DE202023103382U1 - Gemisch fucosylierter HMOs - Google Patents

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Abstract

Gemisch, umfassend, im Wesentlichen bestehend aus oder bestehend aus 3-FL als Komponente A, LNFP-I als Komponente B, 2'-FL als Komponente C, LNDFH-I als Komponente D, DFL als Komponente E und gegebenenfalls Lactose als Komponente F.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Gemisch aus Muttermilch-Oligosacchariden („HMOs“), das fünf fucosylierte HMOs umfasst, sowie auf einen enzymatischen Prozess zur Herstellung dieses Gemisches, wobei die Synthese eine enzymatische α1-3/4-Transfucosidasereaktion zwischen HMO-Donatoren und -Akzeptoren umfasst.
  • HINTERGRUND
  • HMOs sind in den letzten Jahren aufgrund ihrer Rolle bei zahlreichen biologischen Prozessen im menschlichen Organismus zum Gegenstand großen Interesses geworden. Säugermilch enthält mindestens 130 dieser komplexen Oligosaccharide (siehe Urashima et al.: Milk Oligosaccharides. Nova Science Publisher (2011); oder Chen, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)).
  • Es häufen sich Beweise, dass die residente Gemeinschaft von Mikroben, Mikrobiom genannt, im menschlichen Verdauungstrakt eine wichtige Rolle bei Gesundheit und Krankheit spielt. Gerät die normale Zusammensetzung des Mikrobioms aus dem Gleichgewicht, kann dies Folgen für den menschlichen Wirt haben. Die jüngste Forschung hat Mikrobiom-Ungleichgewichte mit so unterschiedlichen Störungen wie Krebs, Fettleibigkeit, entzündlicher Darmerkrankung, Psoriasis, Asthma und möglicherweise sogar Autismus in Zusammenhang gebracht. HMOs modulieren das Mikrobiom vermutlich positiv und sie sind für diesen Zweck von wachsendem Interesse. Die bemerkenswerte Vielfalt von HMOs in Verbindung mit ihrer mangelnden Verfügbarkeit, insbesondere der komplexeren HMOs, hat jedoch Studien zu spezifischen Funktionen einzelner HMOs behindert und so die Erforschung ihres gesamten Potentials zur Verwendung bei der Förderung der menschlichen Gesundheit eingeschränkt.
  • Die natürliche Quelle für HMOs ist Säugermilch, die hauptsächlich Wasser enthält, zusammen mit 55-70 g/l Lactose, 24-59 g/l Lipiden, ca. 13 g/l Proteinen, 5-15 g/l HMOs und ca. 1,5 g/l Mineralien.
  • Bemühungen zur Entwicklung von Prozessen für die Produktion von HMOs im industriellen Maßstab haben in den letzten Jahren erheblich zugenommen. Es wurden Prozesse zur Herstellung von HMOs durch mikrobielle Fermentation, enzymatische Prozesse, chemische Synthesen oder Kombinationen aus diesen Technologien entworfen.
  • Genauer gesagt, wurde die Fermentation in E. coli erfolgreich für die industrielle Großproduktion von HMOs eingesetzt. WO 01/04341 beschreibt, wie Kern-Muttermilch-Oligosaccharide, die gegebenenfalls mit Fucose substituiert sind, unter Verwendung von genetisch modifiziertem E. coli erzeugt werden.
  • WO 2012/158517 und WO 2013/154725 beschreiben präbiotische Zusammensetzungen, die 3-FL, 2'-FL und DFL enthalten, und WO 2012/112777 beschreibt ein Gemisch aus 3-FL, 2'-FL, DFL und Lactose, produziert in einem genetisch modifizierten E. coli.
  • In dem Bemühen, Gemische aus HMOs synthetisch herstellen zu können, ohne alle Bestandteil-Oligosaccharide des Gemisches synthetisieren zu müssen, wurden enzymatische Prozesse für enzymatische Synthese von HMO-Oligosaccharid-Gemischen entwickelt und sind in WO 2012/156897 und WO 2012/156898 beschrieben. Als eine Weiterentwicklung beschreiben WO 2016/063261 und WO 2016/063262 optimierte Enzyme und enzymatische Prozesse zur Erzeugung fucosylierter HMOs. Diese Prozesse haben Reaktionsgemische geliefert, die viele verschiedene HMO-Oligosaccharide enthalten.
  • Nach wie vor umfassen diese Prozesse die Verwendung hoch spezialisierter Enzyme, was wiederum die Notwendigkeit für empfindliche Stöchiometrie und Reaktionsbedingungen, ebenso wie die Notwendigkeit der Beendigung von Reaktionen am Punkt des gewünschten Gleichgewichts der Reaktionen und der Entfernung sekundärer unerwünschter Metaboliten mit sich bringt.
  • Es besteht daher nach wie vor ein deutlicher Bedarf an weiteren spezifischen HMOs oder Kombinationen aus HMOs, um ein Mikrobiom in der gewünschten Weise zu modulieren, um spezifische Probleme der menschlichen Gesundheit anzugehen, ebenso wie an vereinfachten und präziseren Verfahren zu ihrer Herstellung.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Der erste Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Gemisch, bestehend aus oder im Wesentlichen bestehend aus einer Komponente A, die 3-FL ist, einer Komponente B, die LNFP-I ist, einer Komponente C, die 2'-FL ist, einer Komponente D, die LNDFH-I ist, einer Komponente E, die DFL ist, und gegebenenfalls einer Komponente F, die Lactose ist.
  • Der zweite Aspekt der Erfindung bezieht sich auf eine Zusammensetzung, die das Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus 2'-FL, 3-FL, LNFP-I, DFL, LNDFH-I und gegebenenfalls Lactose besteht, umfasst. Die Zusammensetzung kann eine nutritive, eine pharmazeutische oder eine kosmetische Zusammensetzung sein.
  • Der dritte Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die enzymatische Synthese des obigen Gemisches aus HMOs, vorzugsweise unter einer im Wesentlichen pufferfreien Bedingung. Die enzymatische Synthese umfasst eine enzymatische α1-3/4-Transfucosidasereaktion zwischen einem fucosylierten Donator-HMO und zwei fucosylierten Akzeptor-HMOs. Die enzymatische Synthese zur Herstellung eines Gemisches aus HMOs gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Schritte der Umsetzung einer Komponente A, einer Komponente B und einer Komponente C in der Gegenwart einer α1-3/4-Transfucosidase zur Erzeugung eines Reaktionsgemisches und des Entfernens der α1-3/4-Transfucosidase und gegebenenfalls Lactose aus dem Reaktionsgemisch. Die vorliegende Erfindung bezieht sich folglich auch auf ein Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus 2'-FL, 3-FL, LNFP-I, DFL, LNDFH-I und gegebenenfalls Lactose besteht und durch die vorliegend offenbarte enzymatische Synthese erhalten wird oder erhalten werden kann.
  • Ein spezielles Merkmal der enzymatischen Synthese gemäß der vorliegenden Erfindung ist, dass sie unter im Wesentlichen pufferfreien Bedingungen durchgeführt wird. Üblicherweise wird die enzymatische Synthese gemäß der vorliegenden Erfindung in einem pH-Bereich von pH 4,5 bis pH 7, wie vorzugsweise in einem pH-Bereich von pH 5,0 bis pH 6,0 durchgeführt.
  • Die α1-3/4-Transfucosidase, die bei der enzymatischen Synthese gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, besitzt vorzugsweise keine hydrolytische Aktivität oder zumindest signifikant verringerte hydrolytische Aktivität.
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die enzymatische Synthese gemäß der vorliegenden Erfindung ferner einen Entfernungsschritt, der einen Schritt zum Deaktivieren der α1-3/4-Transfucosidase enthält. Dieser Deaktivierungsschritt kann das Erhitzen der Reaktionslösung auf Temperaturen im Bereich von 60 °C bis 100 °C für einen Zeitraum im Bereich von 5 Minuten bis 180 Minuten umfassen.
  • Bei der enzymatischen Synthese gemäß der vorliegenden Erfindung wird die α1-3/4-Transfucosidase beispielsweise durch Mikrofiltration, Nanofiltration, Zentrifugation oder Ultrazentrifugation entfernt. Diese enzymatische Synthese kann mehr als einen Schritt zur Entfernung der α1-3/4-Transfucosidase umfassen. Ein Schritt kann aus dem Entfernen der α1-3/4-Transfucosidase mit pulverförmiger Aktivkohle im Chargenmodus bestehen. Alternativ kann der Schritt aus dem Entfernen der α1-3/4-Transfucosidase mit pulverförmiger Aktivkohle im Säulenmodus bestehen.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus 2'-FL, 3-FL, LNFP-I, DFL, LNDFH-I und gegebenenfalls Lactose besteht, oder eine Zusammensetzung, die das Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus 2'-FL, 3-FL, LNFP-I, DFL, LNDFH-I und gegebenenfalls Lactose besteht, umfasst, zur Verwendung bei der Behandlung, Vorbeugung und/oder Linderung einer Krankheit und/oder eines Leidens in Verbindung mit dem Mikrobiom-Ungleichgewicht.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Gemisches, das aus oder im Wesentlichen aus 2'-FL, 3-FL, LNFP-I, DFL, LNDFH-I und gegebenenfalls Lactose besteht, zur Verbesserung der Lebensfähigkeit von Probiotika in wässeriger Lösung.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf eine Verwendung eines Gemisches, das aus oder im Wesentlichen aus 2'-FL, 3-FL, LNFP-I, DFL, LNDFH-I und gegebenenfalls Lactose besteht, oder einer Zusammensetzung, die das Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus 2'-FL, 3-FL, LNFP-I, DFL, LNDFH-I und gegebenenfalls Lactose besteht, umfasst, bei der diätetischen Behandlung eines Menschen oder bei einer kosmetischen Anwendung.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
    • Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beigefügte 1, die die Koloniezählung von L. rhamnosus nach 3 h Inkubation mit oder ohne HMOs bei 37 °C und pH 3,0 zeigt, ausführlich beschrieben.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • Allgemein sollen alle der hierin verwendeten Ausdrücke gemäß ihrer gewöhnlichen Bedeutung auf dem technischen Gebiet und als auf alle Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung anwendbar ausgelegt werden, sofern nicht etwas anderes ausdrücklich definiert oder angegeben ist.
