DE2139310C3

DE2139310C3 - Process for the preparation of L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamide

Info

Publication number: DE2139310C3
Application number: DE19712139310
Authority: DE
Inventors: G R Flouret
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1970-08-06
Filing date: 1971-08-05
Publication date: 1974-03-14
Also published as: FR2104025A5; CA953710A; DE2139310A1; AU449817B2; AU3114871A; DE2139310B2; JPS4917264B1; SE375301B; GB1362696A

Description

In kürzlich erschienenen Veröffentlichungen wurden Theorien aufgestellt, und es wurde nachfolgend bewiesen, daß die Struktur des Thyrotropin freisetzenden Faktor oder Hormons (hiernach einfach als TRH bezeichnet) derjenigen des L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamids entspricht. TRH ist ein äußerst wertvolles Heilrr.ittel und im Laboratorium dienliches Instrument, das insbesondere bei der Analyse von Funktionen der Hypophyse nützlich ist.Theories have been proposed in recent papers and it has subsequently been proven that the structure of the thyrotropin releasing factor or hormone (hereinafter referred to simply as TRH denotes) those of L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamide is equivalent to. TRH is an extremely valuable medicinal product and useful in the laboratory Instrument that is particularly useful in analyzing pituitary functions.

TRH kann synthetisch jnter Verwendung des Tripeptids L-Glutamyl-L-histidyl-L-proIin als Ausgangsmaterial hergestellt werden. Dieses Verfahren ist kostspielig, weil zur Herstellung des Ausgangsmaterials zahlreiche Stufen erforderlich sind. Natürliches TRH kann zwar auch aus natürlichen Quellen isoliert werden; dieses Verfahren ist aber ebenfalls unwirtschaftlich, weil der Ertrag aus 165 000 Schweinehypothalami Sich nur auf etwa 4,4 mg beläuft. Dies beweist klar die Notwendigkeit zur Auffindung eines praktischen Syntheseweges. Auch ist die Reinheit des aus natürlichen Quellen extrahierten Produktes allzu zweifclihaft, als daß das Produkt als Heilmittel für Schilddrüsenstörungen verwendet werden könnte.TRH can be synthesized using the tripeptide L-glutamyl-L-histidyl-L-proIine as starting material getting produced. This process is costly because of the production of the starting material numerous stages are required. Natural TRH can also be isolated from natural sources; but this process is also uneconomical because the yield from 165,000 swine hypothalami Only amounts to about 4.4 mg. This clearly proves that Need to find a practical synthetic route. Also, the purity of what is made is natural Sources of extracted product are too ambiguous to use as a cure for thyroid disorders could be used.

Es wurden auch Versuche mit synthetischen Verfahren, die von den einzelnen Aminosäuren ausgehen, angestellt; diese Verfahren lassen aber ebenfalls noch viel zu wünschen übrig. Beispielsweise verlangen die bis heute bekannten Verfahren die Durchführung von vielen Stufen, um bestimmte Gruppen innerhalb der Moleküle, die an der Umsetzung teilnehmen, zu · schützen. Nach jeder Reaktionsstufe müssen die Schutzgruppen in einem getrennten Verfahren entfernt werden. So umfaßt ein klassisches Verfahren zum Aufbau des gewünschten Tripeptids 2 bis 3 »Schutz«- Stufen an Aminosäure^Ausgangsmaterialien, 2 wesentliche Reaktionsstufen und 2 bis 3 Stufen zur Entfernung der Schutzgruppen, wobei jedes Zwischenprodukt Reinigungsstufen notwendig macht. Diese Reinigungen sind besonders lästig und sollten auf einem praktischen Syntheseweg auf die Mindestanzahl herabgesetzt werden und so beschaffen sein, daß nie leicht und mit brauchbaren Muterialmcngen durchgeführt werden können.Attempts have also been made with synthetic methods starting from the individual amino acids; however, these processes also leave a lot to be desired. For example, the processes known to date require the implementation of many steps in order to protect certain groups within the molecules that take part in the reaction. After each stage of the reaction, the protecting groups must be removed in a separate process. Thus, a classic process for building the desired tripeptide comprises 2 to 3 "protection" steps on amino acid starting materials, 2 essential reaction steps and 2 to 3 steps for removing the protecting groups, each intermediate product requiring purification steps. These cleanings are particularly troublesome and should be reduced to the minimum number in a practical synthetic route and be such that they can never be carried out easily and with usable amounts of material.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Syntheseverfahrens zum Herstellen von TRH, das nicht die Isolierung und/oder Reinigung von als Zwischenprodukte auftretenden Dipeptiden umfaßt. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von TRH in guten Ausbeuten aus leicht zugänglichen Ausgangsstoffen.An object of the present invention is to provide a synthetic method for producing TRH which does not involve the isolation and / or purification of intermediate dipeptides. Another object of the present invention is to produce TRH in good yields from easily accessible starting materials.

