DE2061008A1

DE2061008A1 - Proteinseparation

Info

Publication number: DE2061008A1
Application number: DE19702061008
Authority: DE
Inventors: Linda Fryklund; Prof Porath Jerker Olof
Original assignee: Exploaterings TBF AB
Current assignee: Exploaterings TBF AB
Priority date: 1969-12-22
Filing date: 1970-12-11
Publication date: 1971-06-24
Also published as: DK135915C; JPS5141839B1; DK135915B; SE357622B; FR2074098A5; DE2061008B2; NL7018596A; GB1318570A; SU392627A3

Description

' ' ^!"^ιη!1Ι'^!Ι: ^! τ¹¹«

PATENTANWÄLTE

Dip!.-1.'·.;;. htpäitttJER DipL-Chem. Dr. hüFF' DipUng. J. BElER

T₁B₁F₁₁₁ ⁷ Stuttgart-l, Neckarstraße 50

Uppsala, Schweden

Proteinseparation

Gleichzeitig mit grossen Portschritten auf dem Gebiet der Chromatographie von Aminosäuren und anderen niedermolekularen Substanzen sind bedeutende Schwierigkeiten entstanden, bei Versuchen eine chromatographische Fraktionierung von Proteinen zu entwickeln. Proteinchromatographie auf Ionenaustauschern ist ein technisch einfaches, theoretisch jedoch kompliziertes Verfahren. Es gibt keine quantitative Theorie für die Durchführung von praktischen Versuchen, sondern nur empirische Erfahrungen,qualitative Ueberlegungen und das Erraten des Verlaufes möglicher Ionenreaktionen in Ionenaustauscherbetten.

Adsorption und desorption werden bedingt durch das komplizierte Zusammenspiel von konkurrierenden Ionenreaktionen, unter Teilnahme von Ionenaustauschern, Proteinen, Pufferionen und anderen niedermolekularen Ionen. Die Ladungsdichte im Ionenaustauscher wowie die Ladungsverhältnisse auf der Oberfläche der Proteinmolekiile sind von ausschlaggebendem Einfluss auf den Adsorptions-Desorptionsprozess. Ueblicherweise bindet man die Proteine an den Ionenaustauscher mittels mehrerer Punktkontakte. Die unterschiedliche Bindungsstärke der einzelnen Ionengruppierungen führt zu einer breiten Verteilung der Energie, die die Proteinmolekule an den Ionenaustauscher bindet. Die Proteine werden dadurch einseitig zwischen der Ionenaustauscherphase und der diese umgebenden Lösung verteilt und werden somit entweder quantitativ oder aber gar nicht adsorbiert.

Um den Trennungseffekt bei der Ionenaustauscherchromatographie zu erhöhen, wo die Verteilungskoeffizienten für die Proteinkomponenten

109826/1556

2061

entweder Unendlich oder Null sind, greift man zur s.g. Gradientelution. Dabei wird die Zusammensetzung des eingehenden Elutionsmittels kontinuierlich verändert. Die Berechnung der Form und Lage des abgehenden Gradients erschwert, wenn man sich dazu der bisher angewandten Ionenaustauscher bedient, da der Gradient beim Passieren durch das Bett (sukzessiv) sein Aussehen verändert.

In Betten aus granulierten, nicht geladenen Gelen wandern Proteine und niedermolekulare Substanzen als diskrete, oft wohlgetrennte Zonen. Die Trennung basiert sich auf eine selektive Ausschliessung und spiegelt die Unterschiedlichkeit in molekularer Grosse und Form ab. Die Fraktionierung ist bedingt durch eine differenzierte Permeabilität und nicht durch Affinität.

In gewissen Fällen werden stark basische Proteine auf kommerziell zugänglichen Gelen mehr retardiert als es dem Molekülsiebungseffekt entspricht. Beispielsweise adsorbiert Lysozym auf Sephadex bei geringer Ionenstärke. Hier kann angenommen werden, dass die Adsorption wahrscheinlich durch Auftreten von verstreut distribuierten Carboxylgruppen in der Gelmatrix bedingt wird.

Mit diesem Ausgangspunkt befasst sich die Erfindung mit der Herstellung besserer Adsorptionsmittel für die Proteinchromatographie als der derzeit zugänglichen. Hierzu muss die Matrix hydrophil sein und schwache Adsorptionszentra in relativ hoher Dichte enthalten, in der Grössenordnung 100-1000 /uekv/g. Die Adsorption müsste auf einer Ionen-Dipol-Wechselwirkung gegründet sein, wobei die auf der Gelmatrix fixierten Dipole des Typs dipolare Ionen (Ampho-Ionen) sein können.

