DE2230320A1 - Reagenz zur bestimmung von hydroxysteroiden, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung - Google Patents
Reagenz zur bestimmung von hydroxysteroiden, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendungInfo
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Description
Dr. F. Zumsteln sen. - Dr. E. Assmann Dr. R. Koenlgsberger - Dlpl.-Phys. R. Holzbauer - Dr. F. Zumstein jun.
TELEX 529979
BANKKONTO: " BANKHAUS H. AUFHÄUSER
8 MÜNCHEN 2,
NYEGAAKD & CO., A/S} Oslo 4· / Norwegen
"Reagenz zur Bestimmung von Hydroxysteroiden, Verfahren zu
dessen Herstellung und dessen Verwendung"
Die Erfindung "betrifft ein neues Testreagenz zur Bestimmung
von Hydroxysteroiden, ein Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung.
Die Bestimmung von Hydroxysteroiden in z.B. Körperflüssigkeiten
und insbesondere in menschlichem Urin ist für die Untersuchung des Steroidstqffwechsels und insbesondere für die Untersuchung
der Nebennieren- und Gonaden-Funktionen sowie für Gallensäure*-
untersuchungen von Bedeutung. Die üblichen Bestimmungsverfahren sind relativ zeitraubend und erfordern zur Erzielung verlässlicher
Ergebnisse hochqualifiziertes Personal, was insbesondere bei nur gelegentlich durchgeführten Untersuchungen ein
Nachteil ist. Bisher bekannte oxydative Verfahren sind mit ' Fehlern behaftet und obwohl erfahrene Fachkräfte diese Fehler
im Laufe einer großen Folge von Untersuchungen eliminieren können, können nur gelegentlich durchgeführte Bestimmungen zu
divergierenden Ergebnissen führen.
Die Erfindung beruht auf der enzymatischen Oxydation spezifischer Hydroxysteroide unter Verwendung von Hydroxysterοidde-
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hydrogenasen in Anwesenheit reduzierbarer Coenzyme, die in der J
reduzierten Form ein wohldefiniertes Absorptionsmaximum besitzen. Dieses gestattet die Bestimmung des molaren Extinktionsko'effizienten,
was zu einer relativ genauen Bewertung der Menge des oxydierten Hydroxy steroids führt.
Es wurde nun gefunden, daß von den vielen möglichen, in der Literatur
beschriebenen Coenzymen Nikotinamid-adenin-dinucleotid und Thionikotinamid-adenin-dinucleotid (die bequemerweise im
folgenden als NAD bzw. TNAD bezeichnet werden) besonders geeignet sind. Beide Verbindungen zeigen jedoch selbst in trockenem
Zustand eine starke Unbeständigkeit und insbesondere zersetzt sich NAD unter Ausbildung eines Enzyminhibitors, der vor der
Verwendung, z.B. durch Chromatographie, entfernt werden muß. TNAD zersetzt sich unter Bildung von schwefelhaltigen Produkten.
Es wurde nun gefunden, daß diese Schwierigkeit in einfacher und bequemer Weise dadurch überwunden werden kann, daß man das Coenzym
zusammen mit dem Enzym gefriertrocknet. Während NAD in trockenem Zustand bei -4°C sich mit einer Geschwindigkeit von
etwa 1 % pro Monat unter Ausbildung des oben angegebenen Inhibitors zersetzt, so daß nach einer Lagerung von einigen wenigen
Monaten das Material nicht mehr ohne aufwendige Abtrennungsverfahren verwendet werden kann, kann eine gefriergetrocknete Mischung
aus Hydroxysteroid-dehydrogenase und NAD während mehrerer Jahre gelagert werden, ohne daß sich ein merklicher Verlust
der Enzymaktivität einstellt. Ein derartiger Verlust wäre auch zu erwarten, wenn nur ein kleiner Teil des NAD unter Ausbildung
eines Enzyminhibitors zersetzt würde. In ähnlicher Weise ist TNAD noch instabiler als NAD und dennoch wurden gefriergetrocknete
Mischungen von Dehydrogenäse und TNAD bei -40C während
mehr als einem Jahr ohne Aktivitätverlust gelagert.
