DE20207793U1 - Kit zur Durchführung eines Verfahrens zur Nukleinsäure-Extraktion und Nukleinsäure-Reinigung - Google Patents

Kit zur Durchführung eines Verfahrens zur Nukleinsäure-Extraktion und Nukleinsäure-Reinigung

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DE20207793U1
DE20207793U1 DE20207793U DE20207793U DE20207793U1 DE 20207793 U1 DE20207793 U1 DE 20207793U1 DE 20207793 U DE20207793 U DE 20207793U DE 20207793 U DE20207793 U DE 20207793U DE 20207793 U1 DE20207793 U1 DE 20207793U1
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von
multivalenten Kationen und komplexbildenden Agenzien zur
Nukleinsäure-Extraktion und Nukleinsäure-Reinigung mit
Trägermaterialien auf Silikabasis, insbesondere mit
Tonmineralen, Sand und Tonmineral-Sand-Mischungen. Es wird
damit ein universelles . Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren aus jedem Nukleinsäure-haltigen Material in beliebigen Mengen bereitgestellt.
• ·
HAMBURG: TEL.: (04WAS=JeE^-O .:.Sc3S.fivvSsS-ER@UEkr)E · FAV: (046) 899 564-6«*
MÜNCHEN: THOMAS-WIMMER-RING 9, D-80539 MÜNCHEN , TEL.: (089)29 09 170
Klassischerweise werden Nukleinsäuren im Stand der Technik mit Hilfe von stark denaturierenden und reduzierenden Agenzien, mitunter auch hydrolytischen Enzymen (z.B. Proteasen, Lysozym, Lyticase), aus Zellen und Geweben freigesetzt und darauffolgend mit einer Mischung aus Chloroform und Phenol extrahiert und gereinigt. Die Nukleinsäuren werden am Ende durch Ethanolpräzipitation oder Einengung mittels Dialyse aus der wässrigen Phase gewonnen (Sambrook, J., Russell, D.W. (2001): Molecular cloning - a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
Diese "klassischen" Verfahren sind besonders zeitaufwendig (teilweise bis zu 4 8 Stunden), benötigen eine große apparative Ausstattung sowie relativ große Mengen an biologischem Material und sind darüber hinaus in einem erheblichen Maße gesundheitsgefährdend (u.a. durch die Verwendung von Chloroform, Phenol).
In den letzten Jahren sind alternative Extraktions- und Reinigungsverfahren entwickelt worden, die eine Vereinfachung und Minderung des gesundheitlichen Risikos zum Ziel hatten. Sie basieren auf der Methode von Vogelstein und Gillespie (Proc. Nat. Acad. Sei., USA 76, 1979, 615-619), die erstmals für die präparative und analytische Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen entwickelt wurde. Nach dieser Methode werden DNA-enthaltende Agarosestücke aufgelöst und die DNA in Anwesenheit hoher Konzentrationen chaotroper Salze (Natriumiodid oder Guanidinsalze) reversibel an Silika oder Silikate (Glaskkügelchen oder Glasmilch) gebunden. Im weiteren Reinigungsprozeß wird die Silikamatrix mit einer Pufferlösung (20 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,2, 0.2 mol/1 NaCl; 2 mmol/1 EDTA; 50% Ethanol) gewaschen und die DNA schließlich mit Wasser oder verdünnten Pufferlösungen (z.B. 10 mmol/1 Tris-HCl, pH 8,0)
eluiert. • · · ···
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Auf dieser Methode beruhende, modifizierte Verfahren wurden zur Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Materialien verwendet (Marko, M.A. , Chipperfield, R., Birnboim, H.G., Anal. Biochem. 121,1982, 382-3 87) , u.a. Plasmid-DNA aus bakteriellen Lysaten sowie genomische DNA und Gesamt-RNA aus Blut, tierischen und menschlichen bzw. pflanzlichen Geweben und Zellkulturen.
Diese in Form von Kits kommerziell vertriebenen Verfahren, z.B. von QIAGEN (Hilden, DE) oder Macherey-Nagel (Düren, DE), beruhen auf dem Prinzip, daß Nukleinsäuren in Anwesenheit hoher Ionenstärke, vor allem chaotroper Salze, an mineralische Trägermaterialien binden. Als Trägermaterialien haben sich fein gemahlenes Glaspulver (z.B. Promega; MoBio), Diatomeenerde (Sigma) oder Silikagele (Qiagen) bewährt, wobei auch chemisch modifizierte Materialien wie Silikakarbid (U.S. Pat. No. 6,2 91,24 8) verwendet werden können.
In U.S. Patent Nr. 5,234,809 wird ein Verfahren für die Reinigung von Nukleinsäuren aus verschiedenen Materialien, einschließlich Blut, Blutserum, Stuhl, Urin und Zellkulturen, offenbart, das sich bewährt hat. Dabei wird ein Puffer mit chaotropen Agenzien (z.B. Detergenz und Guanidinsalz in hoher Konzentration) für die Zelllysis und gleichzeitig für die Bindung der Nukleinsäuren an ein festes Trägermaterial (z.B. Silika, Polystyrol-Kugeln, Nitrocellulose-Papier) verwendet. Hinlänglich bekannte Waschschritte mit Ethanol- oder Isopropanol-haltigen Lösungen werden eingesetzt, um gelöste Verunreinigungen von dem Trägermaterial zu beseitigen. Eine Elution mit Wasser oder Niedrigsalzpuffern wie 10 mmol/1 Tris oder TE (10 mmol/1 Tris, 1 mmol/1 EDTA) bewirkt schließlich die Desorption der Nukleinsäuren von dem Trägermaterial.