Das Prinzip für Dipol-Ionenchromatographie ist also wie folgt:

a) Matrize -B⁺ -A" + b⁺ -Lösung i=^. Matrize -B⁺ -ΑΓ... .b⁺-Lösung oder

b) Matrize -B⁺ -A" + a" -Lösung Matrize -B⁺ -A7....a~-Lösung wobei B⁺, b⁺ und A", a~ positiv resp. negativ geladenen Substituenten entsprechen.

109826/1556

20610Ö8 3

Es ist von besonderem Interesse, dass die Feldpotentiale (ψ} bei Dipolen schneller abnimmt als bei Punktladungen· Bei einem isolierten Dipol bzw* einer einfachen Ladung gilt bekanntlich

1) Dipoly a-AJL-fifttt-Ja

D. ffCr*i cos ö)

2) Ion Ψ *

wobei q ein positiv oder negativ geladenes Ion ist, r den Abstand vom positiven Pol des Dipols (oder vom Ion im Beispiel 2) zum be* obachteten Feldpunkt bezeichnet, 1 ist die Dipoldistanz (Abstand zwischen den beiden Ladungen des Dipols), @ der Winkel zwischen der Dipolachse und der Verbindungslinie zwischen dem positiven Pol und dem Feldpunkt und D die Dielektrizitätskonstante der Lösung.

Ein Vorteil der Dipol-Ionenaustausch-Chromatographie ist ferner, dass man die eingeführte Ladungsabschirmung (^f) durch Kontrollie.-ren der Dipoldistanz 1 sehr genau einstellen kann. Dies geschieht, indem man eine Brücke aus z.B. Methylengruppen zwischen die Ladungen schiebt. Es ist anzunehmen, dass der amphotere Charakter des Adsorptionsmittels bei der Chromatographie von sowohl Ampholyten als auch gewöhnlichen Salzen zu interessanten Konsequenzen führt.

Als Adsorptionsmittel sind amphotere Ionenaustauscher wohlbekannt. Sie werden hergestellt durch Verdampfung von Minen und Phenolen, aus Polystyrol durch Einführung von Sulfonat- und quartären Amingruppen und durch Einpolymerisation von Polykationen oder Polyanionen in Kationen- bzw. Anionenaustausehern (z.B. kommerzielles Ratardion). Die amphoteren Ionenaustauscher verwendet man als Adsorptionsmittel für Elektrolyten.

Aminosäuren, die an stark hydroxylhaltige Polymeren, z.B. Agar, Sephadex und Cellulose gebunden sind, ergeben Produkte, die sich für Proteinchromätographie eignen. Wesentlich ist dabei, dass die Matrix hydrophil ist, d.h. dass sie benetzt wird, vorzugsweise in Wasser geschwellt werden kann und dass Proteine in das polymere

109826M556

■■: ": i ξ- \ η ^r y ■■ ■ .

Gel eindringen können, was bei den bisherigen, zur Chromatographie benutzten amphoteren Ionenaustauschern nicht der Fall ist. Ionenaustauscher, die sich für Proteinchromatographie eignen, sind bisher hergestellt worden, indem man saure oder basiche Gruppen in Cellulose, Sephadex, u.a. eingeführt hat. "Aminosäureionenaustauscher^ die auf der Basis von Polysacchariden (Agarose, Sephadex, Cellulose) hergestellt werden, sind für Proteinchromatographie geeignete amphotere Ionenaustauscher. Man erhält Adsorptionsmittel für Proteine, in denen sich Ionengleichgewichte schnell einstellen. Der Dipolcharakter der adsorptionsaktiven Gruppen verleiht den Ad- | sorptionsmitteln neue wertvolle Eigenschaften zur Trennung der verschiedenartigen Proteine und anderer Polyelektrolyte.

Aminosäuren können nach verschiedenen Methoden an hydrophile Polymere gebunden werden. Ein Verfahren besteht z.B. darin, dass man cyanbromidaktiviertes Polymer anwendet, wobei sich u.a. Iminokohlensäureester bilden, beispielsweise;

V-OH Y-O^

I + BrCN £ I ^C=NH + HBr

Ä-°^H "

;=NH + H₂N-( CH₂ )_n-COOH-

V-O.

^C=N-CCH₂)_n-C00H + HN

Die amphoteren Eigenschaften der Aminosäuren bleiben folglich auch nach dieser Reaktion erhalten. Derartige Derivate aus Aminosäuren und hydrophilen Gelen können sich wie bewiesen zu Proteinadsorbenten eignen.