  • Alle Verweise auf „ein/eine/der/die/das [Sequenz, Enzym, Schritt usw.]“ sollen als offen in Bezug auf mindestens ein Beispiel für die Sequenz, das Enzym, den Schritt usw. ausgelegt werden, sofern nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist.
  • Die Schritte eines hierin offenbarten Verfahrens müssen nicht in der genauen Reihenfolge, die offenbart ist, ausgeführt werden, wenn nicht ausdrücklich angegeben.
  • Das Wort „umfassend“ wird eher im Sinne von „einschließend“ verwendet, als dass es „bestehend aus“ bedeutet.
  • Im Kontext der Erfindung bedeutet der Ausdruck „Oligosaccharid“ ein Saccharidpolymer, das mehrere Monosaccharideinheiten enthält, die über Interglycosid-Verknüpfungen miteinander verbunden sind. Bevorzugte Oligosaccharide der Erfindung sind Muttermilch-Oligosaccharide (HMOs).
  • Der Ausdruck „Muttermilch-Oligosaccharid“ oder „HMO“ bedeutet im vorliegenden Kontext ein komplexes Kohlenhydrat, das in menschlicher Brustmilch zu finden ist (als Verweis, siehe Urashima et al.: Milk Oligosaccharides. Nova Science Publisher (2011); oder Chen, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)).
  • Im Speziellen ist 2'-FL 2'-Fucosyllactose (Fucα1-2Galβ1-4Glc), 3-FL ist 3-Fucosyllactose (Galβ1-4[Fucα1-3]Glc), DFL ist Difucosyllactose (Fucα1-2Galβ1-4[Fucα1-3]Glc), LNFP-I ist Lacto-N-fucopentaose I (Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) und LNDFH-I ist Lacto-N-difucohexaose (Fucα1-2Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc). Bei den obigen Strukturen bedeutet Fuc L-Fucopyranosyl-, Gal bedeutet D-Galactopyranosyl-, Glc bedeutet D-Glucopyranose- und GlcNAc bedeutet D-(2-Acetylamino)-2-desoxy-glucopyranosyl-Einheit. Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird Lactose nicht als eine HMO-Spezies angesehen.
  • Im Kontext der Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Donator“ auf ein fucosyliertes Saccharid, wobei ein α1-3-Fucosyl durch eine enzymkatalysierte Reaktion auf ein anderes Saccharid überführt wird, wonach das erzeugte Produkt ein α1-3-Fucosyl oder ein α1-4-Fucosyl enthaltendes Saccharid ist. Der Ausdruck „Akzeptor“ bezieht sich auf das Saccharid, auf das die Fucosylgruppe aus dem Donator überführt wurde.
  • „Diätetische Behandlung“ bedeutet ausschließliche oder teilweise Ernährung von Patienten, die aufgrund einer Krankheit, einer Störung oder eines medizinischen Leidens unter:
    • - eingeschränkter, beeinträchtigter oder gestörter Fähigkeit zur Aufnahme, Verdauung, Absorption, Verstoffwechselung oder Ausscheidung gewöhnlicher Nahrung oder spezieller Nährstoffe, die darin enthalten sind, oder Metaboliten, oder
    • - anderen medizinisch-bestimmten Nährstoffbedürfnissen leiden
    (siehe: Commission Notice on the classification of Food for Special Medical Purposes of the European Commission, Official Journal of the European Union C 401, 25.11.2017, S. 10-11).
  • „Mikrobiota“, „Mikroflora“ und „Mikrobiom“ bedeuten eine Gemeinschaft von lebenden Mikroorganismen, die typischerweise ein Körperorgan oder einen Teil, insbesondere die Magen-Darm-Organe von Menschen, bewohnen. Die dominantesten Vertreter der Magen-Darm-Mikrobiota umfassen Mikroorganismen der Stämme von Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Synergistetes, Verrucomikrobia, Fusobacteria und Euryarchaeota, auf der Gattungsebene Bacteroides, Faecalibacterium, Bifidobacterium, Roseburia, Alistipes, Collinsella, Blautia, Coprococcus, Ruminococcus, Eubacterium und Dorea, auf der Speziesebene Bacteroides uniformis, Alistipes putredinis, Parabacteroides merdae, Ruminococcus bromii, Dorea longicatena, Bacteroides caccae, Bacteroides thetaiotaomikron, Eubacterium hallii, Ruminococcus torques, Faecalibacterium prausnitzii, Ruminococcus lactaris, Collinsella aerofaciens, Dorea formicigenerans, Bacteroides vulgatus und Roseburia intestinalis. Die Magen-Darm-Mikrobiota umfasst die schleimhautassoziierte Mikrobiota, die sich in der Schleimhautschicht, die das Epithel des Magen-Darm-Traktes bedeckt, befindet oder daran haftet, und lumenassoziierte Mikrobiota, die im Lumen des Magen-Darm-Traktes zu finden ist.
  • „Modulieren von Mikrobiom“ bedeutet das Ausüben eines modifizierenden oder regulierenden Einflusses auf Mikrobiota, beispielsweise einen Einfluss, der zu einer Erhöhung der indigenen Darmdichte von Bifidobacterium-, Barnesiella-, Faecalibacterium- und/oder Butyrat produzierenden Bakterien führt. In einem anderen Beispiel kann der Einfluss zu einer Verringerung der Darmdichte von Ruminococcus gnavus und/oder Proteobakterien führen. „Proteobakterien“ sind ein Stamm von Gram-negativen Bakterien und umfassen eine breite Vielzahl an pathogenen Bakterien, wie Escherichia, Salmonella, Vibrio, Helicobacter, Yersinia und viele andere bedeutende Gattungen.
  • „Orale Verabreichung“ bedeutet eine herkömmliche Form für die Abgabe einer Zusammensetzung an einen Menschen über den Mund.
  • „Vorbeugende Behandlung“ oder „Vorbeugung“ bedeutet eine Behandlung oder Maßnahme zur Verringerung des Risikos für den Ausbruch oder das Wiederkehren einer Krankheit.
  • „Behandeln“ bedeutet, sich einem medizinischen Leiden oder einer Krankheit zu widmen, mit dem Ziel, ein Resultat bei der behandelten Person zu verbessern oder zu stabilisieren, oder sich einem zugrundeliegenden Nährstoffbedarf zu widmen. Behandeln umfasst daher die diätetische oder nutritive Behandlung des medizinischen Leidens oder der Krankheit, indem sich Nährstoffbedürfnissen der behandelten Person gewidmet wird. „Behandeln“ und „Behandlung“ haben grammatikalisch entsprechende Bedeutungen.
  • Alle vorstehend erwähnten Lehren sind hierin durch Verweis aufgenommen. Die Erwähnung eines früher veröffentlichten Dokuments in diesem Dokument ist nicht als Eingeständnis oder Zusicherung zu verstehen, dass die darin enthaltene Lehre zum Zeitpunkt des Erscheinens dieses Dokuments allgemein bekannt war.
  • Das neue HMO-Gemisch
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde überraschend entdeckt, dass ein neues Gemisch aus 5 fucosylierten HMOs durch eine enzymatische Synthese unter Verwendung eines HMO-Start-Donators und zweier HMO-Start-Akzeptoren hergestellt werden kann. Die Reaktion kann vorzugsweise unter im Wesentlichen pufferfreien Bedingungen durchgeführt werden. Ebenso besitzt das Enzym vorzugsweise nur eine eingeschränkte oder keine hydrolytische Aktivität.
  • Das neue Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus 5 fucosylierten HMOs besteht, weist eine einzigartige neue Kombination von Eigenschaften und biologischen Aktivitäten auf. Im Speziellen kann das Gemisch zur Modulation des Mikrobioms eines Menschen verwendet werden, wie zur Erhöhung der Bifidobacterium-Dichte und Barnesiella-Dichte im Mikrobiom eines Menschen. Ferner kann das Gemisch die Firmicutes-Dichte im menschlichen Mikrobiom verringern, insbesondere von Clostridia. Das Gemisch kann ebenso zur Behandlung eines und/oder Verringerung des Risikos für einen breiten Bereich(es) an menschlichen bakteriellen und viralen Infektionen verwendet werden, sowie für. Das hierin beschriebene neue Gemisch aus HMOs ist infektionsverhindernd. Ferner erhöht das Gemisch in Kombination mit einem Probiotikum die Lebensfähigkeit dieses Probiotikums in wässeriger Lösung erheblich.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus:
    1. a) einer Komponente A, die 3-FL ist,
    2. b) einer Komponente B, die LNFP-I ist,
    3. c) einer Komponente C, die 2'-FL ist,
    4. d) einer Komponente D, die LNDFH-I ist,
    5. e) einer Komponente E, die DFL ist, und gegebenenfalls
    6. f) einer Komponente F, die Lactose ist, besteht.
