DE2200376A1

DE2200376A1 - Vaccine against Streptococcus equi. and methods of making them

Info

Publication number: DE2200376A1
Application number: DE19722200376
Authority: DE
Inventors: Usdin Myron Gladstone
Original assignee: Richardson Merrell Inc
Current assignee: Richardson Vicks Inc
Priority date: 1971-01-20
Filing date: 1972-01-05
Publication date: 1972-08-10
Also published as: GB1303560A; US3793150A; FR2122560A1; NL7200311A; ZA717688B; CA958641A; FR2122560B1; BE777369A; CH564604A5

Description

RECHTSANWÄLTE O O Π Π Q "7 ßLAWYERS O O Π Π Q "7 ß

DR. JüR. D!X-CHEM. WALTER BEIl Z Z U U O /DR. JüR. D! X-CHEM. WALTER BEIl Z Z U U O /

MrRZO no:.".--ui!E;t f 4. Jan. MrRZO no:. ".-- ui! E; tf Jan. 4

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. FRANKFUKTAMMAiN-HOCHSI. FRANKFUKTAMMAiN-HOCHSI

ADEIONSKASS&58ADEIONSKASS & 58

Unsere Nr. 17 511Our no. 17 511

Richardson Merrell, Inc. New York, N.Y. 10017, V.St.A.Richardson Merrell, Inc. New York, N.Y. 10017, V.St.A.

Vaccine gegen Streptococcus equi. und Verfahren zu deren Herstellung Vaccine against Streptococcus equi. and methods of making them

Die Erfindung betrifft einen Impfstoff zur Immunisierun; von Pferden gegen Pferdestappe und ein Verfahren zur Herstellung des Impfstoffs.The invention relates to a vaccine for immunization; of horses versus horse stomp and a method of making the vaccine.

Pferdestaupe ist eine hochansteckende Pferdekrankheit, die durch Streptococcus equi hervorgerufen wird. Obwohl die Sterblichkeitsrate klein ist_s d.h. in der Größenordnung von 2 % liegt, ist die Krankheit unangenehm und kräfteverzehrendä und befällt große Gruppen von Pferden, wenn sie wie z.B. auf Rennbahnen, Pferdeausstellungen, Versteigerungen (sales lots) und dergleichen zusammengebracht sind. Die klinischen Zeichen der Krankheit sind ein Temperaturanstieg auf 40 - 4I⁰C₉ beschleunigte Atmung, Depression, Anorexie, Entzündung der Nasenschleimhaut, katarrhalische Absonderungen, Schwellung der Lymphknoten, Entwicklung von Abszessen und andere Symptome. Der die KrankheitHorse distemper is a highly contagious equine disease caused by Streptococcus equi. Although the mortality rate is small _sec ie in the order of 2%, the disease is unpleasant and kräfteverzehrendä and affects large groups of horses, when they are such as are brought together at race tracks, horse exhibitions, auctions (sales lots) and the like. The clinical signs of the disease are an increase in temperature to 40-4I ⁰ C _9, accelerated breathing, depression, anorexia, inflammation of the nasal mucosa, catarrhal secretions, swelling of the lymph nodes, development of abscesses and other symptoms. The disease

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■ ORIGINAL INSPECTED■ ORIGINAL INSPECTED

verursachende Organismus S. equi ist sehr resistent und kann in Ställen und anderen Plätzen, wo Pferde gehalten werden, viele Monate überleben. Junge Pferde sind empfänglicher für die Infektion, da die älteren Tiere wohl schon mit der Krankheit in Berührung gekommen sind und eine Immunität entwickelt haben, die anscheinend sehr lange anhält und höchst wirksam ist.causative organism S. equi is very resistant and can be found in stables and other places where horses are kept will survive many months. Young horses are more susceptible to infection than the older ones Animals have probably come into contact with the disease and have developed an immunity that apparently lasts a very long time and is highly effective.

