpe 49 hinter dem Mischer 48 zum Abziehen der Flüssigkeiten durch das Leitungssystem vorgesehen sein. Es kann somit entweder eine Pumpen- oder eine Schwerkraftförderung zum Überführen der Flüssigkeiten durch die Leitung 24 in einen Behälter vorgesehen werden. Wie in Fig. 2 gezeigt, kann sich ferner die Leitung 24 verzweigen, um entsprechende Flüssigkeitsgradienten in mehreren Versuchsröhrchen 26 gleichzeitig zu erhalten.

Da eine wichtige Anwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung 10 in der Herstellung von Dichte-Gradienten, wie beispielsweise von Lösungen mit veränderlichen Konzentrationen, liegt, sind Vorkehrungen zu treffen, um ein Übertreten der Flüssigkeit mit geringerer Dichte aus einer Zelle in die andere zu verhindern, da die Strömung weit mehr durch Viskositäts-Faktoren als durch Schwerkraft oder Körperkräfte bestimmt wird. Daher soll der Strömungsdurchnesser der Auslässe 15 und 16 ebenso wie der Innendurchmesser der Leitungen 18 und 20 so gewählt werden, daß der Strömungswiderstand der Flüssigkeiten in den Auslässen und Leitungen durch den jeweiligen Druck in den Kammern geregelt wird und die Viskosität beider Flüssigkeiten sich auf die Strömung nicht merkbar auswirkt. Die Strömungsquerschnitte der Abflüsse aus jeder Zelle können daher voneinander differieren, falls die Viskositäten der beiden Flüssigkeiten ein bestimmtes angestrebtes Gleichgewicht der Ström ungs wider stände zwischen jeder Kammer und der Mischzone bestimmen. Eine 20prozentige Rohrzucker-

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Lösung ist beispielsweise doppelt so viskos wie Wasser. Falls die viskosere oder zähflüssigere Flüssigkeit (20prozentige Saccharose) durch eine Leitung strömt, deren Durchmesser um den Faktor \{2 größer als der Durchmesser einer entsprechenden Wasserleitung ist, dann ist der Strömungswiderstand pro Längeneinheit pro Einheit an Durchflußleistung gleich. Für bestimmte Anwendungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann dieses Merkmal angestrebt werden. Da sich ferner die Durchflußleistungen ständig ändern, ist es vorteilhaft, die Verbindungsstücke der Leitungen in die Nähe der Anschlüsse zu den Zellen (Fig. l) zulegen, so daß der Druckabfall oder der Strömungswiderstand durch eine einzige Leitung beherrscht wird.

Wie oben ausgeführt, erzeugt das System nach Fig. 2 den kleinsten Dichtewert des Gradienten am Anfang. Die aus der Leitung 24 am Boden des Teströhrchens 26 ausströmende Flüssigkeit schwimmt daher über den folgenden dichteren Phasen. Eine zweckmäßige Änderung für den Zulauf der Flüssigkeiten durch die Leitung 24 ist möglich, wenn die L sungen in den Zellen 12 und 14 ausgetauscht werden, so daß das dichtere Ende des Gradienten zuerst in das Versuchsröhrchen 26 gelangt. Wenn das dichtere Ende des Gradienten zuerst eingetragen wird, ist es vorteilhaft, das Teströhrchen 26 unter einem Winkel gegenüber der Leitung 24 anzuordnen und das Versuchsröhrchen 26 sowie die Abflußleitung 24 gegeneinander so auszurichten, daß das Ende der Leitung 24 sich im Bereich des oberen Endes des Versuchsröhrchens 26 befindet. Bei der Anoxdnung nach Fig. 3 können benetzbare Flüssigkeiten aus der Leitung 24 an der Seite des Versuchsröhrchens 26 ohne Spritzen entlangfließen, ohne daß es zur Störung des sich im Röhrchen bildenden Gradienten kommt.