Vorteil dieses Verfahrens ist, daß chaotrope Salze für die irreversible Denaturierung und dadurch Inaktivierung von Nukleasen sorgen. Wesentliche Nachteile des Verfahrens liegen darin, daß die Konzentration der chaotropen Salze teils stark auf das eingesetzte Material eingestellt werden muß und auch die Lyse von biologischem Material, wie pilzliches oder pflanzliches Gewebe, zum Teil nur sehr ineffizient ist. Auch muß für den vielfach gewählten Einsatz von Enzymen (Proteinase, RNase) in den Reinigungsverfahren die Konzentration von chaotropen Agenzien unter Werte gesenkt werden, die ansonsten eine Inaktivierung von Nukleasen bewirken.
Ferner wurde eine alternative, auf Silika basierende Technologie beschrieben, die ohne den Einsatz chaotroper Salze auskommt (vgl. DE 198 56 064 Al). Vorteil dieses kommerzialisierten Verfahrens ist, daß auch aus sehr geringen nukleinsäurehaltigen Materialien mit einem universellen Protokoll Nukleinsäuren extrahiert werden können. Nachteil ist, daß die Nukleinsäurepräparate nicht ausnahmslos den erforderlichen Qualitätsstandards (u.a. photometrischer Messung) entsprechen, also Absorptionsverhältnisse bei 260 nm zu 280 nm von unter 1.70 haben.
Ein weiteres Verfahren basiert auf der chromatographischen Reinigung von Nukleinsäuren mit Hilfe von Austauscherharzen (U.S. Patent Nr. 5,057,426). Hierbei werden die Nukleinsäuren in Zelllysaten an positiv geladene Gruppen des Harzes gebunden, und nach verschiedenen Waschschritten durch hohe Anionenkonzentrationen von der Matrix eluiert. Dieses Verfahren wird vor allem für die Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus größeren Mengen biologischen Materials angewendet. Eine gängige kommerzielle Anwendung verwendet gravitationsgetriebene Durchflußsäulen, die Nukleinsäuren von hohem Reinheitsgrad liefern. Nachteil des Systems ist, daß das
Verfahren sehr zeitaufwendig ist (über 16 Stunden bei chromosomaler DNA), da die Nukleinsäuren nach der Elution entsalzt und gefällt werden müssen, um sie anschließend in Wasser oder einem Niedrigsalzpuffer (z.B. 10 mmol/1 Tris-HCl, pH 8,0 oder 10 mmol/1 Tris, 1 mmol/1 EDTA) zu lösen. Zudem kann die Matrix durch Anwesenheit extrazellulärer, hochpolymerer Substanzen (z.B. Schleime) verstopfen, wodurch keine oder nur geringe Mengen Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäuren verminderter Qualität gewonnen werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem hochreine DNA und Gesamt-RNA (u.a. tRNA, mRNA, rRNA, mitochondriale RNA, hnRNA) präpariert werden können und das dabei bezüglich des nukleinsäurehaltigen Ausgangsmaterials universell einsetzbar sowie schnell und einfach zu handhaben ist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Verwendung von Puffern gelöst, die multivalente Kationen enthalten.
Die Erfindung betrifft somit die Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren unter Verwendung von (1) Trägermaterialien auf Silika-Basis, insbesondere aber von mineralischen Trägermaterialien, die bislang noch nicht als Trägermaterial für die Isolierung von Nukleinsäuren vorgeschlagen bzw. verwendet wurden, in Anwesenheit von (2) neuen Puffern für diese Trägermaterialien gelöst, die spezifisch eine Bindung von Nukleinsäuren an die genannten Trägermaterialien und vor allem an mineralische Trägermaterialien, die Entfernung kontaminierender Substanzen vom Trägermaterial und die Elution der Nukleinsäuren vom Trägermaterial bewirken.
ZU (1):
Als Trägermaterial können bei dem er findlingsgemäßen Verfahren Trägermaterialien auf Silika-Basis, wie z.B. Glasfaser-Vliese oder Siliciumverbindungen unterschiedlicher Partikelgrößen, eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt verwendet man Tonminerale, Sand oder Tonmineral-Sand-Mischungen, die sich in ihrer Diagenese, Mineralogie und den physiko-chemischen Eigenschaften zu den bisher für die Nukleinsäurereinigung verwendeten Silikamaterialien deutlich unterscheiden.
Tonminerale sind weitaus überwiegend zu den Phyllosilicaten, aber in einigen Fällen auch zu den Band-Silicaten (z.B. Palygorskit (Attapulgit) und Sepiolith (Meerschaum)) gehörende Minerale, die den Hauptmineralbestand der Tone und Tonsteine bilden und auch in Silten und Siltsteinen, Tonschiefern und manchen Sanden und Sandsteinen vorkommen. Tonminerale, die aus Abfolgen von je 1 Tetraeder- und Oktaederschicht bestehen werden als Zweischicht- Tonminerale oder l:l-Minerale bzw. nach dem fachsprachlich als Basisabstand bezeichneten Abstand der Tetraeder-Schichten auch 7 Ä-Minerale genannt; hierher gehören z.B. Kaolinit, Dickit und Nakrit. Tonminerale mit Verbänden aus 1 Oktaeder- und 2 Tetraeder-Schichten heißen Dreischicht- oder 10 Ä-Tonminerale oder 2:1-Minerale; hierher gehören u.a. Illit, die Smektite (Montmorillonit ist der Hauptvertreter in der Gruppe der Smektite und Hauptbestandteil von Bentonit. In der Praxis werden Bentonit, Smektit und Montmorillonit als Synonyme für quellfähige Mehrschichtsilikate gebraucht.), Glaukonit und Vermiculit. Wenn zwischen die Dreischicht-Verbände eine weitere selbständige Oktaeder-Schicht eingelagert wird, entstehen Vierschicht- oder 14 Ä-Minerale; Beispiele sind die Chlorite.
