DD262808A1

DD262808A1 - VESICULAR FUEL KOERPERS FOR CHROMATOGRAPHY FROM DENATURED MICROORGANISMS AND METHOD OF PREPARING THEM

Info

Publication number: DD262808A1
Application number: DD30589887A
Authority: DD
Inventors: Uwe Beyer; Rudolf Ehwald; Kathrin Moeller; Volker Eckert; Barbara Koeppen; Joachim Koenig; Joachim Bauch
Original assignee: Univ Berlin Humboldt
Priority date: 1987-08-11
Filing date: 1987-08-11
Publication date: 1988-12-14
Also published as: DE3821619A1

Abstract

Die Erfindung beinhaltet vesikulaere Fuellkoerper fuer die Chromatographie aus denaturierten Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung. Die Erfindung betrifft Fuellkoerper fuer die Chromatographie, Verfahren zu ihrer Herstellung und vorteilhafte Anwendungen. Die Fuellkoerper bestehen aus granulierten Extraktionsrueckstaenden artifiziell verklebter Mikroorganismen. Sie werden aus Granulaten der Mikroorganismen oder deren Extraktionsrueckstaenden durch besondere Befeuchtungs- und Trocknungsverfahren hergestellt. Die Verfahren fuehren zu formstabilen und druckfesten Fuellkoerpern aus Mikroorganismen, die sich als Einzelzellen schlecht packen und filtrieren lassen, z. B. Hefen und kokkale Gruenalgen. Aus Hefezellen hergestellte Fuellkoerper haben vorteilhafte Eigenschaften insbesondere im Zusammenhang mit der Ausschlusschromatographie und chromatographischen Zentrifugationstechniken.The invention includes vesicular fillers for the chromatography of denatured microorganisms and methods of preparation. The invention relates to Fuellkoerper for chromatography, processes for their preparation and advantageous applications. The Fuellkoerper consist of granulated extraction residues of artificially adhered microorganisms. They are produced from granules of microorganisms or their extraction residues by special moistening and drying processes. The processes lead to dimensionally stable and pressure-resistant Fuellkoerpern of microorganisms that pack bad as single cells and can be filtered, z. Yeasts and coccal green algae. Filling bodies produced from yeast cells have advantageous properties, in particular in connection with exclusion chromatography and chromatographic centrifugation techniques.

Description

Field of application of the invention

Einsatzgebiete der Erfindung sind die chemische Industrie, die pharmazeutische Industrie und die biochemische Forschung. Die Erfindung ist zur chromatographischen Reinigung und Trennung verschiedenster, insbesondere kolloidaler Stoffe geeignet.Fields of application of the invention are the chemical industry, the pharmaceutical industry and biochemical research. The invention is suitable for chromatographic purification and separation of various, especially colloidal substances.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Füllkörper für die Ausschlußchromatographie sind üblicherweise Gelpartikeln oder poröse Feststoffe. Sie nehmen das Elutionsmittel durch Quellung auf. Der Verteilungsraum eines gelösten oder dispergierten Stoffes in der Gelmatrix oder in den Poren hängt von der Größe der Moleküle oder Kolloide ab (Vergl. Determann, H. Gelchromatographie, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York 1967).Fillers for exclusion chromatography are usually gel particles or porous solids. They absorb the eluent by swelling. The distribution space of a dissolved or dispersed substance in the gel matrix or in the pores depends on the size of the molecules or colloids (see Determann, H. Gelchromatography, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York 1967).

Neuerdings werden anstelle von Gelpartikeln auch vesikuläre Trenn-, Füll-und Trägermaterialien (im folgenden kurz als vesikuläre Füllkörper bezeichnet) zur Ausschlußchromatographie eingesetzt. Vesikuläre Füllkörper bestehen im Unterschied zu Gelpartikeln zum größten Teil ihres Volumens aus flüssigkeitsgefüllten Hohlräumen von lichtmikroskopischer Dimension, die von geschlossenen semipermeablen Wänden umgeben sind. Sie können aus Zellen und Geweben höherer und niederer Pflanzen, u.a. auch aus Hefen, hergestellt werden. Die Ausschlußchromatographie mit diesen Füllkörpern beruht nicht auf der Verteilung in einer Gelmatrix sondern auf klassischer Dialyse (Ehwald, R., Fuhr, G., Olbrich, M., Göring, H., Stofftrennung mit Hilfe pflanzlicher ZellwändeHngenieurhochschule Köthen, Wissenschaftliche Beiträge, 1985, S.74—76).Recently, instead of gel particles and vesicular separation, filling and support materials (hereinafter referred to briefly as vesicular filling) used for exclusion chromatography. Vesicular fillers, unlike gel particles, consist for the most part of their volume of liquid-filled cavities of light-microscopic dimension, which are surrounded by closed semipermeable walls. They may consist of cells and tissues of higher and lower plants, i.a. also from yeasts. The exclusion chromatography with these random packings is not based on the distribution in a gel matrix but on classical dialysis (Ehwald, R., Fuhr, G., Olbrich, M., Göring, H., separation of substances with the help of herbal cell walls, the University of Applied Sciences Köthen, Wissenschaftliche Beiträge, 1985, S.74-76).