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Bei einer weiteren Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Erzielung bestimmter Konzentrations-Volumen-Gradienten gemäß Fig. 4 besteht das Gerät 50 aus zwei symmetrischen rechteckigen Zellen 52 und 54. Ähnlich wie bei den Geräten 10 nach Fig. 2 umfaßt das Gerät 50 einen Flüssigkeitsbehälter 56 mit vier Wänden 58 und einen Boden. Eine Trennwand 60 unterteilt den Behälter 56 in die Zellen 52 und 54. Gleichgroße Abflüsse am Boden der Zellen 52 und 54 erlauben ein Abfließen der Flüssigkeit in die Leitungen 62 und 64. Diese Leitungen 62 und 64 haben gleiche Durchmesser und sind über ein gemeinsames Verbindungsteil 66 mit einer Abflußleitung 68 verbunden. Beide Zellen 52 und 54 sind oben offen. Zur Ausbildung verschiedener, z. B. nicht linearer Gradienten können die Zellen 52 und 54 auch unterschiedliche Volumina haben. Ebenso kann auch der Strömungsquerschnitt der Abflüsse ungleich sein.

Bei dem Gerät nach Fig. 4 können Änderungen des Gradienten durch unterschiedliche Einsätze 70 erzielt werden, die jeweils entsprechend dem gewünschten Gradienten ausgebildet sind.

Bei allen Ausführungen gemäß der Erfindung wird die Konzentration der aus der Abflußleitung ausströmenden Flüssigkeiten vom volumetrischen Teil jeder die jeweilige Zelle verlassenden Flüssigkeit bestimmt. Diese volumetrischen Teile hängen von der Flüssigkeits-Oberfläche in der jeweiligen Zelle ab, die wiederum durch die kombinierte Wirkung der die Zellen gegeneinander teilenden Trennwand und der Flüssigkeits.höhe in jeder Zelle bestimmt wird. Die Höhe der Flüssigkeit ist eine Funktion der Flüssigkeitsdichte in der Zelle und der auf die Flüssig-

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keit wirkenden Schwerkraft. Daher ist bei Zellen mit gleichgroßen Öffnungen die volumetrische Verteilung der aus den Zellen ausfließenden Flüssigkeiten lediglich eine Funktion der spezifischen Anordnung der die Zellen abteilenden Trennwand. In Fig. 2 ist die Trennwand 13 beispielsweise eine geradlinige schräge Wand, die einen weitgehend linearen Gradienten erzeugt, dessen Verlauf annähernd äquivalent zum Änderungsgrad des Volumens mit der Tiefe in den Zellen ist.

Bei der in Fig. 5 dargestellten weiteren Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung befindet sich der Gradientenerzeuger 72 im oberen Teil eines Behälters 74, der eine einem Versuchsröhrchen ähnliche Gestalt aufweist und in eine Zentrifuge eingesetzt werden kann. Der Behälter 74 ist beides, ein Gradientenerzeuger und ein Versuchsröhrchen, in welchem die zu waschenden Blutkörperchen zentrifugiert werden. Der den Gradientenerzeuger 72 umfassende obere Teil des Behälters 74 besitzt zwei Kammern 76 und 78, die durch eine Trennwand 77 gegeneinander abgetrennt sind. Bei der erfindungsgemäßen Ausführung nach Fig. 5 ist es vorteilhaft, die Kammern 76 und 78 mit den Flüssigkeiten vorzufüllen, die den Gradienten bestimmen. Es ist ohne weiteres ersichtlich, daß die Kammern 76 und 78 wie die Kammern 12 und 14 der Ausführung nach Fig. 2 ausgebildet sein können. Wie bei dieser Ausführung ist die vorteilhafteste Art der Vorfüllung des Gradientenerzeugers 72 die Kammer 78 mit der weniger dichten und die Kammer 76 mit der dichteren Flüssigkeit zu füllen. Jede der Kammern 76 und 78 besitzt eine Kapillaröffnung 80 und 82, die mit einem Kapillar-Kanal 86 kommuniziert. Die Durchmesser der Öffnungen 80 und 82 und der Innendurchmesser des Kanals 86 liegen vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 2,0 mm. Der Kapillar-Kanal 86

