DE20310413U1

DE20310413U1 - Impfstoff

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Publication number: DE20310413U1
Application number: DE20310413U
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-07-07
Filing date: 2003-07-07
Publication date: 2003-12-04
Anticipated expiration: 2013-07-08

Abstract

Impfstoff, erhältlich durch Bestrahlung eines Mikroorganismus mit Licht einer Intensität im Bereich der Wellenlängen 265 bis 305 nm von mindestens 1 % der Gesamtintensität der Strahlung.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Impfstoff, der durch Inaktivieren eines Mikroorganismus mit UVB-Strahlung erhalten werden kann.
Hintergrund der Erfindung
Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur Inaktivierung von Mikroorganismen und Herstellung von Impfstoffen bekannt. Die am häufigsten angewendeten Verfahren sind die Inaktivierungen mit Formaldehyd oder mit ß-Propiolacton. Diese Verfahren haben den Nachteil, daß antigene Eigenschaften der Mikroorganismen durch Denaturieren beschädigt werden und damit der geimpfte Körper eine suboptimale Immunantwort erzeugt und in vielen Fällen der erhoffte Impfschutz sogar ausbleibt. Darüberhinaus sind die Formalinrückstände für viele Personen, insbesondere Allergiker, problematisch. Nicht zuletzt sind lange Einwirkzeiten von bis zu 15 Tagen für die Inaktivierung nachteilig.
Eine Möglichkeit der Inaktivierung von Viren ist die Bestrahlung mit UV-Strahlen. Eine bekannte Anwendung von UV-Strahlen ist die Desinfektion von Raumluft mit UVC-Strahlung, wobei gewöhnlich 253,7 nm (eine Entladungslinie von Hg) zum Einsatz kommt (Berg-Perier et al. (1992) Ultraviolet radiation and ultra-clean air enclosures in operating rooms. UV-protection, economy and comfort; J. Arthroplasty, 7, 457-463). UVC-Strahlung zerstört DNA und RNA und löst darüberhinaus chemische Reaktionen aus, die zur Proteinzerstörung und zur Bildung von Ozon führen. Die Photonenenergie ist hoch genug, um Moleküle zu ionisieren und zu zerstören. UVC-Strahlung wirkt damit stark zelltoxisch und mutagen. Durch weitgehende Absorption der Strahlung durch biologische Materialien, Flüssigkeiten und auch Kunststoffmaterialien hat UVC nur eine geringe Eindringtiefe und ist damit nur effektiv in Luft und proteinarmen Wasser. Zur Impfstoffherstellung ist diese Strahlung weniger geeignet, da auch sie antigene Determinanten zu zerstören vermag. Das Hauptproblem jedoch ist die geringe Eindringtiefe durch Absorption durch DNA/RNA-fremde Moleküle. In jeder mikroorganismen-haltiger Flüssigkeit sind auch störende Bestandteile, wie z. B. Zelltrümmer, enthalten. Diese können, genauso wie Konglomeratbildung der Mikroorganismen, Abschattend wirksam werden. Damit besteht ein erhöhtes Risiko, daß dadurch ein Mikroorganismus der Inaktivierung entkommt und damit die Gesundheit eines Impflings gefährdet wird. Darüberhinaus sind die Inaktivierungskinetiken nicht linear und damit schlecht kalkulierbar. Zur Herstellung von Impfstoffen wurde auch die PUVA-Methode evaluiert, bei welcher einer Suspension mit Mikroorganismen eine phototoxische Substanz zugefügt wird und diese dann mit Bestrahlung mit Wellenlängen des UVA-Bereichs aktiviert wird und dadurch die Mikroorganismen inaktiviert. Dies hat jedoch den Nachteil, daß toxisches, carzinogenes Psoralen hinzugefügt und nach Bestrahlung mit der ansonsten unwirksamen UVA-Strahlung wieder entfernt werden muss.
Bei der Impfstoffherstellung mittels Bestrahlung kommt es ganz entscheidend darauf an, dass jedes Partikel mit grösstmöglicher Sicherheit eine vorbestimmte Strahlungsdosis allseits erhält, womit die Inaktivierungskinetik präzise kalkulierbar wird. Darüberhinaus dürfen keine weiteren Destruktionen ausgelöst werden, um die antigenen Eigenschaften vollständig zu erhalten. Das ist bisher technisch sehr schwierig gewesen, weshalb bislang noch kein Impfstoff auf diese Weise hergestellt wurde.