Wenn ein virulenter S. equi-Stamm in einer Gruppe von nicht immunen Pferden auftritt, ist es sehr schxdleri.p;, die Ausbreitung zu verhindern. Gegen S. equi wirksame Bakterien-Impfstoffe (bacterins) sind im Handel erhältlich und besitzen zufriedenstellende Immunisierungseigenschaften. Jedoch enthalten die handelsüblichen Bakterien-Impfstoffe, die Suspensionen der abgetöteten S. equi-Mikroorganismen sind, körperfremdes Eiweiß und Kohlehydratfraktionen, cellulare und extracellulare, die für viele Nebenreaktionen wie Purpura, Schwellung an der Injektionsstelle, Gelenkversteifung, zeitweilige Drüsenschwellung mit Absonderungen aus dor Nase, verantwortlich sind. Diese Reaktionen verursachen häufig Appetitlosigkeit, Schwäche, Konditionsverlust und subklinische Symptome der Krankheit.When a virulent S. equi strain in a group of does not occur in immune horses, it is very schxdleri.p ;, prevent the spread. Bacterins effective against S. equi are commercially available and have satisfactory immunization properties. However, the commercially available Bacteria vaccines, the suspensions of the killed S. equi microorganisms are exogenous protein and carbohydrate fractions, cellular and extracellular, which are responsible for many side reactions such as purpura, swelling at the injection site, joint stiffening, temporary swelling of the glands with secretions from the nose. These cause reactions often loss of appetite, weakness, loss of stamina, and subclinical symptoms of the disease.

S. equi gehört zu den Streptokokken der Gruppe C, deren Stämme ein gemeinsames gruppenspezifisches Polysnccharidantigen besitzen. Lactose, Sorbit oder Trehalose werden von S. equi-Stämmen nicht fermentiert. Kolonien sind im allgemeinen schleimig und glatt und besitzen nicht das matte Aussehen anderer Streptokokken, von denen man weiß, daß sie ein eiweißartiges M-Antigen bilden.S. equi belongs to the group C streptococci, whose Strains have a common group-specific polysnccharide antigen. Lactose, sorbitol or trehalose can be used not fermented by S. equi strains. Colonies are generally slimy and smooth and do not have that Other streptococci, which are known to produce a protein-like M antigen, appear dull.

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Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein hochwirksames Antigen, das bei Injektion bei Pferden zur Bildung von schützenden Antikörpern gegen S. equi führt, aus S. equi-Kulturen extrahiert werden. Das Antigen, auf dem der neue erfindungsgeniäße Impfstoff beruht, befindet sich auf den Zelloberflächen der Bakterien und ".■commc nur gleichzeitig mit dem gruppenspezifischen Polysaccharid-Antigen vor. Es hat einen eiweißartigen Charakter, und wird von Proteinasen zerstört, die sich ebenfalls bei der Züchtung von S. equi entwickeln; dementsprechend werden bei der Züchtung von S. equi-Bakterien und bei dem Extraktioneverfahren Mittel zur Verminderung der Zerstörung des Protein-Antigens eingesetzt.According to the present invention, a highly effective Antigen which, when injected into horses, leads to the formation of protective antibodies against S. equi S. equi cultures are extracted. The antigen, on based on which the new vaccine according to the invention is located on the cell surfaces of the bacteria and ". ■ commc only simultaneously with the group-specific Polysaccharide antigen. It has a protein-like appearance Character, and is destroyed by proteinases, which are also developed when S. equi is grown; accordingly, in the cultivation of S. equi bacteria and in the extraction process, means become used to reduce the destruction of the protein antigen.