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endet am Boden des Behälters 74, der ein Versuchsröhrchen 88 für die Blutuntersuchung bildet. Die Kapillaröffnungen 80 und 82 sind so ausgebildet, daß bei normalem Schwerefeld keine der Flüssigkeiten durch diese Öffnungen abfließen kann. Unter einem größeren Gravitationsfeld, z.B. den in einer Zentrifuge erzeugten Zentrifugalkräften, fließt die in den Kammern 76 und 78 enthaltene Flüssigkeit durch die Öffnungen 80 und 82. Alternativ können die Öffnungen 80 und 82 auch mit einem nicht benetzendem Material verstopft sein. Wird ein so verstopfter Behälter 74 zentrifugiert, dann bricht das zusätzliche, durch die Zentrifuge erzeugte Kavitationsfeld den Pfropfen, so daß Flüssigkeit durch die Öffnungen ausfließen kann.

Der Teströhrchen-Teil 88 und der Gradienten-Erzeuger-Teil 72 des Behälters 74 sind so miteinander verbunden, daß der Erzeuger 72 von dem Teströhrchenteil 88 abgebrochen werden kann.

Im Teströhrchen-Teil 88 ist eine Öffnung 90 zum Einbringen einer zu waschenden Probe an Blutkörperchen vorgesehen. Ist der Behälter 74 beschickt, in einer Zentrifuge eingesetzt und wird zentrifugiert, dann fließen die Flüssigkeiten aus den Kammern 76 und 78 in den Versuchs-Röhrchen-Teil 88. Die in das Versuchsröhrchen 88 "eingeführte, zu untersuchende Blutprobe schwimmt anfangs auf dem Konzentrationsgradienten im Teströhrchenteil 88.

Beim weiteren Zentrifugieren wird die Blutprobe durch die Flüssigkeit im Teströhrchenteil 88 hindurchbewegt und dabei gewaschen. Nach Beendigung des Waschvorgangs und dem Herausnehmen des Behälters 74

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.aus der Zentrifuge wird der Behälter 74 zerbrochen, um das die ge- ι waschenen Blutkörperchen enthaltende Versuchsröhrchen zu erhalten, die dann auf einfache Weise weiter untersucht werden können.

Bei einer bevorzugten Ausführung der Erfindung besteht der Behälter 74 aus einem verformbaren, elastischen thermoplastischen Material, z.B. Polyvinylchlorid. Der Vorteil eines solchen Materials liegt im leichten Abschneiden mittels Scheren. Dadurch kann ein aus einem solchen Material bestehender Behälter nach dem Waschen der Blutkörperchen oberhalb der Flüssigkeit im Behälter abgeschnitten werden, und so ein gesonderter Teströhrchenteil 88 erhalten werden. Danach kann die Flüssigkeit oberhalb der Blutkörperchen abgegossen werden. Zur Sicherung der gewaschenen Blutkörperchen werden die PVC-Wände des Versuchsröhrchenteils 88 oberhalb der Blutkörperchen zusammengedrückt. Das Zusammendrücken der Wände dichtet den Teströhrchenteil 88 ab und gewährleistet einen sicheren und einfachen Einschluß der roten Blutkörperchen im Teströhrchenteil 88.

