DE2131139C2

DE2131139C2 - Cross-linked, pearl-shaped agar or agarose derivatives, process for their production and their use

Info

Publication number: DE2131139C2
Application number: DE2131139A
Authority: DE
Inventors: Jan-Christer Uppsala Janson; Jerker Olof Porath
Original assignee: Exploaterings TBF AB
Current assignee: Exploaterings TBF AB
Priority date: 1970-06-25
Filing date: 1971-06-23
Publication date: 1986-08-07
Also published as: FR2098036A5; IL37131A0; IL37131A; GB1352613A; DE2131139A1; CA995606A; JPS5713561B1; CH564040A5

Description

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Quervernetzung mit einer Gelkonzentration der Agar- oder Agarose-Perlen von 20 bis 80% arbeitet2. The method according to claim 1, characterized in that one in the cross-linking with a Gel concentration of the agar or agarose beads from 20 to 80% works

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Sulfatesterhydrolyse durch ein- oder mehrmaliges Erhitzen des gewaschenen quervernetzten Agar- oder Agarose-Gels mit einer 0,5 bis 1,5 M NaOH-Lösung auf Siedetemperatur, ggf. in Gegenwart von Natriumborhydrid, durchführt. 3. The method according to any one of claims 1 or 2, characterized in that the sulfate ester hydrolysis by heating the washed cross-linked agar or agarose gel one or more times with a 0.5 to 1.5 M NaOH solution at boiling temperature, optionally in the presence of sodium borohydride.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das quervernetzte Reaktionsprodukt vor der Reduktion zunächst in Wasser quillt und danach mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel wäscht4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the cross-linked Reaction product swells first in water before the reduction and then with a suitable organic Solvent washes

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das in Wasser gequollene Reaktionsprodukt mit n-Propanol und danach mit Dioxan oder mit Tetrahydrofuran, Dibutyläther oder hochsiedenden Alkyläthern wäscht.5. The method according to claim 4, characterized in that the reaction product swollen in water with n-propanol and then with dioxane or with tetrahydrofuran, dibutyl ether or high boiling points Washes alkyl ethers.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Wassergehalt im Reaktionssystem vor der Reduktion praktisch auf 0 senkt.6. The method according to claim 4 or 5, characterized in that the water content in the reaction system practically drops to 0 before the reduction.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reduktion bei einer Temperatur von 80 bis 120° C durchführt.7. The method according to any one of claims 4 to 6, characterized in that the reduction at a Temperature of 80 to 120 ° C performs.

8. Quervernetztes, perlförmig ausgebildetes Agar-Derivat oder Agarose-Derivat, das auch bei höherer Temperatur und in alkalischem Milieu unlöslich bleibt, erhältlich nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.8. Cross-linked, pearl-shaped agar derivative or agarose derivative, which also with higher Temperature and remains insoluble in an alkaline medium, obtainable by the process according to one of the Claims 1 to 7.

9. Verwendung der Derivate nach Anspruch 8 zur Herstellung von Produkten, die ein Enzym oder eine Proteinkomponente gebunden enthalten.9. Use of the derivatives according to claim 8 for the production of products that contain an enzyme or a Protein component contained bound.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von quervernetzten, perlförmig ausgebildeten Agar- oder Agarose-Derivaten, die danach erhältlichen Agar-, oder Agarose-Derivate sowie deren Verwendung.The invention relates to a method for the production of cross-linked, pearl-shaped agar or agarose derivatives, the agar or agarose derivatives obtainable thereafter and their use.

Agar ist durch Extraktion gewisser Rotalgen erhältlich und besteht aus einem Gemisch von hochmolekularen Polysacchariden, deren Hauptprodukt bei ausgedehnter Hydrolyse die Galaktose ist. Wegen ihrer Fähigkeit, Gele mit hohem Wassergehalt zu bilden, wird Agar häufig in der Biochemie und Mikrobiologie verwendet. Besonders geschätzt wird die Resistenz von Agar gegenüber Mikroben.Agar can be obtained by extracting certain red algae and consists of a mixture of high molecular weight Polysaccharides, the main product of which, after extensive hydrolysis, is galactose. Because of their ability To form gels with high water content, agar is widely used in biochemistry and microbiology. The resistance of agar to microbes is particularly valued.

Beim Kühlen einer warmen Wasserlösung bildet sich Agargel, und zwar dann, wenn die Agarkonzentration eine bestimmte, für verschiedene Agartypen charakteristische Grenze überschreitet, die gewöhnlich unter 1 Gewichtsprozent liegt. Man nimmt an, daß sich bei der Gelbildung ein Molekülnetz bildet, bei dem die Polysaccharideketten durch Wasserstoffverbindungen zusammengehalten werden. Beim Wärmen löst sich das Gel auf und wird mit starker Säure oder starkem Alkali hydrolysiert, besonders beim Aufwärmen. Ein Agargel kann auch gewonnen werden, indem man feste, trockene Agarpartikel in Wasser quellen läßt. Das dabei erhaltene Produkt bekommt allerdings, von dem aktuellen Standpunkt aus betrachtet, bedeutend schlechtere Eigenschaften. When a warm water solution is cooled, agar gel forms, namely when the agar concentration exceeds a certain limit characteristic of different types of agar, which is usually below 1 Percent by weight. It is assumed that a molecular network is formed during gel formation in which the polysaccharide chains are held together by hydrogen bonds. The gel dissolves when heated and is hydrolyzed with strong acid or strong alkali, especially when warmed up. An agar gel can can also be obtained by swelling solid, dry agar particles in water. The thereby obtained From the current point of view, however, the product has significantly poorer properties.

Die meisten Separationsprozesse in der Biochemie bauen auf die Fähigkeit der Agargels, große Mengen Wasser zu binden, besonders Prozesse, die auf der Diffusion gelöster Stoffe beruhen. Derartige Prozesse sind Gelfiltration, auch Gelchromatographie genannt, Molekül-Ausschlußchromatographie, Molekül-Abseihungschromatographie, Molekularsiebchromatographie oder Permeationschromatographie. Auf Agar bezogen besteht diese chromatographische Technik darin, daß man ein Gemisch von Stoffen mit verschiedener Molekülgröße ein Bett aus Agarpartikeln passieren läßt, die mit einer Wasserlösung benetzt sind. Dabei wandern die StoffeMost separation processes in biochemistry are based on the ability of agar gels to process large quantities To bind water, especially processes that are based on the diffusion of dissolved substances. Such processes are Gel filtration, also known as gel chromatography, molecule exclusion chromatography, molecule separation chromatography, Molecular Sieve Chromatography or Permeation Chromatography. Insists on agar this chromatographic technique consists in the fact that a mixture of substances with different molecular sizes is obtained lets pass a bed of agar particles which are wetted with a water solution. The substances migrate in the process

mit unterschiedlicher Geschwindigkeit durch das Bett Die hochmolekularen Stoffe passieren das Bett rascher als die niedermolekularen. Das Arbeitsintervall für die Molekularsiebung wird durch das Netzwerk und das gegenseitige Größenverhältnis der Moleküle bestimmt. Ein Gel mit niedriger Agarkonzentration kann zur gegenseitigen Separation von hochmolekularen Stoffen verwendet werden, während sich ein Gel mit hoher Agarkonzentration besser für die Fraktionierung von Stoffen mit kleineren Moleküldimensionen eignet.through the bed at different speeds The high molecular weight substances pass the bed faster than the low molecular weight ones. The working interval for molecular sieving is determined by the network and the mutual size ratio of the molecules is determined. A gel with a low concentration of agar can be used for mutual separation of high molecular weight substances can be used while forming a gel with high Agar concentration better suited for the fractionation of substances with smaller molecular dimensions.

Das ideale Molekularsieb muß gewissen Ansprüchen genügen. So soll es beispielsweise keine gelandenen Gruppen enthalten, und ferner soll er unlöslich und chemisch resistent sein. Gewöhnliches Agar läßt in dieser Hinsicht zu wünschen übrig.The ideal molecular sieve must meet certain requirements. For example, it shouldn't land Contain groups, and it should also be insoluble and chemically resistant. Ordinary agar leaves in this Respect to be desired.

Nun hat man gefunden, daß Agar eine Fraktion enthält, die Agarose, mit bedeutend niedrigerem Gehalt an geladenen Gruppen als das Ausgangsmaterial. Diese Fraktion ist daher als Molekularsieb mit besseren Eigen ■ schäften als Agar zur Anwendung gekommen. Die Agarose hat Agar auch in anderem Zusammenhang ersetzt, wenn verlangt wurde, daß das Gel keine große Menge geladener Gruppen enthalten sollte, die in der Gelsubstanz chemisch verbunden waren.It has now been found that agar contains a fraction, agarose, with a significantly lower content of charged groups as the starting material. This fraction is therefore considered to be a molecular sieve with better properties shells as agar. Agarose has also replaced agar in other ways, when it was required that the gel should not contain a large amount of charged groups present in the gel substance were chemically linked.

Ein des weiteren verbessertes Produkt erhält man gemäß der amerikanischen Patentschrift 35 07 851, die eine Querverbindung der Agarose mit Epichlorhydrin beschreibt {vgl. auch Chemical Abstracts Vol. 69 (1968) Ref.Nr. 16715x). Auf diese Art gebundene Agarose ist weniger löslich als die natürliche Agarose und auch mehr resistent gegenüber Alkali. Sie hat jedoch keine Perlform, was in vielen Fällen von Nachteil istA further improved product is obtained according to the American patent 35 07 851, the one Cross-connection of agarose with epichlorohydrin describes {cf. also Chemical Abstracts Vol. 69 (1968) Ref.No. 16715x). Agarose bound in this way is less soluble than natural agarose and also more resistant to alkali. However, it does not have a pearl shape, which is a disadvantage in many cases

Es ist besonders für den technischen Gebrauch von großer Bedeutung, daß man einen hohen Strom von Molekularsiebbetten erhält, der die Einstellung geschwinder Diffusionsgleichgewichte erlaubt Es ist außerdem von besonderem Gewicht, eine wohldefinierte Strömungsfront durch das Bett zu erhalten, oder so nahe theoretischer Pistonströmung wie möglich. Dies geschieht am besten, indem man den Partikeln eine sphärische Form gibt. Dies ist seinerzeit bei den quervernetzten Agargelen nicht geschehen.It is of great importance, especially for technical use, that one has a high current of Molecular sieve beds that allow the establishment of rapid diffusion equilibria are also obtained of particular importance in maintaining a well-defined flow front through the bed, or as close to theoretical Piston flow as possible. This is best done by giving the particles a spherical shape gives. At the time, this did not happen with the cross-linked agar gels.