Die Bildung von Proteinasen durch die Streptokokken wird durch Reduktionsbedingungen im Nihrmedium begünstigtj daher sollte die Züchtung von S. equi unter aeroben Bedingungen durchgeführt w©rd©n„ Bei der Produktion in kleinem Maßstab können Schütte!kolben verwendet werden, während bei der Herstellung von größeren Mengen der Kultur,beispielsweise in Tanks, die Nährmedien belüftet werden können. Bei der Bildung von Prοteinase spielt die Art des im Nährmedium verwendeten Peptons eine Rolle. Beispielsweise Pfanstiehlpepton und Protecser peptone begünstigen die Bildung von Proteinasen und sollten vermieden werden. Neopepton bildet eine minimale Konzentration an Proteinase. Hefeextrakte begünstigen ebenfalls das Wachstum von S. equi, ohne die Bildung von Proteinasen zu fördern. Auch die Regulierung der Temperatur und der Wasserstoffkonzentration des Nährmediuma verhindern die Bildung von Proteinase.The formation of proteinases by the streptococci is favored by reducing conditions in the nutrient medium therefore the cultivation of S. equi should be carried out under aerobic conditions small-scale flasks can be used, while in the production of larger quantities of the culture, for example in tanks, the culture media is aerated can be. It plays a role in the formation of proteinase the type of peptone used in the nutrient medium Role. For example Pfanstiehlpepton and Protecser peptones promote the formation of proteinases and should be avoided. Neopepton forms a minimal Concentration of proteinase. Yeast extracts also favor the growth of S. equi without the Promote the formation of proteinases. Also regulating the temperature and the hydrogen concentration of the Nutrient media prevent the formation of proteinase.

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Bestimmte chemische Mittel wie Formaldehyd, Jodessigsäure und ß-Propiolacton zerstören die Proteinasen und töten gleichzeitig die wachsende Kultur ab; sie können verwendet werden, um die Entwicklung der Proteinase zu hemmen, die sonst das Antigen zerstören würde, wenn beide miteinander in Berührung blieben. Auch durch Erhitzen des Nährmediums für einige Minuten werden Bakterien und Proteinase ohne schädliche Wirkung auf das Antigen zerstört. Da die Proteinase in der gesamten Nährflüssigkeit zu finden ist, ist es wünschenswert, die Flüssigkeit von den bakteriellen Zellen abzutrennen, sobald eine optimale Bildung von Antigen in den Zellen stattgefunden hat. Dies kann durch Zentrifugieren geschehen. Wenn eine Säureextraktion des Antigens aus der frisch gezüchteten S. equi-Zelle unmittelbar nachdem die Kultur ihre maximale Antigenität entwickelt hat, durchgeführt werden kann, besteht keine Notwendigkeit, die wachsenden Zellen abzutöten und die Proteinasen oder deren Präcursoren in den Medien zu zerstören, bevor die Extraktion vorgenommen wird.Certain chemical agents such as formaldehyde, iodoacetic acid and ß-propiolactone destroy the proteinases and at the same time kill the growing culture; they can be used to aid the development of proteinase to inhibit that would otherwise destroy the antigen if both remained in contact with each other. Also through Heating the nutrient medium for a few minutes will cause bacteria and proteinase to have no harmful effect destroys the antigen. Since the proteinase can be found in the entire nutrient fluid, it is desirable that the Separate fluid from the bacterial cells once optimal antigen formation in the cells has taken place. This can be done by centrifugation. When acid extraction of the antigen from the freshly grown S. equi cells immediately after the culture has developed its maximum antigenicity, There is no need to kill the growing cells and the proteinases or destroy their precursors in the media before the extraction is performed.