In der Beschreibung der Erfindung DD WP wird in einem Beispiel auf die Möglichkeit zur Anwendung abgetöteter und extrahierter Hefezellen als vesikuläre Füllkörper eingegangen. Dabei wird festgestellt, daß die aus einzelnen Hefezellen bestehenden bzw. gebildeten Hohlträgerin wäßrigen Lösungen oder Wasser keine für die Säulenchromatographie geeigneten Packungen ermöglichen. Der Filtrationswiderstand der wasserhaltigen Packungen steigt mitzunehmender Verdichtung so stark an, daß auch bei hohen Arbeitsdrucken eine ausreichende Fließgeschwindigkeit des Elutionsmittels nicht erreicht wird. Dies gilt auch für weitere untersuchte Mikroorganismen. Hierdruch wird das Einsatzgebiet der aus den Zellwänden von Hefen und anderen Mikroorganismen gebildeten Füllkörper stark eingeschränkt. Ausschlußchromatographie mit hydrophilen Probebestandteilen und wäßrigen Elutionsmitteln ist mit diesen Füllkörpern praktisch unmöglich. Ihre Anwendung beschränkt sich auf Fälle, bei denen organische Flüssigkeiten mit geringem Wassergehalt als Elutionsmittel eingesetzt werden können. Wegen ihrer hohen Lösungsmittelfestigkeit und ihrer massenhaften Verfügbarkeit sind die Glucanhüllen der Hefezellen andererseits ein besonders interessantes Ausgangsmaterial für die Herstellung vesikulärer Füllkörper. Bisher ist ein aus Hefen oder deren Zellwänden hergestellter Füllkörper mit guten Packungseigenschaften in wäßrigen Elutionsmitteln bzw. ein Verfahren zu seiner Herstellung nicht bekannt.In the description of the invention DD WP, the possibility of using killed and extracted yeast cells as vesicular filling bodies is discussed in one example. It is found that the hollow carriers consisting of individual yeast cells or formed in aqueous solutions or water do not allow packings suitable for column chromatography. The filtration resistance of the water-containing packings increases so much with increasing compression that even at high working pressures a sufficient flow rate of the eluent is not achieved. This also applies to other investigated microorganisms. Hereby, the field of application of the packing formed from the cell walls of yeasts and other microorganisms is severely restricted. Exclusion chromatography with hydrophilic sample components and aqueous eluents is practically impossible with these random packings. Their application is limited to cases where low water organic liquids can be used as eluents. On the other hand, because of their high solvent resistance and their mass availability, the glucan envelopes of the yeast cells are a particularly interesting starting material for the preparation of vesicular fillers. So far, a packing made of yeasts or their cell walls with good packing properties in aqueous eluents or a process for its preparation is not known.

Object of the invention

Das Ziel der Erfindung ist die Entwicklung von Füllkörpern mit vorteilhaften Gebrauchseigenschaften bei der präparativen chromatographischen Reinigung von Biomolekülen, vor allem Makromolekülen.The object of the invention is the development of packings having advantageous performance properties in the preparative chromatographic purification of biomolecules, especially macromolecules.

Explanation of the essence of the invention

Die Aufgabe besteht in der Entwicklung vesikulärer Füllkörper aus Mikroorganismen, vorzugsweise Hefen, die hochpermeable Packungen in Wasser ermöglichen und in der Entwicklung ökonomischer Verfahren zu ihrer Herstellung. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Füllkörper Granulate extrahierter und miteinander irreversibel verklebter Zellwandhüllen oder extrahierter Zellen darstellen. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung dieser Füllkörper besteht darin, daß auf dem Wege der Granulation oder Sprühtrocknung Aggregate aus den Zellen oder deren festen Extraktionsrückständen hergestellt werden, der hydrophile Feststoff der genannten Aggregate bei oder nach ihrer Bildung durch Behandlung mit Wasserdampf oder wasserhaltigen organischen Flüssigkeiten selektiv mit Wasser befeuchtet und verquollen wird, ohne die intra- und interzellulären großen Hohlräume des Aggregats mit Wasser zu sättigen, und daß die entstandenen wasserhaltigen Aggregate anschließend bis zur Gewichtskonstanz getrocknet werden.The object is the development of vesicular fillers from microorganisms, preferably yeasts that allow highly permeable packings in water and in the development of economic processes for their preparation. The object is achieved in that the filler granules extracted and irreversibly glued together cell wall envelopes or extracted cells. The process according to the invention for the preparation of these random packings comprises producing aggregates from the cells or their solid extraction residues by granulation or spray drying, selectively adding the hydrophilic solid of said aggregates to or after their formation by treatment with water vapor or aqueous organic liquids Water is moistened and swollen, without saturating the intra- and intercellular large cavities of the aggregate with water, and that the resulting aqueous aggregates are then dried to constant weight.