Die Eigenschaften, die das ideale Molekularsieb charakterisieren, sind auch in den Fällen erwünscht, in denen das Gel als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Ionenaustauschern oder anderen Adsorptionsmitleln sowie zur Herstellung von an Gele chemisch gebundenen Enzymen oder anderen biologisch und chemisch aktiven Gelmaterialien, verwendet werden soll, um die Konvektion in einer Lösung zu verhindern, beispielsweise bei präparativer Elektrophorese.The properties that characterize the ideal molecular sieve are also desirable in those cases in which the gel as a starting material for the production of ion exchangers or other adsorbents and for the production of enzymes chemically bound to gels or other biologically and chemically active ones Gel materials, should be used to prevent convection in a solution, for example at preparative electrophoresis.

Vorliegende Erfindung betrifft ein Produkt, das den Ansprüchen an Molekularsiebe besser genügt, als die bisher bekannten Agargelprodukte. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung dieses Produktes kann Agar ohne vorheriges zeitraubendes und niit Materialverlust verbundenes Fraktionierungsverfahren direkt als Ausgangsmaterial verwendet werden. Erfindungsgemäß erhält man das Agarprodukt in Form von sphärischen Partikeln mit sehr geringer Absorptionsfähigkeit, die in Wärme wasserunlöslich sind, sogar in alkalischem Milieu.The present invention relates to a product which meets the requirements of molecular sieves better than that previously known agar gel products. According to the process according to the invention for the production of this product can agar without a previous time-consuming and material loss-related fractionation process can be used directly as a starting material. According to the invention, the agar product is obtained in the form of spherical particles with very low absorption capacity that are insoluble in heat, even in alkaline environment.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man Agar- oder Agarosepartikel in Gestalt homogen gequollener Perlen, die in an sich bekannter Weise aus einer homogenen Wasserlösung erhalten worden sind, in einer wäßrigen Aufschlämmung mit Epichlorhydrin, Epibromhydrin, Bisepoxiden, Divinylsulfon, l,3-Dichlorpropan-2-ol oder 2;3-Dichlorpropan-l-ol als jeweiliges Vernetzungsmittel, das gegebenenfalls in einem organischen Lösungsmittel gelöst ist, bei Temperaturen bis 70° C während einer Reaktionsdauer von mehr als einer Stunde in alkalischem Milieu mit einer Laugenkonzentration zwischen 0,2 und 1,0 M in Abwesenheit von Sauerstoff und/oder in Gegenwart von stark reduzierenden Stoffen wie Natriumborhydrid umsetzt, sodann den Sulfatgehalt des erhaltenen quervernetzten Reaktionsproduktes durch alkalische Hydrolyse von Sulfatestergruppen unter sauerstofffreien und/oder reduzierenden Bedingungen so weit absenkt, bis die Adsorptionsfähigkeit des Produktes gegenüber basischen Stoffen die gewünschte Grenze erreicht hat und gegebenenfalls zusätzlich vor oder nach der Sulfatesterhydrolyse das Reaktionsprodukt durch Reduktion mit einem starken Reduktionsmittel bei erhöhter Temperatur ganz oder zum Teil von Carboxylgruppen befreit. An den Quervernetzungsreaktionen mit Agar nehmen sowohl Agarose als auch die übrigen, in Agar enthaltenen Polysaccharide (eil. Es hat sich erwiesen, daß durch die Quervernetzung in Abwesenheit von Sauerstoff und/oder in Gegenwart eines Reduktionsmittels, z. B. Natriumborhydrid die Braunfärbung und teilweise Zerstörung von Agar, die normalerweise bei Reaktionen im alkalischen Medium geschieht, das zur Kupplung der Agare an das Epichlorhydrin benötigt wird, vermieden wird. Die Umsetzung mit dem Vernetzungsmittel erfolgt in den meisten Fällen bei Temperaturen zwischen 50°C und 70°C. Es hat sich außerdem gezeigt, daß die Quervernetzung das Agarprodukt so stabilisiert, daß es durch Alkalibehandlung, ζ. B. ein- oder mehrmalige Behandlung in Autoklaven, mehr oder weniger sulfatfrei gemacht werden und, falls verlangt, fast ganz von der unerwünschten Adsorptionsfähigkeit befreit werden kann. Diese wird großenteils gewöhnlich dem Sulfatgehalt des Produktes zugeschrieben, kann jedoch durch die hier genannte Behandlung für die meisten der in der Natur vorkommenden Stoffe auf Null gebracht werden, ohne daß deshalb der totale Schwefelgehalt des Produktes notwendigerweise Null werden muß (vgl. Zusammenstellung der Werte in Tabelle 1).The method according to the invention is characterized in that agar or agarose particles are in the form homogeneously swollen pearls, which are obtained in a manner known per se from a homogeneous water solution have been, in an aqueous slurry with epichlorohydrin, epibromohydrin, bisepoxides, divinyl sulfone, 1,3-dichloropropan-2-ol or 2; 3-dichloropropan-l-ol as the respective crosslinking agent, which may be used in is dissolved in an organic solvent, at temperatures up to 70 ° C for a reaction time of more than one hour in an alkaline medium with an alkali concentration between 0.2 and 1.0 M in the absence of oxygen and / or in the presence of strongly reducing substances such as sodium borohydride, then the sulfate content of the resulting crosslinked reaction product by alkaline hydrolysis of Sulphate ester groups are lowered under oxygen-free and / or reducing conditions until the adsorption capacity of the product has reached the desired limit with regard to basic substances and, if applicable in addition, before or after the sulfate ester hydrolysis, the reaction product by reduction with a strong reducing agent completely or partially freed from carboxyl groups at elevated temperature. To the Cross-linking reactions with agar take agarose as well as the rest of the agar contained Polysaccharides (eil. It has been shown that by cross-linking in the absence of oxygen and / or in the presence of a reducing agent, e.g. B. sodium borohydride the brown coloration and partial destruction of Agar, which normally occurs in reactions in the alkaline medium that is used for coupling the agar to the Epichlorohydrin needed is avoided. The reaction with the crosslinking agent takes place in the most cases at temperatures between 50 ° C and 70 ° C. It has also been shown that the cross-linking the agar product is stabilized in such a way that it can be obtained by alkali treatment, ζ. B. single or multiple treatment in Autoclaves can be made more or less sulfate-free and, if required, almost entirely of the undesirable Adsorptive capacity can be freed. This is mostly due to the sulphate content of the product attributed, however, by the treatment mentioned here can be used for most of the naturally occurring Substances are brought to zero without necessarily reducing the total sulfur content of the product Must be zero (cf. compilation of the values in table 1).

Es hat sich ebenfalls gezeigt, daß man unter gewissen Bedingungen vorteilhafte Resultate erzielen kann durch eine Quervernetzung mit Bisepoxyden, z. B. l,3-Bis-(2,3-epoxy-propoxy)-butan. Hierzu kann man auch Divinylsulfon und andere quervernetzende Vinylverbindungen verwenden. Schließlich kann hinzugefügt werden, daß man selbstverständlich auch solche chemische Verbindungen anwenden kann, die bei Reaktionsbedingungen und beim Reaktionsverlauf in z. B. Epichlorhydrin oder einen anderen vorgenannten Querver'oinder umgewandelt werden können. Als Beispiel für derartige Verbindungen kennen l,3-Dichlorpropanol-2 (siehe Beispiel 12) oder 2,3-Dichlorpropanol-l (siehe Beispiel 13) genannt werden.It has also been shown that under certain conditions advantageous results can be achieved by cross-linking with bisepoxides, e.g. B. 1,3-bis (2,3-epoxy-propoxy) -butane. Divinyl sulfone can also be used for this purpose and other cross-linking vinyl compounds. Finally, it can be added that you can of course also use such chemical compounds that under reaction conditions and during the course of the reaction in z. B. epichlorohydrin or another aforementioned Querver'oinder converted can be. As an example of such compounds, know 1,3-dichloropropanol-2 (see Example 12) or 2,3-dichloropropanol-1 (see Example 13) can be mentioned.

Indem man den Grad der Quervernetzung variiert und zwar hauptsächlich die Natur des quervernetzenden Moleküls, kann man Molekularsiebe mit gewissermaßen variablen Molekülausschlußgrenzen, und dazu mit viel höheren Werten als es früher möglich war, erhalten. Dies wird in der Figur illustriert, die ein Beispiel zur Molekularsiebung auf 2% quervernetztem und hydrolysiertem Agar zeigt. Die Kurven beziehen sich aufBy varying the degree of cross-linking, mainly the nature of the cross-linking Molecule, one can use molecular sieves with somewhat variable molecular exclusion limits, and in addition with a lot higher values than was previously possible. This is illustrated in the figure which is an example for Shows molecular sieving on 2% cross-linked and hydrolyzed agar. The curves relate to

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I Tabakmosaikvirus mit einem Partikelgewicht zirka 2 · 10⁸ und länglicher Form,I tobacco mosaic virus with a particle weight of about 2 · 10 ⁸ and an elongated shape,

II Adenovirus Typ 3 mit einem Partikelgewicht zirka 1,8 · 10² und sphärischer Form,II adenovirus type 3 with a particle weight of around 1.8 · 10 ² and spherical shape,

III Poliovirus mit einem Partikelgewicht zirka 6,8 · 10⁶ und sphärischer Form undIII poliovirus with a particle weight of about 6.8 · 10 ⁶ and spherical shape and