Eine besondere Tonmineral-Gruppe stellen die Wechsellagerungs-Minerale dar. Zwischen die Schichtpakete, die sich verhältnismäßig leicht gegeneinander verschieben lassen und die blättchenartige Struktur ergeben, die für viele Tonminerale charakteristisch ist und auch deren vollkommene Spaltbarkeit erklärt, können sich z.B. Ionen und Wassermoleküle einlagern; das kann zu einer Aufweitung der Schicht-Abstände (Quellung) führen, z.B. bei den Smektiten.
Bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung von Tonmineralen zur Isolierung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigem Material und/oder zur Reinigung von Nukleinsäuren, wobei das Tonmineral im Sinne der vorliegenden Erfindung ein einzelnes Tonmineral oder eine Mischung verschiedener Tonminerale ist, vorzugsweise ein 1:1- und/oder 2:1-Tonmineral. Gemäß einer besonderen Ausführungsform verwendet man Kaolinit und/oder Montmorillonit (Bentonit). Soweit nachfolgend „ein Tonmineral" erwähnt wird, soll dieser Begriff auch die genannte Mischung einschließen.
Geologisch ist Sand ein Gemisch aus kleinen, ungefähr rundlichen Fragmenten bzw. Partikeln aufgebaut, die aus dem Zerfall von Gesteinen entstehen. Der Partikeldurchmesser liegt zwischen 0,05 und 2 mm im Durchmesser. Sand besteht hauptsächlich aus Quarz, enthält daneben andere Minerale wie SiIt (sehr feiner Sand, 0,002 bis 0,06 mm im Durchmesser), Glimmer, Feldspat, Calcite (CaCO3) , Magnetite, Tonminerale und Schwerminerale.
Gegenstand der Erfindung ist somit auch die Verwendung von Sand zur Isolierung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigem Material und/oder zur Reinigung von Nukleinsäuren. Dabei kann es sich im Sinne der Erfindung um Sande verschiedener Herkunft
als auch um künstliche Mischungen von Sand und Mineralen handeln.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform verwendet man säurebehandelten und geglühten Seesand (Fa. Merck) oder Mischungen aus o.g. Seesand und Tonmineralen, insbesondere Kaolinit und/oder Montmorillonit (Bentonit), z.B. Seesand und Tonmineral im Verhältnis 100 : 1. Soweit nachfolgend „Sand" erwähnt wird, soll dieser Begriff auch die genannten Mischungen einschließen.
Zu (2) :
Erfindungsgemäß werden Puffer verwendet, die zur Bindung, Reinigung und Elution von Nukleinsäuren an die genannten silikabasierten Trägermaterialien, insbesondere an die Tonminerale, führen. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Anwesenheit multivalenter, nicht aber monovalenter Kationen, in geringer Konzentration (< 0.2 mol/1) für die Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Trägermaterialien ausreichend. Im Sinne der Erfindung ist für die Reinigung und Elution von Nukleinsäuren die Verwendung von Puffern obligatorisch, die komplexbildende Agenzien sowie, für die Reinigung, Alkohole enthalten.
Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung eines Puffers, der ein Salz eines oder mehrerer multivalenter Kationen enthält, zur Bindung von Nukleinsäuren an Trägermaterialien auf Silika-Basis, insbesondere an Tonminerale, Sand oder Tonmineral/Sand-Mischungen.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Isolierung und/oder Reinigung von Nukleinsäuren, bei dem man nukleinsäurehaltiges Material (Probe)
(a) zur Adsorption von Nukleinsäuren mit einem oben genannten Trägermaterial, das gemäß einer bevorzugten Ausführungsform Tonmineral, Sand oder eine Tonmineral-Sand-Mischung ist, in Gegenwart eines Salzes eines multivalenten Kations in Kontakt bringt, man
(b) das Trägermaterial und die Probe voneinander trennt, man
(c) das Trägermaterial ein oder mehrmals wäscht, wobei mindestens ein Schritt die Verwendung eines Puffers mit komplexbildendem Agens und Alkohol beinhaltet, und man
(d) die Nukleinsäuren isoliert, indem man das Trägermaterial zur Desorption der Nukleinsäuren mit einer wässrigen Lösung eines für das Kation geeigneten Komplexierungsagens versetzt und man die wässrige, nukleinsäurehaltige Lösung vom Trägermaterial abtrennt.
Bei dem Verfahren kann man in Stufe (a) auch mehrere Salze eines multivalenten Kations oder mehrerer multivalenter Kationen verwenden. Vorzugsweise handelt es sich bei den Kationen um Mg2+, Ca2+, Mn2+ und/oder Al3+ und bei den Salzen insbesondere um MgCl2, CaCl2, MnCl2 und/oder AlCl3. Dementsprechend können in Stufe (c) und (d) auch gleichzeitig mehrere Komplexierungsagenzien verwendet werden.
Die Durchführung des Verfahrens kann erfolgen, indem man das Trägermaterial in Form einer Suspension in einem geeigneten Puffer bereitstellt. Alternativ kann das Verfahren in Form einer Spin-Säule durchgeführt werden, die mit dem Trägermaterial (bevorzugt Sand oder ein Gemisch aus Sand und
Tonmineral) gefüllt ist (und diese vorzugsweise ferner mit einer Pufferlösung versetzt).
Bei der letzgenannten Verfahrensvariante der Spin-Säule können die Schritte (a) und (b) ausgeführt werden, indem man das nukleinsäurehaltige Material (Probe) auf die Spin-Säule aufträgt und man eine Zentrifugation durchführt.