  • Folglich ist eine Ausführungsform der Erfindung ein Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus:
    1. a) einer Komponente A, die 3-FL ist,
    2. b) einer Komponente B, die LNFP-I ist,
    3. c) einer Komponente C, die 2'-FL ist,
    4. d) einer Komponente D, die LNDFH-I ist, und
    5. e) einer Komponente E, die DFL ist, besteht.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus:
    1. a) einer Komponente A, die 3-FL ist,
    2. b) einer Komponente B, die LNFP-I ist,
    3. c) einer Komponente C, die 2'-FL ist,
    4. d) einer Komponente D, die LNDFH-I ist,
    5. e) einer Komponente E, die DFL ist, und
    6. f) einer Komponente F, die Lactose ist, besteht.
  • Eine enzymatische Synthese zur Herstellung des Gemisches aus HMOs gemäß der Erfindung
  • In den folgenden Absätzen ist der Ausdruck „kann tragen“ äquivalent zu dem Ausdruck „trägt gegebenenfalls“, und der Ausdruck „kann substituiert sein“ ist äquivalent zu dem Ausdruck „ist gegebenenfalls substituiert“.
  • Das oben beschriebene neue Gemisch fucosylierter HMOs wird durch eine enzymatische Synthese, umfassend einen Fucosyl-HMO-Donator, der Komponente A (3-FL) ist, zwei Fucosyl-HMO-Akzeptoren, die Komponente B (LNFP-I) und Komponente C (2'-FL) sind, und eine Transfucosidase, vorzugsweise unter im Wesentlichen pufferfreien Bedingungen hergestellt. Ebenso bevorzugt besitzt in dieser Reaktion das Enzym eine eingeschränkte oder keine hydrolytische (das heißt Fucosidase-) Aktivität.
  • Folglich bezieht sich diese Erfindung auch auf ein Verfahren zur Herstellung eines Gemisches aus HMOs, das aus oder im Wesentlichen aus einer Komponente A, die 3-FL ist, einer Komponente B, die LNFP-I ist, einer Komponente C, die 2'-FL ist, einer Komponente D, die LNDFH-I ist, einer Komponente E, die DFL ist, und einer Komponente F, die Lactose ist, besteht, durch Umsetzen der Komponenten A, B und C in der Gegenwart einer α1-3/4-Transfucosidase unter Erzeugung eines Reaktionsgemisches, das die Komponenten A, B, C, D, E und Lactose enthält, und dann Entfernen der α1-3/4-Transfucosidase aus dem Reaktionsgemisch. Die α1-3/4-Transfucosidase kann auf herkömmliche Weise entfernt werden, z. B. durch Denaturieren des Reaktionsgemisches, gefolgt von ihrer Zentrifugation oder Ultrafiltration.
  • Ein Aspekt dieser Erfindung bezieht sich ebenso auf ein Verfahren zum Erhalt eines Gemisches aus HMOs, das aus oder im Wesentlichen aus einer Komponente A, die 3-FL ist, einer Komponente B, die LNFP-I ist, einer Komponente C, die 2'-FL ist, einer Komponente D, die LNDFH-I ist, und einer Komponente E, die DFL ist, besteht, umfassend die Schritte des Umsetzens der Komponenten A, B und C in der Gegenwart einer α1-3/4-Transfucosidase unter Erzeugung eines Reaktionsgemisches, das die Komponenten A, B, C, D, E und Lactose enthält, und dann Entfernens von Lactose und der α1-3/4 Transfucosidase aus dem Reaktionsgemisch. Die α1-3/4-Transfucosidase kann beispielsweise durch ihre Denaturierung, gefolgt von Zentrifugation oder Ultrafiltration entfernt werden. Die Lactose kann von den Komponenten A, B, C, D und E beispielsweise durch Kaskadenultra- und/oder -nanofiltration abgetrennt werden, oder die Lactose kann zunächst mit Lactase behandelt werden, um sie in Glucose und Galactose zu zersetzen, die dann von den Komponenten A, B, C, D und E durch Ultra- und/oder Nanofiltration abgetrennt werden können.
  • Das geeignete Enzym (Protein) zur Durchführung der obigen enzymatischen Reaktion ist eine α1-3/4-Fucosidase oder eine α1-3/4-Transfucosidase. Diese Enzyme können einen Fucosylrest aus einem Fucosyl-Donator überführen, wobei der Fucosylrest mit einer α1-3-Verknüpfung an einen Akzeptor gebunden ist. Im Speziellen wird, wenn der Akzeptor ein HMO ist, der Fucosylrest zu der 4-Stellung eines GlcNAc in dem HMO-Akzeptor überführt, oder, wenn diese Stellung nicht frei ist oder es kein GlcNAc in der HMO-Akzeptorstruktur gibt, zu der 3-Stellung von Glc.
  • Die α1-3/4-(Trans)fucosidase ist eine natürliche α1-3/4-L-Fucosidase, wie gemäß EC 3.2.1.111 klassifiziert, oder ihre genetisch modifizierte Mutante. Alle natürlichen α1-3/4-L-Fucosidasen können zu einem gewissen Ausmaß als eine Transfucosidase agieren.
  • Eine bevorzugte α1-3/4-(Trans)fucosidase, die zur Durchführung der enzymatischen Reaktion gemäß der Erfindung geeignet ist, ist eine α1-3/4-(Trans)fucosidase, die mindestens 60%ige, vorzugsweise mindestens 70%ige, stärker bevorzugt mindestens 80%ige, insbesondere mindestens 90%ige Identität mit Aminosäurepositionen 56 bis 345 der α1-3/4-Fucosidase aus Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697 aufweist, wie in US-Patent 8361756 , als Protein von SEQ ID NO:18 (in der vorliegenden Anmeldung bezeichnet als SEQ ID NO:1) angegeben.
  • Bei der enzymatischen Synthese der Erfindung kann die Hydrolyse der Komponenten aufgrund zunehmender Konzentrationen der hergestellten Komponenten der Reaktion signifikant werden, wobei die α3/4-fucosylierten Komponenten dann in nicht-α3/4-fucosylierte Komponenten, Lactose, 2'-FL und LNFP-I und freie Fucose hydrolysiert werden. Daher besitzt die α1-3/4-Transfucosidase der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine eingeschränkte oder keine hydrolytische Aktivität. Die eingeschränkte oder fehlende hydrolytische Aktivität der α1-3/4-Transfucosidase ermöglicht längere Reaktionsdauern als sie anderweitig möglich wären.
  • Daher ist eine stärker bevorzugte α1-3/4-Transfucosidase zur Herstellung der HMO-Gemische dieser Erfindung eine α1-3/4-Transfucosidase ohne hydrolytische Aktivität oder mit zumindest signifikant verringerter hydrolytischer Aktivität.
  • Eine solche α1-3/4-Transfucosidase kann durch Verändern der Aminosäuresequenz an einer oder mehreren Aminosäurepositionen erzeugt werden, so dass die mutierte Aminosäuresequenz zu verbesserter Transfucosidaseaktivität und/oder verringerter hydrolytischer Aktivität führt. Gemäß dieser Erfindung wurde die α1-3/4-Transfucosidase
    1. a) zumindest an einer oder mehreren der folgenden Aminosäurepositionen von SEQ ID NO:1 mutiert: 134, 135, 168, 170, 174, 216, 221, 236, 237, 244, 245, 282 und 413, vorzugsweise zumindest an einer oder mehreren der folgenden Aminosäurepositionen: 134, 135, 174, 216, 221, 282 und 413; und liefert dadurch
    2. b) eine Umwandlungsrate von mindestens 20 % bis zu 70 %, wie mindestens 35 % oder wie mindestens 40 % oder wie mindestens 50 %, für die enzymatische Reaktion der vorliegenden Erfindung.
  • Geeigneterweise sind die in der Erfindung verwendeten mutierten Fucosidasen nichtnatürliche Fucosidasen, das heißt, sie werden nicht in der Natur erzeugt oder sind nicht natürlich vorkommend, sondern werden als ein Ergebnis chemischer Synthese, Gentechnik oder ähnlichen Verfahren im Labor erzeugt, was zu synthetischen mutierten Fucosidasen führt.
  • Vorzugsweise umfasst die mutierte α1-3/4-Transfucosidase das Polypeptid von SEQ ID NO:1 und eine Aminosäuremutation zumindest an einer oder mehreren der folgenden Aminosäurepositionen: 134, 135, 174, 216, 221 und 282 oder besteht daraus.
  • Stärker bevorzugt umfasst die α1-3/4-Transfucosidase dieses ersten Aspekts das Polypeptid von SEQ ID NO:1 und eine Aminosäuremutation zumindest an Aminosäureposition 174 und an einer oder mehreren der folgenden Aminosäurepositionen: 134, 135, 170, 216, 221, 236, 237, 241, 244, 245 und 282, vorzugsweise an einer oder mehreren der folgenden Aminosäurepositionen: 134, 135, 216, 221 und 282, oder besteht daraus.