IV Satellit Tabak Nekros Virus mit einem Partikelgewicht zirka 2 · 10⁶ und sphärischer Form.
5 IV satellite Tobacco Necros Virus with a particle weight of about 2 · 10 ⁶ and spherical shape.
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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Produkte sind angequollene Gele in Perlenform und mit hohem Wassergehalt. Geht man von einem Gel aus, das mit Wasser vollgezogen ist, bleibt der Quervernetzungsgrad begrenzt, er kann aber gleichzeitig wunschgemäß reguliert und reproduziert werden, indem man die für die Quervernetzungen vorgesehenen Moleküle in das Gel eindringen läßt. 90% Wasser oder mehr scheint in den meisten Fällen ein angemessener Wassergehalt zu sein. Es ist zu beachten, daß sich die Form der Gelpartikel während der erfindungsgemäßen Behandlung nicht verändert. Es ist aber auch wichtig, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren das quervernetzte Gel auch bei höherer Temperatur in alkalischer Lösung unlöslich bleibt. Ein Bett aus dem erfindungsgemäßen Produkt kann demzufolge durch Aufwärmen im Autoklaven sterilisiert werden, was bei verschiedenen Fällen von ausschlaggebender Bedeutung sein dürfte. Die Unlöslichkeit ist ferner besonders wertvoll, falls das Agarprodukt beispielsweise zur Reinigung pharmazeutischer Produkte verwendet werden soll, insbesondere zu Injizierungszwecken, wo kontaminierende Stoffe, wie antigene Substanzen, nicht ausgelöst werden dürfen. Das Agarprodukt verbleibt ferner transparent, farblos oder weiß, was zeigt, daß bei der Behandlung keine unerwünschte Zersetzung des Agarproduktes erfolgt.The products obtainable by the process according to the invention are swollen gels in the form of pearls and with high water content. Assuming a gel that has been completed with water, the degree of cross-linking remains limited, but at the same time it can be regulated and reproduced as desired by the allows molecules provided for the cross-links to penetrate into the gel. 90% water or more appears in to be an adequate water content in most cases. It should be noted that the shape of the gel particles not changed during the treatment according to the invention. But it is also important that after the invention Makes the cross-linked gel insoluble in alkaline solution even at higher temperatures remain. A bed of the product according to the invention can therefore be heated in an autoclave sterilized, which is likely to be of crucial importance in various cases. The insolubility is also particularly valuable if the agar product is used, for example, to purify pharmaceutical products should be used, especially for injection purposes, where contaminants such as antigens Substances, must not be triggered. The agar product also remains transparent, colorless or white, which shows that there is no undesirable degradation of the agar product during the treatment.

Um die Erfindung weiter zu verdeutlichen, folgt nachstehend eine Anzahl von Ausführungsbeispielen, wobei allerdings die genannten Reagenzen und Mengen im Rahmen der Erfindung beliebig variiert werden können.In order to further illustrate the invention, a number of exemplary embodiments follow below, wherein however, the reagents and amounts mentioned can be varied as desired within the scope of the invention.

example 1

Eine Suspension aus angequollenen Agar- oder Agarosepartikein, in Perlenform (welche auf an sich bekannte Weise aus einer homogenen Wasserlösung des aktuellen Agar- oder Agaroseproduktes hergestellt ist, wobei sogar Brechgut verwendet werden kann), in 0,5 M Natriumhydroxidlösung wurde mit 10 ml Epichlorhydrin pro 100 ml angequollene Gelmasse versetzt. Man erwärmte die Mischung auf 6O⁰C und hielt diese Temperatur 2 Stunden lang bei, wobei in einer Stickstoffatmosphäre oder in Gegenwart von Natriumborhydrid unter Schütteln gearbeitet wurde. Das quervernetzte Gel wurde in Wasser bis zur neutralen Reaktion gewaschen. Zur Hydrolyse von Sulfatestern erhitzte man das quervernetzte Agar- oder Agarosegel im Autoklaven mit dem gleichen Volumen 2 M Natriumhydroxidlösung während 2 Stunden in Gegenwart von Natriumborhydrid.A suspension of swollen agar or agarose particles, in bead form (which is prepared in a known manner from a homogeneous water solution of the current agar or agarose product, whereby even crushed material can be used), in 0.5 M sodium hydroxide solution was mixed with 10 ml of epichlorohydrin added per 100 ml of swollen gel mass. The mixture was heated to 6O ⁰ C and this temperature was held for 2 hours at long, was being carried out in a nitrogen atmosphere or in the presence of sodium borohydride under agitation. The cross-linked gel was washed in water until it was neutral. For the hydrolysis of sulfate esters, the crosslinked agar or agarose gel was heated in the autoclave with the same volume of 2 M sodium hydroxide solution for 2 hours in the presence of sodium borohydride.

Example 2

Die Quervernetzung wurde gemäß Beispiel 1 ausgeführt, jedoch mit dem Unterschied, daß man anstatt der Wasserlösung ein Lösungsmittel aus 50 Vol.-% Ethanol und 50 Vol.-% Wasser nahm. Das Epichlorhydrin war in diesem Gemisch ganz löslich. Das resultierende, quervernetzte Gel war in kochendem Wasser nicht löslich und ließ sich ohne merkbare Veränderung in 1 M Natriumhydroxid bei 120⁰C 1 Stunde lang im Autoklaven behandeln. The crosslinking was carried out according to Example 1, with the difference that a solvent composed of 50% by volume of ethanol and 50% by volume of water was used instead of the water solution. The epichlorohydrin was quite soluble in this mixture. The resulting, cross-linked gel was not soluble in boiling water and could be ^{treated in 1 M sodium hydroxide at 120 °} C. for 1 hour in an autoclave without any noticeable change.

Example 3

Die Ouervernetzung wurde gemäß Beispiel 1 durchgeführt, mit dem Unterschied, daß man als Lösungsmittel absolutes Ethanol nahm. In bezug auf die Löslichkeit stimmte das Produkt mit dem in Beispiel 2 erhaltenen Agargel überein.The crosslinking was carried out as in Example 1, with the difference that the solvent took absolute ethanol. The product agreed with that obtained in Example 2 in terms of solubility Agar gel match.

Example 4

Die Quervernetzung wurde in 50 VoI.-% Dioxan und 50 Vol.-% Wasser bei im übrigen gleichen Bedingungen so wie im vorherigen Beispiel durchgeführt. Man erhielt ein nichtlösliches, in Wärme und Alkali stabiles Produkt.The crosslinking was carried out in 50% by volume of dioxane and 50% by volume of water under otherwise identical conditions done as in the previous example. A product was obtained which was insoluble and stable to heat and alkali.

Example 5

Man führte die Quervernetzung auf genau dieselbe Art durch wie im vorangehenden Beispiel, jedoch mit Epibromhydrin anstelle von Epichlorhydrin. Man erhielt ein in Wärme und Alkali stabiles Produkt mit gleichem Aussehen.The cross-linking was carried out in exactly the same way as in the previous example, but with Epibromohydrin instead of epichlorohydrin. A product with the same which was stable in terms of heat and alkali was obtained Appearance.

Example 6

Die Quervernetzung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 durchgeführt, jedoch mit Epibromhydrin. Man erhielt ein gleichartiges ProduktThe crosslinking was carried out in the same way as in Example 3, but with epibromohydrin. A similar product was obtained

Example 7

Die Quervernetzung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 gemacht, jedoch mit Epibromhydrin. Man erhielt ein gleichartiges ProduktThe cross-linking was done in the same way as in Example 4, but with epibromohydrin. Man received a similar product

Example 8

Die Quervernetzung wurde gemäß Beispiel 1 durchgeführt, doch tauschte man das Epichlorhydrin gegen l,3-Bis-(2,3-epoxypropoxy)-butan aus. Dieses Bisepoxid läßt sich allerdings im Gegensatz zum Epichlorhydrin in Wasser mischen. Man erhielt ein nichtlösliches, in Wärme und Alkali stabiles Produkt, das die ursprüngliche Partikelform behielt, wie auch bei den übrigen Beispielen.The crosslinking was carried out as in Example 1, but the epichlorohydrin was exchanged for 1,3-bis (2,3-epoxypropoxy) butane. This bisepoxide can, however, in contrast to epichlorohydrin in Mix water. An insoluble product, which was stable under heat and alkali, was obtained, which was the original Particle shape retained, as in the other examples.

Example 9

Die Quervernetzung wurde wie in Beispiel 8 vorgenommen. Man tauschte jedoch das Wasser gegen ein gemischtes Lösungsmittel aus 50 Vol.-% Wasser und 50 Vol.-% Ethanol aus, und es wurde das in Wasser schwer lösliche Bisepoxid l,4-Bis-(2,3-epoxy-propoxy)-butan verwendet.The crosslinking was carried out as in Example 8. However, the water was exchanged for mixed solvent of 50 vol% water and 50 vol% ethanol, and it became difficult in water soluble bisepoxide 1,4-bis- (2,3-epoxy-propoxy) -butane used.

Beispiel 10Example 10

Man verfuhr hier auf gleiche Weise wie in Beispiel 9, führte die Quervernetzung jedoch in absolutem Ethanol durch.The procedure here was the same as in Example 9, but the crosslinking was carried out in absolute ethanol by.

Beispiel 11Example 11

Die Quervernetzung geschah gemäß Beispiel 9, mit dem Unterschied, daß das Lösungsmittel aus 50 Vol.-% Ethanol und 50 Vol.-°/o Dioxan bestand.The crosslinking took place according to Example 9, with the difference that the solvent from 50 vol .-% Ethanol and 50% by volume dioxane.

Beispiel 12Example 12

Die Quervernetzung geschah gemäß Beispiel 3, mit dem Unterschied, daß Epichlorhydrin gegen 1,3-Dichlorpropanol-2 ausgetauscht wurde.The crosslinking took place according to Example 3, with the difference that epichlorohydrin against 1,3-dichloropropanol-2 was exchanged.

Beispiel 13Example 13

Die Quervernetzung geschah gemäß Beispiel 3, aber mit 2,3-Dichlorpropanol-l anstatt Epichlorhydrin.The crosslinking took place as in Example 3, but with 2,3-dichloropropanol-1 instead of epichlorohydrin.

Beispiel 14Example 14

Das quervernetzte Gel wurde gemäß Beispiel 3 hergestellt, mit dem Unterschied, daß die Behandlung im Autoklaven in einer Lösung von 1 M Natriumalkoholat in absolutem Ethanol durchgeführt wurde.The cross-linked gel was prepared according to Example 3, with the difference that the treatment in Autoclave was performed in a solution of 1 M sodium alcoholate in absolute ethanol.

Beispiel 15Example 15

100 ml gequollenes, perlenförmiges Agar wurde durch Waschen mit 1 M Sodalösung ins Gleichgewicht gebracht. Man setzte 5 ml Divinylsulfon in 50 ml Sodalösung hinzu. Das Gel bekam ein milchiges Aussehen. Die Suspension wurde eine halbe Stunde lang bis 50⁰C erhitzt und danach auf einem Filter gewaschen. Man entnahm eine Probe und erhitzte diese bis 100⁰C. Ein Zerfall ließ sich nicht wahrnehmen, und die Gelkugeln behielten ihre Form. Das Gel wurde danach in eine 1 M NaOH-Lösung, 0,5% NaBH4 enthaltend, überführt. Das so behandeite Gel behielt die sphärische Partikelform, und ein damit gepacktes Bett zeigte hervorragende Strömungseigenschaften. 100 ml of swollen, pearl-shaped agar was equilibrated by washing with 1 M soda solution. 5 ml of divinyl sulfone in 50 ml of soda solution were added. The gel took on a milky appearance. The suspension was ^{heated to 50 °} C. for half an hour and then washed on a filter. A sample was taken and heated them to 100 ⁰ C. A collapse could not be perceived, and the gel spheres retained their shape. The gel was then transferred to a 1 M NaOH solution containing 0.5% NaBH4. The gel thus treated kept the spherical particle shape, and a bed packed therewith exhibited excellent flow properties.