Mit der hier dargestellten erfindungsgemäßen Lösung entstehen Füllkörper mit überraschenden und vorteilhaften Eigenschaften, aus denen sich neue, bisher mit Gelpartikeln und vesikulären Füllkörpern aus Zellen höherer Pflanzen nicht realisierbare Anwendungen ergeben. Die erfindungsgemäß aus granulierter Hefe hergestellten Füllkörper sind außerordentlich druckfest. Daher kann das Totvolumen einer Packung durch Zentrifugation vollständig abgeschleudert werden, ohne die Füllkörper zu deformieren und die Packung zu komprimieren. Sie sind im gesamten, für die Reinigung von Biopolymeren in Frage kommenden pH-Bereich (2 bis 10) stabil und unbegrenzt einsetzbar. Die Größe der Füllkörper kann einheitlich gestaltet und im Granulationsprozeß reguliert werden. Die Form ist kugelförmig. Sie enthalten großenteils kapillar gebundene Flüssigkeit im gequollenen Zustand. Dennoch ändern die Füllkörper ihr Volumen kaum, wenn sie aus organischen Flüssigkeiten in Wasser überführt werden oder, umgekehrt, wenn sie aus Wasser in organische Flüssigkeiten überführt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der vesikulären Füllkörper aus Mikroorganismen kann mit einfachen bzw. in der Technik eingeführten Mitteln wie Sprühtrocknern durchgeführt werden. Es besteht in der irreversiblen Verklebung der in einem Granulat von Zellhüllen oder extrahierten Zellen miteinander verbundenen hydrophilen Zellwandpolysaccharide. Wesentlich für das Verfahren ist die Granulation der einzelnen Zellen oder Zellhüllen in Kombination mit einem bestimmten Befeuchtungs- und Trocknungsregime. Es wurde gefunden, daß bei Einhaltung von weiter unten näher erläuterten Bedingungen allein die Verdunstung des Wassers aus den Zellaggregaten eine so feste Verbindung der Einzelzellen oder Zellhüllen bewirkt, daß anschließend die Aggregate allen mit der Säulenchromatographie verbundenen mechanischen Belastungen auch im wassergesättigten Zustand standhalten, ohne auch nur zu einem kleinen Teil in die Einzelkomponenten zu zerfallen. Wichtig ist, daß beim Trocknen der Füllkörper die miteinander verquollenen Zellwände irreversibel verkleben. Sie müssen hierzu aus dem wasserhaltigen Zustand getrocknet werden. Es ist aber gleichzeitig bedeutungsvoll, daß beim Trocknen die großen Hohlräume in und zwischen den Zellen nicht auf Grund von Kohäsionskräften kollabieren. Sie müssen während des Trocknungsvorganges mit einer organischen Flüssigkeit oder mit Dampf gefüllt sein.With the solution according to the invention shown here are formed packing with surprising and advantageous properties, from which arise new, previously unrealizable with gel particles and vesicular fillers from cells of higher plants applications. The fillers produced according to the invention from granulated yeast are extremely pressure-resistant. Therefore, the dead volume of a packing can be completely spun off by centrifugation without deforming the packing and compressing the packing. They are stable in the entire, for the purification of biopolymers in question pH range (2 to 10) and unlimited use. The size of the packing can be uniform and regulated in the granulation process. The shape is spherical. They contain largely capillary fluid in the swollen state. However, the fillers barely change in volume when transferred from organic liquids to water or, conversely, when converted from water to organic liquids. The process according to the invention for the preparation of the vesicular packing from microorganisms can be carried out with simple or in the art introduced means such as spray dryers. It consists in the irreversible bonding of hydrophilic cell wall polysaccharides which are connected to each other in a granule of cell envelopes or extracted cells. Essential for the process is the granulation of the individual cells or cell envelopes in combination with a specific moistening and drying regime. It has been found that in compliance with conditions explained in more detail below, the evaporation of the water from the cell aggregates causes such a strong connection of the individual cells or cell envelopes, that subsequently the aggregates withstand all the mechanical stresses associated with column chromatography in the water-saturated state, without only to a small extent disintegrate into the individual components. It is important that the interspersed cell walls irreversibly stick together when drying the filler. They must be dried for this purpose from the hydrous state. At the same time, however, it is significant that when drying, the large voids in and between the cells do not collapse due to cohesive forces. They must be filled with an organic liquid or with steam during the drying process.

In verschiedener Weise hergestellte Zellhüllen- oder Zellgranulate fallen mit einer gewissen Restfeuchte an. Beim Trocknen aus dem wassergesättigten Zustand schrumpfen die Aggregate stark. Aus wasserfreiem Ethanol oder höheren einwertigen Alkoholen ist vollständige Trocknung ohne Schrumpfen möglich. Die Aggregate zerfallen dann aber in Wasser sehr leicht in die Einzelkomponenten.Cell envelope or cell granules prepared in various ways accumulate with a certain residual moisture content. When dried from the water-saturated state, the aggregates shrink strongly. From anhydrous ethanol or higher monohydric alcohols, complete drying without shrinkage is possible. The aggregates then decompose very easily into the individual components in water.