Das Antigen kann durch eine Reihe von Verfahren aus dem cellularen Material extrahiert werden; vorzugsweise wird es durch Erhitzen mit Salzsäure für 10 Minuten bei einem pH-Wert von 2,0 extrahiert, wie in dem nachstehenden Beispiel gezeigt wird. Es können selbstverständlich auch andere Säuren, die die Protein-Antigene nicht denaturieren, verwendet werden. Die Wasserstoffionenkonzentration kann etwa einem pH-Wert von 1,5 bis 6,0 entsprechen, wobei die Extraktionsseit bei den höheren pH-Werten länger ist. Das Antigen kann auch auf andere Weise extrahiert werden. Die bakteriellen Zellen können beispielsweise in einer Kugelmühle gemahlen und mit Pufferlösungen mitThe antigen can be extracted from the cellular material by a number of methods; preferably will it is extracted by heating with hydrochloric acid for 10 minutes at pH 2.0, as in the one below Example is shown. Of course, other acids that do not denature the protein antigens can also be used. be used. The hydrogen ion concentration can correspond approximately to a pH value of 1.5 to 6.0, the extraction side being longer at the higher pH values is. The antigen can also be extracted in other ways. The bacterial cells can for example ground in a ball mill and mixed with buffer solutions

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einem pH-Wert von 6 bis 11 bei 37°C extrahiert werden. UltraschalIschwingungen fördern die Freisetzung des Antigens aus der Zelloberfläche der Bakterien, mit denen es assoziiert ist. Zur Erzielung zufriedenstellender Antigenherstellungen kann von der enzymatischen Wirkung des Phagen-assoziierten Lysins Gebrauch gemacht werden.a pH of 6 to 11 at 37 ° C. Ultrasonic vibrations promote the release of the antigen from the cell surface of the bacteria with which it is associated. To achieve more satisfactory Antigen production can make use of the enzymatic action of phage-associated lysine be made.

Obwohl das Antigen als Vaccine verwendet werden kann, wenn es durch Säureextraktion gewonnen und neutralisiert wird, und zur Entfernung von suspendierten Teilchen zentrifugiert wird, kann es gegebenenfalls weiter gereinigt werden, z.B. durch chromatographische Adsorption an einer Säule, durch Fällung mit Ammoniumsulfat, Zonenelektrolyse oder nach anderen bekannten Verfahren. Vorzugsweise wird es für praktische Zwecke als Vaccine mit einem Hilfsmittel wie ein Aluminiumhydroxidgel, wie nachstehend beschrieben, verwendet. Andere Hilfsmittel wie Aluminiumphosphat können ebenfalls mit dem Antigen zur Herstellung eines zum Gebrauch geeigneten Impfstoffs verwendet werden.Although the antigen can be used as a vaccine if it is obtained and neutralized by acid extraction is, and is centrifuged to remove suspended particles, it can optionally be further purified, e.g. by chromatographic adsorption on a column, by precipitation with ammonium sulfate, Zone electrolysis or other known methods. Preferably it is used for practical purposes used as a vaccine with an adjuvant such as an aluminum hydroxide gel as described below. Other adjuvants such as aluminum phosphate can also be used with the antigen to make one appropriate vaccine should be used.

Das nachstehende Beispiel dient der Erläuterung der Erfindung.The following example serves to explain the invention.

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example

Eine modifizierte Todd-Hewitt-Nährbrühe wurde aus folgenden Bestandteilen pro Liter destilliertem Wasser hergestellt :A modified Todd-Hewitt nutrient broth was made from the following ingredients per liter of distilled water:

Rinderherzinfusion von 500 gBeef heart infusion of 500 g Neopepton 20 gNeopeptone 20 g

Dextrose 10 gDextrose 10 g

Natriumchlorid 2 gSodium chloride 2 g Dinatriumphosphat 0,4 gDisodium phosphate 0.4 g Natriumcarbonat 2,5 ε·Sodium carbonate 2.5 ε Hefeextrakt (entwässert) 30 gYeast extract (dehydrated) 30 g