Um zu zeigen, daß die Agarperlen ebenso wie Flüssigkeitspartikel unter Beibehaltung der sphärischen Form quervernetzt werden können, wurden nachstehende Versuche gemacht, aus denen außerdem hervorgeht, daß es nicht nötig ist, die sphärischen Partikel nach ihrem Entstehen abzusondern, um dann die Quervernetzung durchzuführen.To show that the agar beads as well as liquid particles while maintaining the spherical shape can be crosslinked, the following experiments were made, from which it can also be seen that it it is not necessary to separate the spherical particles after they have formed in order to then cross-link perform.

Beispiel 16Example 16

500 ml einer 6-prozentigen Agarlösung in 0,5 M NaOH mit 2,5 g NaBHi wurden bei 75° in 600 ml Ethylenchlorid, das 20 g Polyvinylacetat als Stabilisator enthielt, suspendiert.500 ml of a 6 percent agar solution in 0.5 M NaOH with 2.5 g NaBHi were at 75 ° in 600 ml ethylene chloride, which contained 20 g of polyvinyl acetate as a stabilizer, suspended.

Das Schütteln regulierte man derart, daß Partikel geeigneter Größe (50—250 μ) erhalten wurden. Danach wurden 50 ml Epichlorhydrin zugesetzt und 2 Stunden bei 60° weitergeschüttelt. Nach Abkühlen befreite man die Gelpartikel vom Emulgator durch sorgfältiges Waschen in Aceton. Danach kamen die Perlen in Wasser und wurden gemäß Beispiel 1 im Autoklaven erhitztThe shaking was regulated so that particles of suitable size (50-250 µ) were obtained. Thereafter 50 ml of epichlorohydrin were added and the mixture was shaken at 60 ° for a further 2 hours. After cooling, it was freed remove the gel particles from the emulsifier by carefully washing them in acetone. After that, the pearls came in water and were heated according to Example 1 in the autoclave

Zum Vergleich der Adsorptionseigenschaften der so erhaltenen Produkte mit denen des Ausgangsmateriales und der Agarose machte man folgende Versuche:To compare the adsorption properties of the products thus obtained with those of the starting material and the following experiments were made on agarose:

Das Gel wurde auf ein Bett mit 0,90 cm² im Querschnitt und 2,5—3,5 cm Höhe in Chromatographierröhren gepackt. Danach glich man das Bett mit 0,01 M Ammoniumacetatpuffer, pH 4,1, aus. Cytochrom C (0,1% Lösung im gleichen Puffer) wurde eingeführt und zeigte effluent die gleiche Farbstärke. Das Bett wurde mit der Pufferlösung gewaschen, bis kein weiteres Cytochrom eluierte. Die Verdrängung des absorbierten Cytochroms geschah mit 0,15 M Ammoniumacetatpuffer, pH 4,1. Die gemessene Menge Cytochrom im Eluat, wobei mit der Adsorptivität 1,54 cm² mg-¹ berechnet wurde, lag bei 280 nm. Nach jedem Versuch wurde das Gel mit 0,5 M Natriumhydroxid gewaschen und danach mit destilliertem Wasser, bis das Eluat eine neutrale Reaktion aufwies.The gel was packed on a bed 0.90 cm ² in cross section and 2.5-3.5 cm high in chromatography tubes. The bed was then equalized with 0.01 M ammonium acetate buffer, pH 4.1. Cytochrome C (0.1% solution in the same buffer) was introduced and effluent showed the same color strength. The bed was washed with the buffer solution until no more cytochrome eluted. The absorbed cytochrome was displaced with 0.15 M ammonium acetate buffer, pH 4.1. The measured amount of cytochrome in the eluate, the adsorptivity being ^{calculated as 1.54 cm 2} mg- ¹ , was 280 nm. After each experiment, the gel was washed with 0.5 M sodium hydroxide and then with distilled water until the eluate had a had a neutral reaction.

Das Gel wurde gefriergetrocknet und gewogen.The gel was freeze dried and weighed.

In der Tabelle 1 wird die Absorptionsfähigkeit für Cytochrom C sowie der Schwefelgehalt einiger verschiedener Agarosegele und von Agar angegeben, teils unbehandelt und teils erfindungsgemäß behandelt (Beispiel 1).Table 1 shows the cytochrome C absorptivity, as well as the sulfur content of several different ones Agarose gels and indicated by agar, partly untreated and partly treated according to the invention (Example 1).

Table 1

GeltypeGel type

Adsorptionsfähigkeit (mg Cytochrom C/m Gel) unbehandelt behandeltAdsorptive capacity (mg cytochrome C / m gel) treated untreated

%S% S

unbehandelt behandelttreated untreated

Sepharose 2B®
Sepharose 6B®
Bio-Gel Α® 1,5 m
Difco Bacto Agar® 6%Sepharose 2B®
Sepharose 6B®
Bio-Gel Α® 1.5 m
Difco Bacto Agar® 6%

0,124 0,102 0,080 0,2400.124 0.102 0.080 0.240

0,007 0,005 0,008 0,0600.007 0.005 0.008 0.060

0,179 0,182 0,118 0,3710.179 0.182 0.118 0.371

0,028 0,026 0,021 0,0490.028 0.026 0.021 0.049

Sepharose 2B® und Sepharose 6B® sind Agarosen von Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala. Bio-Gel A® ist eine Agarose von Bio Rad Lab., Richmond, USA, und Difco Bacto Agar® 6% wird von Difco Lab. Inc., Detroit, hergestellt.Sepharose 2B® and Sepharose 6B® are agaroses from Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala. Bio-Gel A® is an agarose from Bio Rad Lab., Richmond, USA, and Difco Bacto Agar® 6% is available from Difco Lab. Inc., Detroit, manufactured.

Hier soll betont werden, daß die Formstabilität des erfindungsgemäßen Produktes viel größer ist, als bei nicht quervernetztem Agar oder Agarose. So behält das erfindungsgemäße Produkt eine unveränderte Form auch beim Erhitzen in alkalischer Lösung zum Unterschied von bereits früher bekannten Agarprodukten in Kugelform. Sie können außerdem nicht nur starkes Alkali und höhere Temperatur vertragen, sondern auch gefriergetrocknet werden, wobei die gefriergetrockneten Produkte aufs Neue durch Behandlung mit Wasser zu sphärisehen Produkten aufgequollen werden können.It should be emphasized here that the dimensional stability of the product according to the invention is much greater than that of not cross-linked agar or agarose. The product according to the invention thus also retains an unchanged shape when heated in an alkaline solution, in contrast to previously known agar products in spherical form. In addition to being able to withstand strong alkali and higher temperatures, they can also be freeze-dried The freeze-dried products can be seen again by treatment with water Products can be swollen.

Erfindungsgemäß quervernetztes und entschwefeltes Agar kann nicht als ein Produkt betrachtet werden, bei dem die quervernetzte Agarose in eine im übrigen nicht reagierte Masse eingeht. Aus genauen Untersuchungen geht hervor, daß sowohl Agarpektine sowie andere in Agar eingebundene Polysaccharide an dem Quervernetzungsprozeß teilgenommen haben müssen.Cross-linked and desulfurized agar according to the invention cannot be considered as a product which the cross-linked agarose enters into an otherwise unreacted mass. From detailed investigations it appears that both agar pectins as well as other agar-bound polysaccharides participate in the cross-linking process must have participated.

Durch vorstehend beschriebene Behandlung entfernt man zunächst den größten Teil der Sulfatgruppen von Agar, während die Carboxylgruppen zum größten Teil zurück bleiben. Unter gewissen Bedingungen können diese allerdings zu Adsorptionsverhältnissen führen, die sich beispielsweise auf das Molekülabseihen störend auswirken können.The treatment described above first removes most of the sulfate groups from Agar, while most of the carboxyl groups are left behind. Under certain conditions you can however, these lead to adsorption conditions which, for example, interfere with the sequence of molecules can affect.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann jedoch auch der Carboxylgehalt bis praktisch Null erniedrigt werden, wodurch die gesamte Adsorptionsfähigkeit noch bedeutend weiter verringert wird. Man hat Produkte mit einer Adsorptionsfähigkeit hergestellt, die durch Decarboxylierung auf 10% der nur desulfatierten Produkte erniedrigt wurde. Hierbei wird das Produkt vor oder nach der Entschwefelung ganz oder zum größten Teil von Carboxylgruppen befreit, indem es in eine für die Reaktion geneigte Form überführt und danach mit starken Reduktionsmitteln, wie Metallhydriden, z. B. Hydriden von Lithium, Magnesium, Aluminium oder Bor, deren Derivaten oder Boranen umgesetzt wird, wodurch sich die Adsorptionskapazität des Produktes weiterhin verringert.According to the present invention, however, the carboxyl content can also be reduced to practically zero , whereby the total adsorption capacity is reduced even further. You have products manufactured with an adsorptive capacity that decarboxylates 10% of the desulphated products only was humiliated. Here, the product is completely or for the most part from before or after the desulfurization Freed carboxyl groups by converting it into a form inclined for the reaction and then with strong Reducing agents such as metal hydrides, e.g. B. hydrides of lithium, magnesium, aluminum or boron, their Derivatives or boranes is converted, whereby the adsorption capacity of the product continues decreased.

Folgendermaßen können Partikel von quervernetztem Agar oder Agar-Derivaten mit beispielsweise Aluminium- oder Borhydrid oder einem Derivat davon, behandelt werden, besonders Lithium-Aluminiumhydrid in Lösungsmitteln, die Agare oder das Agar-Derivat quellen können und mit denen das Hydrid nicht oder so träge reagiert, daß die Reaktion mit dem Agar nicht gestört wird. Erhöhte Temperatur beschleunigt die Reaktion. Von dieser Behandlung verlangt man, daß sie weder den Zerfall der Partikel noch eine Änderung der Form zur Folge hat.Particles of cross-linked agar or agar derivatives with, for example, aluminum or borohydride or a derivative thereof, especially lithium aluminum hydride in Solvents which agar or the agar derivative can swell and with which the hydride is not or so sluggish reacts so that the reaction with the agar is not disturbed. Increased temperature accelerates the reaction. from this treatment is required to result in neither disintegration of the particles nor change in shape Has.