Irreversible Verklebung der Zellwände ohne Schrumpfen der Granulate erfolgt, wenn das flüssige Wasser vor dem Trocknungsschritt die lichtmikroskopisch sichtbaren Kapillarräume nicht erfüllt sondern nur auf den quellfähigen Feststoff bzw. die Zellwandmatrix beschränkt bleibt und so eine Verquellung der Zellwände ermöglicht, ohne daß es beim Wasserentzug zum Kollabieren der Zellen durch Kohäsionskräfte kommen kann. Eine solche selektive Befeuchtung der Gerüstsubstanz ist z. B. durch Extraktion der Granulate mit einer Mischung aus Ethanol, Isopropanol oder Isobutanol einerseits und Wasser andererseits im Verhältnis 20/1, durch Behandlung der Aggregate mit Wasserdampf bei Atmosphärendruck wenig oberhalb des SiedepunktesIrreversible adhesion of the cell walls without shrinkage of the granules takes place when the liquid water before the drying step does not fulfill the light microscopy visible capillary spaces but only limited to the swellable solid or the cell wall matrix and thus allows swelling of the cell walls without collapsing during dehydration the cells can come through cohesive forces. Such selective moistening of the framework substance is z. B. by extraction of the granules with a mixture of ethanol, isopropanol or isobutanol on the one hand and water on the other hand in the ratio 20/1, by treating the aggregates with steam at atmospheric pressure just above the boiling point

oder mit wasserdampfhaltiger Luft in der Nähe des Taupunktes möglich. Für die Festigkeit der erfindungsgemäßen Füllkörper im Quellmittel Wasser ist außerdem wichtig, daß die Aggregate der miteinander verquollenen Zellhüllen oder Zellen so vollständig getrocknet werden, daß ein irreversibles Verkleben erfolgt. Dies ist beispielsweise möglich durch Trocknung bei 105°Coderim Vakuum bis zur Gewichtskonstanz.or with steam-containing air near the dew point. For the strength of the filler according to the invention in the swelling agent water is also important that the aggregates of the swollen cell envelopes or cells are dried so completely that an irreversible sticking takes place. This is for example possible by drying at 105 ° Coder in vacuum to constant weight.

Für zahlreiche Anwendungen dervesikulären Füllkörper auf dem Gebiet der Chromatographie ist es erforderlich, aus den mit Wasser und organischen Lösungsmitteln extrahierten Zellen die noch vorhandenen unlöslichen Inhaltsstoffe, vor allem die Proteine und Nukleinsäuren, zu entfernen. Hierzu wird wie im Fall der pflanzlichen Gewebeteilchen Trypsin zur Zellzucht, ein aus mehreren hydrolytischen Enzymen bestehendes Pankreaspräparat, oder ein anderes Enzympräparat eingesetzt, wenn die Extraktion der Proteine nicht durch Alkalilauge durchgekühlt werden soll. Überraschend zeigte sich, daß es nicht nur verfahrenstechnisch sondern auch für die Anwendung der erfindungsgemäßen Füllkörper zur ausschlußchromatographischen Gruppentrennung günstig ist, wenn die enzymatische Entfernung des koagulierten Protolisierung der Füllkörper erfolgt. Die nachträglich enzymbehandelten Füllkörper sind durch ein größeres Hohlraumvolumen und Füllkörper sind durch ein größeres Hohlraumvolumen und einen kürzeren Fraktionierungsbereich ausgezeichnet, wenn man sie mit Füllkörpern vergleicht, die aus bereits gereinigten Zellhüllen gebildet wurden.For many applications of the vesicular packing in the field of chromatography, it is necessary to remove from the cells extracted with water and organic solvents the remaining insoluble ingredients, especially the proteins and nucleic acids. For this purpose, as in the case of plant tissue particles, trypsin is used for cell cultivation, a pancreatic preparation consisting of several hydrolytic enzymes, or another enzyme preparation, if the extraction of the proteins is not to be cooled by alkali lye. Surprisingly, it has been shown that it is not only advantageous in terms of process technology but also for the use of the filling bodies according to the invention for exclusion chromatographic group separation if the enzymatic removal of the coagulated protolization of the filling bodies takes place. The later enzyme-treated packing are characterized by a larger void volume and packing are characterized by a larger void volume and a shorter fractionation range when compared to packing formed from already cleaned cell casings.

Erfindungsgemäß kann die Einwirkung des Enzympräparates und die Auswaschung der Hydrolyseprodukte sehr bequem an den bereits geformten und stabilisierten Füllkörpern im Fließbett bzw. in einer Säulenpackung durchgeführt werden. Aufwendige Trennverfahren wie Filtration, Dialyse oder Zentrifugation von Einzelzellmassen werden hierdurch überflüssig und die Hydrolyseprodukte (Aminosäuren und Nukleotide) fallen in hoher Konzentration an.According to the invention, the action of the enzyme preparation and the leaching of the hydrolysis products can be carried out very conveniently on the already shaped and stabilized packings in the fluidized bed or in a column packing. Elaborate separation methods such as filtration, dialysis or centrifugation of single cell masses become superfluous and the hydrolysis products (amino acids and nucleotides) are obtained in high concentration.

Die Erfindung beschränkt sich nicht auf die Verwendung von Hefezellen, obwohl die Hefen wegen ihrer sehr säure- und laugenfesten Zellwände ein besonders vorteilhaftes Ausgangsmaterial darstellen. Beispielsweise können Grünalgen oder deren Zellwandhüllen zu packfähigen Füllkörpern verklebt werden.The invention is not limited to the use of yeast cells, although the yeasts represent a particularly advantageous starting material because of their very acid and alkali-resistant cell walls. For example, green algae or their cell wall envelopes can be glued to packable packings.