Schritt (c) kann ausgeführt werden, indem man eine Waschlösung auf die Spin-Säule aufträgt und eine Zentrifugation durchführt und diesen Schritt gegebenenfalls mehrfach mit gegebenenfalls unterschiedlichen Waschlösungen wiederholt. Gemäß einer besonderen Ausführungsform führt man Schritt (c) mehrfach aus, wobei man zum Waschen eine EDTA-haltige Pufferlösung verwendet, die ferner einen Alkohol enthält. Es ist aber auch möglich, zunächst mit einer alkoholischen Pufferlösung und anschließend mit einer EDTA-haltigen Pufferlösung zu waschen, die einen Alkohol enthält. Bei dem verwendeten Alkohol handelt es sich vorzugsweise um Ethanol, Propanol und/oder Isopropanol.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Verfahrensvariante, bei der man vor Stufe a) oder nach Stufe (b) und vor Stufe (d) eine Behandlung mit einer oder mehreren RNasen oder DNasen durchführt.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. der genannten Verfahrensvarianten, d.h. ein Kit zur Durchführung eines Verfahrens zur Isolierung und/oder Reinigung von Nukleinsäuren, bei dem man nukleinsäurehaltiges Material (Probe)
a) zur Adsorption von Nukleinsäuren mit einem Trägermaterial in Gegenwart eines Salzes eines multivalenten Kations in Kontakt bringt, man
b) das Trägermaterial und die Probe voneinander trennt, man
c) das Trägermaterial ein oder mehrmals wäscht und man
d) die Nukleinsäuren isoliert, indem man das Trägermaterial zur Desorption der Nukleinsäuren mit einer wässrigen Lösung eines für das Kation geeigneten Komp1exierungsagens versetzt und man die wässrige, nuklexnsäurehaltige Lösung vom Trägermaterial abtrennt.
Das Kit enthält ein Salz von Mg2+, Ca2+, Mn2+ und/oder Al3+, vorzugsweise MgCl2, CaCl2, MnCl2 und/oder AlCl3, beispielsweise in Form eines Puffers. Vorzugsweise enthält es entweder eine Suspension von Tonmineral(en) in einem geeigneten Puffer oder eine mit Sand oder einem Gemisch aus Sand und Tonmineral gefüllte Spin-Säule. Ferner ist es von Vorteil, wenn das Kit ferner Agenzien zur Zelllyse, Waschlösungen (Waschpuffer) und/oder sonstige zur Durchführung des Verfahrens notwendige oder nützliche Geräte, Mittel oder Reagenzien enthält. Gemäß einer besonderen Ausführungsform enthält das Kit folgende Puffer und Lösungen:
RS (10 mmol/1 EDTA, 50 ramol/1 Tris-HCl, pH,8,0), CH (5 mol/1 Guanidin-isothiocyanat, 5 % Tween-20), AB (0,3 mol/1 MgCl2, 0,3 mol/1 Tris-HCl, pH 9,5, 20 % Isopropanol), ALI (0,2 mol/1 NaOH, 1 % SDS), AL2 (0,2 mol/1 MgCl2, 0,8 mol/1 Tris-HCl, pH 9,5), WB (0,2 mol/1 EDTA, 50 mmol/1 Tris-HCl, pH 9,5, 40 % Isopropanol), TE (10 mmol/1 Tris-HCl, pH 8,0, 1 mmol/1 EDTA).
Überraschenderweise wurde gefunden, daß gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung Nukleinsäuren (DNA und Gesamt-RNA) höchster Qualität aus nukleinsäurehaltigem Material unter Verwendung von zelllysierenden Agenzien
mit gepufferten Suspensionen der Trägermaterialien, insbesondere der Tonminerale, in Anwesenheit geringer Konzentrationen (< 0.2 mol/1) von Salzen multivalenter, nicht aber monovalenter Kationen (0.6 mol/1) bei der Bindung,
mit komplexbildenden Agenzien bei einem Waschschritt sowie nachfolgenden bekannten Waschschritten mit alkoholhaltigen Lösungen (z.B. Ethanol oder Isopropanol)
- und mit komplexbildenden Agenzien für die Desorption der Nukleinsäuren von dem Trägermaterial, nicht dagegen, wie nach dem Stand der Technik bekannt, bei anderen Reinigungsverfahren unter Verwendung von Silikatragermaterialien mit Wasser oder verdünntem Puffer (z.B. Tris-HCl, pH 8,0)
isoliert werden können.
Essentiell für die Reinigung und spätere Elution ist ein Waschschritt mit einem Puffer, der z.B. EDTA (0,2 mol/1) und einen Alkohol (z.B. 40 % Isopropanol) enthält. Für die Elution sind dagegen Puffer (10 mmol/1 Tris, pH 8,0) mit geringeren EDTA-Konzentrationen erforderlich (1 bis 100 mmol/1). Für die Elution kann sich in einigen Anwendungsfällen die Verwendung von erwärmten Puffern (z.B. 700C) und/oder Puffern mit erhöhten pH-Werten (z.B. 10 mmol/1 Tris, pH 9,5) für erhöhte Nukleinsäureausbeuten als vorteilhaft erweisen.
Die Anwesenheit von chaotropen Salzen (z.B. Guanidinsalze) in hohen Konzentrationen ist nicht obligat für die im Sinne der Erfindung erfolgende Bindung der Nukleinsäuren an die Trägermaterialien. Auch stören hohe Konzentrationen von Salzen wie NaCl, KCl oder K-Acetat, chaotrope Salze wie Guanidinhydrochlorid bzw. Guanidinisothiocyanat, andere chaotrope Agenzien (z.B. Detergenzien), geringe Konzentrationen komplexbildender Agenzien (z.B. Ethylendiamintetraessigsäure, EDTA; Bis-aminoethyl-glykoether-&Ngr;,&Ngr;,&Ngr;',N'-tetraessigsäure, EGTA) und/oder Protein-abbauende Enzyme (z.B. Proteinase K) die Adsorption der Nukleinsäuren an die Trägermaterialien im Sinne der Erfindung nicht.