Es wurde ferner gefunden, daß das Coenzym selbst in wässriger Lösung eine gewisse Stabilisierungswirkung auf das Enzym ausübt,
so daß die gefriergetrocknete Mischung die enzymatisch« Aktivität besser beibehält als das Enzym selbst. Das Enzym muß jedoch
weiter stabilisiert werden, um der .Gefriertrocknung widerstehen
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zu können und es wurde gefunden, daß Polyhydroxyverbindungen,
z.B. Glycerin, Dextrane und Zucker insbesondere Saccharose,für
diesen Zweck besonders wirksam sind. Die Anwesenheit eines derartigen
Stabilisierungsmittels unterstützt auch, die Stabilisierung des Enzymes während der Hydroxysteroid-Bestimmung.
Da die Enzyme empfindlich gegen Schwermetal!ionen sind, ist wünschenswerterweise
ein chelatbildendes Mittel, wie Äthylendiamintetraessigsäure
(EDTA)1 vorhanden und um sicherzustellen, dass die !Phiolgruppen des Enzyms in dem reduzierten Zustand vorliegen,
ist vorzugsweise ein Thiol, wie z.B. Mercaptoäthanol,
Cystein, Glutathion oder bevorzugter Dithiothreit (Cleland's
Reagenz) vorhanden.
Bevor die Enzym-Bestimmung durchgeführt werden kann, müssen die im Urin enthaltenen Steroide zunächst hydrolysiert werden, um
die oxydierbaren Hydroxylgruppen freizusetzen, worauf eine Extraktion zur Erzielung einer ausreichenden Konzentration und
einer Reinigung, die für eine genaue Bestimmung erforderlich ist, durchgeführt wird. Die vorhandenen Steroide besitzen unterschiedliche
Polaritätsgerade und es wurde gefunden, daß es zur Erzielung eines zufriedenstellenden hohen Extraktionsgrades
der relevanten Steroide erforderlich ist, polare Extraktions-
lösungsmittel als auch weniger polare Lösungsmittel einzusetzen. Unglücklicherweise werden verschiedene, in der Urinprobe ebenfalls
vorhandene gefärbte Bestandteile ebenfalls mit polaren Lösungsmitteln extrahiert und beeinträchtigen die für die Bestimmung
angewandte Absorptionsmessung. In ähnlicher Weise "sind bei der Bestimmung van Gallensäuren in Zwölffingerdarmsekreten
ebenfalls gefärbte Substanzen anfänglich vorhanden und schwierig vollständig abzutrennen.
Es wurde nun gefunden, daß TSUl als Coenzym EfAD deutlich überlegen
ist, da es ein Absorptionsmaximum besitzt, das von den
hauptsächlichen Absorptionsmaxima der in den Urinextrakten enthaltenen
polaren gefärbten Verbindungen, relativ weit entfernt
ist* Wenn man TNAB verwendet f ist es möglich, die Empfindlich—
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keit der Enzymbestimmung von Hydroxysteroiden in dem Maße derart zu steigern, daß das Verfahren eine genaue Alternative für "bisher
bekannte Verfahren darstellt, die besser ausgebildete und geübte Fachkräfte benötigen. TNAD besitzt in reduziertem Zustand
(THADH) ein Absorptionsmaximum bei etwa 400 mn, während die polaren
gefärbten Substanzen, die in dem Urin enthalten sind und die die Bestimmung beeinträchtigen können, Absorptionspeaks bei
3OO und 500 bis 600 nm und ein Minimum bei 400 nm besitzen. Dies
bedeutet, daß die Bestimmung in Anwesenheit der genannten gefärbten
Substanzen durchgeführt werden kann, und daß polare Lösungsmittel verwendet werden können, um die polareren Ilydroxysteroide
aus dem Urin zu extrahieren. NAD besitzt ein Absorptionsmaximum bei 340 nm, das mit einer starken Schulter des Absorptionsspektrums
der genannten gefärbten Substanzen zusammenfällt. TNAD besitzt ferner in der reduzierten Form eine besonders
hohe Absorption bei 400 nm (molarer Extinktionskoeffizient von 12 χ 10 , verglichen mit 6 χ 10 für NAD) und es kann ein
linearer Wert mit hoher Empfindlichkeit erzielt werden. Da dieses Maximum im sichtbaren Bex'eich liegt, können übliche Kolorimeter
statt der erheblich teureren Spektrophotometer verwendet
werden. Weiterhin wurde gefunden, daß TNAD ein sehr günstiges Gleichgewicht bei der Oxydation ergibt, während NAD normalerweise
die Anwesenheit eines ketonbindenden Mittels, wie Hydrazin
(z.B. 0,1 Mol Hydrazinhydrat), benötigt, um die Oxydation
vollständig ablaufen zu lassen.