embodiments example 1

Käufliche Preßhefe wird in einem Soxhlet-Apparat mit Ethanol und anschließend mit Benzin (Siedetemperatur etwa 80°C) extrahiert. Nach dem Trocknen an der Luft wird das Material mit Aqua dest. suspendiert und 2mal auf der Zentrifuge gewaschen. Das Sediment wird im Fünffachen seines Volumens einer Lösung von KOH (40 g/l) und Na₂S₂O₄ (4g/l) in einer verschlossenen Glasflasche bei 60⁰C 24h lang inkubiert. Die extrahierten Zellhüllen werden durch 5maliges Zentrifugieren mit destilliertem Wasser gewaschen, mit heißem Ethanol und heißem Isobutanoi extrahiert und nochmals 24h lang in der oben beschriebenen Extraktionslösung aus Kalilauge und Natriumdithionit bei 6O⁰C aufgestellt. Nach der zweiten Laugenbehandlung werden die gereinigten Glucanhüllen durch Zentrifugation gewaschen, bis der Überstand neutral ist. Das Pellet wird im 5fachen seines Volumens in Aqua dest. aufgenommen. Die Suspension wird mit der doppelten Menge an reinem Isobutanoi vermischt und kräftig geschüttelt, bis die milchige Dispersion als Emulsion vorliegt. Die Emulsion wird unter ständigem Schütteln in kleinen Portionen in ein großes Volumen kräftig gerührten wasserfreien Isobutanols geschüttelt (maximal 150 ml der Emulsion pro L wasserfreien Isobutanols). Es entsteht ein Niederschlag von annähernd kugelförmigen Aggregaten der Hefeglucanhüllen, der auf einer G3-Fritte abgesaugt wird.Commercially available yeast is extracted in a Soxhlet apparatus with ethanol and then with gasoline (boiling point about 80 ° C). After drying in air, the material is distilled with aqua. suspended and washed twice on the centrifuge. The sediment is incubated at 50 times its volume of a solution of KOH (40 g / l) and Na ₂ S ₂ O ₄ ( ₄ g / l) in a sealed glass bottle at 60 ^° C. for 24 hours. The extracted cell envelopes are washed 5 times by centrifugation with distilled water, extracted with hot ethanol and hot Isobutanoi and again long established in the above-described extraction solution of potassium hydroxide and sodium dithionite at 6O ⁰ C for 24 h. After the second lye treatment, the purified glucan shells are washed by centrifugation until the supernatant is neutral. The pellet is distilled 5 times its volume in aqua. added. The suspension is mixed with twice the amount of pure isobutanoi and shaken vigorously until the milky dispersion is present as an emulsion. The emulsion is shaken with constant shaking in small portions in a large volume vigorously stirred anhydrous isobutanol (maximum 150 ml of the emulsion per L of anhydrous isobutanol). The result is a precipitate of approximately spherical aggregates of Hefeglucanhüllen, which is sucked on a G3 frit.

Die entstandenen noch wasserhaltigen Granulate zerfallen bei der Überführung in Wasser wieder in die Einzelzellen. Nach vollständiger Trocknung bei 105⁰C oder im Vakuum über KOH sind die Aggregate in wäßrigen Lösungen stabil und können zur Chromatographie eingesetzt werden.The resulting still hydrous granules disintegrate when transferred to water back into the individual cells. After complete drying at 105 ⁰ C or in vacuo over KOH, the aggregates are stable in aqueous solutions and can be used for chromatography.

Mit einem feinen Sieb werden sehr kleine Zellaggregate aus dem getrockneten Pulver abgetrennt. Die Größe der zurückgebliebenen als Füllkörper genutzten Granulate beträgt im gequollenen Zustand 25 bis 150/u.m. Eine Packung der so hergestellten Füllkörper enthält in der Volumeneinheit nur noch etwa 2% der Proteinmenge, die im gleichen Volumen der Hefe vor der Extraktionsbehandlung enthalten ist. Die Packung ist hochpermeabel für Wasser und kann ohne Druck in einer Chromatographie-Säule zur Ausschlußchromatographie eingesetzt werden. Niedermolekulare Stoffe wie Zucker und Salze werden bei etwa 9O⁰C des Packungsvolumens, ausgeschlossene Kolloide wie Dextran 60 (Serva) oder Ovalbumin bei etwa 30% des Packungsvolumens eluiert. Die Elutionsvolumina von Dextran 8, Dextran 15 und Dextran 35 (Serva) liegen zwischen diesen Extremen. Ein Teil des Dextran 35 wird ausgeschlossen, ein anderer breit fraktioniert. Eine Trennstrecke von nur 4,5cm ist ausreichend, um die vollständige Entsalzung eines Proteins zu erreichen (Ovalbumin, Ammoniumsulfat, Glassäule mit 1,6cm Durchmesser). Eine vollständige Abtrennung des Ovalbumins von Ammoniumsulfat erfolgt auch bei der Elution mit destilliertem Wasser. Die Säule kann ohne Veränderung der Trennleistung in vielen Wiederholungen benutzt werden.With a fine sieve very small cell aggregates are separated from the dried powder. The size of the remaining used as filler granules is in the swollen state 25 to 150 / um A package of the thus prepared filler contains in the unit volume only about 2% of the protein amount contained in the same volume of yeast before the extraction treatment. The packing is highly permeable to water and can be used without pressure in a chromatography column for exclusion chromatography. Low molecular weight substances such as sugars and salts are eluted at about 9O ⁰ C of the packing volume excluded colloids such as dextran 60 (Serva) or ovalbumin at about 30% of the packing volume. The elution volumes of dextran 8, dextran 15 and dextran 35 (serva) are between these extremes. Part of the dextran 35 is excluded, another fractionally broad. A separation distance of only 4.5 cm is sufficient to achieve the complete desalting of a protein (ovalbumin, ammonium sulfate, glass column with 1.6 cm diameter). Complete separation of the ovalbumin from ammonium sulfate also occurs upon elution with distilled water. The column can be used in many repetitions without changing the separation efficiency.