  • Stärker bevorzugt umfasst die α1-3/4-Transfucosidase auch das Polypeptid von SEQ ID NO:1 und eine Aminosäuremutation zumindest an Aminosäureposition 135 und an einer oder mehreren der folgenden Aminosäurepositionen: 134, 170, 174, 216, 221, 236, 237, 241, 244, 245 und 282, vorzugsweise an einer oder mehreren der folgenden Aminosäurepositionen: 134, 135, 216, 221 und 282, oder besteht daraus.
  • Noch stärker bevorzugt umfasst die α1-3/4-Transfucosidase das Polypeptid von SEQ ID NO:1 und eine Aminosäuremutation zumindest an Aminosäurepositionen 135 und 174 und an einer oder mehreren der folgenden Aminosäurepositionen: 134, 170, 216, 221, 236, 237, 241 und 282, vorzugsweise an einer oder mehreren der folgenden Aminosäurepositionen: 134, 216, 221 und 282, oder besteht daraus.
  • Gegebenenfalls umfasst die α1-3/4-Transfucosidase das Polypeptid von SEQ ID NO:1 und eine Aminosäuremutation zumindest an Aminosäurepositionen 135 und/oder 174 und an einer oder mehreren der folgenden Aminosäurepositionen: 134, 170, 216, 221, 236, 237, 241 und 282, vorzugsweise an einer oder mehreren der folgenden Aminosäurepositionen: 134, 216, 221 und 282, und es gibt eine weitere Mutation an einer oder mehreren der folgenden Aminosäurepositionen: 165, 168, 232, 237, 258, 260 oder 274, oder besteht daraus.
  • Vorzugsweise umfasst die α1-3/4-Transfucosidase die Sequenz von SEQ ID NO:1 mit Mutationen:
    • - an Aminosäureposition 135 und/oder 174 und
    • - zumindest an einer Aminosäureposition, ausgewählt aus 168, 237 und 413
    oder besteht stärker bevorzugt daraus.
  • In diesem Aspekt ist an Position 135 Trp (W) vorzugsweise mit Ala, Asp, Asn, Glu, Gln, His, Phe, Leu, Lys, Val oder Tyr, stärker bevorzugt Phe oder Tyr substituiert; an Position 168 ist Ser (S) vorzugsweise mit Glu (E) substituiert; an Position 174 ist Ala (A) vorzugsweise mit Arg, Asn, Cys, Glu, Ile, His, Leu, Lys, Met, Phe, Trp, Tyr oder Val, stärker bevorzugt Asn, His oder Phe substituiert; an Position 237 ist Glu (E) vorzugsweise mit His (H) substituiert und an Position 413 ist Glu (E) mit Arg (R) substituiert.
  • Noch stärker bevorzugt umfasst die α1-3/4-Transfucosidase die Sequenz von SEQ ID NO:1, wie oben beschrieben, mit Mutationen:
    • - an Aminosäureposition 174,
    • - an einer Aminosäureposition 135 oder 168 und
    • - an Aminosäureposition 413
    • - und gegebenenfalls an Aminosäureposition 165, 232, 258, 260 oder 274
    oder besteht stärker bevorzugt daraus.
  • Die obige Kombination von Mutationen verleiht dem mutierten Enzym nicht nur eine noch bessere Transfucosidase-Syntheseleistung, sondern auch höhere Stabilität, insbesondere Temperaturstabilität, während gleichzeitig noch bessere Transfucosidase-Syntheseleistung beibehalten wird. Die Mutationen an 135, 165, 174, 232, 258, 260 und 274 sind vorzugsweise die folgenden:
    • - an Position 135 als W135F oder W135Y,
    • - an Position 165 als P165E,
    • - an Position 174 als A174F, A174H oder A174N,
    • - an Position 232 als R232A,
    • - an Position 258 als Q258R,
    • - an Position 260 als D260P,
    • - an Position 274 als N274A.
  • Vorzugsweise liefert die mutierte α1-3/4-Transfucosidase, die das Polypeptid von SEQ ID NO:1 und eine Mutation zumindest an Aminosäureposition 174 oder 282, vorzugsweise zumindest an beiden Aminosäurepositionen umfasst oder daraus besteht, signifikant oder vollständig unterdrückte hydrolytische Aktivität. Diesbezüglich ist an Position 174 Ala (A) vorzugsweise durch Phe (F), Asn (N) oder His (H) ersetzt und/oder an Position 282 ist Val (V) vorzugsweise durch Arg (R), Glu (E), His (H) oder Lys (K) ersetzt. Die unterdrückte hydrolytische Aktivität ist von Vorteil, weil das mutierte Enzym dann den Donator und/oder das Produkt durch Hydrolyse nicht signifikant zersetzt. Im Ergebnis wird die Transfucosidasereaktion nicht länger kinetisch gesteuert und es kann ein viel besseres Synthese/Hydrolyse-Verhältnis (eine bessere Syntheseleistung) erzielt werden. Mutation an einer oder beiden, vorzugsweise beiden der obigen Aminosäurepositionen kann eine um das mindestens 100-Fache, vorzugsweise mindestens 1.000-Fache, stärker bevorzugt mindestens 10.000-Fache verringerte hydrolytische Aktivität hinsichtlich der fucosylierten Produkte liefern.
  • Folglich weist die mutierte α1-3/4-Transfucosidase
    1. a) das Polypeptid von SEQ ID NO:1 und eine Mutation zumindest an Aminosäureposition 174 oder 282 und
    2. b) eine signifikant oder vollständig unterdrückte hydrolytische Aktivität im Vergleich zu dem Protein gemäß SEQ ID NO: 1 auf.
  • Überdies umfasst die mutierte α1-3/4-Transfucosidase gemäß einer bestimmten Ausführungsform das Polypeptid von SEQ ID NO:1 und eine Mutation von
    • - zumindest der Aminosäureposition 174 oder 282, und
    • - zumindest der Aminosäureposition 165, 168, 232, 237, 258, 260 oder 274 oder besteht vorzugsweise daraus.
  • Die oben offenbarte Kombination von Mutationen verleiht nicht nur eine signifikant verringerte, vorzugsweise praktisch nicht nachweisbare Hydrolyse des fucosylierten Produktes, sondern auch eine höhere Stabilität, insbesondere Temperaturstabilität.
  • Daher weist die mutierte α1-3/4-Transfucosidase im Vergleich zu dem Protein gemäß SEQ ID NO: 1
    1. a) das Polypeptid von SEQ ID NO:1 mit einer Mutation zumindest an der Aminosäure an Position 174 oder 282 und zumindest an der Aminosäureposition 165, 168, 232, 237, 258, 260 oder 274, und
    2. b) signifikant oder vollständig unterdrückte hydrolytische Aktivität, und/oder
    3. c) höhere Stabilität, insbesondere Temperaturstabilität, auf.
  • Vorzugsweise umfasst die mutierte α1-3/4-Transfucosidase die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:1, eine Mutation zumindest der Aminosäure an Position 174 oder 282, stärker bevorzugt ist an Position 174 Ala (A) vorzugsweise durch Phe (F), Asn (N) oder His (H) ersetzt und/oder ist an Position 282 Val (V) vorzugsweise durch Arg (R), Glu (E), His (H) oder Lys (K) ersetzt, oder besteht vorzugsweise daraus.
  • Eine besonders bevorzugte modifizierte α1-3/4-Transfucosidase umfasst die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:1 mit den folgenden Mutationen: W135F-A174N-N274A-E413R, wobei die Aminosäurenummerierung SEQ ID NO: 1 entspricht, oder besteht daraus.
  • Bei der Durchführung des Verfahrens dieser Erfindung sind bestimmte relative Konzentrationen des Komponente-A-Donators, der Komponente-B- und -C-Akzeptoren, der α1-3/4-Transfucosidase, des wässerigen Lösungsmittels und des Inkubationspuffers nicht kritisch. Diesbezüglich kann das Verfahren geeigneterweise bei Raumtemperatur (z. B. 15-50, vorzugsweise 20-37 °C) bei einem pH von 4-7, vorzugsweise 5-6, für 15 min bis 24 Stunden durchgeführt werden. Die Reaktion wird üblicherweise so geführt, dass ein Gleichgewicht erreicht wird.
  • Bei der enzymatischen Reaktion wird Komponente A als Fucosyl-Donator bereitgestellt und Komponenten B und C werden als Fucosyl-Akzeptoren bereitgestellt. Im Verlauf der Reaktion wird bei der α1-3/4-Transfucosidase ein Fucosylrest aus dem Donator in beide Akzeptoren überführt, wodurch Komponente D, Komponente E und Lactose erzeugt werden. Die neu erzeugte Komponente E kann aber auch als ein Fucosyl-Donator dienen, was zu einer enzymatischen α1-3/4-Transfucosidasereaktion zwischen Komponente E und Komponente B unter Erzeugung von Komponente D und Komponente C oder zwischen Komponente E und Lactose unter Erzeugung von Komponente A und Komponente C in weiteren Teil-Gleichgewichtsreaktionen führt.
  • Stärker bevorzugt wird die α1-3/4-Transfucosidase, vorteilhafterweise die W135F-A174N-N274A-E413R-Mutante (Aminosäurenummerierung entspricht SEQ ID NO:1) in etwa 0,09-0,11 Gew.-%, basierend auf dem anfänglichen Gesamtgewicht von Komponenten A, B und C, verwendet. Die Menge an Enzym hat keinen Einfluss auf den Endanteil der HMOs in der erhaltenen Zusammensetzung, sie hat lediglich eine Auswirkung, wenn das Gleichgewicht erreicht ist (eine höhere Enzymkonzentration führt zu einer kürzeren Zeit, in der das Gleichgewicht erreicht wird).