Diese Ziele werden erreicht, indem man eine Lösung von Pentachlorphenyl-L-pyroglutamat in einem inerten, polaren, organischen Lösungsmittel mit einer wäßrigen Lösung von 1 Moläquivalent-L-Histidin in einer äquimolaren Menge eines Alkalihydroxids bei einer Temperatur zwischen 0 und 10⁰C während eine: Zeitraums zwischen 5 und 60 Minuten umsetzt, zu dem Reaktionsgemisch mindestens 1 Moläquivalen·- L-Prolinamid-hydrochlorid bei einer Temperatur zwischen 0 C und Raumtemperatur und nach der Auflösung des genannten Amids gibt, I bis 2 Moiäquivalente eines Epimerisierungsinhibitors zusetzt, cL· Gemisch unter Bewegung auf 0" C abkühlt, mindeste;, I Moläquivalent Dicyclohexyicarbodiimid, gelöst einem inerten, polaren, organischen Lösungsmitte, zugibt und das gerührte Gemisch mindestens 10 Stunden lanc bei einer Temperatur zwischen —10 un... -HO"C hält.These goals are achieved by mixing a solution of pentachlorophenyl L-pyroglutamate in an inert, polar, organic solvent with an aqueous solution of 1 molar equivalent of L-histidine in an equimolar amount of an alkali hydroxide at a temperature between 0 and 10 ⁰ C during a: period between 5 and 60 minutes, at least 1 molar equivalent of an epimerization inhibitor is added to the reaction mixture - L-prolinamide hydrochloride at a temperature between 0 C and room temperature and after dissolution of the amide mentioned, I to 2 molar equivalents of an epimerization inhibitor are added, cL Mixture cools to 0 "C with agitation, at least 1 molar equivalent of dicyclohexyicarbodiimide, dissolved in an inert, polar, organic solvent, is added and the stirred mixture is kept at a temperature between -10 and -HO" C for at least 10 hours.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Konzentrationen der Reaktanten in ihren jeweiligen Lösungsmitteln s; gewählt, daß die molare Endkonzentration des TRH zwischen 0,3 und 0,5 liegt. Als das polare, organische, inerte Lösungsmittel, das für die Zugabe des oben genannten Dicyclohexylcarbodiimids oder des Pentachlorphenyl-L-pyroglutamats Verwendung findet, können Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetrahydrofuran, Pyridin und andere inerte Flüssigkeiten verwendet werden. Dimethylformamid ist bevorzugtIn a preferred embodiment of the method according to the invention, the concentrations are the reactants in their respective solvents; chosen so that the final molar concentration of the TRH is between 0.3 and 0.5. As the polar, organic, inert solvent for the addition of the above-mentioned dicyclohexylcarbodiimide or pentachlorophenyl-L-pyroglutamate Is used, dimethylformamide, dimethylacetamide, tetrahydrofuran, Pyridine and other inert liquids can be used. Dimethylformamide is preferred

Der oben gebrachte Hinweis auf einen Epimerisierungsinhibitor ist in dem Sinne von Zimmermann & Anderson, J. amer. Chem. Soc, 89, 1967, S. 7151. zu verstehen. Ein gewöhnlich verwendeter Inhibitor ist N-Hydroxysuccinimid: es sind aber auch andere Reagenzien mit einer N-Hydroxyamido-Gruppe oder u-Hydroxy-amino-Verbindungen in ähnlicher Weise geeignet.The reference made above to an epimerization inhibitor is in the sense of Zimmermann & Anderson, J. amer. Chem. Soc, 89, 1967, p. 7151. to understand. A commonly used inhibitor is N-hydroxysuccinimide: others are also Reagents with an N-hydroxyamido group or u-hydroxy-amino compounds in a similar manner suitable.