Example 2

Ein auf dem Wege der Zentrifugation gewonnenes Pellet der Grünalge Chlorella vulgaris wird im Sfachen seines Volumens an 1 mM CaCI₂ suspendiert. Die Suspension wird mit dem 2fachen ihres Volumens an Isobutanoi versetzt und zur Bildung stabiler Aggregate weiterbehandelt wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Aggregate sind stabil und besitzen eine hohe Kationenaustauschkapazität. Sie können ebenfalls zur Entsalzung von Proteinen eingesetzt werden, da Proteine wie Serumalbumine im Totvolumen der Säulenpackung eluiert werden.A pellet of the green alga Chlorella vulgaris obtained by centrifugation is suspended in 1-fold volume of 1 mM CaCl ₂ . The suspension is mixed with 2 times its volume of isobutanoi and further treated to form stable aggregates as described in Example 1. The aggregates are stable and have a high cation exchange capacity. They can also be used to desalt proteins since proteins such as serum albumins are eluted in the dead volume of the column packing.

Example 3

Eine großtechnisch erzeugte sprühgetrocknete Futterhefe (Candida spez.) wird in heißem Isopropanol im Soxhletapparat entfettet. Beim anschließenden Quellen in Wasser zerfallen die Granulate zum Teil in die Einzelzellen. Stabile Füllkörper werden erhalten, wenn die extrahierten kugelförmigen Produkte der Sprühtrocknung mit einer Mischung aus Wasser und Isopropanol oder Wasser und Ethanol mit dem Volumenverhältnis 1 /20 qesättigt werden, danach auf der Fritte scharf abgesaugt und bis zur Gewichskonstanz getrocknet werden. Die verwendeten Granulate von 0,09 bis 0,14mm Durchmesser lassen sich bequem in Chromatographie-Säulen packen. Die hydraulische Permeabilität der Packung für Wasser beträgt etwa 7 χ 10~"^om²Pa~¹s~¹. Das entspricht einer linearen Fließgeschwindigkeit von 0,7 mm s~¹ an einer 10cm langen Packung bei einer Druckdifferenz von 1 m Wassersäule. Auch mit diesem Material kann eine vollständige Abtrennung des Ovalbumins von Ammoniumsulfat an einer Trennstrecke von nur 4,5cm erreicht werden. Im Unterschied zu proteinfreien Füllkörpern wird das ElutionsverhaltenA commercially produced spray-dried feed yeast (Candida spec.) Is degreased in hot isopropanol in Soxhletapparat. During the subsequent swelling in water, the granules partially decompose into the individual cells. Stable fillers are obtained when the extracted spherical spray-drying products are saturated with a mixture of water and isopropanol or water and ethanol at a volume ratio of 1/20, followed by vigorous extraction on the frit and drying to constant weight. The granules from 0.09 to 0.14 mm in diameter can be conveniently packed in chromatography columns. The hydraulic permeability of the pack for water is about 7 χ 10 ~ ^"o m ² Pa ~ ¹ s ~ ^1. This corresponds to a linear flow rate of 0.7 mm s ^-1 at a 10cm long packing at a pressure difference of 1 m water column. Even with this material, a complete separation of the ovalbumin from ammonium sulfate can be achieved at a separation distance of only 4.5 cm, in contrast to protein-free packing, the elution behavior

verschiedener niedermolekularer Stoffe in unterschiedlichem Maße durch Adsorption, Anionenausschluß und Kationenumtausch modifiziert. Das Elutionsvolumen der Zucker liegt, dem hohen Trockensubstanzgehalt der Packung entsprechend, bei etwa 70% des Packungsvolumens. Die Peaks der Dextranpräparate Dextran 4,8 und 15 (Serva) liegen aufeinanderfolgend zwischen der Trennschwelle und dem Totvolumen. Im Totvolumen (etwa 30% des Packungsvolumens) werden die Extrane 35 (Serva), T20 (Pharmacia) und T250 (Pharmacia) ebenso wie Ovalbumin oder Hämoglobin eluiert. Mit den proteinreichen vesikulärenFüllkörpem aus Hefe können die Adsorptionseffekte des Hefeproteins für die Säulenchromatographie in Wasser genutzt werden (vergl. DD WP Beispiel 7).various low molecular weight substances modified to varying degrees by adsorption, anion exclusion and cation exchange. The elution volume of the sugars, corresponding to the high dry matter content of the pack, is about 70% of the pack volume. The peaks of dextran preparations 4,8 and 15 (Serva) are in sequence between the separation threshold and the dead volume. In the dead volume (about 30% of the packed volume) the Extranes 35 (Serva), T20 (Pharmacia) and T250 (Pharmacia) are eluted as well as ovalbumin or hemoglobin. With the high-protein yeast vesicular fillers, the adsorption effects of the yeast protein can be used for column chromatography in water (see DD WP Example 7).