Es hat sich als schwierig erwiesen, durch eine direkte Behandlung des Agarproduktes mit LiAlH« in Äther, Dioxan usw. die Adsorptionskapazität zu erniedrigen, da das Lösungsmittel anscheinend nicht in erforderlichem Ausmaße in Agar eindringt Geeignete Verfahren zur Durchführung der Behandlung sind u. a. die Überführung von Agar in eine reaktionswillige Form, beispielsweise indem man die Partikel zunächst in Wasser anquellen läßt und sie danach mit einem organischen Lösungsmittel mittlerer Polarität wäscht, z. B. mit n-Propanol und danach mit Dioxan. Auch andere Lösungsmittel, z. B. Tetrahydrofuran, können in Frage kommen. Man kann außerdem Agar oder das Agar-Derivat in eine Esterform überführen, z. B. in ein Acetat. Derartig erhält man ein Zwischenprodukt, das besser in Dioxan und anderen Äthern quilltIt has proven to be difficult, by a direct treatment of the agar product with LiAlH «in ether, Dioxane, etc. to lower the adsorption capacity, since the solvent does not appear to be necessary Agar Penetration Extent Suitable methods of carrying out the treatment include: the overpass from agar into a reactive form, for example by first allowing the particles to swell in water and thereafter washes them with an organic solvent of medium polarity, e.g. B. with n-propanol and then with dioxane. Other solvents, e.g. B. tetrahydrofuran, can be considered. You can also Convert agar or the agar derivative into an ester form, e.g. B. in an acetate. In this way an intermediate product is obtained which swells better in dioxane and other ethers

Es hai sich als geeignet erwiesen, die Reduktion bei erhöhter Temperatur zu vollziehen, vorzugsweise von über 80° C Dies scheint darauf zu beruhen, daß sich die Molekülkonstruktion bei höherer Temperatur weiter öffnet, anscheinend dadurch, daß die Wasserstoffverbindungen während der Polymerbildung aufgebrochen werden. Bei hohen Temperaturen erhöht sich außerdem die Löslichkeit und Reaktionsneigung der Hydride. Äther mit hohem Siedepunkt sind daher dazu am besten geeignetIt has proven suitable to carry out the reduction at an elevated temperature, preferably from above 80 ° C. This seems to be due to the fact that the molecular construction continues at a higher temperature opens, apparently by breaking the hydrogen bonds during polymer formation will. In addition, the solubility and tendency of the hydrides to react increases at high temperatures. Ethers with a high boiling point are therefore best suited for this

Die Reduktion, beispielsweise eine Lithiumaluminiumhydridbehandlung, kann direkt an quervernetztem Agar oder Agarose durchgeführt werden, ohne diese zuerst zu entschwefeln. Dabei dürften teils Sulfatgruppen abgespalten, teils Carboxylgruppen reduziert werden. Man kann gegebenerweise auch quervernetztes Agar oder Agarose behandeln, die vorher von Sulfatgruppen durch alkalische Hydrolyse in reduzierendem Milieu befreit worden sind. In letzterem Falle senkt man die Adsorptionsfähigkeit nur durch die Reduktion der Carboxylgruppen. Wird die Reduktion auf quervernetztem, acetyliertem Agar oder Agarose vollzogen, müssen die restlichen Acetatgruppen durch alkalische Hydrolyse beseitigt werden, geeigneterweise in Gegenwart von Natriumborhydrid. Um ein zufriedenstellendes Resultat zu erzielen, benötigt man einen bedeutenden Überschuß an Reduktionsmitteln; die Menge kann allerdings bei geringem Wassergehalt im ReduktionssystemThe reduction, for example a lithium aluminum hydride treatment, can be carried out directly on cross-linked agar or agarose without desulfurizing it first. Sulphate groups are likely to be part of this split off, some carboxyl groups are reduced. Cross-linked agar can also be used or treat agarose previously removed from sulphate groups by alkaline hydrolysis in a reducing medium have been released. In the latter case, one only lowers the adsorption capacity by reducing the Carboxyl groups. If the reduction is carried out on cross-linked, acetylated agar or agarose, must the remaining acetate groups are eliminated by alkaline hydrolysis, suitably in the presence of Sodium borohydride. A significant excess is required to achieve a satisfactory result of reducing agents; however, the amount can be reduced if the water content in the reduction system is low

bedeutend herabgesetzt werden. Bei einer Quantität LiAlH₄, die größer ist als die halbe Menge trockener Agarsubstanz, erhält man ein Produkt mit sehr niedriger Adsorptionskapazität.
Um die Erfindung deutlicher zu erklären, werden hier einige Ausführungsbeispiele angeführt.can be significantly reduced. If the quantity of LiAlH _{4 is} greater than half the amount of dry agar substance, a product with a very low adsorption capacity is obtained.
In order to explain the invention more clearly, some exemplary embodiments are given here.

Beispiel 17Example 17

300 ml quervernetztes, acetyliertes, 6-prozentiges Agar in Perlenform wurden in einen 500-ml-Rundkolben getan und 250 ml Dioxan hinzugefügt. 10 g LiAlH₄ wurden portionsv/eise bei vorsichtigem Schütteln und kontinuierlicher Stickstoffzufuhr über dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Man erhielt keine oder nur eine sehr schwache Reaktion. Beim Erhöhen der Temperatur auf 45°C jedoch trat eine kräftige Reaktion ein. Das Gemisch wurde vorübergehend abgekühlt und danach auf 60° C erhitzt und bei dieser Temperatur 1 Stunde stehengelassen und danach 2 Stunden bei 80° C. Daraufhin wurde die Reaktion mit Äthylacetat und anschließend durch Wasserzusatz unterbrochen, wonach man das Gemisch abkühlte. Während der Eiskühlung wurde 1 M Salzsäure zugesetzt, bis jeglicher Niederschlag aufgelöst war. Die Perlen wurden rasch in eisgekühlter 0,1 M Salzsäure gewaschen und danach in Wasser.300 ml of cross-linked, acetylated, 6 percent beaded agar was placed in a 500 ml round bottom flask and 250 ml of dioxane was added. 10 g of LiAlH ₄ were added in portions to the reaction mixture with careful shaking and a continuous supply of nitrogen. No or only a very weak reaction was obtained. However, when the temperature was increased to 45 ° C, a vigorous reaction occurred. The mixture was temporarily cooled and then heated to 60 ° C. and left to stand at this temperature for 1 hour and then for 2 hours at 80 ° C. The reaction was then interrupted with ethyl acetate and then by addition of water, after which the mixture was cooled. While cooling with ice, 1 M hydrochloric acid was added until any precipitate was dissolved. The beads were quickly washed in ice-cold 0.1 M hydrochloric acid and then in water.

Danach erfolgte eine Deacetylierung mit 1 M NaOH enthaltend NaBH₄ bei 80°C während 15 Minuten, wonach die Perlen in Wasser gewaschen wurden.This was followed by deacetylation with 1 M NaOH containing NaBH ₄ at 80 ° C. for 15 minutes, after which the beads were washed in water.

Das auf diese Art hergestellte Produkt adsorbierte 0,01 mg Cytochrom C (gerechnet pro mg trockenes Gel) in 0,001 M Ammoniumformiat bei pH 3,8, während das Ausgangsmaterial unter gleichen Bedingungen 0,12 mg Cytochrom C adsorbierte.The product produced in this way adsorbed 0.01 mg of cytochrome C (calculated per mg of dry gel) in 0.001 M ammonium formate at pH 3.8, while the starting material under the same conditions 0.12 mg Cytochrome C adsorbed.

Beispiel 18Example 18

25 ml 2-prozentiges, quervernetztes, entschwefeltes Agar in Perlenform wurden in Wasser gequollen, in 100 ml n-Propanol und danach in 200 ml Dioxan gewaschen. Einer Suspension in 25 ml Dioxan wurden 0,5 g LiAlH₅ zugesetzt. Das Gemisch wurde während 20 Minuten auf 90°C erhitzt, danach auf 0° C gekühlt, worauf die Reaktion mit Äthylacetat und Wasser (Eis) unterbrochen wurde. Man machte das Gemisch durch Zusatz von 1 M HCI auf pH 2 sauer, wusch die Perlen in eisgekühltem 0,1 M HCl und danach in großen Mengen Wasser.25 ml of 2 percent, crosslinked, desulfurized agar in pearl form were swollen in water, washed in 100 ml of n-propanol and then in 200 ml of dioxane. _{0.5 g of LiAlH 5 was} added to a suspension in 25 ml of dioxane. The mixture was heated to 90 ° C for 20 minutes, then cooled to 0 ° C and the reaction was stopped with ethyl acetate and water (ice). The mixture was made acidic to pH 2 by adding 1 M HCl, the beads were washed in ice-cold 0.1 M HCl and then in large amounts of water.

Das so hergestellte Produkt absorbierte 0,013 mg Cytochrom C pro mg trockener Gelsubstanz, was ungefähr 10% der Adsorption des ursprünglichen quervernetzten Agar entsprach.The product thus produced absorbed 0.013 mg of cytochrome C per mg of dry gel substance, which is approximately 10% of the adsorption of the original cross-linked agar corresponded.

Ein wie vorstehend quervernetztes, desulfatiertes und gegebenfalls decarboxyliertes Agar kann als Matrix in unlöslichen Proteinagarderivaten vorteilhaften Dienst tun.A crosslinked, desulfated and optionally decarboxylated agar as above can be used as a matrix in insoluble protein agard derivatives do beneficial service.

Es ist bekannt, daß Proteine chemisch mit unlöslichen Polymeren wie Zellulose, quergebundenem Dextran usw. verbunden werden können und dabei ganz oder teilweise ihre biologisch wichtigen Eigenschaften, ihre enzymatische Aktivität, die Fähigkeit selektiv andere Proteine und andere Substanzen usw. zu binden, beibehalten. Die Voraussetzung hierzu ist, daß die chemische Fixierung unter schonungsvollen Bedingungen vollzogen wird und daß das Polymer gewissen Ansprüchen genügt.It is known that proteins are chemically linked to insoluble polymers such as cellulose, cross-linked dextran etc. can be combined and thereby fully or partially their biologically important properties, their enzymatic activity, the ability to selectively bind other proteins and other substances, and so on. The prerequisite for this is that the chemical fixation is carried out under gentle conditions and that the polymer meets certain requirements.