  • Hinsichtlich der Herstellung des Gemisches, das aus oder im Wesentlichen aus Komponenten A, B, C, D, E und gegebenenfalls Lactose besteht, vorzugsweise der Gemische gemäß einer der nachstehend offenbarten Ausführungsformen i) bis iv), wird die enzymatische Synthese gemäß der Erfindung in der Gegenwart eines geeigneten Puffers, vorzugsweise aber unter im Wesentlichen pufferfreien Bedingungen durchgeführt.
  • Angesichts der Erfindung ist eine gepufferte Lösung eine Lösung, die einen Puffer enthält und dadurch gekennzeichnet ist, dass der pH der Lösung Veränderungen der freien Wasserstoffionenkonzentration im Ergebnis interner und/oder Umweltfaktoren standhält. Ferner hält eine gepufferte Lösung je nach verwendetem Puffer den pH für ein Reaktionssystem im Wesentlichen innerhalb eines speziellen pH-Bereiches. Überdies liefern gepufferte Lösungen für enzymatische Reaktionen bekanntermaßen essentielle Co-Faktoren für enzymatisch betriebene Reaktionen, z. B. kritische Salze, und halten ebenso Veränderungen der Wasserstoffionenkonzentration und Bedingungen, die Proteine im Allgemeinen stabilisieren, stand. In der Folge erwartet der Fachmann bei der Durchführung einer enzymatischen Reaktion, dass dem Reaktionsmilieu Puffer und/oder Komponenten zugeführt werden müssen, die normalerweise als Wesentlich für die korrekte Funktion des Enzyms angesehen werden.
  • Vor der Weiterverarbeitung der Reaktionsprodukte müssen jedoch diese zusätzlichen Mittel und/oder Komponenten und/oder ihre restlichen Produkte aus der Reaktion entfernt werden, was sowohl zeitaufwendig als auch schwierig sein kann und zusätzliche unerwünschte Kosten für das Herstellungsverfahren bedeutet.
  • Es ist überraschend herausgefunden worden, dass die enzymatische Synthese gemäß der vorliegenden Erfindung unter im Wesentlichen pufferfreien Bedingungen durchgeführt werden kann, wodurch die Notwendigkeit der Bereitstellung und Entfernung der Puffer und/oder Komponenten ausgeräumt wird.
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die hierin beschriebene enzymatische Synthese in gereinigtem Wasser durchgeführt, wobei der Reinigungsschritt einen oder mehrere Reinigungsprozesse, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Umkehrosmose, Filtration, Ultrafiltration, Sedimentation, Chlorierung, lodzugabe, Elektrodialyse, Sieden, Entsalzung und Flockung, umfassen kann.
  • In einem im Vorliegenden bevorzugten Aspekt der Erfindung wird die enzymatische Synthese in Wasser mit einer Leitfähigkeit vor der Verwendung in der enzymatischen Synthese unter 10 µS/cm, wie unter 5 µS/cm, wie unter 1 µS/cm, wie unter 0,1 µS/cm, und/oder einem Siliciumdioxidgehalt unter 0,05 mg/l, wie unter 0,04 mg/l, wie unter 0,02 mg/l oder wie unter 0,01 mg/l durchgeführt.
  • Bei einer enzymatischen Synthese gemäß der vorliegenden Erfindung sind im Wesentlichen pufferfreie Bedingungen Bedingungen, bei denen dem gereinigten Wasser keine zusätzlichen Puffer zugegeben werden.
  • Im vorliegenden Kontext umfasst der Ausdruck „im Wesentlichen pufferfrei“ auch eine Lösung, der anorganische Salze zugegeben werden, um das Wasser mit der zuvor spezifizierten Leitfähigkeit und den Reinheitsbereichen zu reinigen, die als Stabilisatoren für das Enzym agieren, wobei die Salze keine Pufferfähigkeiten besitzen. Beispiele für Salze umfassen die üblichen Salze wie Natriumchlorid (NaCl), Calciumchlorid (CaCl2), Magnesiumchlorid (MgCl2), Kaliumchlorid (KCI) und Natriumsulfat (Na2SO4), sind aber nicht darauf beschränkt.
  • In einem Aspekt einer enzymatischen Synthese können gemäß der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen pufferfreie Bedingungen eine Menge an Salz in einem Bereich von 1 mikromolar bis 1 molar, in einem bevorzugten Bereich wie 100 mikromolar bis 500 millimolar oder in einem noch stärker bevorzugten Bereich von 1 millimolar bis 300 millimolar umfassen. In einem anderen Aspekt bezieht sich die im Wesentlichen pufferfreie Bedingung auf die Gegenwart von Spurenionen in Wasser in einer Konzentration, die zu einer Leitfähigkeit unter 5 µS/cm führt.
  • In einem anderen Aspekt der Erfindung umfasst der Ausdruck „im Wesentlichen pufferfrei“ auch die Verwendung von Leitungswasser.
  • Die Gegenwart von Ionen in einer Lösung, mit oder ohne die Zugabe von Salzen zu der Lösung, kann den pH der Lösung beeinflussen, selbst bei Spurenkonzentrationen, was zu einer Leitfähigkeit über 5 µS/cm führt, nach wie vor ohne, dass den im Wesentlichen pufferfreien Bedingungen Pufferfähigkeiten verliehen werden. Ferner kann die Zugabe von Reaktanten zu einer Lösung unter im Wesentlichen pufferfreier Bedingung auch den pH der Lösung verändern, ebenso wie die Leitfähigkeit. In der Folge werden im vorliegenden Kontext die Bedingungen nach der Zugabe von Ionen und/oder Reaktanten zu der Reaktionslösung nach wie vor als im Wesentlichen pufferfrei angesehen.
  • In einem bevorzugten Aspekt einer enzymatischen Synthese wird gemäß der vorliegenden Erfindung die Synthese in einer im Wesentlichen pufferfreien Lösung durchgeführt, wobei der pH im Bereich von pH 4 bis pH 7, vorzugsweise bei pH 5 bis pH 6 liegt.
  • Vor der Nutzung eines Gemisches aus HMOs gemäß der Erfindung als eine Behandlung oder anderweitig müssen unerwünschte Reaktionskomponenten entfernt werden. Unerwünschte Produkte des Endproduktes sind beispielsweise Enzyme, wie die α1-3/4-Transfucosidase, Lactose, zusätzliche Spurenprodukte und/oder ähnliche unerwünschte Produkte.
  • Ferner kann eine enzymatische Synthese gemäß der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere Schritte zur Deaktivierung und Abtrennung der α1-3/4-Transfucosidase von dem verbleibenden Reaktionsgemisch umfassen.
  • Die enzymatische Synthese wird in einem Reaktionsgefäß durchgeführt, und in einigen Fällen kann es von Vorteil sein, die Lösung aus dem Reaktionsgefäß, das ein Prozesstank oder ein Kunststoffbehälter oder irgendein anderes geeignetes Gefäß zur Durchführung der Synthese ist, in einen zweiten Behälter, beispielsweise mit Druckregelung, Temperaturregelung und/oder Regelung einer flüssigen und/oder einer gasförmigen Umgebung, zu überführen. Daher kann eine enzymatische Synthese in einer Weise durchgeführt werden, in der das Reaktionsgefäß und das Inaktivierungs-/Deaktivierungsgefäß dieselben sind, oder sie kann in einer Weise durchgeführt werden, in der das Reaktionsgefäß und das Inaktivierungs-/Deaktivierungsgefäß nicht dieselben sind.
  • Der Deaktivierungsschritt kann das Erhitzen auf eine Temperatur im Bereich von 60 °C bis 100 °C für ein Zeitintervall von 1 Minute bis 180 Minuten, wie 5 Minuten bis 150 Minuten, 10 Minuten bis 120 Minuten, 15 Minuten bis 90 Minuten, und 30 Minuten bis 60 Minuten umfassen. In einem bevorzugten Aspekt umfasst der Deaktivierungsschritt das Erhitzen des Reaktionsgemisches auf eine Temperatur im Bereich von 60 °C bis 100 °C für eine Zeit von mindestens 1, 5, 10, 30 oder 60 Minuten.
  • Nach dem einen oder den mehreren Schritt(en) zur Deaktivierung der α1-3/4-Transfucosidase aus dem verbleibenden Reaktionsgemisch umfasst eine enzymatische Synthese der vorliegenden Erfindung ferner einen oder mehrere Schritt(e) zum Entfernen der deaktivierten α1-3/4-Transfucosidase aus dem synthetisierten HMO-Gemisch, wodurch das Gemisch bereitgestellt wird, dass aus oder im Wesentlichen aus Komponenten A, B, C, D, E und Lactose besteht, vorzugsweise die Gemische gemäß einer der nachstehend offenbarten Ausführungsformen i) und ii), einschließlich ihrer bevorzugten und stärker bevorzugten Ausführungsformen.
  • In der Regel kann die α1-3/4-Transfucosidase aus dem synthetisierten Gemisch aus HMOs durch herkömmliche Trennmethoden, wie Filtration (Nano-, Ultra- oder Mikrofiltration), Entfernung durch Zentrifugation oder Ultrazentrifugation, Behandeln des Reaktionsgemisches mit pulverisierter Aktivkohle im Chargenmodus und/oder im Säulenmodus und/oder chromatographischer Methoden, wie lonenaustausch, Affinitätschromatographie, Größenausschlusschromatographie, normale Phasen- oder Umkehrphasenchromatographie, vorzugsweise nachdem dass für die Synthese verwendete Enzym denaturiert oder deaktiviert worden ist, entfernt werden. Methoden zur Abtrennung können zu einer Mehrschrittabtrennung kombiniert werden.