Die Fig. 6 bis 9 sind schematische Darstellungen der Anwendung bzw. der Wirkungsweise eines erfindungsgemäßen Gerätes nach Fig. 5 . Fig. 6 zeigt eine in dem Teströhrchenteil 88 des Behälters 74 injizierte Probe an zu waschenden Blutkörperchen 92. Wie aus Fig. 7 ersichtlich, werden die den Gradienten bildenden Flüssigkeiten in die Kammern 76 und 78 injiziert, wobei die Flüssigkeit höherer Dichte in die Kammer 76 und diejenige mit niedrigerer Dichte in die Kammer 78 eingegeben wird. Darüber hinaus ist es vorteilhaft, die gesamte notwendge Menge an "Coornb'schem" Serum zu gleichen Teilen in die Kammern 76 und

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78 mit einzugeben, obwohl diese Stufe wahlweise erfolgen kann.

Die tatsächliche Reihenfolge der Abläufe gemäß der Fig. 6 und 7 kann natürlich auch umgekehrt werden, wobei es beispielsweise vorteilhaft ist, die Zellen 76 und 78 des Behälters 74 mit Flüssigkeiten vorzufüllen und die Blutprobe im Labor zuzusetzen. Bei Verwendung solcher vorbehandelter Behälter ist die einzige im Labor noch in den Behälter 74 zu injizierende Flüssigkeit die Blutprobe selbst.

Der den vorbehandelten Gradientenerzeuger 72 und den ebenfalls vorbehandelten Teströhrchenteil 88 enthaltende Behälter 74 wird in eine Zentrifuge eingesetzt und wie in Fig. 8 gezeigt zentrifugiert. Während der Anfangsphasen des Zentrifugierens wird ein Dichte-Gradient 94 im Teströhrchenteil 88 erzeugt, auf dem die zu waschenden roten Blutkörperchen schwimmen. Die Zentrifugalkräfte sind hoch genug, um die Flüssigkeiten aus den beiden Zellen 76 und 78 zur Ausbildung des Dichte-Gradienten in dem Teströhrchenteil 88 auszutreiben. Beim weiteren Zentrifugieren werden die roten Blutkörperchen durch den Gradienten 94 zum Boden des Teströhrchenteils 88 bewegt (Fig. 9). Danach wird der Behälter 74 in zwei Teile gebrochen, um den Teströhrchenteil 88 zu erhalten, in dem sich die gewaschenen roten Blutkörperchen befinden.

Erforderlichenfalls wird die überschüssige Flüssigkeit abgegossen und die gewaschenen roten Blutkörperchen weiter untersucht. Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Gradientenerzeugers wird eine effektivere Waschung der Blutkörperchen möglich.

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Im folgenden wird die Technik des Waschens von Blutkörperchen niit der erfindungsgemäßen Vorrichtung anhand von Ausführungsbeispielen beschrieben:

Beispiel 1

Bei der Verwendung einer Ausführung gemäß Fig. 2 wird der Behälter mit Flüssigkeiten von unterschiedlicher Dichte gefüllt. In die Zelle 12 wird eine 12gewichtprozentige Lösung von "Ficoll" in normaler Salzlösung und in die Zelle 14 bis zum gleichen Pegel eine normale Salzlösung eingegeben. Das spezifische Gewicht der Ficoll-Lösung beträgt 1,07 und das der normalen Salzlösung 1,03. Die Kapazität des Generators 10 ist dabei so gewählt, daß bei vollständig gefüllten Zellen 12 und 14 die Teströhrchen die gesamte Flüssigkeitsmenge der Zellen aufnehmen. Demzufolge enthält jedes Teströhrchen einen Bruchteil des gesamten durch die Vorrichtung erzeugten Gradienten. Nach dem Füllen der Teströhrchen wird eine zu untersuchende Blutprobe auf die Oberfläche der in dem Teströhrchen befindlichen Flüssigkeit eingegeben. Bei einem 10-ml=Teströhrchen mit ca. 8 ml Waschflüssigkeit beträgt die in das Teströhrchen eingegebene Blutmenge 1 ml. Das die zu waschende Blutprobe enthaltende Teströhrchen wird danach in eine Zentrifuge eingesetzt und mit einer Drehzahl von 3000 Upm eine Minute lang oder mit 1000 Upm 10 Minuten lang zentrifugiert. Das Teströhrchen wird danach aus der Zentrifuge herausgenommen und die Flüssigkeit oberhalb der gewaschenen Blutkörperchen abgezogen. Die gewaschenen Blutkörperchen am Boden des Teströhrchens werden dann

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mit Coomb'schem Serum oder einem anderen Gegenstoff untersucht. Natürlich wird das Ergebnis des Coomb' sehen Testes durch die Art des untersuchten Blutes geregelt.