In der Praxis hat man bereits mit der Anwendung von Protein-Polymer-Derivaten begonnen, und es ist zu erwarten, daß deren Bedeutung in verschiedenem Zusammenhang stark zunimmt. Es sind bereits mit Zellulose verbundene Enzyme oder synthetische Polymere für kommerziellen Gebrauch vorhanden, die zu präparativen oder analytischen, biochemischen Reaktionen, z. B. der Hydrolyse von Estern, dem Abbau von Proteinen zu Peptiden und Aminosäuren, der Oxydation von Kohlehydraten usw. verwendet werden. Man kann antigene Proteine an Polymere fixieren zu Ädsorptionsmitteln für dementsprechende Antikörper. Enzyminhibitoren polypeptider oder proteiner Natur können mit Polymeren verbunden werden zu spezifischen Adsorptionsmitteln für gegen die Inhibitoren gerichtete Enzyme.In practice, the use of protein-polymer derivatives has already begun, and it is closed expect their importance to increase sharply in various contexts. There are already cellulose related enzymes or synthetic polymers available for commercial use leading to preparative or analytical, biochemical reactions, e.g. B. the hydrolysis of esters, the breakdown of proteins Peptides and amino acids, the oxidation of carbohydrates, etc. can be used. You can get antigens Proteins fix to polymers to form adsorbents for the corresponding antibodies. Enzyme inhibitors polypeptide or protein nature can be combined with polymers to form specific adsorbents for enzymes directed against the inhibitors.

Es ist offensichtlich, daß derartige spezifische Adsorptionsmittel sehr effektive Wege eröffnen zur Reinherstellung von medizinisch oder andersartig biologisch wirkungsvoll in der Natur vorkommenden Stoffen, z. B. zur Reinigung von Vaccinen. Alle bisher bekannten Proteinpolymere waren allerdings mit verschiedenen Nachteilen behaftet. Erfindungsgemäß wird dem jedoch abgeholfen, und man bringt ein einwandfreies Produkt zustande, wobei zwei Faktoren wesentlich sind, und zwarIt is evident that such specific adsorbents provide very effective ways of making them pure of medicinally or otherwise biologically effective substances occurring in nature, e.g. B. to Purification of vaccines. All previously known protein polymers, however, had various disadvantages afflicted. According to the invention, however, this is remedied and a flawless product is achieved, two factors are essential, namely

a) Struktur und Eigenschaften der angewendeten polymeren Matrix, unda) Structure and properties of the polymeric matrix used, and

b) Art der Kupplung des Proteins an die Matrix.b) Type of coupling of the protein to the matrix.

Es ist somit äußerst wichtig, daß man ein geeignetes Polymer zum Fixieren des biologisch wirksamen Proteins wählt. Dieses Polymer muß chemisch inert und mechanisch stabil sein. Er soll in Form von Partikeln vorkommen, die sich effektiv und schnell von Proteinen penetrieren lassen. Die Enzym-Proteinkomplexe und andere Biopolymerkomplexe müssen sich im Gel bilden und auflösen können und eine möglichst ideale Pistonströmung gestatten.It is thus extremely important to have a suitable polymer for fixing the biologically active protein chooses. This polymer must be chemically inert and mechanically stable. It should occur in the form of particles, that can be effectively and quickly penetrated by proteins. The enzyme-protein complexes and other biopolymer complexes must be able to form and dissolve in the gel and a piston flow that is as ideal as possible allow.

Aus diesen Forderungen geht deutlich hervor, daß das Polymer hydrophil sein und aus einem makromolekularen Netzwerk sehr offener Art bestehen soll. Das Polymer soll ferner in eine chemisch aktive Form gebracht werden können, die eine chemische Kupplung des Proteins unter schonenden Bedingungen erlaubt.From these requirements it is clear that the polymer must be hydrophilic and from a macromolecular Network should exist in a very open manner. The polymer should also be brought into a chemically active form which allows a chemical coupling of the protein under mild conditions.

Die bisher angewendeten, gelbildenden Polymere haben alle Mängel. Zellulose sowie viele andere synthetische Polymere haben eine unvollständige Permeabilität zur Ausbildung von Protein-Proteinkomplexen. Copolymere zwischen Ethylen und Maleinsäureanhydrid enthalten eine durchaus hohe Konzentration von Carboxylgruppen, wodurch das Polymer stark ionenaustauschende Eigenschaften erhält, die zum Nachteil bei der spezifischen Adsorption sind und auch auf Enzymreaktionen einwirken.The gel-forming polymers used so far all have shortcomings. Cellulose as well as many other synthetic ones Polymers have incomplete permeability for the formation of protein-protein complexes. Copolymers between ethylene and maleic anhydride contain a very high concentration of carboxyl groups, whereby the polymer has strong ion-exchanging properties, which are detrimental to the specific Adsorption are and also act on enzyme reactions.

Agar enthält ebenfalls ionogene Gruppen. Die Agarose, eine der Polysaccharidekomponenten von Agar, hatAgar also contains ionogenic groups. The agarose, one of the polysaccharide components of agar, has

indessen eine niedrigere Konzentration ionogener Gruppen und eignet sich deshalb besser zur Matrix für polymergebundene Proteine. Agar und Agarose bilden mechanisch stabile Gele, auch wenn die Matrix in einer so niedrigen Konzentration vorliegt, daß hochmolekulare Proteine und sogar Viren in das Gel eindringen können. Man kann Proteine mit Agar oder Agarose verbinden, z. B. nach der Bromcyanmethode, wie in Nature 214,1302 (1967) und 215,1491 (1967) beschrieben, oder nach der Oxiranmethode (schwedische Patentanmeldung 8 43/70), ohne daß damit gleichzeitig ionogene Gruppen eingeführt werden. Sowohl Agar als auch Agarose haben indessen einen ernstlichen Nachteil, sie sind nicht ganz unlöslich. Anzunehmen ist, daß der Zusammenhalt im Gel durch Wasserstoffbrücken zwischen den Polymerketten zustande gebracht wird. Diese Brücken lösen sich offenbar spontan und oft selbst auf und bilden sich neu, wodurch ein kontinuierlicher Verlust an Polysaccha-however, a lower concentration of ionic groups and is therefore better suited to the matrix for polymer-bound proteins. Agar and agarose form mechanically stable gels, even if the matrix is in one the concentration is so low that high molecular weight proteins and even viruses penetrate the gel can. One can combine proteins with agar or agarose, e.g. B. by the cyanogen bromide method, as in Nature 214, 1302 (1967) and 215, 1491 (1967), or by the oxirane method (Swedish patent application 8 43/70) without introducing ionogenic groups at the same time. Both agar and agarose however, have a serious disadvantage, they are not entirely insoluble. It can be assumed that the cohesion is brought about in the gel by hydrogen bonds between the polymer chains. Loosen these bridges apparently spontaneously and often on their own and form anew, whereby a continuous loss of polysaccha

ίο riden verursacht wird. In gewissen Milieus, die sich zum Spalten von Proteinkomplexen eignen, die oft mit Wasserstoffverbindungen gebildet werden, kann die Löslichkeit von Agar außerordentlich zunehmen. Bei der Fixierung des Proteins kann die Löslichkeit weiter zunehmen.ίο riden is caused. In certain environments that are suitable for splitting protein complexes, which are often with Hydrogen compounds are formed, the solubility of agar can greatly increase. In the Fixing the protein can increase the solubility further.

Die Reinherstellung einer Substanz oder Substanzklasse, hier mit Sj bezeichnet, aus einem Gemisch der Komponenten Si, 52... S,... S_n geschieht, indem alle Komponenten S* bei denen / φ j ist, entfernt werden. Bildet nur Sj einen Komplex mit einem Protein P, kann man S; im Prinzip isolieren durch eine biospezifische Adsorption mit darauffolgender Desorption. Zu diesem Zweck fixiert man P auf eine Matrix M, wobei sich ein spezifisches Adsorptionsmittel bildet, hier symbolisch MP bezeichnet Bringt man MP zum Kontakt mit der Mischung Si... S_n, bildet sich der unlösliche Komplex oder der Komplex MPSj, der durch Dekantieren oder Waschen auf Filter von den übrigen Komponenten S; befreit werden kann. Die nächste Stufe soll Sj freimachenThe pure production of a substance or substance class, here denoted Sj , from a mixture of the components Si, 52 ... S, ... S _n is done by removing all components S * for which / φ j is. If only Sj forms a complex with a protein P, one can use S; isolate in principle by a biospecific adsorption with subsequent desorption. For this purpose, P is fixed on a matrix M, whereby a specific adsorbent is formed, here symbolically denoted MP . If MP is brought into contact with the mixture Si ... S _n , the insoluble complex or the complex MPSj is formed, which by decanting or washing on filter of the remaining components S; can be released. The next stage is to clear Sj

2020th

SjSj

wobei MP regeniert wird.
Sy ist nicht selten sehr stark an MP gebunden, insbesonders bei hochgradiger Spezifität Die Dissoziation von S, kann daher in dieser Form des spezifischen Reinigungsverfahrens den kj .tischen Moment ausmachen. Sowohl Sj als auch MP sollen ihre Eigenschaften beibehalten. Das Protein fdarf nicht denaturiert werden, weil dann die Adsorptionsfähigkeit verloren geht. Die Dissoziation kann oft mit s. g. chaotropen Ionen geschehen, z. B. Rohdanid und Jodid in hoher Konzentration, beispielsweise 3 M Lösungen. Hierbei lösen sich indessen Agar und Agarose im großen Umfang auf.where MP is regenerated.
Sy is not infrequently very strongly bound to MP , especially with a high degree of specificity. The dissociation of S can therefore make up the kj .tic moment in this form of the specific purification process. Both Sj and MP should retain their properties. The protein must not be denatured, because then the adsorptive capacity is lost. The dissociation can often take place with so-called chaotropic ions, e.g. B. raw danide and iodide in high concentration, for example 3 M solutions. Here, however, agar and agarose dissolve to a large extent.