Das erfindungsgemäße gefriergetrocknete Enzym/Coenzym-Eeagenz ergibt bei der Bestimmung von 3oc-Hydroxysteroiden unter Verwendung
geeigneter Dehydrogenasen ausgezeichnete Ergebnisse. Andere Hydroxysteroide, die ebenfalls bestimmt werden können,
schließen JB-Ejdroxj-, 17ß-Hydroxy- und 20ß-Hydroxy-Steroide
ein, wobei man die Dehydrogenasen verwendet, die diese Steroide oxydieren können.
Die Konzentrationen der verschiedenen Bestandteile der bei der Gefriertrocknung eingesetzten Lösung sind geeigneterweise diejenigen,
die vorzugsweise in der letztendlich wiedergebildeten
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Reagenzlösung vorzugsweise vorliegen sollen.
Das Enzym/Coenzym-Verhältnis liegt vorzugsweise derart, daß die
Steroide in nicht mehr als etwa einer Stunde "bei etwa 25°C
vollständig oxydiert werden. Die geeignete Anzahl an Enzymeinheiten kann aus der Literatur entnommen oder durch zuvor durchgeführte
Untersuchungen bestimmt werden. Die Konzentration des
Coenzyms in dem gelösten Reagenz beträgt geeigneterweise 0,05. "bis 0,15 uMol/ml, vorzugsweise etwa 0,10 uMol/ml. Im Fall von
TNAD ergibt dies eine maximale- optische Dichte bei 400 nm von etwa 1,2 und entspricht einer Konzentration von 200 mg Steroid/Liter,
wenn ein Zehntel des Extraktes einer Urinprobe oxydiert wird.
Vorzugsweise ist in dem gefriergetrockneten Reagenz ein Puffer vorhanden. Obwohl der pH-Wert nicht kritisch ist und sich von
6 bis 10 erstrecken kann, ist ein pH-Wert von 9 bis 10, vorzugsweise
ein pH-Wert von 9»5> bevorzugt. Die Enzympräparation ist
normalerweise neutral, um die Stabilität sicherzustellen und sie kann einen geeigneten Puffer zur Erreichung eines derartigen
pH-Wertes enthalten. Es muß somit ausreichend Puffer zugesetzt werden, um den pH-Wert in der gelösten Form auf den angestrebten
alkalischen Bereich zu bringen. Dies kann geeigneterweise dadurch erreicht werden, daß man einen Tris-(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol)/Chlorwasserstoffsäure-Puffer
verwendet, obwohl Dian mit Glycin/Natriumhydroxyd- und Pyrophosphat-Puffer
vergleichbare Ergebnisse erreicht hat. Die Molarität des Puffers in der letztendlich erhaltenen Testreagenzlösung ist
vorzugsweise 0,1 bis 0,4 molar.
Das ThLoL, z.B. Dithiothreit, liegt vorzugsweise in der Test-
—'zi
reagernvLößung in einer Konzentration, die 2 bis 7 "*■ 10 ' molar
ist, vor, während das Chelatisierungsmittel in einer Konzentrati
cm von 0,r; bis 1,5 x 10""-^ riolar vorliegt. Die Konzentration
den ί\/Γ;,1; .,li'ox;7stabLl LBierungsmittels in der letztendlich tutv/endett;ii
"Τωsfcreagenzlööung ist vui-augsweise 0,4 bis 1,0 molar.
2 Ü 9 8 8 2 / 11 7 9 BAD
Die Enzympräparation ist vorzugsweise relativ roh, da die gereinigten
Dehydrogenasen weniger stabil als die ungereinigten sind, obwohl diese Materialien frei von anderen Enzymen sein
sollten, die die Untersuchung stören wurden.
So enthält z.B. die nach dem Verfahren von Talalay (P.I. Marcus
und P. Talalay, J.B.C. 218, 661 (1956), P. Talalay und P.I.