Der Hauptvorteil des neuen Verfahrens beruht auf dei Tatsache, daß der ganze, stufenweise Aufbau des gewünschten T:ipeptids in einem Reaktionsgefäß vorgenommen werden kann und dabei keine Isolierung und/oder Reinigung eines Zwischenproduktes verlangt. Ein anderer Vorteil der neuen Arbeitsweise liegt in der Tatsache, daß keine Schutzgruppen benötigt werden. Ein weiterer Vorteil der neuen Arbeitsweise ist es, daß sie für mittlere und große Chargen wie auch für Chargen im MikromaDstab, d. h. für analytische oder diagnostische Präparate, angewandt werden kann, bei dens:n von radioaktiven Kohlenstoffatomen in der einen oder der anderen der drei Aminosäuren, aus den<:n nach dem erfindungsgemäßen Verfahren TRH hergestellt wird, Gebrauch gemacht wird.The main advantage of the new method is based on the fact that the whole, step-by-step construction of the desired T: ipeptids can be made in a reaction vessel without isolation and / or purification of an intermediate product required. Another advantage of the new way of working is the Fact that no protecting groups are needed. Another advantage of the new way of working is that it for medium and large batches as well as for batches in the micromad bar, d. H. for analytical or diagnostic preparations, can be applied at dens: n of radioactive carbon atoms in the one or the other of the three amino acids, from the <: n according to the method TRH according to the invention is made, use is made.

Die sich ergebende Produktmischung kann auf zweierlei Wegen hergestellt werden, wobei der eingeschlagene Weg hauptsächlich von der Größe der Charge abhängt. Ist die Charge groß, so wird die Lösung auf eine chromatographische Säule gebracht, und Silicagel wird als Adsorbens und eine Kombination aus Methanol und Chloroform als Eluierungs-The resulting product mixture can on two paths can be established, the chosen path being mainly dependent on the size of the Batch depends. If the batch is large, the solution is transferred to a chromatographic column, and silica gel is used as the adsorbent and a combination of methanol and chloroform as the elution

mittel verwendet. Ist die Charge klein, z. B. I mg oder weniger, so wird die schließlich erhaltene Lösung durch präparative Dünnschichtchromatographie ^ereinigt. Dieses Verfahren wird hauptsächlich für die Herste!- lung von radioaktiv gekennzeichnetem TRH mit hoher Aktivität angewandt, welches eine möglichst geringe Anzahl von Zwischenprodukt-Behandlungsschritten verlangt. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewöhnlich erhaltene Gesamtausbeute beträgt etwa 40°·,; der Theorie.medium used. If the batch is small, e.g. B. I mg or less, the solution finally obtained is purified by preparative thin-layer chromatography. This process is mainly used for the production of radioactively labeled TRH with high Activity applied, which minimizes the number of intermediate treatment steps required. The overall yield usually obtained by the process of the invention is about 40 ° · ,; the theory.

Example I.

Eine Lösung von 465 mg L-Histidin in 1,5 ml 2n-Natriumhydroxid wird bei Raumtemperatur zu einer Lösung von 1,134 g L-Pyroglutaminsäure-pentachlorphenylester in 6,5 ml Dimethylformamid gegeben. Es ergibt sich eine klare Lösung, die beim Stehenlassen die Ablagerung eines gelähnlichen Materials zeigt. Das Kondensationsprodukt, das sich bildet, L-Pyroglutamyl-L-histidin, kann durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von 66% Methanol in Chloroform als Lösungsmitte! und der Chlor-Tolidin- } arbreaktion nachgewiesen werden. Man kann so den Fortschritt der Umsetzung verfolgen, und es wird sichtbar, daß der größte Teil der Reaktion in den ersten wenigen Minuten stattfindet. Nach 1 Stunde erhöht sich die Intensität des durch die Anwesenheit von L-Pyrogluiamyl-L-histidin verursachten Fleckes nicht mehr wesentlich.A solution of 465 mg of L-histidine in 1.5 ml of 2N sodium hydroxide is added at room temperature to a solution of 1.134 g of pentachlorophenyl L-pyroglutamate in 6.5 ml of dimethylformamide. A clear solution results which, on standing, shows the deposition of a gel-like material. The condensation product that forms, L-pyroglutamyl-L-histidine, can be determined by thin layer chromatography using 66% methanol in chloroform as the solvent! and the chloro-tolidine } arbreaktion can be detected. In this way you can follow the progress of the reaction, and it becomes apparent that most of the reaction takes place in the first few minutes. After 1 hour, the intensity of the stain caused by the presence of L-pyrogluiamyl-L-histidine no longer increases significantly.