Erfindungsgemäß kann man allerdings ein Agarprodukt mit unbedeutender Löslichkeit und praktisch ohne ionogene Gruppen herstellen, indem es durch ein spezielles Verfahren gelungen ist, in Agar Quervernetzungen herzustellen. Es hat sich auch erwiesen, daß diese Quervernetzungen kein Hindernis darstellen, wenn es gilt, nach bekannten Methoden eine Fixierung verschiedenartiger Proteine an das quervernetzte Agar vorzunehmen. Somit kann z. B. nach der Bromcyan- oder Oxiranmethode, wie auch auf andere Art, eine derartige Kupplung zustande bringen. Das Protein kann z. B. ein Enzym sein, wobei sich ein »unlösliches Enzym« bildet, das gleichzeitig ein spezifisches Adsorptionsmittel darstellt für alle gegen das Enzym gerichteten Inhibitoren und Antikörper sowie andere mit dem Enzym Komplexe bildende Substanzen. Man kann auch zunächst Agar mit geeigneten organischen Ketten verbinden, an die danach das Protein gekuppelt wird, um sterische Störungen zu verhindern. Weil praktisch alle Proteine P, Antikörper bilden, ist stets ein Komplexpaar PS, zu finden, das prinzipiell den Ansprüchen genügt. Das an das quervernetzte Agar fixierte Protein P kann in einen Proteinkomplex höherer Rangordnung einbezogen sein, z. B. in ein Virus oder Zellpartikel, beispielsweise Rhibosom oder Zellenfragment. Das Protein kann auch zusammengesetzt sein, z. B. ein Glykoprotein.According to the invention, however, an agar product with insignificant solubility and practically without ionogenic groups can be produced by using a special process to produce cross-links in agar. It has also been found that these cross-links do not constitute an obstacle when it comes to fixing various proteins to the cross-linked agar by known methods. Thus, for. B. by the cyanogen bromide or oxirane method, as well as in other ways, bring about such a coupling. The protein can e.g. B. be an enzyme, whereby an "insoluble enzyme" is formed, which at the same time represents a specific adsorbent for all inhibitors and antibodies directed against the enzyme as well as other substances that form complexes with the enzyme. You can also first connect agar with suitable organic chains, to which the protein is then coupled in order to prevent steric disturbances. Because practically all proteins P, form antibodies, a complex pair PS, is always to be found, which in principle meets the requirements. The protein P fixed to the cross-linked agar can be included in a protein complex of higher order, e.g. B. in a virus or cell particle, for example rhibosome or cell fragment. The protein can also be composed, e.g. B. a glycoprotein.

Es gibt keine scharfe Abgrenzung zwischen Proteinen und Polypeptiden. In der vorliegenden Anmeldung wird »Protein« im weitläufigen Sinne gebraucht, diese Definition umfaßt sogar Polypeptide mit hohem Molekulargewicht, z. B. von über 4000.There is no sharp distinction between proteins and polypeptides. In the present application "Protein" used in a broad sense, this definition even includes polypeptides with a high molecular weight, z. B. of over 4000.

Durch die erfindungsgemäße Verwendung des erfindungsgemäß quervernetzten Agars bzw. der Agarose ist es möglich, Proteinagarprodukte herzustellen, dieThe inventive use of the crosslinked agar or agarose according to the invention is it possible to make protein agar products that

1) nicht löslich sind in Wasserlösungen, bei denen Proteine nicht hydrolysiert werden,
2) von Proteinen, Polysacchariden, Viren und anderen hochmolekularen Stoffen penetriert werden können,1) are not soluble in water solutions in which proteins are not hydrolyzed,
2) can be penetrated by proteins, polysaccharides, viruses and other high molecular weight substances,

unter Bildung von reversiblen Molekülkomplexen in Gelen, und
3) mit Wasserstoffbindungen spaltenden Stoffen wie Jodiden, Carbamiden und Guanidin behandelt werden können, ohne daß Agarpolysaccharide mit oder ohne Proteine aus der Gelphase ausgelöst werden.with the formation of reversible molecular complexes in gels, and
3) can be treated with substances that break hydrogen bonds, such as iodides, carbamides and guanidine, without agar polysaccharides with or without proteins being released from the gel phase.

Für die Herstellung der Proteinagarprodukte verwendet man erfindungsgemäß erhältliches Agar bzw. Agarose in Perlenform, die quervernetzt und desulfatiert und eventuell, wie vorstehend beschrieben, decarboxyliert worden ist Derart hergestelltes Proteinagar bildet schnellfiltrierende Betten, bei denen die Adsorption- und Enzymreaktion störende ionogene Gruppen aus dem nativen Agar entfernt sind. Die Permeabilität in Proteinagarpartikel kann man durch die Konzentration des Agar in den mit Wasser gequollenen Partikeln bei der Quervernetzung einstellen.Agar or agarose obtainable according to the invention is used for the production of the protein agar products in bead form which cross-links and desulfates and possibly decarboxylates as described above Protein agar produced in this way forms fast-filtering beds in which the adsorption and Ionogenic groups which interfere with the enzyme reaction have been removed from the native agar. The permeability in protein agar particles can be determined by the concentration of the agar in the particles swollen with water Set cross-linking.

Sollen Ad- und Desorption bei sehr niedriger Salzkonzentration geschehen, ist es besonders wichtig, daß die Agarmatrix keine lonogenen Gruppen enthält. Eine nicht spezifische Ionenaustauschadsorption kann unter derartigen Verhältnissen die ganze biospezifische Fraktionierung gefährden, und die Ausbeute wird gleich Null. Die Unlöslichkeit des Proteinagar ist besonders wichtig, wenn die zu reinigenden Substanzen zur klinischen Verwendung vorgesehen sind, z. B. für die intravenöse Injektion, wenn Immunreaktionen stattfinden können. Ein Verlust an Enzymen, Antigenen, Antikörpern usw. könnte die analytische Anwendung polymerverbundener Proteine gefährden. Mit der vorliegenden Erfindung können alle derartigen Komplikationen vermieden werden.If adsorption and desorption are to take place at a very low salt concentration, it is particularly important that the Agar matrix does not contain any ionogenic groups. Non-specific ion exchange adsorption can occur below such conditions endanger the whole biospecific fractionation, and the yield becomes zero. The insolubility of the protein agar is particularly important when the substances to be purified are used for clinical purposes Use are provided, e.g. B. for intravenous injection when immune reactions can take place. A Loss of enzymes, antigens, antibodies etc. could make the analytical application more polymer-related Endanger proteins. All such complications can be avoided with the present invention.

Um die erfindungsgemäße Verwendung zu illustrieren und eingehender zu erklären, wird sie in Form vonIn order to illustrate the use according to the invention and to explain it in more detail, it is presented in the form of

Ausführungsbeispielen beschrieben.Embodiments described.

, Beispiel 19, Example 19

1 Liter gequollene, quervirnetzte, desulfatierte Agaroseperlen wurden mit 20 gr Bromcyan, in 50 ml Wasser gelöst, versetzt Nach 2 Minuten wurden 2 M NaOH hinzugefügt pH 11 — 11,5. Nach 9 Minuten wusch man das Gel mit zirka 2,5103 M NaHCO₃ bei +4⁰C1 liter of swollen, cross-linked, desulfated agarose beads were mixed with 20 g of cyanogen bromide dissolved in 50 ml of water. After 2 minutes, 2 M NaOH were added, pH 11-11.5. After 9 minutes, the gel was washed with about 2.5103 M NaHCO ₃ at +4 ⁰ C

500 ml einer Lösung aus 10 g Concanacalin A und gegen 0,05 M Natriumacetatpuffer, pH 6,0, dialysiert, wurden dem aktivierten Gel zugesetzt und die Suspension 2 Stunden bei pH 8,0 umgerührt. Man wusch dann das Concanavalinagarosegel nacheinander mit je 21 0,5 M NaHCO3-Puffer, pH 8,0, destilliertem Wasser, 03 M to Natriumformiatpuffer, pH 3,0 und 1 M hinsichtlich NaCl, 0,05 M Natriumacetatpuffer, pH 6,0 mit einem Gehalt von 0,02% NaN₃ und 0,001 M Mg+* und Ca⁺².500 ml of a solution of 10 g of concanacalin A and dialyzed against 0.05 M sodium acetate buffer, pH 6.0, were added to the activated gel and the suspension was stirred at pH 8.0 for 2 hours. The concanavaline agarose gel was then washed in succession with 21 0.5 M NaHCO3 buffer, pH 8.0, distilled water, 03 M sodium formate buffer, pH 3.0 and 1 M with regard to NaCl, 0.05 M sodium acetate buffer, pH 6.0 with a content of 0.02% NaN ₃ and 0.001 M Mg + * and Ca ⁺² .

Danach packte man ein Bett, 6,3 χ 1 cm, aus dem wie oben hergestellten Proteingel, und eine Lösung von Glykogen, 2 mg/ml, wurde mit einer Geschwindigkeit von 5 ml pro Stunde auf das Bett eingeführt. Nach ungefähr 10 Stunden war das Bett in bezug auf Glykogen, gesättigt Man wusch das Bett mit einem Puffer, worauf das Eluat nach und nach ganz von Glykogen befreit war. Durch das Negativwerden der Orcinolreaktion konnte bewiesen werden, daß kein Kohlehydrat aus dem Gel ausgewaschen wurde. Man wusch das Bett in 0,1 M Natriumformiatpuffer, pH 3,0, wobei zirka 35 mg Glykogen aus dem Bett verdrängt wurden.Then you packed a bed, 6.3 χ 1 cm, of the protein gel prepared as above, and a solution of Glycogen, 2 mg / ml, was introduced onto the bed at a rate of 5 ml per hour. To about 10 hours the bed was saturated for glycogen. The bed was washed with a buffer, whereupon the eluate was gradually freed from glycogen. By the orcinol reaction going negative it was possible to prove that no carbohydrate was washed out of the gel. The bed was washed in 0.1M Sodium formate buffer, pH 3.0, displacing about 35 mg of glycogen from the bed.

In diesem Beispiel besteht die Matrix Maus quervernetzter Agarose, das Protein Paus Concanavalin und Sj aus G lykogen. Sj kann auch ein anderes Polyglukan oder ein Glykose enthaltendes Glykoprotein sein.In this example, the matrix M consists of cross-linked agarose, the protein Paus Concanavalin and Sj of glycogen. Sj can also be another polyglucan or a glycose-containing glycoprotein.