Mauris, 21j3, 675 (1956)) aus P. testosteron! (ATCC 11996) oder
Mutanten davon isolierte 3a-Hydroxysteroid-dehydrogenase eine geringe Menge Oestradiol-17ß-dehydrogenase, wobei dies Jedoch
keine deutliche Beeinträchtigung darstellt, da die relevanten östrogene nicht in merklichen Mengen im Urin vorhanden sind.
Die Präparation ist Jedoch frei von einer 3ß- und 20ß-Dehydrogenase-Aktivität
und von Alkoholdehydrogenase. Die Enzymmischung enthält 3a-Hydroxysteroid-dehydrogenasen, die die 3a-Hydroxysteroide
der C^q-,Cp.- und Cp^-Reihen oxydieren können
und die die hauptsächlichen 3ct-Hydroxysteroide in biologischen
Fluiden darstellen.
3ß- und i7ß-Hydroxysteroid-dehydrogenasen können gemäß dem Verfahren
von Talalay (loc cit.) hergestellt werden.
20ß-Hydroxysteroid-dehydrogenaße kann aus gewachsenen S. hydrogeiians
isoliert und nach dem Verfahren von Hübner (H.J. Hübner und F.D. Sahrholz, Biochem Z. _£3, 95, (i960) ) extrahiert werden.
östradiol- -|7'ß-dehydrogenase kann nach dem Verfahren von Jarabak
eb aL (J. Jarabak, E. Seeds und P. Talalay, Biochemistry j?,
month 4, 1260 (1966) ) aus menschlicher Placenta erhalten werden.
"ui1 Herstellung des gefriergetrockneten Testreagenz werden die
■vt .τ-.'.hie· U'ii'.:n Bestand teilt; in wässriger Lösung in im wesentlich
-ι Um >btn ari^og ebenen, für die bei der Bestimmung verwendet
-ν i.-'r-lloi.-uii] bevorzugten Konzentrationen vermischt. Im Fall
.-i.i.ι ·,<.-dj-\v:i' 7steroid -dehydro^-nase soltte die endgültig eingel·
te 'f-..-nt.rnat:^:n3lövSung ?00 bis 1000 mU Enzym/ml enthalten.
.!0*108*2/1 179
BAD
1 mU einer 3oc-Hydroxysteroid-dehydrogenase ist diejenige Enzymmenge,
die bei einem pH-Wert von 9?5 "imcL "bei 25°C in einer Menge
1 mu-Mol Tetrahydrocortisol oxydiert. Das tatsächlich eingesetzte
Gewicht der zügesetzten.Enzympräparation hängt natürlich
von der spezifischen Aktivität des Materials ab.
Im Fall der 20ß-Hydroxysteroid-dehydrogenase sollte die letztendlich eingesetzte Testreagenzlösung 500 bis 1000. mU Enzym/ml
enthalten. 1 mU 20ß-Hydroxysteroid-dehydrogenase ist diejenige
Enzymmenge, die in einer Minute bei einem pH-Wert von 9»5 und
bei 25°C ein πιμ-ΜοΓ 5ß-Pregnan-3cx,20ß-diol oxyidert.
Im allgemeinen sind, wenn die erfindungsgemäßen gefriergetrockneten
Zusammensetzungen 3a-Hydroxysteroid- oder 20ß-Hydroxysteroid-dehydrogenäse
enthalten, jeweils pro 1000 mU Dehydrogenase 0,05 bis 0,30 χ 10 Mol Nikotinamid-adenin-dinucleotid
oder Thionikotinamid-adenin-dinucleotid und vorteilhafterweise
0,2 bis 1,4- χ 10"-3 Mol Thiol, geeigneterweise zusammen mit
0,5 bis 3,0 χ 10" Mol eines chelatbildenden Mittels und/oüar
0,4- bis 2,0 χ 10""·^ Mol der Polyhydroxyverbindung vorhanden.