Andere Methoden für die Herstellung dipolarer Adsorpenten sind denkbar. Man kann beispielsweise Vinylacetat und Vinylpyridin

109826/1656

™ F" "Π l % ¹T" it Ff f "nil .., ,, .. „ .,,., ,

mit Divinylsulfon oder Divinylbenzol als querbindende Substanz copolymerisieren, danach durch Hydrolyse die Acetylgruppen entfernen und das Polymer mit Halogencarbonsäure umsetzen. Beispiel;

η CH₂=CH-O-CO-CH₃ + m CH₂=CH-^ ^X N + ρ CH₂=CH-^vS-CH=CH₂

-CH₀-CH-CH₀-CH-^/ ^NN NaOH
I ² ί W .—Η
OCOCH. CH_O-CH-CH_O-CT

OCOCH^

CH₂-CH-CH₂-Ch/ N Cl(CH₂)_nC00H

CH-CH₂-Ch/ N

AtT I - -

^ΌΆ CHCHC

CH
OH

-CH₀-CH-CH₀-CH-// ^NV"~ (CH₀) ~COO*H

^0H CH₂-CH-CH_2n

OH ί

Man kann auch Aminoäthylcellulose z.B. mit Halogencarbonsäuren im üeberschuss alkylieren, so dass eine vollständige Alkylierung eintritt. Beispiel:

R-O-CH₂-CH₂-NH₂ + Cl-CH₂SO₃Na > RO-CH₂-CH₂-NH₂-CH₂SO^NaCl

wobei R Cellulose oder ein anderes hydroxylhaltiges Polymer ist.

Diese amphoteren Ionenaustauscher haben den an sie gestellten An-■ forderungen vollkommen genügt. Für Versuche wurde Cobragift (Naja \ nigricollis) als Testmaterial genommen, teils Rattengift, teils t (rohe) Giftproteine, d.h. Gift, das von niedermolekularen Substanf zen durch Gelfiltration auf Sephadex G25 befreit worden war.

V 109826/1556

Das Gift enthält eine grosse Menge einfacher Proteine im Molekulargewichtsbereich von 6000-20 000, der überwiegende Teil ist stark basisch.

Die guten Resultate, die man erhält, wenn die Erfindung zur Anwendung kommt, gehen deutlich aus den nachstehenden Ausführungsbeispielen und Zeichnungen hervor und zeigen auf Fig. 1 die Adsorption bei 280 nm als Funktion von Elutionsvolumen, Fig. 2 die Konduktivitätskurve bei der Eluierung mit verschiedenen Puffern, und Fig. 3 und h die Adsorption bei 600 nm nach Reaktion mit Nin-P hydrin als Funktion vom Elutionsvolumen.

Beispiel 1.

Ein Bett, 58,5 x 1 cm, aus quergebundenem Dextran-gel (Sephadex 75) nach der Bromcyanmethode mit fi-Alanin verbunden (annähernd 750 Mikroäquivalente $-Alanin pro Gramm trockener Gelsubstanz) wurde zubereitet in 0,12 molar Ammoniumacetat und mit Essigsäure auf pH 6,0 justiert.100 mg Cobragift (Naja nicricollis toxin) in 1 ml Puffer wurde über das Bett geschichtet und durch Öffnen des unter dem Bette angebrachten Hahns in das GaI eingesaugt. Danach wurde auf dieselbe Weise die oben angegebene Acetatlösung zugeführt, wobei eine chromatographische Trennung zustandekam. Bei Durchlei-P tung von l>+0 ml genannter Salzlösung erhöhte sich die Salzkonzentration im Eluat kontinuierlich. Eine Analyse des Eluats zeigte 6 getrennte Komponenten (Fig. 1).

Beispiel 2.

Ein Bett, 52,8 χ 1 cm, aus an Cellulose gebundenem j9-Alanin (30° Mikroäquivalente ß-Alanin pro Gramm Konjugat) in 0,05 M Ammoniumacetat wurde hergestellt. ^O mg des gleichen Cobragiftes wie in Beispiel 1 in 1 ml Acetatpuffer wurde in das Bett eingesogen und die Säule mit 121 ml 0,05 M Acetatlösung gewaschen. Danach wurde mit 0,2 M Ammoniumacetatpuffer des gleichen pH-Wertes eluiert. Mit einem 0,05 M Puffer erhielt man 5 getrennte Komponenten; das Restmaterial (anderer Zusammensetzung) wurde von der Ö-Alanin-Cellulose durch Puffer höherer Konzentration verdrängt.

109826/1556

Beispiel λ. -

1 ml eines Wasserextraktes aus Rapssamen wurde auf einer Säule aus -Alanin-Sephadex G75 in 0,1 H Ammoniumacetat, pH-Wert 6,0 chromatographiert. (Säulenabmessung 60 χ 1 cm) Drei gut getrennte Komponenten wurden erhalten.