Diese wäßrige Lösung des Natriumsalzes des L-Pyroglutamyl-L-histidins wird m : 498 mg L-Prolinamid-hydrochlorid in 1,5 ml Wasser versetzt, und, nachdem das Amid vollständig gelöst ist, werden 381 mg N-Hydroxysuccinimid zugegeben, um die Epimerisierung des n-Kohlenstoffatoms des Histidylrestes bei der Aktivierung der Carboxygruppe in dem Pyroglutamylhistidin zu verhindern. Die wäßrige Lösung wird auf OC abgekühlt, und es wird eine Lösung von 1,238 g Dicyclohexylcarbodiimid in 1 ml Dimethylformamid zugegeben. Die Reaktanten werden nun über Nacht bei einer Temperatur zwischen 0 und IO^:C gerührt. Man kann den Fortschritt dieser Reaktion durch Dünnschichtchromatographie verfolgen. Nachdem die Umsetzung im wesentlichen vollständig ist, wird das Gemisch filtriert, um den gebildeten Dicyclohexylharnstoff zu entfernen, und das Filtrat wird direkt auf eine chromatographische Säule gebracht, die 30 g Sslicagel in Methanol/Chloroform (1:19) gepackt enthält. Die Eluierung der Säule mit Methanol/Chloroform (1:19) führt zur Entfernung von sich schneller bewegenden Bestandteilen. Das gewünschte TRH wird mit Methanol/Chloroform (1:2) eluiert, und durch Eindampfen des Eluats erhält man TRH, das Spuren an Chlorwasserstoffsäure enthalten kann. Das isolierte, trockene Material wird in Methanol gelöst und durch ein hasisches Ionenaustauschharz geleitet. Es ergeben sich 420 mg reines TRH, das durch Vergleich mit einer Standard-Probe an TRH durch Dünnschichtchromatographie in Methanol/Chloroform (2:1) und durch Elektrophorese, die identische Beweglichkeiten aufdeckt, identifiziert wird. Das Material weist eine optische Drehung [a]/r⁵ -64,8' (c 1 ~>5 HoO) aufThis aqueous solution of the sodium salt of L-pyroglutamyl-L-histidine is mixed with 498 mg of L-prolinamide hydrochloride in 1.5 ml of water, and after the amide has completely dissolved, 381 mg of N-hydroxysuccinimide are added to the To prevent epimerization of the n-carbon atom of the histidyl residue upon activation of the carboxy group in the pyroglutamylhistidine. The aqueous solution is cooled to OC and a solution of 1.238 g of dicyclohexylcarbodiimide in 1 ml of dimethylformamide is added. The reactants are then stirred at a temperature between 0 and 10 ^{: C overnight.} The progress of this reaction can be followed by thin layer chromatography. After the reaction is essentially complete, the mixture is filtered to remove the formed dicyclohexylurea and the filtrate is applied directly to a chromatographic column containing 30 g of silica gel packed in methanol / chloroform (1:19). Eluting the column with methanol / chloroform (1:19) removes components that move faster. The desired TRH is eluted with methanol / chloroform (1: 2) and evaporation of the eluate gives TRH, which may contain traces of hydrochloric acid. The isolated, dry material is dissolved in methanol and passed through a static ion exchange resin. 420 mg of pure TRH are obtained, which is identified by comparison with a standard sample of TRH by thin-layer chromatography in methanol / chloroform (2: 1) and by electrophoresis, which reveals identical mobilities. The material has an optical rotation [a] / r ⁵ -64.8 '(c 1 ~> 5 HoO)