  • In einem Aspekt der Erfindung wird das Reaktionsgemisch, das eine α1-3/4-Transfucosidase enthält, mit Aktivkohle behandelt, beispielsweise wird das Reaktionsgemisch unter Anwendung einer peristaltischen Strömung, einer Hochdruckströmung oder einer Gravitationsströmung über eine mit Aktivkohle gepackte Säule geleitet.
  • In einem anderen Aspekt der Erfindung kann bei der Nutzung von Ultrafiltration oder Mikrofiltration zum Abtrennen einer α1-3/4-Transfucosidase aus dem Reaktionsgemisch die Abtrennung einen vorherigen Schritt umfassen, in dem die (inaktivierte) α1-3/4-Transfucosidase Partikel, wie Aggregate, Kristalle und/oder Niederschläge gebildet hat, was eine bequemere Abtrennung durch Filtration ermöglicht. Die Porengröße der Ultra- oder Mikrofiltrationsmembran wird so gewählt, dass die Kohlenhydratkomponenten die Membran durchqueren können, während die Zurückhaltung der (inaktivierten) α1-3/4-Transfucosidase sichergestellt ist.
  • In einem anderen Aspekt der Erfindung kann bei der Nutzung von Ultrazentrifugation oder Zentrifugation zum Abtrennen einer α1-3/4-Transfucosidase aus dem Reaktionsgemisch die Abtrennung einen vorherigen Schritt umfassen, in dem die (inaktivierte) α1-3/4-Transfucosidase Partikel, wie Aggregate, Kristalle und/oder Niederschläge gebildet hat, was eine bequemere Abtrennung durch (Ultra)Zentrifugation ermöglicht.
  • Die oben offenbarten Reinigungsschritte führen zu einer gereinigten wässerigen Lösung, aus der ein Feststoffgemisch, das aus oder im Wesentlichen aus den Komponenten A, B, C, D, E und Lactose besteht, vorzugsweise die Gemische gemäß einer der nachstehend offenbarten Ausführungsformen i) und ii), einschließlich ihrer bevorzugten und stärker bevorzugten Ausführungsformen, nach der Entfernung von Wasser, beispielsweise durch Verdampfung, Sprühtrocknung oder Gefriertrocknung, erhalten werden kann.
  • Zum Erhalt des Gemisches, das aus oder im Wesentlichen aus den Komponenten A, B, C, D und E besteht, vorzugsweise der Gemische gemäß einer der nachstehend offenbarten Ausführungsformen i) und ii), einschließlich ihrer bevorzugten und stärker bevorzugten Ausführungsformen, sollte Lactose von den Komponenten A, B, C, D und E abgetrennt werden. Eine geeignete Methode hierfür ist beispielsweise Gelfiltration oder Membranfiltration unter Verwendung einer Membran, welche die Zurückhaltung der Komponenten A, B, C, D und E sicherstellt und ermöglicht, dass Lactose sie durchqueren kann. Eine andere Methode ist, dass vor oder nach dem Entfernen der α1-3/4-Transfucosidase aus dem Reaktionsmilieu, wie oben offenbart, jedoch vor der Entfernung von Wasser, eine β-Galactosidase zugegeben wird, um Lactose in Glucose und Galactose zu zersetzen, dann werden diese Monosaccharide unter Verwendung einer Membran, die die Zurückhaltung der Komponenten A, B, C, D und E sicherstellt und ermöglicht, dass Glucose und Galactose sie durchqueren können, abgetrennt. Die Entfernung der β-Galactosidase kann vor oder nach dieser Membranfiltration unter Anwendung der für die Entfernung der α1-3/4-Transfucosidase offenbarten Schritte erfolgen.
  • Ausführungsformen des ersten Aspekts der Erfindung
  • In Anbetracht des Gemisches, das aus oder im Wesentlichen aus den Komponenten A, B, C, D, E und F besteht, betragen vorzugsweise in Bezug auf die Komponenten A, B, C, D, E und F zusammengenommen,
    1. i)
      • - Komponente D 8-13 mol-% oder 14-22 Gew.-% und/oder
      • - Komponente E 9,5-17,5 mol-% oder 11,5-19 Gew.-% und/oder
      • - Komponenten D+E 17,5-30,5 mol-% oder 25,5-41 Gew.-% oder
    2. ii)
      • - Komponente D 2-22 mol-% oder 5-34 Gew.-% oder
      • - Komponente E 7-24 mol-% oder 6-29 Gew.-%, vorausgesetzt, dass die Komponenten D+E 23,5-33 mol-% oder 30,5-43 Gew.-% betragen.
  • Das Gemisch gemäß Ausführungsform i) kann typischerweise erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) im Bereich von etwa 3:1 bis 1:3 liegt, und wobei die Akzeptor-Komponenten etwa äquimolar sind. Das Gemisch gemäß Ausführungsform ii) kann typischerweise erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa äquimolar ist, und wobei in dem Akzeptor das Molverhältnis von Komponente B zu Komponente C im Bereich von etwa 3,5:1 bis 1:3,9. liegt
  • In Anbetracht der oben offenbarten Ausführungsform i) ist bevorzugt, dass die Komponenten A+B+C 41,5-67 Mol-% oder 41-66 Gew.-% in Bezug auf die Komponenten A, B, C, D, E und F zusammengenommen betragen, wobei insbesondere mehr von Komponente B vorliegt als von Komponente C.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform i) beträgt
    • - Komponente A 52-58 Mol-% oder 47-52 Gew.-%,
    • - Komponente B 4-6 Mol-% oder 6,5-8,5 Gew.-%,
    • - Komponente C 1-2 Mol-% oder 1-2 Gew.-%,
    • - Komponente D 8,5-10 Mol-% oder 15,5-17,5 Gew.-%,
    • - Komponente E 10-11,5 Mol-% oder 11,5-13 Gew.-% und
    • - Komponente F 17,5-20,5 Mol-% oder 12-13,5 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D, E und F zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa 3:1 beträgt und die Akzeptor-Komponenten etwa äquimolar sind.
  • Ebenso beträgt in einer stärker bevorzugten Ausführungsform i)
    • - Komponente A 42-46 Mol-% oder 36-40 Gew.-%,
    • - Komponente B 7-9 Mol-% oder 11,5-13,5 Gew.-%,
    • - Komponente C 3-4 Mol-% oder 2,5-3,5 Gew.-%,
    • - Komponente D 9-11 Mol-% oder 16,5-19 Gew.-%,
    • - Komponente E 11-13,5 Mol-% oder 13-16 Gew.-% und
    • - Komponente F 20,5-23,5 Mol-% oder 13-16 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D, E und F zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa 1:2 beträgt und die Akzeptor-Komponenten etwa äquimolar sind.
  • Ebenso beträgt in einer stärker bevorzugten Ausführungsform i)
    • - Komponente A 7,5-9,5 Mol-% oder 5-7,5 Gew.-%,
    • - Komponente B 21-24 Mol-% oder 30-33 Gew.-%,
    • - Komponente C 16-19 Mol-% oder 12,5-15,5 Gew.-%,
    • - Komponente D 10-12 Mol-% oder 16,5-19,5 Gew.-%,
    • - Komponente E 14-16,5 Mol-% oder 14,5-17 Gew.-% und
    • - Komponente F 23-27 Mol-% oder 13-16 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D, E und F zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa 1:2 beträgt und die Akzeptor-Komponenten etwa äquimolar sind.
  • Ebenso beträgt in einer stärker bevorzugten Ausführungsform i)
    • - Komponente A 3-5,5 Mol-% oder 2,5-4 Gew.-%,
    • - Komponente B 26-30 Mol-% oder 36-40 Gew.-%,
    • - Komponente C 22,5-25,5 Mol-% oder 17-20 Gew.-%,
    • - Komponente D 8,5-11 Mol-% oder 14-16,5 Gew.-%,
    • - Komponente E 11-14 Mol-% oder 11-14 Gew.-% und
    • - Komponente F 20-23 Mol-% oder 11-13,5 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D, E und F zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa 3:1 beträgt und die Akzeptor-Komponenten etwa äquimolar sind.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform i) beträgt
    • - Komponente A 19-24,5 Mol-% oder 15-20 Gew.-%,
    • - Komponente B 12,5-15,5 Mol-% oder 19-22 Gew.-%,
    • - Komponente C 7-10 Mol-% oder 6-8 Gew.-%,
    • - Komponente D 11-14 Mol-% oder 18-22 Gew.-%,
    • - Komponente E 14,5-17,5 Mol-% oder 16-19 Gew.-% und
    • - Komponente F 25-30 Mol-% oder 15-19 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D, E und F zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa 1:1 beträgt und die Akzeptor-Komponenten etwa äquimolar sind.