Durch die Erfindung zu lösende Aufgaben
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, inaktivierte Mikroorganismen zur Verwendung als Tot-Impfstoff bereitzustellen. Die Mikroorganismen sollen auf kalkulierbare Weise unter Erhalt der antigenen Eigenschaften inaktiviert werden. Die Inaktivierung muß auch dann sicher gewährleistet sein, wenn innerhalb bestimmter Grenzen abschattende Partikel, wie Zelltrümmer oder Proteine, vorhanden sind.
Gegenstand der Erfindung
Die erste Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Impfstoffes gelöst, der durch Bestrahlung eines Mikroorganismus mit Licht einer Intensität im Bereich der Wellenlängen 270 bis 310 nm von mindestens 1 % der Gesamtintensität der Strahlung erhalten werden kann.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Der Begriff Mikroorganismus umfaßt prokaryontische Mikroorganismen, wie Bakterien, eukaryontische Mikroorganismen, wie Algen, Pilze, Protozoen, aber auch höher entwickelte Zellen, wie menschliche, tierische oder pflanzliche Zellen, sowie Viren und Plasmide.
Der Begriff Impfstoff umfaßt den inaktivierten Mikroorganismus oder Teile davon, mit oder ohne Adjuvantien oder/und anderer Hilfsstoffe, mit oder ohne andere auch mit anderen Verfahren inaktivierten oder replikationsfähigen Mikroorganismen. Der Impfstoff kann zur allgemeinen Anwendung zu Prävention oder Therapie an Mensch oder Tier vorgesehen sein oder auch nur hergestellt sein zur Anwendung für ein bestimmtes Individuum.
Der Begriff „Inaktiviert" umfaßt im erfindungsgemässen Sinne Replikationsunfähigkeit des Mikroorganismus in einer ansonsten permissiven Zelle infolge Schädigung der Erbsubstanz des Mikroorganismus.
Der erfindungsgemäß hergestellte Impfstoff kann zusätzlich auch noch mit anderen Verfahren weiter Inaktiviert werden.
Die Intensität der eingesetzten UV-Strahlung ist mindestens 1 %, bevorzugt 10 % und stärker bevorzugt 50 % der Gesamtintensität der Strahlung.
Die UV-Strahlung wird nach DIN 5031 wie folgt unterteilt: UVA (315-380 nm), UVB (280-315 nm) und UVC (100-280 nm).
Die Wirkung von Strahlung des UV-Bereichs zwischen 270-310 nm ist darauf zurückzuführen, dass die Strahlungsenergie von Nukleinsäure absorbiert wird und dadurch schädigende Reaktionen induziert werden. Die Art der Schädigungen ist überwiegend gekennzeichnet durch Bildung von Cyclobutan-Pyrimidin-Dimeren (CPD), die durch kovalente Bindung von benachbarten Pyrimidinen einer Polynucleotid-Kette entstehen. Ferner ist unter anderem die Bildung von Pyrimidin-Pyrimidon-Läsionen (6-4 Läsionen) von Bedeutung. Zusätzlich kommt es zu Kreuzvernetzungen (Crosslinking) von DNA, aber besonders bei RNA. Darüberhinaus haben die gewählten Strahlenbereicheb im Gegensatz zu 253,7 nm den Vorzug, Proteine und andere störende Stoffe besser zu durchdringen, so daß eine ausreichende Produktsicherheit erzielbar ist.
Die Effektivität und Sicherheit einer Inaktivierung mittels UV-Strahlung, hängt von verschiedenen Parametern ab.
Ist die zu inaktivierende Flüssigkeit in einer handelsüblichen Polystyrol-Zellkulturflasche eingeschlossen, dann kommt es zu einer Durchlassschwächung der Strahlungsintensität durch eine Kunststoffschicht und zu einem Reflektionsverlust. Außerdem entsteht eine Spektralverschiebung durch ein unterschiedliches, wellenlängenabhängiges Absorptionsverhalten eines jeden Werkstoffes, so dass sich im Falle von Polystyrol eine Verschiebung zugunsten der Transmission in Richtung der längerwelligen Strahlung ergibt.