Das Nährmedium wurde mit einer S.equi-Kultur beimpft,die aus einem Nackenabste* eines Pferdes mit typischen Pferdestaupesymptomen erhalten wurde und die auch sonst als S.equi identifieiert wurde. Die Kulturen ließ man M bis 20 Stunden bei 37°C und einem pH-Wert zwischen 7,8 und 6,3 in Schüttelkolben wachsen, die zum Zwecke der Belüftung »it Watt· verschlossen waren. Zum Zeitpunkt der Ernte wurden die Kulturen auf das Vorhandensein von großen Kapseln um die S.equi-Zellen und zur Feststellung der Reinheit untersucht. Es ist jedoch nicht notwendig, daß die Bakterien Kapseln aufweisen, da sich das Antigen nicht in der Kapsel befindet. Die Kapsel kann zerstört werden oder vor der Extraktion des Antigens entfernt •/eräon. Ein Fachmann kann ein tüchtiges Wachstum der Kultur mit dem bloßen Auge feststellen. Einheitlich gute Kulturen werden bei 6-stündie.em Wachstum bei 37⁰C unter Verwendung von 5 bis lOfigem Impfmaterial erhalten. Eine solche Kultur ergibt 2,5 g nasse Zellen pro 1.The nutrient medium was inoculated with a S.equi culture, which was obtained from a neck cut * of a horse with typical equine distemper symptoms and which was otherwise identified as S.equi. The cultures were allowed to grow for up to 20 hours at 37 ° C. and a pH between 7.8 and 6.3 in shake flasks which were closed for the purpose of aeration. At the time of harvest, the cultures were examined for the presence of large capsules around the S. equi cells and for purity. However, it is not necessary for the bacteria to have capsules as the antigen is not in the capsule. The capsule can be destroyed or removed before the antigen is extracted. One skilled in the art can detect proficient growth of the culture with the naked eye. Uniformly good cultures are obtained at 6-stündie.em growth at 37 ⁰ C using from 5 to lOfigem inoculum. Such a culture yields 2.5 g of wet cells per liter.

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Unmittelbar nach der Erate wurden die Kulturen etwa durch Zusats von ß-Propiolacton₈ wodurch der pH-Wert auf k_f5 absänke abgetötete Die Zellen wurden anschlies-8end aus der Kulturlösung abgentrifugiert und eingefroren. Der so erhaltene Kulturbrei mrde in einer Salzlösung in einem Verhältnis von 5 g feuchten Brei pro 50 ml Salzlösung resuspendiert. Der pH-Wert der Suspension wurde mit In Salzsäure auf 2_sö eingestellt, und die Lösung wurde 10 Minuten unter Hüforen auf einem siedenden Wasserbad auf 9O=95°C erhitzt. Durch eine zweite Extraktion mit der halben Menge Salzlösung wurde zusätzliches Antigen erhaltene Die Lösung wurde¹ abgekühlt, mit In Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7» ¹J +. 0»l eingestellt und zentrifugiert. Der Bodensatz wurde verworfen« Die tfaseerstoffionsnkonsentration der überstehenden , das Antigen enthaltenden Flüssigkeit wurde mit In Salzsäure auf/o eingeteilt und da© Volumen mit Salzlösung auf 100 ml gebrachtο Aluminiumhydroxidgel wurde bis zu einer Menge von 20 % sugesetsst, und als Konservierungsmittel wuFde Pferthiolat in einer Koneentration von 1:10 000 sugesetat. Das erhaltene Produkt ist der erfindungeg®mIÄe Impfstoff.Immediately after the test, the cultures were killed by adding β-propiolactone _8, which caused the pH to drop to k _f 5. The cells were then centrifuged from the culture solution and frozen. The culture slurry obtained in this way was resuspended in a salt solution in a ratio of 5 g of wet slurry per 50 ml of salt solution. The pH of the suspension was adjusted ö _s with in hydrochloric acid to 2 and the solution was heated for 10 minutes under Hüforen on a boiling water bath for 9O = 95 ° C. Additional antigen was obtained by a second extraction with half the amount of saline solution. The solution was ^{cooled 1} with 1N sodium hydroxide to a pH of 7 » ¹ J +. 0 »l adjusted and centrifuged. The sediment was discarded "The tfaseerstoffionsnkonsentration of the supernatant, the antigen-containing liquid was divided with in hydrochloric acid / o and since © volume of salt solution to 100 ml gebrachtο aluminum hydroxide gel was added to an amount of 20% sugesetsst and wuFde as preservatives Pferthiolat in a Concentration of 1:10 000 sugesetat. The product obtained is the erfindungeg®mIÄe vaccine.