Example 4

Die vesikulären Füllkörper werden zunächst wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Danach werden sie in einer Lösung gequollen, die Natriumazid (0,1 %), Trypsin zur Zellzucht der Firma B. Beiger Klein Machnow, DDR (0,5%) und 0,1 M Phosphatpuffer pH 7 enthält. Nach einer Einwirkungszeit von 4 Tagen werden die Füllkörper auf einer Nutsche mit Baumwolltuch als Filter gepackt, mit Filterpapier abgedeckt und mit 0,2% NaHCO₃ überschichtet. Aus der Packung werden die Proteolyseprodukte anschließend mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von etwa 3 mm min"¹ eluiert. Auf diese Weise kann der größte Teil dieser Stoffe im Anderthalbfachen des Packungsvolumens ausgewaschen werden. Nachdem 2 Packungsvolumina an Bicarbonat-Lösung durch die Packung gelaufen sind, wird mit Aqua dest. (2 Packungsvolumina) und 94% Ethanol (2 Packungsvolumina) nachgewaschen. Die Füllkörper w'erden scharf abgesaugt und vollständig getrocknet. Sie unterscheiden sich von den proteinreichen Füllkörpern (Beispiel 3) durch ein wesentlich geringeres Puffer- und Adsorptionsvermögen, einen geringeren Trockensubstanzgehalt der Packung, einen größeren Spielraum zwischen der Trennschwelle und dem Totvolumen der Packung und durch die Fähigkeit zu einer ausschlußchromatographischen Gruppentrennung mit scharfem Übergang zwischen den permeationsfähigen und nicht permeationsfähigen Stoffen. An den enzymatisch gereinigten Füllkörpern wird Dextran 15 der Firma Serva scharf in eine ausgeschlossene Hauptfraktion und eine permeationsfähige Nebenfraktionen aufgespalten.The vesicular fillers are first prepared as described in Example 3. Thereafter, they are swollen in a solution containing sodium azide (0.1%), trypsin for cell culture from B. Beiger Klein Machnow, DDR (0.5%) and 0.1 M phosphate buffer pH 7. After a contact time of 4 days, the fillers are packed on a suction filter with cotton cloth as a filter, covered with filter paper and covered with 0.2% NaHCO ₃ . From the packing, the proteolysis products are then eluted at a linear flow rate of about 3 mm min ^-1 , so that most of these substances can be washed out in one and a half times the volume of the package washed with distilled water (2 pack volumes) and 94% ethanol (2 pack volumes) .The packings are thoroughly filtered off with suction and dried completely, and they differ from the protein-rich packings (Example 3) in that they have a significantly lower buffering and adsorption capacity The reduced dry matter content of the packing, a greater margin between the separation threshold and the dead volume of the packing and the ability to exclude chromatographic group separation with a sharp transition between the permeationable and non-permeable substances 15 of the company Serva sharply split into an excluded main fraction and a permeable secondary fractions.

Table 1

Pufferkapazität, Trockensubstanzbehalt und Trennschwelle von proteinreichen Füllkörpern (hergestellt entsprechend Beispiel 3) und deproteinisierten Füllkörpern (hergestellt entsprechend Beispiel 4)Buffer capacity, dry substance retention and separation threshold of protein-rich packing (prepared according to Example 3) and deproteinized packing (prepared according to Example 4)

HerstellungnachHerstellungnach Beispiel 3Example 3 Beispiel 4Example 4 Pufferung zwischen pH 4 und pH 5Buffering between pH 4 and pH 5 5252 9,59.5 (juval/ml Packungsvolumen)(juval / ml pack volume) Trockenmassedry matter 210210 7474 (mg/ml Packungsvolumen)(mg / ml pack volume) Trennschwelleseparation threshold ca. 70about 70 ca. 90about 90 (% des Packungsvolumens)(% of the package volume)