Beispiel 2

Bei Verwendung einer erfindungsgemäßen Ausführung nach Fig. werden die Blutkörperchen in folgender Weise gewaschen: Die Kammern 76 und 78 sind mit den den Gradienten bildenden Flüssigkeiten vorgefüllt. In der Kammer 76 befinden sich 2,5 ml einer 12gewichtprozentigen Lösung von "Ficoll" in normaler Salzlösung und in der Kammer 78 2,5 ml normaler Salzlösung. Eine 0,2-ml-Blutprobe wird danach durch die Öffnung 90 in den Behälter 74 injiziert. Der Behälter wird dann in eine Zentrifuge eingesetzt und bei einer Drehzahl von 2000 Upm eine halbe Minute lang zentrifugiert, wobei die Flüssigkeiten aus den Kammern 76 und 78 in den Teströhrchenteil 88 gedrückt werden. Zur Erzielung eines derartigen Flusses beträgt der Innendurchmesser der Öffnungen 80 und 82 0,5 mm. Danach wird der Behälter 74 mit einer Drehzahl von 3000 Upm eine Minute lang zentrifugiert, wodurch die Blutkörperchen durch die Flüssigkeiten in dem Teströhrchenteil 88 hindurchbewegt werden. Der Behälter 74 wird dann aus der Zentrifuge herausgenommen und eine Hälfte zum Erhalt des Teströhrchenteils 88 abgebrochen. Nach dem Abziehen der Flüssigkeit aus dem Teströhrchenteil 88 ist der Waschvorgang der Blutkörperchen abgeschlossen und diese können weiter untersucht'werden.

In den obigen Beispielen wurde der Dichte-Gradient aus einer

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12prozentigen Lösung von "Ficoll" in normaler Salzlösung gebildet. Dabei ist unter dem Ausdruck "Ficoll" ein synthetisches Hochpolymer zu verstehen, welches durch Copolymerisation von Rohrzucker und Epichlorohydrin erhalten wird. Die Moleküle haben eine verzweigte Struktur und einen hohen Anteil an Hydroxylgruppen, die eine sehr gute Löslichkeit in wäßrigen Medien bewirken. Es wurden keine ionisierte Gruppen in "Ficoll" festgestellt. Das mittlere Molekulargewicht von "Ficoll" liegt bei 4 000 000 ± 100 000. Es besitzt eine Eigenviskosität von um 0,17 dl/g. "Ficoll" kann von der "Pharmacia Fine Chemicals, Inc., 800 Centennial Avenue, Piscataway, New Jersey 08 854" bezogen werden.

Es sei darauf hingewiesen, daß ein Gradient zum Waschen von Blutkörperchen aus einer Anzahl verschiedener Materialien gebildet werden kann. Die wichtigste Voraussetzung ist, daß der dichteste Bestandteil des Gradienten weniger dicht als die Blutkörperchen ist. Das spezifische Gewicht der Blutkörperchen liegt bei 1,20. Gemäß der Erfindung soll der Dichte-Gradient der Flüssigkeit, durch die das Blut gewaschen wird, eine spezifische Dichte zwischen ca. 1,03 und 1,15 haben, obwohl auch ausgezeichnete Ergebnisse mit einer Flüssigkeit erzielt werden, deren spezifischer Gewichts-Gradient bei 1,03 bis 1,09 liegt. Wird eine "Ficoll"-Lösung für die dichte Phase des Gradienten verwendet, ist es vorteilhaft, eine normale Salzlösung mit einem spezifischen Gewicht von 1,03 als zweite, geringer dichte Phase einzusetzen.