Überraschend ist ferner, daß - im Gegensatz zu Verfahren unter Verwendung von Glas- und Silikamaterialien im Stand der Technik die erfindungsgemäße Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Trägermaterialien, in einer besonderen Ausführungsform Tonminerale und Sand, unabhängig vom pH-Wert der nukleinsäurehaltigen Lösung ist.
Die nukleinsäurehaltigen Lösungen können durch Inkubation von nukleinsäurehaltigen Materialien mit Lysispuffern erhalten werden, die entweder (1) chaotrope Salze wie Guanidinsalze, (2) alkalische Verbindungen wie NaOH, (3) neutrale, anionische oder kationische Detergenzien wie Natriumdodecylsulfat (SDS), TritonX-100, TWEEN-20 oder Hexadecyltrimethylammoniumbromid CTAB oder (4) Enzyme wie Lysozym bei Bakterien, Lyticase bei Hefen, Chitinasen bei Pilzen oder Proteasen bei Geweben enthalten.
Als nukleinsäurehaltige Materialien zur Gewinnung von nukleinsäurehaltigen Lösungen können beispielsweise Viren, Bakteriophagen, Zellmaterial (insbesondere Zellfragmente aus Zellaufschlüssen, z.B. von Bakterien) zur Extraktion von
Plasmiden und Vektoren (u.a. Cosmide, Phagemide, &ldquor;Bacterial Arteficial Chromosomes" [BACs], &ldquor;Yeast Arteficial Chromosomes" [YACs], &ldquor;Pl-derived arteficial chromosomes" [PACs], Prokaryoten (Eubakterien, Archaeen), Hefen, niedere und höhere Pilze, Pflanzenmaterial (u.a. Früchte, Blätter, Stengel), Wirbellose wie Schnecken, Blut und Gewebe von Menschen und Tieren, menschliche, tierische und pflanzliche Zellkulturen, Urin, Stuhl, Nahrungsmittel (u.a. Fisch, Milch, Wurst, Konserven), forensisches Probenmaterial, (Erd-)Boden und Material wie nukleinsäurehaltige Agarosegele oder PCR-Reaktionsansätze eingesetzt werden, um Nukleinsäuren oder Nukleinsäure-Fragmente zu extrahieren.
Unter Nukleinsäuren werden nachfolgend DNA und/oder Gesamt-RNA verstanden. Unter Gesamt-RNA fassen sich die in einer Zelle vorkommenden RNA_Spezies zusammen, u.a. tRNA, mRNA, rRNA, mitochondriale RNA und hnRNA.
Für die Bindung von Nukleinsäuren an die oben genannten (silikabasierten) Trägermaterialien, insbesondere an Tonminerale und Sand, reichen bereits geringe Konzentrationen von Salzen multivalenter Kationen (wie z.B. Mg2+, Ca2+, Mn2+ oder Al3+) aus, vorzugsweise MgCl2, CaCl2, MnCl2 und/oder AlCl3 (z.B. MgCl2 < 0.08 mol/1) . Dies können beispielsweise Magnesiumchlorid-, Calciumchlorid-, Manganchlorid- und/oder Aluminiumchlorid-haltige Puffer sein.
Ferner kommen als Waschlösungen, die ein Komplexierungsagens enthalten, z.B. EDTA- oder EGTA-haltige Lösungen in Betracht.
Bevorzugte Tonminerale sind sogenannte Zweischicht-Tonminerale, auch 1:1 Tonminerale genannt, und sogenannte Dreischicht-
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Tonminerale, auch 2:1 Tonminerale genannt, wie z.B. Kaolinit bzw. Montmorillonit (Bentonit).
Zur Optimierung des Bindungs- und anschließenden Reinigungsprozesses der Nukleinsäuren an die oben genannten Trägermaterialien, insbesondere an die Tonminerale und den Sand, wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zusätzlich eine alkoholische Komponente wie Isopropanol oder Ethanol bzw. Mischungen derselben hinzugefügt.
Nach dem kurzzeitigen Kontakt bzw. der Inkubation des Lysates mit dem Trägermaterial erfolgt die Abtrennung des Lysates von den Trägermaterialien, z.B. durch einen kurzzeitigen Zentrifugationsschritt. Im weiteren Reinigungsprozeß wird das nukleinsäuretragende Trägermaterial mit einem EDTA-haltigen Waschpuffer, der zusätzlich eine alkoholische Komponente wie z.B. 40%-iges (v/v) Ethanol oder 40%-iges Isopropanol enthält, gewaschen. Nachgeschaltet wird mit 70%-igem Alkohol auf bekannte Weise gewaschen. Das Trägermaterial wird getrocknet, und die adsorbierte Nukleinsäure wird mit Komplexbildnerhaltigem Puffer gelöst. Es besteht die Möglichkeit, je nachdem, ob DNA oder Gesamt-RNA isoliert werden soll, einen enzymatischen (Reaktions-)Schritt durch Verwendung von RNasen (z.B. RNase A) oder DNasen (z.B. DNase I) einzufügen. Dafür wird nach der Trennung des Lysates vom Trägermaterial zunächst mit einer alkoholhaltigen Lösung, z.B. 70%-iges Ethanol gewaschen, bevor man den enzymatischen Verdau durchführt. Danach wird mit einem einem EDTA- und Alkohol-haltigen Waschpuffer gewaschen und wie oben beschrieben weiter verfahren.