Γ. e ι s ρ ι e 1 2Γ. e ι s ρ ι e 1 2

Für die radioaktive Kennzeichnung berechnete Mikrosynthese: Eine Lösung von 2,44 mg Pentachlorphenyl-I.-pyroglutamat in 25 μΐ warmem Dimethylformamid wird zu einer Lösung von I mp L-Histidin in 3,3 μΙ 2n Natriumhydroxid gegeben. Nach Zusatz von weiteren 20 μΙ Dimethylformamid ergibt sich eine klare Lösung, und nach einer Stunde werden ä ,07 mg L-Prolinamid-hydrochlorid in 2 al Wasser und danach 0,82 mg N-Hydroxysuccinimid zugefügt. Das Gemisch wird 10 Minuten lang bewegt, auf OC abgekühlt, und 2,66 mg Dicyclohe.xylcarbodiimid werden als Feststoff an den Seiten des Reaktionsgefäßes zugegeben, von wo die Dimethylformamiddämpfe es in das Reaktionsgemisch hineinlösen. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei einer Temperatur von 0 bis 5"¹C in einem kalten Raum bewegt. Zum Zwecke der Reinigung wird eine präparative Dünnschichtchromatographie durchgeführt und das Reaktionsgemisch direkt auf eine große Dünnschichtplatte aufgetragen, die an jedem Ende mit einem TRH-Standard markiert ist und in Methanol/Chloroform (2:1) entwickelt wird. Nachdem der Flächenbereich, auf dem das Reaktionsgemisch aufgetragen und entwickelt wurde, in geeigneter Weise abgedeckt worden ist, wird die Dünnschichtchromatographieplatte mit einem Chlor-Tolidin-Zerstäubungsmittel besprüht, um die Lage des TRH nachzuweisen. Der dem gekennzeichneten TRH entsprechende Flächenbereich der Platte wird abgeschabt, um das Absorbens zu entfernen, das seinerseits in eine kleine Kolonne gebracht und mit Methanol/Chloroform (1:2) eluiert wird. Das Eluat wird, wie im Beispiel 1 gezeigt, aufgearbeitet.Microsynthesis calculated for radioactive labeling: A solution of 2.44 mg of pentachlorophenyl I.-pyroglutamate in 25 μl warm dimethylformamide is added to a solution of I mp L-histidine in 3.3 μl of 2N sodium hydroxide. After adding a further 20 μl of dimethylformamide, a clear solution results, and after one hour, 0.7 mg of L-prolinamide hydrochloride in 2 ml of water and then 0.82 mg of N-hydroxysuccinimide are added. The mixture is agitated for 10 minutes, cooled to OC and 2.66 mg of dicyclohexylcarbodiimide are added as a solid to the sides of the reaction vessel from where the dimethylformamide vapors dissolve it into the reaction mixture. The reaction mixture is moved overnight at a temperature of 0 to 5 " ¹ C in a cold room. For the purpose of purification, preparative thin-layer chromatography is carried out and the reaction mixture is applied directly to a large thin-layer plate which is marked with a TRH standard at each end and developed in methanol / chloroform (2: 1) After the area on which the reaction mixture was applied and developed has been suitably covered, the thin-layer chromatography plate is sprayed with a chloro-tolidine atomizing agent to remove the The area of the plate corresponding to the marked TRH is scraped off in order to remove the absorbent, which in turn is placed in a small column and eluted with methanol / chloroform (1: 2). The eluate is, as shown in Example 1, worked up.

Obwohl das oben beschriebene Verfahren unter Verwendung von Natriumhydroxid als das zum Auflösen des Histidins notwendige Alkali vorgeführt wurde, ist es klar, daß an seiner Stelle Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid und die entsprechenden Carbonate oder Dicarbonate verwendet werden können. Vorzugsweise wird eine Base verwendet, welche genügend hohe Konzentrationen des Histidins ermöglicht, so daß die sich ergebende Tripeptidlösung innerhalb eines Konzentrationsbereichs von 0,25 bis 0,5 Mol je Liter liegt.Although the method described above using sodium hydroxide as that for dissolving the alkali necessary for the histidine was demonstrated, it is clear that in its place potassium hydroxide, Lithium hydroxide and the corresponding carbonates or dicarbonates can be used. Preferably if a base is used which enables sufficiently high concentrations of the histidine, see above that the resulting tripeptide solution is within a concentration range of 0.25 to 0.5 moles per liter located.

Claims

Claim:

Process for the preparation of L-PyrogluU myl-L-histidyl-L-prolinamide, characterized in that a solution of pentachlorophenyl-L-pyroglutamate in an inert, polar, organic solvent with an aqueous solution of 1 mol equivalent L- Histidine is reacted in an equimolar amount of an alkali hydroxide at a temperature between 0 and 10 C for a period between 5 and 60 minutes, at least 1 molar equivalent of L-prolinamide hydrochloride at a temperature between 0 ⁰ C and room temperature and after the dissolution of the said amide 1 to 2 molar equivalents of an epimerization inhibitor is added, the mixture is cooled to OC while agitating, at least 1 molar equivalent of a solution of dicyclohexylcarbodiimide in an inert, organic, polar solvent is added and the mixture is kept at a temperature between -10 and HO ¹ C during stirred for a period of at least 10 hours.