Die Lösung wird vorzugsweise in Flaschen gefriergetrocknet, die
für eine genaue Anzahl von Aliquoten des Reagenz geeignet sind, wenn das gefriergetrocknete Material in destilliertem Wasser gelöst
wird und die z.B. 9 ml (die für zwei Bestimmungen und eine Vergleichsbestimmung von jeweils 2,9 ml geeignet sind) oder 33
ml (die für zehn Bestimmungen und eine Vergleichsbestimmung von jeweils 2,9 ml geeignet sind) fassen. Bei der bevorzugten Durchführung
der Bestimmung werden 0,1 ml der Urinextraktlösung zu
2,9 ml der Testreagenzlösung zugesetzt.
Um eine Zersetzung des Goenzyms zu vermeiden, bestehen die Flaschen
vorzugsweise aus lichtundurchlässigem Material, z.B. dunkelgefärbtem Glas und werden in evakuiertem Zustand belassen
oder nach der Gefriertrocknung mit Stickstoff gefüllt. Es wurde gefunden, daß die Enzympräparation in dieser Weise 3 Monate bei
37°C, 1 Jahr bei 25°C und mehrere Jahre bei 4°C oder -200C gelagert
werden kann. 209882/1179
In der bevorzugtesten Form der Bestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Keagenz wird eine abgemessene Urinprobe zur
Bewirkung der Hydrolyse auf einem Wasserbad mit Chlorwasserstoffsäure erhitzt. Vorteilhafterweise ist Formaldehyd vorhanden,
da dieses Material die Bildung von gefärbten Produkten während der Hydrolyse inhibiert.
Nach dem Abkühlen wird Urin mit einem nicht polaren Lösungsmittel,
vorzugsweise Diäthyläther, extrahiert, worauf man den Extrakt in ein anderes Gefäß überführt. Der Urin wird dann mit einem polareren
Lösungsmittel, vorzugsweise Äthylacetat, extrahiert und -dieser
Extrakt wird mit dem zuvor gewonnenen Extrakt vermischt. Die zwei Lösungsmittel sollten natürlich mischbar sein.
Die Extrakte werden dann vorzugsweise bei schwach erhöhter Temperatur,
z.B. bei 40 bis 5O°C in einem Gasstrom, z.B. einem Strom von Stickstoff oder Luft, zur Trockne eingedampft, worauf
man den Rückstand in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, das mit der Enzymreagenzlösung verträglich ist, vorzugsweise einem
Alkanol, wie Methanol, löst. In dieser Weise erfolgt eine gewisse Konzentration und der Steroidgehalt von 5 ml Urin kann
in dieser Weise in einem ml Methanol gelöst werden. Üblicherweise verwendet man aus Bequemlichkeitsgründen ein 1/10-Aliquot
der Urinextraktlösung, d.h. 0,1 ml, wenn die Steroide in
1 ml Äthanol gelöst sind. Es sei festgehalten, daß es beim Lösen des Extraktrückstandes in Methanol wesentlich ist, daß die
Flüssigkeit die Wandungen des Gefässes vollständig berührt. Es ergeben sich Jedoch unvermeidbar gewisse Steroidverluste,
selbst wenn jeder Schritt sorgfältig durchgeführt wird. Diese Verluste unterscheiden sich mit den zu bestimmenden Steroiden,
sind Jedoch relativ gleichmässig und können in der Praxis herausgemittelt werden. Die Steroidruckgewinnungen liegen im
Bereich von 70 bis 100 %, was weitaus höher ist als in dem Fall,
da man kein polares Lösungsmittel bei der Extraktion verwendet. Im allgemeinen erstreckt sich die Extraktion von C.q-Steroiden
zwischen 90 bis 100 %, während die Cp.-Steroid-Extraktion im
allgemeinen geringer ist und z.B. 70 % für Tetrahydrocortison
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und 85 % fur Tetrahydrocortisoi "beträgt.
Die Bestimmung der Steroide in dem Urinextrakt wird vorzugsweise durchgeführt, indem man die abgemessene Mischung des Extraktes
und der Te,streagenzlösungen, vorzugsweise 0,1 ml Extraktlösung
in 2,9 ml Reagenz 60 Minuten bei 25°C inkubiert. Das Ke agenz
besitzt vorzugsweise einen pH-Wert von etwa 9>5· Zusätzlich
zu der eigentlichen Testlösung inkubiert man geeigneterweise gleichzeitig eine Vergleichsprobe, die die Testreagenzlösung
zusammen mit einer gleichen Menge des bei der Extraktion verwendeten Lösungsmittels enthält. Weiterhin sollten Färbungs-Blindproben
ebenfalls inkubiert werden, bei denen das Enzymreagenz, das in den beiden oben angegebenen Lösungen verwendet wurde,
durch Wasser ersetzt ist.