Überraschenderweise stellte sich im Rahmen der Erfindung heraus, daß für die Desorption von Nukleinsäuren geringe Konzentrationen eines für das Kation (bzw. für dessen
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Komplexierung) geeigneten Komplexagens, d.h. einer komplexbildenden Verbindung wie z.B. EDTA, erforderlich sind. Geeignet sind beispielsweise 1 bis 100 mmol/1 EDTA. Üblicherweise verwendetes destilliertes Wasser oder Pufferlösungen wie 10 mmol/1 Tris-HCl zur Ablösung von Nukleinsäuren von Glas- oder Silikaträgermaterial erbrachten hingegen nur eine geringe oder gar keine Ablösung von am Trägermaterial gebundener Nukleinsäure.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Reinigungs- bzw. Isolierungsverfahrens, der die zur Nukleinsäure-Aufreinigung erforderlichen Lösungen und/oder Reagenzien und Trägermaterialien, insbesondere Tonmineral(e) und/oder Sand, enthält (vorzugsweise bereits in geeignetem Puffer suspendiert), die es ermöglichen, ein nukleinsäurehaltiges Material dem beschriebenen Verfahren zu unterziehen.
Vorzugsweise enthält der Kit die folgenden Lösungen, die zur erfindungsgemäßen Aufreinigung von Nukleinsäuren benötigt werden, wie (a) Magnesiumchlorid-, Calciumchlorid-, Manganchlorid-, und/oder Aluminiumchlorid-haltigem Puffer, (b) EDTA- oder EGTA-haltigen Puffer, (c) Ethanol- oder Isopropanolhaltigen Puffer, (d) DNasel, oder RNase A oder andere Nuklease(n) und/oder Protease(n) enthaltende Lösung. Diese Lösungen können schon gebrauchsfertig vorliegen oder können bei Bedarf frisch angesetzt werden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann das Kit Lösungen zur Lyse nukleinsäure-haltigen Materials und das oder die Tonminerale zusammen mit Sand oder Sand alleine als Spin-Säulenausführung enthalten.
Zusammenfassung - Vorteile des Systems
Im Rahmen dieser Erfindung wird zum ersten Mal gezeigt, daß Tonminerale und Sand sehr gut als Trägermaterial für die Bindung und Reinigung von Nukleinsäuren aus verschiedenen nukleinsäurehaltigen Materialien geeignet sind. Für die Bindung der Nukleinsäuren an das Trägermaterial ist lediglich eine sehr geringe Konzentration (< 0,2 mol/1) von Salzen multivalenter Kationen erforderlich, wobei der Adsorptionsprozeß entgegen dem Stand der Technik unabhängig vom pH der Lösung erfolgt. Mit Puffern der genannten multivalenten Kationen lassen sich auch unter Verwendung anderer Trägermaterialien auf Silika-Basis gute Resultate erzielen.
Ferner wird entgegen dem Stand der Technik mit Glas- oder Sxlikamaterialien (DE 198 56 064 Al) die Bindung von Nukleinsäuren an Tonminerale nicht in Anwesenheit von Salzen
monovalenter Kationen (z.B. < 0,6 mol/1 Na+ oder K+) erreicht. Im Sinne der Erfindung und entgegen dem Stand der Technik ist die Verwendung Komplexbildner-haltiger Puffer für die Reinigung und Elution der Nukleinsäuren vom Trägermaterial notwendig.
Die vorliegende Erfindung weist den Vorteil auf, daß ein neues und universell anwendbares Verfahren zur Reindarstellung von Nukleinsäuren aus verschiedenen Nukleinsäure-haltigen Materialien entwickelt wurde.
Das Verfahren beinhaltet ein einheitliches Protokoll zur Lyse des Materials, da hohe Konzentrationen chaotroper Agenzien, komplexbildende Chemikalien und die pH-Werte von Lösungen keinen negativen Einfluß auf die Bindung von Nukleinsäuren an
das Trägermaterial ausüben. Somit können die üblichen Lysisverfahren, z.B. der Einsatz von Alkali mit hohen pH-Werten, hohen Detergenz- und Guanidinsalzkonzentrationen, direkt in das erfindungsgemäße Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren aus verschiedenen Nukleinsäure-haltigen Materialien eingebunden werden, wodurch die Universalität des Systems weiter unterstrichen wird.
Weiterer Vorteil des Verfahrens ist, daß sich sowohl DNA als auch RNA unter den erfindungsgemäßen Bedingungen adsorbieren und wieder lösen lassen, wodurch sich die gleichzeitige Reinigung beider Nukleinsäurespezies bzw. die differenzielle Reinigung von DNA oder RNA durch Einsatz von RNasen bzw. DNasen in einem universellen Verfahren realisieren läßt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist zudem schnell und einfach und liefert qualitativ hochwertige Nukleinsäurepräparate, die für nachgeschaltete Verfahren wie PCR, Hybridisierungen, Restriktionen oder Ligationen hervorragend geeignet sind.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert.
Beispiele Anwendungsbeispiele:
Verwendete Puffer und Lösungen: RS (10 mmol/1 EDTA, 50 mmol/1 Tris-HCl, pH,8,0), CH (5 mol/1 Guanidin-isothiocyanat, 5 % Tween-20) , AB (0,3 mol/1 MgCl2, 0,3 mol/1 Tris-HCl, pH 9,5, 20 % Isopropanol) , ALI (0,2 mol/1 NaOH, 1 % SDS), AL2 (0,2 mol/1 MgCl2, 0,8 mol/1 Tris-HCl, pH 9,5), WB (0,2 mol/1 EDTA, 50 mmol/1 Tris-HCl, pH 9,5, 40 % Isopropanol), TE (10 mmol/1 Tris-HCl, pH 8,0, 1 mmol/1 EDTA).