Blutkörperchen können auch erfindungsgemäß als Vorbereitung zum

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Gefrieren behandelt werden. Bei einer derartigen Gefrier-Vor bereitung werden die gewaschenen Zellen "glycerisiert", nachdem sie von ihrem Serum oder Plasma abgeschieden sind. Diese Behandlungsstufe kann zusammen mit dem Waschvorgang gemäß der Erfindung durchgeführt werden, und zwar:

1. durch Einführen von Glycerin oder dem gewünschten Reagens (Coomb'sches Serum) am Ende der Gradientenflüssigkeit als eine gesonderte Zone, die dichter ist als die dichteste Gradientenzone, jedoch leichter als die Blutkörperchen; oder

2. durch eine konstante Konzentration in der Gradientenflüssigkeit selbst ähnlich der Salzlösung. Der hergestellte Gradient wird eine gleichmäßige Reagentienkonzentration, eine veränderliche Konzentration an gelösten Gradientenstoffen haben.

Es ist ferner erwünscht, einen Dichte-Pufferboden des Teströhrchens auszubilden, um zu verhindern, daß die Blutkörperchen den Boden des Teströhrchens berühren. Hierzu kann eine Flüssigkeit am Boden des Teströhrchens mit einem spezifischen Gewicht von 1,25 wirksam eingesetzt werden. Ein Dichte-Puffer oder -Polster ist mitunter erwünscht, wenn die gewaschenen Blutkörperchen eingefroren werden sollen. Wird "Ficoll" in normaler Salzlösung eingesetzt, dann kann die Lösung "Ficoll" im Bereich von 12 bis 20 Gew.~% besitzen.

Neben oder zusätzlich zu "Ficoll" kann auch zur Ausbildung von Gradienten "Dextran" eingesetzt werden. Zur erfindungsgemäßen Aus-

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bildung von Dichte-Gradienten kann 12 bis 20 Gew.-% Lösung an Dextran in normaler Salzlösung verwendet werden. Dextran ist ein Anhydroglukose-Polymer, das durch verschiedene Stämme von Leuconostoc und eng verwandten Bakterien in Sacchrase enthaltenden Lösungen hergestellt wird. Die häufigsten Glukose-Verkettungen sind Oi D-I 6, aber auch geringere Werte, 1 * 3- und 1 > 4-Verkettungen kommen vor. Das Vorhandensein von derartigen nicht -1 —56-Verkettungen ist für das Verzweigen der Ketten von besonderer Bedeutung . Das Verhältnis 1 > 6 zu nicht 1- ■ > 6-Verkettungen kann

in weiten Grenzen (3 bis 14) für Dextran aus verschiedenen Quellen variieren, wobei sich als Konsequenz Unterschiede in den chemischen und physikalischen Eigenschaften ergeben. Von Leuconostoc mesenteroides erzeugtes pharmazeutisches Dextran Stamm B 512 hat 5 bis 10 % von nicht-1 ^ 6-Verkettungen.

Natürliches Dextran ist in Wasser löslich und ergibt hochviskose Lösungen. Seine Molekular-Verteilung ist extrem breit und umfaßt einen Molekulargewichtsbereich von Hunderten von Millionen bis herab zu den Oligosacchariden. Dextran kann ebenso von der "Pharmacia Fine Chemicals", Inc., 800 Centennial Avenue, Piscataway, New Jersey 08854, bezogen werden.

Die Erfindung kann auch in anderen spezifischen Formen eingesetzt bzw. angewandt werden. Die beschriebenen Ausführungen sollen daher lediglich dem klareren Verständnis der Erfindung dienen und die in den Ansprüchen definierte Erfindung nicht begrenzen, so daß alle Äquivalente oder ähnlichen Varianten mit von den Ansprüchen gedeckt werden.