Example 5

Die Füllkörper werden präpariert wie in Beispiel 4 beschrieben und mit 0,01 M Phosphatpuffer pH 7 gesättigt. Danach werden sie in einem Rohr für die Zentrifugationschromatographie (Determann, H., Gelchromatographie, S. 61, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1967) gepackt. Das verwendete 2,3cm starke Rohr wird in der Mitte durch ein eingeklebtes Filtertuch aus Polyamidseide in den oberen Raum für die Packung und den unteren Raum für das abgeschleuderte Elutionsmittel geteilt. Das Packungsvolumen beträgt 15ml. Das Rohr mit der gequollenen Packung wird in einem passenden Zentrifugenglas 15 min lang bei 180g zentrifugiert. Überraschend ist die mechanische Stabilität des Materials. Obwohl 25% des Elutionsmittels abgeschleudert wurden, ist keine nennenswerte Verkürzung der Packung festzustellen. Auf die zentrifugierte Packung werden 2,5ml einer Probe aufgetragen, die einen hochmolekularen und einen niedermolekularen Stoff enthält, z. B. Blue Dextran und Maltose oder Serumalbumin und Ammoniumsulfat. Die Säule wird ein zweites Mal bei 1000 U/min 15 min lang zentrifugiert. Dabei werden 2,5 ml Flüssigkeit abgeschleudert. Diese Flüssigkeit enthält den hochmolekularen Stoff in einer Ausbeute von über 95% in der ursprünglichen Konzentration. Der niedermolekulare Stoff bleibt zu etwa 90% in der Packung (die Konzentration der genannten Stoffe in der Probe beträgt 2%). Die überraschende Festigkeit der neuen Füllkörper gegen deformierende Kräfte und der geringe Unterschied ihrer Dichte zu der des Mediums ermöglicht ein nahezu vollständiges und selektives Abtrennen der im Totvolumen der Packung vorliegenden Flüssigkeit durch Zenfrifugation. Durch Kombination der Vorteile der Zentrifugationstechnik (Vermeidung der Verdünnung) und der Vorteile des vesikulären Aufbaus der Füllkörper (hohe Diffusionsgeschwindigkeit und Kürze des Fraktionierungsbereiches) entstehen neue vorteilhafte Anwendungsmöglichkeiten für die Zentrifugationstechnik bei der Gruppentrennung von Kolloiden. Mit der hier dargestellten Technik lassen sich Makromoleküle oder kolloide Teilchen zeitsparend, ohne Verdünnung und ohne nennenswerte Verluste von gelösten Bestandteilen der Mischprobe bis zu einer Teilchengröße von 4'mm (Stokescher Durchmesser), bei Proteinen bis zu einer Molmasse von etwa 25 kD abtrennen.The fillers are prepared as described in Example 4 and saturated with 0.01 M phosphate buffer pH 7. Thereafter, they are packed in a tube for centrifugation chromatography (Determann, H., Gel Chromatography, p. 61, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1967). The used 2.3 cm thick tube is divided in the middle by a glued polyamide silk filter cloth in the upper space for the pack and the lower space for the centrifuged eluent. The package volume is 15ml. The tube with the swollen packing is centrifuged in a suitable centrifuge tube for 15 minutes at 180g. The mechanical stability of the material is surprising. Although 25% of the eluant was spun off, no appreciable shortening of the packing is noted. On the centrifuged packing 2.5 ml of a sample containing a high molecular weight and a low molecular weight substance, for. B. Blue Dextran and maltose or serum albumin and ammonium sulfate. The column is centrifuged a second time at 1000 rpm for 15 minutes. In this case, 2.5 ml of liquid are spun off. This liquid contains the high molecular weight substance in a yield of more than 95% in the original concentration. The low-molecular-weight substance remains about 90% in the pack (the concentration of these substances in the sample is 2%). The surprising strength of the new packing against deforming forces and the small difference in their density from that of the medium allows a nearly complete and selective separation of the liquid present in the dead volume of the packing by means of Zen centrifugation. By combining the advantages of the centrifugation technique (avoiding dilution) and the advantages of the vesicular structure of the packing (high diffusion rate and brevity of the fractionation region), new advantageous applications for the centrifugation technique in the group separation of colloids arise. With the technique presented here, macromolecules or colloidal particles can be separated in a time-saving manner, without dilution and without appreciable losses of dissolved constituents of the mixed sample up to a particle size of 4'mm (stokescher diameter), with proteins up to a molecular weight of about 25 kD.

Claims

1. vesicular packing for the chromatography of denatured microorganisms, characterized in that the granules of extracted and artificially bonded cells or cell wall envelopes represent.

2. Vesicular packing according to claim 1, characterized in that they consist of extracted yeast cells or their cell wall shells.

3. vesicular packing according to claim 1, characterized in that they consist of extracted green algae or their cell wall shells.

4. A process for the preparation of vesicular fillers for the chromatography of denatured microorganisms, characterized in that produced by granulation aggregates of microorganisms or their solid extraction residues are moistened during or after their formation with water below the water saturation value, the large capillary spaces within and between the cells are filled with a gas or organic liquid, and the water-containing aggregates are then dried to constant weight.

5. The method according to claim 4, characterized in that the aggregates are saturated with a water-containing organic liquid which evaporates faster than water during drying, and then dried to constant weight, depending on the cavity and solids content of the aggregates and the nature of the organic Liquid is set an initial water content of the organic liquid, which is below, which causes the cohesion-induced shrinkage of the cellular cavities when drying, but is sufficient to allow swelling of adjacent cell walls before drying and thus a stable bonding.

6. The method according to claim 5, characterized in that are used as the water-containing organic liquid, ethanol, isopropanol or isobutanol having a water content of 4 to 6% and as microorganisms yeasts or chlorella.

7. The method according to claim 4, characterized in that the aggregates are moistened with steam or a mixture of water vapor and other gases and then dried, depending on the void and solids content of the aggregates, an initial water content of the aggregates is set below which causes the cohesion-related shrinkage of the cavities during drying, but is sufficient to allow swelling of adjacent cell walls before drying and thus a stable bonding.

8. The method according to claim 4, characterized in that produced by spray drying. Aggregates are used.

9. The method according to claim 4, characterized in that units are used, which are formed by dehydration of droplets of an aqueous suspension of extracted cells or cell wall shells in an organic phase.

10. The method according to claim 4, characterized in that the aggregates are dried in air above the boiling point of water. *

11. The method according to claim 4, characterized in that following the drying of the aggregates, a treatment of the aggregates with a preparation of hydrolytic enzymes containing permeable proteases and nucleases with molecular weights below 28kD, and an extraction of solubiliserter Protoplasmareste with aqueous solutions, preferably in a column packing is performed.