  • In Anbetracht der oben offenbarten Ausführungsform ii) ist bevorzugt, dass die Komponenten A+B+C 40,5-54,5 Mol-% oder 41-54 Gew.-% bezogen auf die Komponenten A, B, C, D, E und F zusammengenommen betragen, wobei insbesondere Komponente A 21-27 Mol-% beträgt.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ii) beträgt
    • - Komponente A 21,5-25,5 Mol-% oder 16-19,5 Gew.-%,
    • - Komponente B 18-22 Mol-% oder 24,5-28,5 Gew.-%,
    • - Komponente C 2-4 Mol-% oder 1,5-3,5 Gew.-%,
    • - Komponente D 18-22 Mol-% oder 30-34 Gew.-%,
    • - Komponente E 6,5-9,5 Mol-% oder 6-9 Gew.-% und
    • - Komponente F 23-27 Mol-% oder 13-15,5 Gew.-%,

    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D, E und F zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa äquimolar ist und in dem Akzeptor das Molverhältnis von Komponente B zu Komponente C etwa 3,5:1 beträgt.
  • Ebenso beträgt in einer stärker bevorzugten Ausführungsform ii)
    • - Komponente A 21-24,5 Mol-% oder 16,5-20 Gew.-%,
    • - Komponente B 15-18 Mol-% oder 21-25 Gew.-%,
    • - Komponente C 5,5-7,5 Mol-% oder 4-6 Gew.-%,
    • - Komponente D 13-16,5 Mol-% oder 22-26 Gew.-%,
    • - Komponente E 12-15 Mol-% oder 12,5-15,5 Gew.-% und
    • - Komponente F 24-28 Mol-% oder 14-17 Gew.-%,

    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D, E und F zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa äquimolar ist und in dem Akzeptor das Molverhältnis von Komponente B zu Komponente C etwa 1,4:1 beträgt.
  • Ebenso beträgt in einer stärker bevorzugten Ausführungsform ii)
    • - Komponente A 21-24,5 Mol-% oder 17-20,5 Gew.-%,
    • - Komponente B 10,5-13,5 Mol-% oder 16,5-20 Gew.-%,
    • - Komponente C 9-12 Mol-% oder 8-10 Gew.-%,
    • - Komponente D 8-10 Mol-% oder 14-17 Gew.-%,
    • - Komponente E 17,5-20,5 Mol-% oder 19,5-23 Gew.-% und
    • - Komponente F 24,5-28,5 Mol-% oder 14,5-17,5 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D, E und F zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa äquimolar ist und in dem Akzeptor das Molverhältnis von Komponente B zu Komponente C etwa 1:1,5 beträgt.
  • Ebenso beträgt in einer stärker bevorzugten Ausführungsform ii)
    • - Komponente A 23-27 Mol-% oder 21-25 Gew.-%,
    • - Komponente B 6-8 Mol-% oder 10-12,5 Gew.-%,
    • - Komponente C 15-19,5 Mol-% oder 14-16,5 Gew.-%,
    • - Komponente D 2,5-4,5 Mol-% oder 5,5-7,5 Gew.-%,
    • - Komponente E 21-24,5 Mol-% oder 25-28,5 Gew.-% und
    • - Komponente F 23,5-27,5 Mol-% oder 16-19 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D, E und F zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa äquimolar ist und in dem Akzeptor das Molverhältnis von Komponente B zu Komponente C etwa 1,3:9 beträgt.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ii) beträgt
    • - Komponente A 19-24,5 Mol-% oder 15-20 Gew.-%,
    • - Komponente B 12,5-15,5 Mol-% oder 19-22 Gew.-%,
    • - Komponente C 7-10 Mol-% oder 6-8 Gew.-%,
    • - Komponente D 11-14 Mol-% oder 18-22 Gew.-%,
    • - Komponente E 14,5-17,5 Mol-% oder 16-19 Gew.-% und
    • - Komponente F 25-30 Mol-% oder 15-19 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D, E und F zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn sowohl das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) als auch das Molverhältnis von Komponente B zu Komponente C etwa äquimolar sind.
  • In Anbetracht des Gemisches, das aus oder im Wesentlichen aus den Komponenten A, B, C, D und E besteht, ist bevorzugt, dass in Bezug auf die Komponenten A, B, C, D und E zusammengenommen
    1. iii)
      • - Komponente D 10-17,5 Mol-% oder 16-25,5 Gew.-% beträgt und/oder
      • - Komponente E 12-23,5 Mol-% oder 13-22 Gew.-% beträgt und/oder
      • - Komponenten D+E 22-41 Mol-% oder 29-47,5 Gew.-% betragen oder
    2. iv)
      • - Komponente D 3,5-29,5 Mol-% oder 6-39 Gew.-% beträgt und/oder
      • - Komponente E 9-32 Mol-% oder 7,5-34,5 Gew.-% beträgt, vorausgesetzt, dass die Komponenten D+E 31,5-41 Mol-% oder 36,5-49 Gew.-% betragen.
  • Das Gemisch gemäß Ausführungsform iii) kann üblicherweise erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) im Bereich von etwa 3:1 bis 1:3 liegt, wobei die Akzeptor-Komponenten etwa äquimolar sind und wobei Lactose aus der so erhaltenen Zusammensetzung im Wesentlichen entfernt ist. Das Gemisch gemäß Ausführungsform iv) kann üblicherweise erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa äquimolar ist, wobei in dem Akzeptor das Molverhältnis von Komponente B zu Komponente C im Bereich von etwa 3,5:1 bis 1:3,9 liegt und wobei Lactose aus der so erhaltenen Zusammensetzung im Wesentlichen entfernt ist.
  • In Anbetracht der oben offenbarten Ausführungsform iii) ist bevorzugt, dass mehr von Komponente B in dem Gemisch vorliegt als von Komponente C.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform iii) beträgt
    • - Komponente A 65-71 Mol-% oder 53,5-59,5 Gew.-%,
    • - Komponente B 5-7 Mol-% oder 7,5-9,5 Gew.-%,
    • - Komponente C 1,5-2,5 Mol-% oder 1-2 Gew.-%,
    • - Komponente D 10-12,5 Mol-% oder 18-20,5 Gew.-% und
    • - Komponente E 12-14,5 Mol-% oder 13-15,5 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D und E zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa 3:1 beträgt, wobei die Akzeptor-Komponenten etwa äquimolar sind und wobei Lactose aus der so erhaltenen Zusammensetzung im Wesentlichen entfernt ist.
  • Ebenso beträgt in einer stärker bevorzugten Ausführungsform iii)
    • - Komponente A 54-58,5 Mol-% oder 42-46,5 Gew.-%,
    • - Komponente B 9-11,5 Mol-% oder 13-15,5 Gew.-%,
    • - Komponente C 4-5 Mol-% oder 3-4 Gew.-%,
    • - Komponente D 11,5-14 Mol-% oder 19-23 Gew.-%,
    • - Komponente E 15-18 Mol-% oder 15-18,5 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D und E zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa 2:1 beträgt, wobei die Akzeptor-Komponenten etwa äquimolar sind und wobei Lactose aus der so erhaltenen Zusammensetzung im Wesentlichen entfernt ist.
  • Ebenso beträgt in einer stärker bevorzugten Ausführungsform iii)
    • - Komponente A 10-12,5 Mol-% oder 6,5-9 Gew.-%,
    • - Komponente B 28,5-32 Mol-% oder 34,5-38,5 Gew.-%,
    • - Komponente C 22-25 Mol-% oder 15-17,5 Gew.-%,
    • - Komponente D 13,5-16 Mol-% oder 19,5-22,5 Gew.-%,
    • - Komponente E 19-21,5 Mol-% oder 17-19,5 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D und E zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa 1:2 beträgt, wobei die Akzeptor-Komponenten etwa äquimolar sind und wobei Lactose aus der so erhaltenen Zusammensetzung im Wesentlichen entfernt ist.
  • Ebenso beträgt in einer stärker bevorzugten Ausführungsform iii)
    • - Komponente A 4,5-6,5 Mol-% oder 2,5-4,5 Gew.-%,
    • - Komponente B 34-38 Mol-% oder 41,5-45,5 Gew.-%,
    • - Komponente C 29-32,5 Mol-% oder 19-22,5 Gew.-%,
    • - Komponente D 11-13,5 Mol-% oder 16-19 Gew.-%,
    • - Komponente E 14,5-17,5 Mol-% oder 13-16 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D und E zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa 1:3 beträgt, wobei die Akzeptor-Komponenten etwa äquimolar sind und wobei Lactose aus der so erhaltenen Zusammensetzung im Wesentlichen entfernt ist.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform iii) beträgt
    • - Komponente A 29-33 Mol-% oder 20-24,5 Gew.-%,
    • - Komponente B 18-21,5 Mol-% oder 23-25,5 Gew.-%,
    • - Komponente C 10-12,5 Mol-% oder 7,5-9,5 Gew.-%,
    • - Komponente D 15-17,5 Mol-% oder 22-25,5 Gew.-%,
    • - Komponente E 20,5-23,5 Mol-% oder 19,5-22 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D und E zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa 1:1 beträgt, wobei die Akzeptor-Komponenten etwa äquimolar sind und wobei Lactose aus der so erhaltenen Zusammensetzung im Wesentlichen entfernt ist.
  • In Anbetracht der oben offenbarten Ausführungsform iv) ist bevorzugt, dass die Komponenten A+B+C 57-70 Mol-% oder 51-64,5 Gew.-% bezogen auf die Komponenten A, B, C, D und E zusammengenommen betragen, wobei insbesondere Komponente A 29-35,5 Mol-% beträgt.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform iv) beträgt
    • - Komponente A 29,5-33,5 Mol-% oder 19-22,5 Gew.-%,
    • - Komponente B 25-28,5 Mol-% oder 29-33 Gew.-%,
    • - Komponente C 3-5 Mol-% oder 2-3,5 Gew.-%,
    • - Komponente D 26-29,5 Mol-% oder 35-39 Gew.-%,
    • - Komponente E 9-11,5 Mol-% oder 7,5-10 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D und E zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa äquimolar ist, wobei in dem Akzeptor das Molverhältnis von Komponente B zu Komponente C etwa 3,5:1 beträgt und wobei Lactose aus der so erhaltenen Zusammensetzung im Wesentlichen entfernt ist.