So können z.B. die im folgenden angegebenen Lösungen 60 Minuten
bei 25°C inkubiert werden.
I. 2,9 ml Enzymlösung + 0,1 ml Extrakt (Probe)
II. 2,9 ml Enzymlösung + 0,1 ml Methanol
Die Ablesungen erfolgen bei 400 nm (E.)
111.2,9 ml destilliertes Wasser + 0,1 ml Extrakt (Probe)
IV. 2,9 ml destilliertes Wasser + 0,1 ml Methanol
Die Ablesungen erfolgen bei 400 nm (E-)
Normalerweise verändert sich der Wert von E2 während der Inkubationsdauer
nicht.
Das Gewicht an abgeschiedenem Steroid in. μΜοΙ/24 Stunden beträgt
0,5 D.ÄE, wobei D die Harnausscheidung (ml/24 Stunden) und ΔΕ =
E.-Ep bedeuten.
Zur Berechnung des Gewichtes an gesamtextrahierten Steroiden
wird das mittlere Molekulargewicht mit etwa 333 angenommen, da die Molekulargewichte der Urinsteroide sich von 290 bis 365 erstrecken.
DLe angegebene Formel lautet dann wie folgt:
mg abgeschiedenes Steroid/24 Sblinden = 167 Ώ.ΔΕ
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter läutern, ohne sie jedoch zu beschränken.
Ja-Hydroxysteroid-dehydrogenase, erhalten gemäß dem Verfahren
von Tallalay (J1BC. 21J3, 661 (1961) ) in 4370 ml 0,03m Phosphatpuffer
wurde mit 700 g Saccharose vermischt (Endkonzentration 0,425m). Die Gesamtenzymmenge betrug 12 χ 10"" mU. Dann wurden
1,1 g TNAD in 437 ml destilliertem Wasser bei +40C gelöst und
in die Enzymlösung gegossen, worauf 3933 ml Tris-(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol)/Chlorwasserstoffsäure-Puffer
(0,4m pH-Wert = 9,5? der 2,5 mg Dithiothreit pro ml enthielt) zugegeben
wurden. Dann wurden 5,32gEDTA zugesetzt und die Lösung
wurde gerührt, bis sich das EDTA vollständig gelöst hatte.
Sofort anschließend wurde die gesamte Lösung (8740 ml) in 437 20 ml-Portionen unter Verwendung von 50 ml Flaschen aufgeteilt
und gefroren. Anschließend wurde das Material durch Gefriertrocknung getrocknet.
Zu mehreren 5 ml Urin-Proben wurden Methanollösungen von Androsteron,
Etiocholanon, Tetrahydrocortison und Tetrahydrocortisol zugesetzt, um zusätzlich 100 μg Steroid pro Probe zu ergeben.
Die Proben wurden dann wie folgt extrahiert:
5 ml Urinproben wurden in 30 ml mit Glasstopfen versehene Kolben
eingebracht und es wurden 2 μΐ 35 %-igen Formaldehyde und 0,15
ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure zugesetzt. Der Formaldehyd
vermindert die Bildung gefärbter Produkte während der Hydrolyse.
Die Kolben wurden während 30 Minuten in ein siedendes Wasserbad
eingebracht und dann unter Leitungswasser gekühlt.
Die Extraktionen erfolgen wie folgt:
i) Es wurden 10 ml Äther zugesebzt und die KoLben 10 Minuten ge-
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schüttelt« Der Äther wurde dann in ein anderes Gefäß abgesaugt.
2) 10 ml Äthylacetat wurden zugesetzt und die Kolben ΊΟ Minuten
geschüttelt* Bas Äthylacetat wurde in das gleiche, bereits für
den Ither verwendete Gefäß abgesaugt, so daß man eine Mischung
der Extrakte erhielt*
Der Extrakt wurde dann bei 45°C in einem Gasstrom, z.B. einem
Stickstoffstrom, zur !Prockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 1 ml Methanol gelöst, wobei man den Alkohol über die Glaswandungen
laufen ließ, um das dort vorhandene Steroidmaterial zu lösen. Es wurden 0,1 ml-Aliquote des Methanolextraktes für
die Bestimmung verwendet.