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Claims

Ansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Gradienten in einer in einem Behälter befindlichen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß zwei unterschiedliche Flüssigkeiten, aus denen der Gradient gebildet wird, in gesonderte Zellen eingefüllt werden, daß diese Flüssigkeiten aus den Zellen zu einer Mischzone befördert werden, wobei sich die Menge der aus einer Zelle ausfließenden Flüssigkeit gegenüber der aus der anderen Zelle ausfließenden Flüssigkeit kontinuierlich ändert, und daß diese Flüssigkeiten aus der Mischzone in einen Behälter abgezogen werden.

2. Verfahren zum Waschen von roten Blutkörperchen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Behälter mit einer Flüssigkeit, deren Dichte geringer als diejenige der Blutkörperchen ist, in der Weise gefüllt wird, daß die Dichte der Flüssigkeit vom oberen Behälterteil zum Behälterboden ständig zunimmt, und daß danach die zu waschenden Blutkörperchen vom oberen Teil des Behälters zum Behälterboden durch die stationäre Flüssigkeit bewegt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutkörperchen durch Zentrifugieren durch die Flüssigkeit bewegt werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , daß ein Dichte-Gradient in einer im Behälter befindlichen

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Waschflüssigkeit durch Einlassen von zwei unterschiedlich dichten Flüssigkeiten, deren Dichte jedoch unter derjenigen der Blutkörperchen liegt, aus zwei gesonderten Zellen in eine Mischzone gebildet wird, wobei die Flüssigkeitsmenge aus einer Zelle gegenüber der Flüssigkeitsmenge aus der anderen Zelle sich kontinuierlich ändert, daß die Flüssigkeit mit sich kontinuierlich ändernder Dichte aus der Mischzone in einen Behälter abgezogen wird, und daß danach die auf die Waschflüssigkeit aufgebrachten Blutkörperchen durch die im Behälter befindliche Flüssigkeit zum Behälterboden bewegt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutkörperchen durch Zentrifugieren durch die Flüssigkeit bewegt werden.

6. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch zwei mit unterschiedlichen Flüssigkeiten gefüllten Zellen (12, 14), die jeweils einen Auslaß (15, 16) zum Ausfließen der Flüssigkeiten in eine Gradienten-Bildungs zone mit Leitungen (18, 20) aufweisen, wobei die Leitungen zu einem Mischteil (19, 22) führen, an das eine in einen Behälter (26) reichende Ablaufleitung (24) angeschlossen ist, und daß die beiden Zellen (12, 14) durch eine geneigte Trennwand (13) gegeneinander abgeteilt sind, deren Ausrichtung den Grad der Änderung des Gradienten bestimmt.

7. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Auslässe (15, 16) am Boden (40) jeder Zelle (12,13) rj Strömungsquerschnitte aufweisen.

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nc:

8. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Volumina der beiden Zellen (12, 14) gleich sind.

9. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennwand (13) den Behälter (10) in zwei geometrisch gleiche
Zellen (12, 14) mit gleichen Voluminas unterteilt und daß feste Einsätze in den Zellen vorgesehen sind, deren geometrische For m den Verlauf des gewünschten Gradienten bestimmt.

10. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der untere Teil (88) eines Behälters (74) zur Aufnahme einer Blutprobe ausgebildet ist und daß der obere Teil (72) des Behälters (74) durch eine geneigte Trennwand (77) in zwei mit unterschiedlichen Flüssigkeiten gefüllte Zellen (76 bzw. 78) unterteilt ist, wobei am Boden jeder Zelle ein zu einer Mischzone (84, 86) führender Auslaß (80, 82) vorgesehen ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß am Behälter (74) Einrichtungen zum einfachen Abtrennen des oberen Reihenteiles (72) vom unteren Probe-Teil (88) vorgesehen sind.

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