Zum Nachweis der Wirksamkeit des wie vorstehend beschrieben hergestellten Impfetoffa wurden 20 gesunde Pferde, die für eine Infektion mit virulenten S.equi empfänglich waren, in vier Gruppen vcn je 5 Pferden eingeteilt. Die Pferde einer dieser Gruppen dienten als Kontrolltiere. Allen Pferden wurde vor der ersten Impfung Blut entnommen, um mit diesem Serum festzustellen, ob sie frei von S. equi-Antikörpern waren.To demonstrate the effectiveness of the vaccine prepared as described above, 20 healthy horses, who were susceptible to infection with virulent S. equi, divided into four groups of 5 horses each. The horses in one of these groups served as control animals. All horses were vaccinated before the first Blood was drawn to determine whether the serum was free of S. equi antibodies.

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Eine Gruppe von 5 Pferden wurde intramuskulär mit je 2 ecm einer Gesamtzellsuspension von S. equi beimpft, die folgendermaßen hergestellt wurde:A group of 5 horses was inoculated intramuscularly with 2 ecm of a total cell suspension of S. equi, which was manufactured as follows:

Eine Zellsuspension von virulenten S.equi wurde durch aerobe Züchtung von Bakterien in einer wie vorstehend beschriebenen modifizierten Todd-Hewitt-Nährbrühe hergestellt. Die Zellsuspension wurde zur Einstellung des pH-Werts auf etwa 4,5 mit ß-Propiolacton und dann mit 1:10 000 Merthiolat behandelt ₃ zentrifugiert und mit einem Streptokokkenbrei, der gemäß der Herstellung der erfindungsgemäßen Vaccine, jedoch ohne die heiße Säureextraktion, hergestellt wurde, behandelt, bis eine Endkonzentration von 50 mg pro 2 ml Dosierung erreicht vmrde. Fünf Pferde wurden jeweils dreimal intramuskulär mit 2 ecm dieser Gesamtzellsuspension in Abständen von 7 Tagen beimpft.A cell suspension of virulent S.equi was prepared by aerobically growing bacteria in a modified Todd-Hewitt nutrient broth as described above. _{The cell suspension was treated 3} with ß-propiolactone and then with 1:10 000 merthiolate to adjust the pH to about 4.5 and centrifuged with a streptococcal paste which was prepared according to the preparation of the vaccines according to the invention, but without the hot acid extraction , treated until a final concentration of 50 mg per 2 ml dosage is reached. Five horses were each inoculated three times intramuscularly with 2 ecm of this total cell suspension at intervals of 7 days.

Eine zweite Gruppe von 5 Pferden wurde jeweils dreimal intramuskulär mit 10 ecm eines handelsüblichen S.equi-Bakterien-Impfstoffs in Abständen von 7 Tagen beimpft.A second group of 5 horses was administered three times intramuscularly with 10 ecm of a commercially available S.equi bacteria vaccine inoculated every 7 days.

Die dritte Gruppe von Pferden wurde jeweils dreimal intramuskulär mit 2 ecm des vorstehend beschriebenen säureextrahierten und an Aluminiumhydroxid adsorbierten Antigens in Abständen von 7 Tagen beimpft.The third group of horses was each intramuscularly extracted three times with 2 ecm of the above-described acid-extracted and antigen adsorbed on aluminum hydroxide are inoculated every 7 days.

Alle 20 Pferde der k Gruppen wurden auf einem Farmgelände gehalten, das isoliert und frei von S. equi-Infektion war. Sie wurden intramuskulär mit einer 12 Stunden alten Kultur einer Kombination von 2 Stämmen virulenter S. equi infiziert.All 20 horses of the k groups were kept on farm land that was isolated and free from S. equi infection. They were infected intramuscularly with a 12 hour old culture of a combination of 2 strains of virulent S. equi.