Example 20

100 mg mit Bisepoxid quervernetzte, resulfatierte Agarperlen (Trockengewicht, 6% in bezug auf Matrixgehalt) wurden in 4 ml destilliertem Wasser supendiert und mit 4 ml BrCN-Lösung, 25 mg BrCN/ml, 6 Minuten bei pH 11 und Zimmertemperatur aktiviert Man wusch das aktivierte Gel mit kalter 0,1 M Natriumhydrogencarbonatlösung. 100 mg resulphated agar beads cross-linked with bisepoxide (dry weight, 6% in relation to matrix content) were suspended in 4 ml of distilled water and treated with 4 ml of BrCN solution, 25 mg of BrCN / ml, for 6 minutes pH 11 and room temperature activated. The activated gel was washed with cold 0.1 M sodium hydrogen carbonate solution.

30 mg Ribonuclease A wurden in 5 ml 0,1 M Natriumhydrogencarbonatlösung gelöst und 30 Stunden bei + 4⁰C mit dem aktivierten Gel umgesetzt Das Ribonucleaseagargel enthielt 82 mg Protein pro Gramm Gel. Dann prüfte man es gegen verschiedene Ribonucleinsäurepräparate. Die Aktivität lag im Intervall 25—50% des freien Enzyms, ein äußerst zufriedenstellendes Resultat, in bezug auf das hohe Molekulargewicht des Substrates und die Tatsache, daß die Ribonucleinsäure ein lineares Polymer ist, was die Permeabilität erschwert.30 mg of ribonuclease A were dissolved in 5 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate solution and ^{reacted with the activated gel for 30 hours at + 4 °} C. The ribonuclease agar gel contained 82 mg of protein per gram of gel. Then it was tested against various ribonucleic acid preparations. The activity was in the range 25-50% of the free enzyme, an extremely satisfactory result in view of the high molecular weight of the substrate and the fact that the ribonucleic acid is a linear polymer, which makes permeability difficult.

Example 21

35 ml mit Epichlorhydrin quervernetztes, desulfatiertes, perlenförmiges Agar wusch man auf Filter mit Dimethylsulfoxyd und danach mit Wasser. Das Gel wurde mit BrCN aktiviert, auf ähnliche Weise wie in Betspiel 19 und 20. Man löste 50 ml Antilymphocytglobulin (ALG) in 20 ml 0,5 NaHCO₃-Lösung und setzte dies dem aktivierten Gel zu. Die Kupplung wurde im Kühlraum mit einer Dauer von 24 Stunden durchgeführt, wonach man das ALG-Agar mit 0,5 M NaHCO₃,0,01 M NaAc-Puffer, pH 3,9,0,05 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,5 und 0,05 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, sorgfältig trocknete. Alle Pufferlösungen waren 1 M in bezug auf NaCl. Man packte das Gel zu einer Säule.35 ml of desulfated, bead-shaped agar crosslinked with epichlorohydrin was washed on a filter with dimethyl sulfoxide and then with water. The gel was activated with BrCN, in a similar manner as in Betspiel 19 and 20. 50 ml of antilymphocyte globulin (ALG) was dissolved in 20 ml of 0.5 NaHCO ₃ solution and this was added to the activated gel. The coupling was carried out in the cold room for 24 hours, after which the ALG agar was mixed with 0.5 M NaHCO ₃ , 0.01 M NaAc buffer, pH 3.9, 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 8.5 and 0.05 M sodium phosphate buffer, pH 7.5, carefully dried. All buffer solutions were 1 M with respect to NaCl. The gel was packed in a column.

5 ml Zonikat menschlicher Lymphozyten wurden auf die Säule eingeführt. Nach Waschen mit einem Phosphatpuffer, pH 7,5, desorbierte man das absorbierte Material mit 20 ml 1 M NaJ in Phosphatpuffer. Die Lösung wurde konzentriert und analysiert. Aus der Kolonne wurde kein Kohlehydrat ausgelöst. Man untersuchte das desorbierte Material mit dem Cytotoxtest und fand, daß es aus immunaktiven Leukocytfragmenten bestand.5 ml of human lymphocyte zonicate was introduced onto the column. After washing with one Phosphate buffer, pH 7.5, the absorbed material was desorbed with 20 ml of 1 M NaI in phosphate buffer. the Solution was concentrated and analyzed. No carbohydrate was released from the column. One examined the desorbed material with the cytotox test and found that it consists of immunoactive leukocyte fragments duration.

Example 22

8 ml sedimentierte, mit l,3-Dichlorpropanol-2 quervernetzte, desulfatierte und mit LiAlH₄ reduzierte Agarperlen behandelte man mit 10 ml 1 M NaOH mit einem Gehalt von 20 mg NaBH^ und 2 ml 1,3-Butandiol-diglycidyläther unter Schütteln 6 Stunden lang bei Zimmertemperatur. Danach wusch man das Gel mit destilliertem Wasser und 0,2 M Natriumhydrogencarbonatpuffer, pH 9,0.8 ml agar beads sedimented, cross-linked with 1,3-dichloropropanol-2, desulfated and _{reduced with LiAlH 4} were treated with 10 ml 1 M NaOH containing 20 mg NaBH ^ and 2 ml 1,3-butanediol diglycidyl ether with shaking 6 For hours at room temperature. The gel was then washed with distilled water and 0.2 M sodium hydrogen carbonate buffer, pH 9.0.

100 mg Soyabohnetrypsinhibitor (STI), in 10 ml Natriumhydrogencarbonatpuffer, pH 9,0 aufgelöst, wurde dem Gel zugesetzt. Das Gel wurde danach 20 Stunden bei Zimmertemperatur geschüttelt. Dann wusch man das Gel mit Hydrogencarbonatpuffer und danach mit 0,1 M Glycinpuffer, pH 3,0 1 M NaCI enthaltend.100 mg of soybean trypsic inhibitor (STI) dissolved in 10 ml of sodium hydrogen carbonate buffer, pH 9.0 added to the gel. The gel was then shaken at room temperature for 20 hours. Then you washed that Gel with hydrogen carbonate buffer and then with 0.1 M glycine buffer, pH 3.0 containing 1 M NaCl.

Man überführte das Gel in 0,05 M Tris-HCl, pH 7,8 mit einem Gehalt von 0,5 M NaCI und 0,02 M Ca⁺² und packte es in eine Kolonne. Daraufhin ließ man eine Lösung mit 0,2 mg/ml kommerziellem Trypsin das Bett passieren. Das inaktive Material floß ohne Verzug hindurch. 3,5 mg aktives Trypsin wurde vom Gel aufgenommen und konnte mit 0,05 M Glycin-HCl, pH 3,0, mit einem Gehalt von 0,5 M Ca⁺², verdrängt werden.The gel was transferred to 0.05 M Tris-HCl, pH 7.8 with a content of 0.5 M NaCl and 0.02 M Ca ⁺² and packed it in a column. A solution containing 0.2 mg / ml commercial trypsin was then passed through the bed. The inactive material flowed through without delay. 3.5 mg of active trypsin was taken up by the gel and could be displaced with 0.05 M glycine-HCl, pH 3.0, with a content of 0.5 M Ca ^+2.

Das Trypsin absorbierte ins STl-GeI im Molverhältnis 1 :1. Die Quervernetzung des Agargels hat also die Fähigkeit, einen reversiblen Komplex zu bilden, nicht beeinträchtigt.The trypsin absorbed into the STI-Gel in a molar ratio of 1: 1. The cross-linking of the agar gel has the Ability to form a reversible complex is not impaired.

Example 23

Ein Rohextrakt aus bovinem Pancreaspulver (aus Bauchspeicheldrüse von Kühen) wurde auf ein Bett aus STI-GeI gemäß Beispiel 22 eingeführt. Eine Trypsinaktivität war nicht wahrzunehmen, bevor 50 ml ExtraktA crude extract of bovine pancreas powder (from cow pancreas) was made on a bed STI-GeI according to Example 22 introduced. Trypsin activity was not noticeable before 50 ml of the extract

eingeführt wurde. Man wusch das Gel mit Tris-HCl-Puffer gemäß Beispiel 22, und 0,1 M NaAc/HAc-Puffer, pH 4,5, wurden eingeführt, wobei das Chymotrypsin sich verdrängen ließ. Danach senkte man den pH durch Elution mit Glycinpuffer gemäß Beispiel 22. Dabei wurden 3,5 mg reines Trypsin aus der Kolonne verdrängt Die nicht spezifische Adsorption war wesentlich kleiner als bei einem Bett, aus kommerziellem, aber nicht vernetztem, desulfatiertem und reduziertem Agar.was introduced. The gel was washed with Tris-HCl buffer according to Example 22 and 0.1 M NaAc / HAc buffer, pH 4.5, were introduced, whereby the chymotrypsin could be displaced. Then the pH was lowered Elution with glycine buffer according to Example 22. 3.5 mg of pure trypsin were displaced from the column nonspecific adsorption was significantly less than a bed of commercial, but uncrosslinked, desulfated and reduced agar.

Man konnte das Gel unbegrenzte Male ohne sichtbare Verringerung der Adsorptionskapazität anwenden. Eine Auslösung des Trypsininhibitors konnte nicht konstatiert werden.The gel could be used indefinitely with no apparent reduction in adsorptive capacity. A triggering of the trypsin inhibitor could not be established.

Das Bett hatte wie in Beispiel 19—22 ausgezeichnete Strömungseigenschaften.As in Examples 19-22, the bed had excellent flow properties.

ίο Hierzu 1 Blatt Zeichnungenίο For this 1 sheet of drawings

1010

Claims

Patent claims:

1. Process for the production of cross-linked, pearl-shaped agra or agarose derivatives, characterized in that one

a) Agar or agarose particles in the form of homogeneously swollen pearls, which in a manner known per se from a homogeneous water solution in an aqueous slurry

b) with epichlorohydrin, epibromohydrin, bisepoxides, divinyl sulfone, 1,3-dichloropropan-2-ol or 2,3-dichloropropan-1-ol as the respective crosslinking agent, optionally in an organic solvent is resolved

c) at temperatures up to 70 ° C

d) for a reaction time of more than one hour

e) in an alkaline medium with an alkali concentration between 0.2 and 1.0 M.

f) in the absence of oxygen and / or in the presence of strongly reducing substances such as sodium borohydride implements,

g) then the sulfate content of the crosslinked reaction product obtained by alkaline hydrolysis of sulfate ester groups under oxygen-free and / or reducing conditions to such an extent that until the product's ability to absorb basic substances has reached the desired limit has and

h) optionally additionally before or after the sulfate ester hydrolysis, the reaction product by reduction with a strong reducing agent at elevated temperature in whole or in part of carboxyl groups freed.