Beispielsweise ist eine Strahlungsminderung von 55% bzw. 57% nachweisbar, wenn Zellkulturflaschen der Firma Greiner oder Falcon verwendet werden und die Inaktivierungskinetik ist nicht mehr linear.
Angestrebtes Ziel ist, daß die Strahlungsverteilung an jedem Punkt der Flüssigkeit möglichst gleich sein sollte, um ein homogenes Strahlungsfeld zu erzeugen. Jede Distanzierung und jede von der Strahlung zu durchdringende Materialschicht zwischen Strahlungsemittent und Ziel gefährdet die Inaktivierungssicherheit. Auch bei UV-durchlässigen Materialien kommt es zu Reflektionsverlusten sowohl am Eintrittswie auch am Austrittsort der Strahlung. Weiterhin führt eine wie auch immer geartete Trennlage zur Distanzierung zwischen Strahlenemissionspunkt und Strahlenziel, welches eine Strahlungsminderung proportional zum Abstandsquadrat zur Folge hat. Wichtig ist auch, daß als Folge einer solchen Distanzierung Strahlen vorwiegend primär im rechten Winkel und damit nur einseitig auf das Ziel treffen. Zusätzlich führen Unreinheiten, Einschlüsse, Wandickenschwankungen und Krümmungen zu Abschattungen, Linseneffekten und Streuungen. Dies hat zur Folge, daß kein homogenes Strahlungsfeld erreicht wird und damit die Inaktivierungseffektivität, Berechenbarkeit und damit die Produktsicherheit beeinträchtigt wird.
Aus den obengenannten Gründen wird der erfindungsgemäße Impfstoff vorzugsweise durch ein Verfahren hergestellt, bei dem die zu bestrahlende Flüssigkeit direkt mit der Lichtquelle kontaktiert wird, so daß kein Intensitätsverlust und keine Spektralverschiebung auftreten sowie das Ziel nicht nur im 90° Winkel, sondern auch in nennenswerter Weise gleichzeitig seitlich getroffen werden kann.
Die UV-Strahlung emittierende Lichtquelle ist vorzugsweise eine Leuchtstofflampe, wobei die zu behandelnde Flüssigkeit bevorzugt in einem Ringspalt über die Oberfläche der Lichtquelle geleitet wird. Vorzugsweise ist die Aussenhülle um die Leuchtstofflampe, die damit den Ringspalt bildet, aus Polytetrafluorethylene (PTFE), Quarzglas oder einem anderen, für UV-Strahlen durchlässigen Material. Um die Aussenhülle kann eine UV-reflektierende Schicht aufgebracht sein. Beispielsweise kann die Aussenhülle mit Aluminium bedampft oder mit poliertem Aluminium, Titan oder einer Legierung umhüllt sein.
Das Verfahren kann weiter optimiert werden, indem eine turbulente Strömung in dem zu behandelnden Medium bewirkt wird. Diese wird dadurch erzielt, daß in geeigneter Weise das Medium, vorzugsweise die Flüssigkeit, quer oder längs zur Fliessrichtung in Schwingungen versetzt wird. Zum Beispiel kann die Aussenhülle mit einer Schwingmasse oder einer unwuchtig rotierenden Masse oder einer schwingenden, mit der Flüssigkeit in Kontakt stehenden Membran (Piezo) oder mit einem Kolben verbunden sein, welcher mechanisch oder elektrisch zum Schwingen gebracht wird.
Zur Überprüfung der Leistungsfähigkeit der Virusinaktivierung durch UVB-Strahlung mit PL-S9W/12 Lampen (Wellenlänge von 290 bis 320 nm) wurden verschiedene Virussuspensionen (Adeno-3,HCMV (HI91), HSV-1, HSV-2, Coxsackie B 1, Reovirus-3, Polio-1, Echo-11, HIV-1 (RF), Corona )in zellfreiem Medium erfolgreich durch Bestrahlung vollständig inaktiviert. Die zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommenen Proben wurden in Verdünnungsreihen zur Infektion von permissiven Zellen eingesetzt, und die Restinfektiosität ist durch Zählung von Antigen-exprimierenden Zellen oder cytopathischen Effekten bestimmt worden. Es zeigte sich, daß die Inaktivierungskinetik im halblogarithmischen Maßstab auch bei Inaktivierung von Ausgangstitern von bis zu 1 x 10⁹ PFU/ml linear ist. Weiterhin zeigte sich, daß zur Inaktivierung besonders umweltresistenter Viren keine höheren Strahlungsdosen notwendig waren sowie die Unterschiede in den Bestrahlungsdosen für die einzelnen Virenarten gering sind (Ausnahme: 10 fach erhöhte Empfindlichkeit für Coronavirus). Eine maximale Dosis von 2,5 J/cm² war ausreichend, um Adenovirus mit dem höchsten Test-Titer (1 x 10⁹ PFU/ml) vollständig zu inaktivieren. Reaktivierungen durch Licht-induzierbare Photolyasen wurden nicht beobachtet. Bei Bestrahlung einer Virussuspension durch eine Polystyrolschicht zeigten die gewonnen Daten im Vergleich eine stark abgeschwächte Wirkung sowie einen nichtlinearen Verlauf.