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Beispiel 1
Isolierung genomischer DNA aus Mikroorganismen
A) Eubakterien und Archaeen
Zelllysis: Ausgangsmaterial sind stationäre Flüssigkulturen (1 - 1,5 ml) von verschiedenen Bakterien und Halobakterien. Zur Gewinnung der Zellen wurden Bakterien- bzw. Halobakteriensuspensionen abzentrifugiert und der Überstand quantitativ abgenommen. Die Zellen wurden in 50 &mgr;&idiagr; RS-Puffer ggf. einschließlich 10 mg/ml Lysozym (Eubakterien) resuspendiert und ggf. 15 min bei 37°C inkubiert. Zelllysis wurde erreicht, indem 250 &mgr;&idiagr; CH dazugegeben und kurz gevortext wurde. Das Lysat wurde mit 200 &mgr;&idiagr; AB durch Vortexen vermischt und sofort auf eine Spin-Säule (z.B. handelsübliche Spin-Säule der Fa. AHN, Nordhausen) gegeben, die ein Sand-Bentonitgemisch (0,5 g Sand, ca. 5 mg Bentonit) enthielt.
Waschschritte: Anschließend wurde die Säule sofort für
15 Sekunden bei > 16.000 &khgr; g zentrifugiert. Anschließend wurde die Säule mit 0,5 ml WB, dann nacheinander durch zweimaliges Auftragen von 0,5 ml 70 % (v/v) EtOH durch Zentrifugation für jeweils 3 0 Sekunden gewaschen.
DNA-Elution: Auf die gewaschene Säule wurden 100 - 150 &mgr;&idiagr; TE gegeben und 15 min inkubiert. Die DNA wurde durch 0,5 - 1 min Zentrifugation in ein 1,5 ml Polypropylenreaktionsgefäß überführt.
Ergebnis siehe Abb. 1.
B) Hefen
1 - 2 ml stationäre Hefekultur wurden 1 min bei >16.000 &khgr; g zentrifugiert, die sedimentierten Zellen in 1 ml 1 M Saccharose, 0,1 mol/1 EDTA, 14 mmol/1 ß-Mercaptoethanol und 100 U Lyticase resuspendiert und 3 0 - 4 5 min bei 3 0 0C inkubiert. Die Sphäroplasten wurden 10 min bei 10.000 &khgr; g abzentrifugiert, der Überstand dekantiert und daraufhin in 250 &mgr;&idiagr; CH mit kräftigem Vortexen lysiert und danach mit 2 00 &mgr;&idiagr; AB vermischt. Nach Auftragen auf eine Spin-Säule wurde wie unter 1. A) weiter verfahren.
Ergebnis siehe Abb. 1 und 2.
Beispiel 2
Isolierung genomischer DNA und Gesamt-RNA aus Pflanzen und Schnecken
Frisches Pflanzenmaterial (z. B. Blätter, Samen, Keimlinge) oder mehrere tiefgefrorene ganze Schnecken samt Gehäuse wurden unter flüssigem Stickstoff zermörsert, und 5 0 - 100 mg des Pulvers in ein 1,5 ml Polypropylenreaktionsgefäß überfuhrt. Nach Zugabe von 0,6 ml CH und ausgiebigem Vortexen (15 - 30 s) wurde 30 min bei 65°C inkubiert, wobei in 10 minütigen Abständen gevortext wurde. Das Lysat wurde 5 min bei ca. 10.000 &khgr; g zentrifugiert, und 3 00 &mgr;&idiagr; des Überstandes wurden mit 3 00 &mgr;&idiagr; AB vermischt. Das weitere Protokoll entspricht dem aus Beispiel 1. A) .
Ergebnis siehe Abb. 3.
Beispiel 3 Isolierung genomischer DNA aus Vollblut
100 &mgr;&idiagr; Vollblut, mit 0,1 % EDTA als Gerinnungshemmer versetzt, wurde 30 Sekunden bei ca. 18.000 &khgr; g zentrifugiert und der Plasmaüberstand abgenommen. Zur Lyse der Zellen wurde das Sediment mit 25 0 &mgr;&idiagr; CH durch Vortexen vermischt und anschließend mit 200 &mgr;&idiagr; AB vermischt. Eine Spin-Säule wurde mit dem Lysat beladen und 3 0 s zentrifugiert, worauf mit 0,5 ml WB geladen und 15 min inkubiert wurde. Danach wurde 2 mal mit 70 % EtOH gewaschen. Die Elution erfolgte mit 70 °C erwärmtem TE, Inkubation für 15 min und einer 3 0 s Zentrifugation.
Ergebnis siehe Abb. 4.
Beispiel 4 Isolierung von Plasmid-DNA
Eine 1,5 ml stationäre E. coli-Kultur wurde 30 Sekunden bei ca. 18.000 &khgr; g zentrifugiert, der Überstand quantitativ dekantiert, und das Zellsediment wurde in 30 &mgr;&idiagr; RS inkl. 100 Mg/ml RNase A durch Vortexen resuspendiert. Nach Zugabe von 3 0 &mgr;&idiagr; ALI wurde vorsichtig mit der Pipettenspitze gemischt, bis Lysis eingetreten war. Darauf wurden 3 0 &mgr;&idiagr; eiskaltes AL2 wie oben beschrieben mit dem Lysat vermischt, 15 min bei ca. 18.000 &khgr; g und 4 0C zentrifugiert und der Überstand mit 90 &mgr;&idiagr; AB vermischt. Das Lysat wurde dann auf eine Spin-Säule gegeben und 15 min inkubiert. Nach einer 30 s Zentrifugation wurde weiter wie unter 1. A) &ldquor;Waschschritte" und &ldquor;DNA-Elution" verfahren.
Ergebnis siehe Abb. 5.