Beispiel h.

2 ml dialysiertes Humanserum wurden auf ein Bett von 56,5 x 1 cm Agaroseperlen (Gehalt 6% Agarose, 9h% Wasser) appliziert, an die nach der Bromcyanmethode 2^8 Mikroäquivalente Arginin gebunden waren. Das Bett war vorher mit Tris-hydroxymethylmethan -HCl-Puffer pH-Wert 8,6 (TrIs-HCl) 0,02 M in Tris äquilibriert. Bei der Elution mit diesem Puffer erhielt man zwei Komponenten. Bei doppelter Salzkonzentration erhielt man eine weitere Komponente, die Serumalbumin war. Ausserdem erhielt man noch einiges Protein beim Eluieren mit 0,5 M Tris-HCl pH 8,0.

Beispiel 5.

Um festzustellen, wie schnell sich Salzgleichgewichte in den dipolaren Adsorbenten des in der Erfindung beschriebenen Typs einstellen, wurde u.a. folgendes Experiment durchgeführt-

Durch die Säule von Versuch h wurden nacheinander l*+8 ml 0,03 M Tris-HCl, l60 ml 0,1 M Tris-HCl und schliesslich wiederum 100 ml 0,03 M Tris-HCl gepumpt. Sämtliche Pufferlösungen waren auf pH 8 eingestellt. 3_}3 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die Konduktivität jeder Fraktion wurde gemessen (Fig. 2). Konduktivitätssprünge ergaben sich innerhalb ungefähr 20 Milliliter.

Beispiel 6.

Auf einem Bett aus Glysincellulose, wobei Glysin mit Hilfe von Epichlorhydrin gebunden war (200 Mikroäqu./g), mit den Abmessungen Mt,5 x 1,0 cm wurde eine Mischung von Oligolysinen (L₁-L₁₀) chromatographiert. 1,0 mg Substanz in 1 ml Puffer (0,02 M Pyridin, 0,02 M Essigsäure, pH 5,0) wurden appliziert und mit einem Gradient (Autograd) aus diesem Puffer und 0,15 M Pyridin, 0,15 M Essigsäure,

1G9826/1556

pH 5,0 eluiert. Das Eluat wurde mit Ninhydrin analysiert. Das Resultat ist in Fig. 3 zu sehen, die Bezeichnungen L-,, L₂, L-. usw. in der Kurve bedeuten Lysin, Dilysin, Trilysin, usw.

Beispiel 7.

Das selbe Glycincellulosebett wie in Beispiel 6 wurde angewandt. 2,0 mg einer Mischung von Oligolysin-Polymeren (Liq'^^o^ ⁱⁿ ^ ^ml Puffer (0,05 M Pyridin, 0,033 M Essigsäure, pH 5,28) wurde appliziert und mit einem Gradient aus diesem Puffer und 0,2 M Pyridin, 0,133 M Essigsäure, pH 5,30 eluiert. Das Ergebnis findet man in Fig. k.

Aus der Anwendung der in der Erfindung beschriebenen amphoteren Ionenaustauscher - gezeigt an der Trennung der Proteine im Naja nigricollis-Toxin - gehen deutlich deren wertvolle chromatographische Eigenschaften hervor:

1. Unempfindlichkeit für massige pH-Verschiebungen (einige Zehntel pH-Einheiten) zusammen mit grosser Empfindlichkeit für Ionenkonzentrationen (die leicht kontrollierbar sind). Dadurch kann man mit flachen Pufferkonzentrationsgradienten bei konstantem pH eine sehr grosse Auflösung erreichen.

2. Für niedermolekulare basische Proteine lassen sich leicht geeignete Bedingungen für die lineare Chromatographie finden. Die Reproduzierbarkeit ist gut.

3. Grosse Kapazität bei massiger Ionenstärke (z.B. mit NH₁₊OAc , Ionenstärke ungefähr 0,1) im pH-Intervall *+-9.

k. Es tritt keine irreversible Adsorption auf in dem Sinne, dass sich die Proteine nicht durch massige Veränderungen in der Ionenstärke oder im pH des Puffers eluieren lassen. Das Denaturierungsrisiko beim Chromatographieren ist daher klein oder nicht vorhanden.

5· Bei Pufferwechsel erreicht man rasch Gleichgewicht. Dies ist bei der praktischen Arbeit sehr wichtig und kann einer technischen Anwendung den Weg bereiten. Die Konzentrationsgradienten wandern mit kurzer Verzögerung durch das Bett.