Die Ergebnisse dieser Referenzversuche zeigen, daß die Wirksamkeit einer Strahlung vermindert wird, wenn sie eine Polystyrolschicht durchdringen muß. Folglich ist es bevorzugt, den erfindungsgemäßen Impfstoff mit einem Verfahren herzustellen, bei dem es zu einem direkten Kontakt zwischen Lichtquelle und zu bestrahlender Flüssigkeit kommt.
Um komplette Antigene für wissenschafliche oder medizinische Zwecke aus Viren, Parasiten, Bakterien oder Tumorzellen herzustellen, sind die genannten Strahlungsbereiche besonders gut geeignet, da die antigene Struktur unverändert erhalten bleibt. Damit lassen sich nur mit Hilfe von UV-Strahlung inaktivierte Antigene von höchster Qualität herstellen. So ist eine maximale Immunantwort bei hoher Inaktivierungssicherheit erzielbar. Das ist von großem Wert zur Stimulation von Immunzellen bei der Krebsbekämpfung und zur Herstellung von Totimpfstoffen, oder auch zur externen Stimulation von Immunzellen, z. B. zur Messung der zellulären Immunantwort. Gerade bei den Impfstoffen gibt es immer wieder Enttäuschungen wegen unzureichender Immunantworten, da die herkömmlichen Verfahren die Antigenität der zu inaktivierenden Ausgangsmaterialien stark verändern und damit beschädigen. Deshalb werden solche schlechten Impfstoffe relativ hoch dosiert, um eine Wirkung zu erzielen. Andererseits wird damit aber auch eine erhöhte Rate an Nebenwirkungen erzeugt. Für eine Reihe von Krankheiten ließ sich mit den herkömmlichen Verfahren bisher überhaupt kein funktionierender Impfstoff zum breiten Einsatz erzeugen (humanes Cytomegalievirus, Denguefieber etc.).

Claims

Impfstoff, erhältlich durch Bestrahlung eines Mikroorganismus mit Licht einer Intensität im Bereich der Wellenlängen 265 bis 305 nm von mindestens 1 % der Gesamtintensität der Strahlung.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die Lichtintensität im Wellenlängenbereich von 265 bis 305 nm mindestens 10 % beträgt.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die Lichtintensität im Wellenlängenbereich von 265 bis 305 nm mindestens 50 % beträgt.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Strahlung im Wellenlängenbereich von 270 bis 300 nm liegt.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Strahlung im Wellenlängenbereich von 275 bis 295 nm liegt.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Strahlung im Wellenlängenbereich von 265 bis 295 nm liegt.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Strahlung im Wellenlängenbereich von 285 bis 295 nm liegt.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Strahlung im Wellenlängenbereich von 290 bis 295 nm liegt.
Impfstoff nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Mikroorganismus unter Viren, Parasiten, Sporen, Bakterien und Tumorzellen ausgewählt ist.
Impfstoff nach einem der vorstehenden Ansprüche, erhältlich durch Bestrahlung des Mikroorganismus in einem flüssigen Medium.
Impfstoff nach einem der vorstehenden Ansprüche, erhältlich durch Bestrahlung des Mikroorganismus in Wasser, einer wäßrigen Lösung, einer nichtwässrigen Flüssigkeit, Blut, verdünntem Blutplasma, verdünntem Blut, Immunglobulinpräparaten, oder Muttermilch.
Impfstoff nach einem der vorstehenden Ansprüche, erhältlich durch direktes Kontaktieren des den Mikroorganismus enthaltenden Mediums mit der Lichtquelle.