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Als Ergebnis der.Infektion wurde festgestellt, daß in der Kontrollgruppe' vier von fünf Pferden unterschiedliche Qrade von Temperaturerhöhung, einseitige und doppelseitige Schwellungen der Lymphdrüsen und doppelseitige schleinieitrige Absonderungen aus der Nase zeigten. Diese Gruppe wies typische Symptome und Läsionen auf, die mit einer Streptococcus equi-Infektion verbunden sind.As a result of the infection, it was found that in the control group 'four out of five horses different Qrade of temperature increase, unilateral and bilateral swelling of the lymph glands and showed bilateral mucous secretions from the nose. This group had typical symptoms and lesions associated with Streptococcus equi infection.

In der Gruppe, der die Gesamtzellsuspension verabreicht worden war, zeigten vier von fünf Tieren
hohe Temperaturen, schleimeitrige Absonderungen
aus der Nase und Drüsencchwellungen. Diese Gruppe lieferte keinen Nachweis für zufriedenstellenden
Schutz gegen die Infektion.In the group given the whole cell suspension, four out of five animals showed
high temperatures, secretions containing mucus
from the nose and glandular swellings. This group did not provide evidence of satisfactory
Protection against infection.

In der Gruppe, die mit einem handelsüblichen Bakterien-Impfstoff beimpft worden war, zeigten vier von fünf Tieren nach der Infektion typische Synjfcome der Pferdestaupe. Diese Gruppe zeigte schleimeitrige Absonderungen aus der Nase, einen Appetitverlust und merkliche
Temperaturerhöhungen. Nur eins von den fünf Tieren dieser Qruppe blieb nach der Infektion normal.
Für das schwache Ergebnis dieses handelsüblichen
Bakterien-Impfstoffe ist keine Erklärung vorhanden.In the group that had been inoculated with a commercial bacterial vaccine, four out of five animals showed typical symptoms of equine distemper after infection. This group showed mucous discharge from the nose, loss of appetite, and noticeable
Temperature increases. Only one of the five animals in this group remained normal after infection.
For the poor result of this commercially available
Bacteria vaccines no explanation is available.

Dia Gruppe schließlich, der das erfindungsgemäÄ hergestellte Antigen verabreicht worden war, blieb während des ganzen Experiments im wesentlichen gesund. Nur ein Pferd zeigte vorübergehende Absonderungen aus der Nase. Nach der ersten Impfung wurden Anzeichen einer Muskelschwellung beobachtet. Bei den nachfolgendenFinally, the group that produced the according to the invention Antigen was administered remained essentially healthy throughout the experiment. Just one horse showed transient discharge from its nose. After the first vaccination there were signs of a Muscle swelling observed. With the following

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Impfungen mit der erfindungsgemäßen Vaccine waren jedoch keine weiteren Zeichen für das Hervorrufen von Schwellungen »ehr erkennbar.However, vaccinations with the vaccine according to the invention were no further signs of causing Swellings »fairly recognizable.