Figuren;
Abb. 1: Gelelektrophoretische Darstellung der Isolierung von genomischer DNA aus 1 - 2 ml stationären Kulturen verschiedener Mikroorganismen (0,8 % TAE-Agarosegel, Ethidium-Bromid-gefärbt).
Proben 1-5 (Anteil des DNA-Präparates aufgetragen):
1: Halobacterium sp., Archaea (1/50) 2: Pseudomonas stutzeri, Gram-negatives Eubakterium
(1/75)
3: Bacillus subtilis, Gram-positives Eubakterium
(1/50) .
4: Saccharomyces carlsbergensis, Hefe (1/150) 5: Aspergillus niger, Pilz (1/75)
Abb. 2: Gelelektrophoretische Darstellung der Isolierung von genomischer DNA und Gesamt-RNA aus 2 ml Hefekultur (Pichia pastoris Gsll5) (0,8 % TAE-Agarosegel, Ethidium-Bromid-gefärbt) ; 1/50 des Präparates wurden aufgetragen.
Proben 1-8: Isolierung von Nukleinsäuren aus verschiedenen Wachstumsphasen:
1: 20 h; 2: 22 h; 3: 25 h; 4: 27 h; 5: 29 h; 6: 31 h; 7: 44 h; 8: 46 h
M: Molekulargrößenmarker (Lambda DNA, Hindlll restringiert): 23,1 kb; 9,4 kb; 6,5 kb; 4,4 kb; 2,3 kb; 2,0 kb; 0,6 kb (von oben nach unten).
Abb. 3: Gelelektrophoretische Darstellung der Isolierung von genomischer DNA und Gesamt-RNA aus 50 mg Pflanzenmaterial bzw. Schnecke (0,8 % TAE-Agarosegel, Ethidium-Bromid-gefärbt); 1/10 des Präparates wurden aufgetragen.
Probe 1: Silbertaler, Blatt (Lunaria annua) Probe 2: Efeu, Blatt (Hedera helix) Probe 3: Silberblatt-Goldnessel, Blatt (Galeobdolon argentaturn)
Probe 4: Schnirkelschnecke (Cepaea sp.)
M: Molekulargrößenmarker (Lambda DNA, Hindlll restringiert): 23,1 kb; 9,4 kb; 6,5 kb; 4,4 kb; 2,3 kb; 2,0 kb; 0,6 kb (von oben nach unten)
Abb. 4: Darstellung der Gelelektrophorese von gereinigter genomischer DNA aus 100 &mgr;&idiagr; Vollblut (0,8 % TAE-
Agarosegel, Ethidium-Bromid-gefärbt); 1/15 des DNA-Präparates wurde aufgetragen
Proben 1-4: DNA isoliert aus verschiedenen gesunden Personen
A-C: Wiederholungen des Versuches
Abb. 5: Isolierung von Plasmid-DNA (pUC13) nach der erfindungsgemäßen Prozedur mit einer Spin-Säule im Vergleich mit kommerziellen Kits zweier Anbieter (Agarosegelelektrophorese, 0.8 % Gel, Ethidium-Bromidgefärbt); je 1/20 des Plasmid-DNA-Präparates aufgetragen
Proben 1 - 2: Plasmid-DNA-Extraktion mittels kommerzieller Plasmid-DNA-Extraktionskits zweier Hersteller
3: Plasmid-DNA-Extraktion mittels erfindungsgemäßen Verfahrens
-/+ ohne bzw. mit EcoRI-Verdau
M: Molekulargrößenmarker (Lambda DNA, Hindlll restringiert): 23,1 kb; 9,4 kb; 6,5 kb; 4,4 kb; 2,3 kb; 2,0 kb; 0,6 kb (von oben nach unten)

Claims (8)

1. Kit zur Durchführung eines Verfahrens zur Isolierung und/oder Reinigung von Nukleinsäuren, bei dem man nukleinsäurehaltiges Material (Probe)
a) zur Adsorption von Nukleinsäuren mit einem Trägermaterial in Gegenwart eines Salzes eines multivalenten Kations in Kontakt bringt, man
b) das Trägermaterial und die Probe voneinander trennt, man
c) das Trägermaterial ein oder mehrmals wäscht und man die Nukleinsäuren isoliert, indem man
d) das Trägermaterial zur Desorption der Nukleinsäuren mit einer wässrigen Lösung eines für das Kation geeigneten Komplexierungsagens versetzt und man die wässrige, nukleinsäurehaltige Lösung vom Trägermaterial abtrennt.
2. Kit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz ein Salz von Mg2+, Ca2+, Mn2+ und/oder Al3+ ist.
3. Kit nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz MgCl2, CaCl2, MnCl2 und/oder AlCl3 ist.
4. Kit nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Suspension von Trägermaterial(ien) in einem geeigneten Puffer enthält.
5. Kit nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial Tonmineral, Sand oder eine Mischung aus Tonmineral und Sand ist.
6. Kit nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es eine mit einem Gemisch aus Sand und Tonmineral gefüllte Spin- Säule enthält.
7. Kit nach den Ansprüchen 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet, daß es ferner Agenzien zur Zelllyse, Waschlösungen (Waschpuffer) und/oder sonstige zur Durchführung des Verfahrens notwendige oder nützliche Geräte, Mittel oder Reagenzien enthält.
8. Kit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Puffer und Lösungen enthält:
a) Magnesiumchlorid-, Calciumchlorid-, Manganchlorid-, und/oder Aluminiumchlorid-haltigen Puffer,
b) EDTA- oder EGTA-haltigen Puffer,
c) Ethanol- oder Isopropanol-haltigen Puffer und
d) DNaseI oder RNaseA oder andere Nuklease(n) und/oder Protease(n) enthaltende Lösung.
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