Die oben angegebenen Lösungen I bis IV wurden dann 60 Minuten bei 25°C inkubiert. Hierbei wurden die folgenden Ergebnisse erzielt:
1) Hur Urinlösungsmittel
E1 = 0,120 E2 »Ό,Ο37 ΛΈ = 0,085
2) Urin mit 100 μβ Androsteron
EJ1.= 0,0246 E2 = 0,030 ΔΕ1= 0,216
Die-Differenz aE1 - ΔΕ =0,133 entspricht 96,42 yig Androsteron
und somit einer Gewinnung (Extraktion) von 96,5 %· ■
3) Urin zusammen mit lediglich dem Lösungsmittel
E1 * 0,100 E2 = 0,025 ΔΕ = 0,075
4) Urin mit 100 μg Etiocholanolon
E^ = 0,220 E2 = 0,022 ΔΕ1= 0,198
Die Differenz s-E* -ΔΈ = 0,123 entspricht 89,2 μg Etiocholanolon
und somit einer Gewinnung von 89,2 %.
5) Urin lediglich mit Lösungsmittel
E1 = 0,125 E2 = 0,025 ΔΕ = 0,100
6) Urin mit.100 μg TetrahydroCortisol
EJ1 = 0,218 E2 = 0,020 ΔΕ1= 0,198
Die Differenz SE* - ΔΕ = 0,098 und entspricht 92,6 ug Tetrahydrocortisol
und somit einer Rückgewinnung von 92,6 %.
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7) Urin zusammen mit Lösungsmittel
E1 β 0,130 E2 = 0,025 ΔΕ = 0,105
8) Urin mit 100 μg Tetrahydrocortison
EJ1 » 0,204 . Έχ 2 = 0,01V ΔΕ1= 0,187
Die Differenz äE1 - ΛΈ = 0,082 entspricht 77,49 ug Tetrahydrocortison
und somit einer Rückgewinnung von 77»5 %·
!Bedeutsam sind die sehr geringen Blindwerte (die üblicherweise
zwischen 0,015 "und 0,035) liegen. Diese Werte sind auch durch die Verwendung anderer Coenzyme erzielbar, wenn die Extraktionen
lediglich mit Äther erfolgen, wobei dieses jedoch zu erheblich geringeren Rückgewinnungswerten führt. Bei Verwendung von
Tetrahydrocortisol und Tetrahydrocortison (die relativ polare
Steroide darstellen) liegen die Rückgewinnungen in der Größenordnung von 40 bis 50 % oder darunter. Wenn Ithylacetat bei den
Extraktionen verwendet wird, werden bessere Extraktionswerte erzielt, jedoch nehmen die Blindwerte aufgrund der gefärbten Verunreinigungen,
die bei der verwendeten Wellenlänge absorbieren, deutlich zu, so daß die Empfindlichkeit des Systems erheblich
vermindert wird.
Ein gefriergetrocknetes Testreagenz wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben,
wobei man jedoch statt 1,10 g TNAD 1,06 g NAD verwendete
20ß-Hydroxysteroid-dehydrogenase (erhalten gemäß dem Verfahren von Hübner (Biochem 2, j?2, 95» (1960) ) in 0,03m Konzentration
in 4370 ml Phosphatpuffer wurde mit 700 g Saccharose (Endkonzentration
0,425 m) vermischt. Die Gesamtenzymmenge betrug
12 X.106 mU. Dann wurden 1,1 g TNAD in 437 ml destilliertem Wasser
bei +40C gelöst und in die Enzymlösung gegossen, worauf
3933 ml Tris-(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol)/Chlorwasserstoffsäure-Puffer
(0,4m und pH-Wert =* 9,5, der 2,5 mg Dithiothreit pro ml enthielt) zugesetzt. Anschließend wurden 5»32 g
EDTA zugesetzt und die Lösung gerührt, bis sich das EDTA voll-
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ständig gelöst hatte.
Sofort anschließend wurde die Gesamtlösung (874-0 ml) in 4-37
20 mi-Portionen unter Verwendung von 50 ml-Fläschönen aufgeteilt
und gefroren. Anschließend wurde das Material durch Gefriertrocknung getrocknet.