Obwohl die Pferde in den vorstehend beschriebenen Vaccinationen zu drei verschiedenen Zeitpunkten mit 2 ecm des säureextrahierten und von Aluminiumhydroxid adsorbierten Antigens beimpft wurden, ist es für den Fachmann offensichtlich, daß die Uaccinationsbedingungen etwas von dem vorstehend beschriebenen abweichen können. Beispielsweise wurden die Pferde mit 2 ml einer Vaccine geimpft, die das aus 5 g der zentrifugierten S. equi-Zellen extrahierte Antigen pro 120 ml Vaccine enthielt, und diese Vaccination wurde insgesamt dreimal in Abständen von 1 Woche wiederholt. Bei rationellerer Produktion von Antigen während der Züchtungszeit, wirksamerer Ausschaltung der Zerstörung von Antigen durch Proteinasen, bei Gewinnung von Antigen aus den Gesamtzellen und bei Verwendung beserer Hilfsstoffe wäre für die Immunisierungsdosis des Impfstoffs pro Impfung Antigen aus einer nicht so großen Zahl von Zellen erforderlich. Der gute Schutz gegen die vorstehend beschriebene ziemlich starke Infektion deutet darauf hin, daß auch geringere Mengen Antigen zur Erzielung tines ausreichenden Schutzes wirksam wären. Es kann daher erwartet werden, daß eine geringere Anzahl von Impfungen von aus etwa 0,08 g frisch gezüchteten verkapselten S.equi-Zellen extrahiertem Antigen ausreichen würden, um bei intramuskulärer Impfung bei Pferden eine wirksame Antikörperreaktion hervorzurufen. Wiederholte Impfungen in geeigneten- Zeitabständen bewirken eine länger anhaltende Immunität, wie dem Fachmann bekannt ist.Although the horses in the vaccinations described above at three different times with 2 ecm of the acid-extracted antigen adsorbed by aluminum hydroxide have been inoculated, it is for the A person skilled in the art obviously knows that the vaccination conditions may differ slightly from what is described above. For example, the horses were using 2 ml of a vaccine inoculated, which the antigen extracted from 5 g of the centrifuged S. equi cells pro 120 ml of vaccine, and this vaccination was repeated a total of three times at 1 week intervals. With more rational production of antigen during the cultivation period, more effective elimination of the Destruction of antigen by proteinases, when antigen is obtained from whole cells and when used Better excipients would be for the immunization dose of the vaccine per vaccination requires antigen from a not so large number of cells. The good Protection against the rather severe infection described above suggests that lesser ones as well Amounts of antigen would be effective in providing adequate protection. It can therefore be expected that a lower number of inoculations of extracted from approximately 0.08 g freshly grown encapsulated S.equi cells Antigen would be sufficient to induce an effective antibody response to equine intramuscular vaccination to evoke. Repeated vaccinations at suitable intervals result in a longer lasting one Immunity as known to those skilled in the art.

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Claims

Patent claims:

.1. Process for the production of a ¥ accine against virulent Streptococcus equi strains _9, characterized in that virulent S. equi bacteria are grown under aerobic conditions, the bacterial cells are separated from their culture medium, a protein artipes antigen effective against S. equi by heating the bacterial cells extracted in a hot acid solution with a pH value of 1 ₉ 5 to 6, the hydrogen ion concentration of the solution is adjusted to a pH value above 7 »O, insoluble material is removed, and the pH value is adjusted _{to below 7 ° O.}

2. The method according to claim 1, characterized in that the antigen is extracted from the isolated bacterial cells ₉ by heating for about 10 minutes with stirring at 90 to 95 C and a pH of 2.0.

3. The method according to claim 1, characterized in that the S.equi bacteria to kill the Bacteria, destruction of proteinases and inhibition of further proteinase development immediately afterwards they have reached the desired degree of growth, kills them.

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4. The method according to claim 1, characterized in that after adjusting the pH to below 7.0 for adsorbing the antigen and providing an aid for the vaccine aluminum hydroxide gel

. clogs.

5. A vaccine for protecting horses against infection by virulent strains of S. equi, characterized in that it contains a protein-like antigen produced according to claim 1 or k and extracted from bacterial cells of S. equi.

6. Vaccine according to claim 5 »characterized in that the antigen adsorbed on aluminum hydroxide in an injectable vehicle is suspended, the vaccine free of cell debris and other water-insoluble Tissue is.

7. Vaccine according to claim 6, characterized in that it contains the protein-like antigen from 10 to 50 mg

S. equi cells containing prc ml.

Pur: Richardson-Mftrrell Inc.Pure: Richardson-Mftrrell Inc.

Dr.H.J.Wolff RechtsanwaltDr.H.J.Wolff Attorney at Law

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