109826/1556

6. Amphotere quergebundene Gele sind weniger geneigt, bei einer Milieuveränderung das Volumen zu ändern, als dies bei den gewöhnlichen Ionenaustauschern der Fall ist. (Dies gilt für |i-Alanin-Sephadex besonders im pH-Intervall 5-7')

Die Puffersysteme in den genannten Beispielen wurden gewählt mit Hinsicht auf ihre leichte Verflüchtigung. Es gibt allerdings zahlreiche andere Puffersysteme ohne diese Begrenzung, die der Trennung eine erhöhte Selektivität verleihen.

Die Mehrzahl der Proteine im Naja nigricollis toxin sind niedermolekular und in den hier angewandten Puffersystemen stark positiv geladen. Stark saure Proteine benehmen sich analog in einer Umgebung, in der die amphoteren Adsorbente.wie schwache Anionenaustauscher wirken. Eine Fraktionierung von Proteinen mit dem isoelektrischen Punkt im pH-Intervall h-8 kann ausserdem bei einer niedrigeren Pufferionenkonzentration geschehen als der, die für die basischen Schlangengiftproteine angewandt wurde. Auch kann das chromatographische Operationsintervall ver schoben werden, indem man andere Typen von amphoteren Ionengruppen, u.a. Guanidin- und SuIfonatgruppen den Gelen zuführt.

Eine verbesserte Fraktionierung erhält man auch bei grösseren Ausmassen, Betten mit 3 cm Diameter und Höhen von 1-1,5 Meter. Hier- " bei kann man Rohgift in Grammquantität behandeln. Darüberhinaus kann man den Trennungseffekt bei der linearen Chromatographie durch das Recyklierungsverfahren weiter erhöhen.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass amphotere Ionenaustauscher als Adsorptionsmittel für biologische Makromoleküle ,von bedeutendem Vorteil sind, und es ist anzunehmen, dass sie zum grossen Teil die derzeit angewandten konventionellen Ionenaustauscher ergänzen oder ersetzen werden. Es wird vielerseits (an anderen Laboratorien) daran gearbeitet, genauer festzustellen, wie die Ionen-Dipol-Wechselwirkungen im einzelnen die Selektivität

109826/1556

der Trennung von Komponenten mit unterschiedlichen Ladungseigenschaften beeinflussen. Die stärksten Flächenladungen scheinen dabei j im Vergleich zu gewöhnlichen Ionenaustauschern, einen akzentuierten Einfluss auf die Adsorption zu haben.

109826/1556

Claims

1 · ■['■ *■ !!! UP!!» Hip!!1 - =>!"■ Ri Uppsala, Schweden P at ent ans prüche

1. Verfahren zur Trennung von Polyelektrolyten, -wie Proteinen verschiedener Art, beispielsweise Proteinen in Schlangengift, im Pankreas- und Rapsextrakt usw., in Peptiden, Nucleinsäuren und Nucleotiden, von einander und von Verunreinigungen, indem eine Lösung der Substanz oder Substanzen ein aus einem Adsorptions- , mittel bestehendes Bett durchfliessen, dadurch g e k e η η ζ ei chnet, dass das Adsorptionsmittel aus einem unlöslichen, organischen, hydroxylhaltigen, hydrophilen polymeren Kupplungsprodukt besteht, das sowohl basische, stickstoffhaltige Gruppen, wie Carboxylase- oder Sulfonatgruppen enthält, und wo die Proportion zwischen den basischen und sauren Grupppn ein einfaches, stöchiometrisches Verhältnis ist, wobei die Polyelektrolyten mit verschiedener Geschwindigkeit durch die Kraft gegenseitiger Wechselwirkung zwischen den Polyelektrolyten und Substituenten im Adsorptionsmittel ins Wandern kommen und selektiv vom Adsorptionsmittel adsorbiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k eη η ζ e i c h - | net, dass das Adsorptionsmittel ein Kupplungsprodukt einer Aminosäure oder einem Aminosäurederivat mit einem unlöslichen, hydroxylhaltigen Polymer ist.

3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e k e η η zeichnet, dass das unlösliche, hydroxylhaltige Polymer ein Kohlenhydrat ist.

k. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Kohlenhydrat ein Agar oder eine Agarose ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Kohlenhydrat ein quergebundenes Dextran ist.

109826/1556

6. Verfahren nach Anspruch 3? dadurch gekennzeich net, dass das Kohlenhydrat Cellulose ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass das hydroxylhaltige Polymer ein Polyacrylsäurederivat ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass das unlösliche, hydroxylhaltige Polymer ein PoIyacrylamidderivat ist.

10987K/1R66

L e e r s e i t e