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Claims (20)
1. Enzymreagenz zur Bestimmung von Hydroxysteroiden,
dadurch gekennzeichnet, daß es eine gefriergetrocknete Mischung einer Hydroxysteroid-dehydrogenase und als Coenzym Nikotinamidadenin-dinucleotid
und/oder Thionikotinamid-adenin-dinucleotid enthält.
2. Reagenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als zusätzlichen Gefriertrocknungsstabilisator eine PoIyhydroxyverbindung
enthält.
3· Reagenz gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyhdroxyverbindung Glycerin, ein Dextran oder ein
Zucker ist.
4. Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß es ein chelatbildendes Mittel und/oder ein
Thiol enthält.
5. Reagenz gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß das Thiol Mercaptoäthanol, Cystein, Glutathion oder Dithiothreit
ist.
6. Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5i dadurch
gekennzeichnet, daß die Dehydrogenase eine 3a-Hydroxysteroiddehydrogenase
ist. . . ..
7. Reagenz gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym aus P. testosteron! (ATCC 11996) oder einer Mutante
davon erhalten wurde.
8. Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch
gekennzeichnet, daß die Dehydrogenase eine 3ß-i 1?ß- oder 20ß-Hydroxysteroid-dehydrogenase
ist.
9. Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch
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gekennzeichnet, daß es einen Puffer enthält.
10. Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 "bis 9^ dadurch
gekennzeichnet, daß das Dehydrogenase/Coenzym-Verhältnis derartig gelegen ist, daß das Hydroxysteroid-Material in nicht mehr
als einer Stunde bei etwa 2ß°C vollständig oxydiert wird.
11. Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 "bis 10, dadurch
gekennzeichnet, daß pro 1000 mU 3a-Hydroxysteroid-dehyd'rogenäse
0,05 "bis 0,30 χ 10"" Mol Nikotinamid-adenin-dinucleotid oder
Thionikotinamid-adenin-dinucleotid vorhanden sind.
12. Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und 11, dadurch
gekennzeichnet, daß pro 1000 mU 3oc-Hydroxysteroid-dehydrogenase
0,2 bis 1,4 χ 10""^ Mol Thiol vorhanden sind.
13· Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 sowie 11
und 12, dadurch gekennzeichnet, daß pro 1000 mU 3a-Hydroxysteroid-dehydrogenase
0,5 bis 3>0 χ 10" Mol des ehelatbiIdenden
Mittels und/oder 0,4 bis 2,0 χ 10" ^ Mol Polyhdroxyverbindung
vorhanden sind.
14·. Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch
gekennzeichnet, daß das Enzym eine 20ß-Hydroxysteroid-dehydrogenäse
ist und pro 1000 mU Dehydrogenase 0,05 bis 0,30 χ 10 Mol
Niktonamid-adenin-dinucleotid oder Thionikotinamid-adenin-dinucleotid
vorhanden sind.
15· Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und 14, dadurch
gekennzeichnet, daß das Enzym eine 20ß-Hydroxysteroid-dehydrogenase
ist und pro 1000 mU Dehydrogenase 0,2 bis 1,4 χ Λ0
Mol Thiol und/oder 0,5 bis 3,0 χ 1O~6 Mol chelatbildendes Mittel
und/oder 0,4 bis 2,0 χ 10"^ Mol Polyhdroxyverbindung vorhanden
sind.
16. Verfahren zur Herstellung des Reagenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxysteroid-dehydrogenase
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und des Coenzym in sterilem Wasser gelöst und gefriergetrocknet
werden.
17· Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,
daß das Reagenz in Fläschchen gefriergetrocknet wird, die ein Fassungsvermögen aufweisen, das zur Herstellung eines gelösten
Reagenz geeigneter Konzentration geeignet ist.
18. Verwendung der Enzymreagentien gemäß einem der Ansprüche
1 bis 15 zur Bestimmung von Hydroxysteroiden in hydroxysteroidhaltigen
Untersuchungslösungen durch Inkubieren und Bestimmen des molaren Extinktionskoeffizienten bei 400 mn.
19· Verwendung gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet,
daß die Testlösung aus Urin erhalten wird.
20. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 und 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmungslösung 500 bis 1000 mU
Enzym pro ml enthält.
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