  • Ebenso beträgt in einer stärker bevorzugten Ausführungsform iv)
    • - Komponente A 29-32,5 Mol-% oder 20,5-23 Gew.-%,
    • - Komponente B 21-24,5 Mol-% oder 26-29,5 Gew.-%,
    • - Komponente C 7,5-10 Mol-% oder 5-7 Gew.-%,
    • - Komponente D 18-21,5 Mol-% oder 27-29,5 Gew.-%,
    • - Komponente E 17-19,5 Mol-% oder 15,5-18 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D und E zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa äquimolar ist, wobei in dem Akzeptor das Molverhältnis von Komponente B zu Komponente C etwa 1,4:1 beträgt und wobei Lactose aus der so erhaltenen Zusammensetzung im Wesentlichen entfernt ist.
  • Ebenso beträgt in einer stärker bevorzugten Ausführungsform iv)
    • - Komponente A 29-33 Mol-% oder 22-24,5 Gew.-%,
    • - Komponente B 15-18 Mol-% oder 20,5-23 Gew.-%,
    • - Komponente C 13-15,5 Mol-% oder 9,5-12 Gew.-%,
    • - Komponente D 11-13,5 Mol-% oder 17-20 Gew.-%,
    • - Komponente E 24,5-27,5 Mol-% oder 24-27 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D und E zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa äquimolar ist, wobei in dem Akzeptor das Molverhältnis von Komponente B zu Komponente C etwa 1:1,5 beträgt und wobei Lactose aus der so erhaltenen Zusammensetzung im Wesentlichen entfernt ist.
  • Ebenso beträgt in einer stärker bevorzugten Ausführungsform iv)
    • - Komponente A 31,5-35,5 Mol-% oder 26-29,5 Gew.-%,
    • - Komponente B 8,5-10,5 Mol-% oder 12,5-15 Gew.-%,
    • - Komponente C 21-24 Mol-% oder 17-20 Gew.-%,
    • - Komponente D 3,5-5,5 Mol-% oder 6-9,5 Gew.-%,
    • - Komponente E 28-32 Mol-% oder 30,5-34,5 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D und E zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten werden, wenn das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) etwa äquimolar ist, wobei in dem Akzeptor das Molverhältnis von Komponente B zu Komponente C etwa 1:3,9 beträgt und wobei Lactose aus der so erhaltenen Zusammensetzung im Wesentlichen entfernt ist.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform iv) beträgt
    • - Komponente A 29-33 Mol-% oder 21-24,5 Gew.-%,
    • - Komponente B 18-21,5 Mol-% oder 23-25,5 Gew.-%,
    • - Komponente C 10-12,5 Mol-% oder 7,5-9,5 Gew.-%,
    • - Komponente D 15-17,5 Mol-% oder 23-25,5 Gew.-%,
    • - Komponente E 20,5-23,5 Mol-% oder 19,5-22 Gew.-%,
    bezogen auf die Komponenten A, B, C, D und E zusammengenommen.
  • Dieses Gemisch kann erhalten, wenn sowohl das Molverhältnis von Donator (Komponente A) zu Akzeptor (Komponenten B und C) als auch das Molverhältnis von Komponente B zu Komponente C etwa äquimolar sind und Lactose aus der so erhaltenen Zusammensetzung im Wesentlichen entfernt ist.
  • Pharmazeutische, kosmetische und/oder nutritive Zusammensetzung
  • Ein Gemisch gemäß der vorliegenden Erfindung, das aus oder im Wesentlichen aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL und gegebenenfalls Lactose besteht, kann als eine pharmazeutische, kosmetische und/oder nutritive Zusammensetzung formuliert werden, die einen pharmazeutisch, kosmetisch und/oder nutritiv akzeptablen Träger wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung, nicht gepufferte Kochsalzlösung, Gemische aus Ethanol in Wasser, Wasser und Emulsionen wie eine Öl/Wasser- oder Wasser/Öl-Emulsion, ebenso wie verschiedene Benetzungsmittel und/oder Hilfsstoffe enthalten kann. Die pharmazeutische, kosmetische und/oder nutritive Zusammensetzung kann ebenso andere Materialien enthalten, die bei der Verabreichung an einen Patienten keine nachteilige, allergische oder anderweitig unerwünschte Reaktion hervorrufen.
  • Träger und andere Materialien, die in der pharmazeutischen, kosmetischen und/oder nutritiven Zusammensetzung enthalten sind, können eines oder mehrere der folgenden umfassen: Lösungsmittel, Dispersionsmittel, Beschichtungen, die Absorption fördernde Mittel, Mittel für kontrollierte Freisetzung und einen oder mehrere inerte Hilfsstoffe wie Stärken, Polyole, Granuliermittel, mikrokristalline Cellulosen, Verdünnungsmittel, Schmiermittel, Bindemittel und Lösungsvermittler. Nach Bedarf können Tablettendosen von den infektionsverhütenden Gemischen mittels wässeriger oder nicht-wässeriger Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, beschichtet werden.
  • Eine pharmazeutische, kosmetische und/oder nutritive Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann oral, bukkal, sublingual, topisch und/oder rektal verabreicht werden. Sie kann als eine Tablette, Kapsel, ein Zäpfchen, eine Brausetablette, ein Pellet, eine Pastille, ein Trochiscus, ein Gel, eine Paste, Lösung, Suspension, Emulsion, ein Sirup, Bolus, eine Latwerge, eine Aufschlämmung, in einer wässerigen oder nicht-wässerigen Flüssigkeit, als ein Pulver oder als Granulat formuliert werden, die eine vorbestimmte Konzentration des Gemisches aus HMOs enthalten.
  • Ebenso kann eine pharmazeutische, kosmetische und/oder nutritive Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung Bindemittel, Schmiermittel, inerte Verdünnungsmittel, Aromastoffe und Feuchthaltemittel umfassen. Eine Tablette, Kapsel, ein Zäpfchen oder Pellet, die die pharmazeutische, kosmetische und/oder nutritive Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthalten, können gegebenenfalls so beschichtet oder formuliert werden, dass eine anhaltende, verzögerte oder kontrollierte Freisetzung des infektionsverhütenden Gemisches aus HMOs bereitgestellt wird.
  • Das Gemisch aus HMOs gemäß der Erfindung kann mit zusätzlichen Pharmazeutika, pharmazeutischen Wirkstoffen oder Mitteln mit einer Wirkung auf ungünstige Gesundheitszustände des Patienten, dem die Zusammensetzung verabreicht wird, ergänzt werden.
  • In einer Ausführungsform kann die Zusammensetzung in Form einer nutritiven Zusammensetzung vorliegen. Beispielsweise kann die nutritive Zusammensetzung eine Lebensmittelzusammensetzung, eine Rehydratationslösung, ein medizinisches Lebensmittel oder Lebensmittel für spezielle medizinische Zwecke, ein Nahrungsergänzungsmittel und dergleichen sein. Die nutritive Zusammensetzung kann Quellen für Protein, Lipide und/oder verdauliche Kohlenhydrate enthalten und kann in pulverisierter oder flüssiger Form vorliegen. Die Zusammensetzung kann als die einzige Nahrungsquelle oder als ein Nahrungsergänzungsmittel gestaltet sein.
  • Geeignete Proteinquellen umfassen Milchproteine, Sojaprotein, Reisprotein, Erbsenprotein und Haferprotein oder Gemische davon. Milchproteine können in Form von Milchproteinkonzentraten, Milchproteinisolaten, Molkenprotein oder Kasein oder Gemischen aus beiden vorliegen. Das Protein kann Gesamtprotein oder hydrolysiertes Protein, entweder teilweise hydrolysiert oder umfangreich hydrolysiert, sein. Hydrolysiertes Protein bietet den Vorteil einer leichteren Verdauung, was für Menschen mit entzündetem oder geschwächtem Magen-Darm-Trakt von Bedeutung sein kann. Das Protein kann ebenso in Form von freien Aminosäuren bereitgestellt werden. Das Protein kann etwa 5 % bis etwa 30 % der Energie der nutritiven Zusammensetzung, normalerweise etwa 10 % bis 20 % umfassen. Idealerweise umfasst die Proteinquelle keine übermäßigen Mengen Lactose.
  • Die Proteinquelle kann eine Quelle für Glutamin, Threonin, Zystein, Serin, Prolin oder eine Kombination aus diesen Aminosäuren sein. Die Glutaminquelle kann ein Glutamindipeptid und/oder ein mit Glutamin angereichertes Protein sein. Glutamin kann aufgrund der Verwendung von Glutamin von Enterozyten als eine Energiequelle enthalten sein. Threonin, Serin und Prolin sind wichtige Aminosäuren für die Produktion von Muzin. Muzin beschichtet den Marken-Darm-Trakt und kann die Darmbarrierefunktion und Schleimhautheilung verbessern. Zystein ist ein Haupt-Präkursor von Glutathion, das der Schlüssel für die oxidationshemmenden Abwehrkräfte des Körpers ist.
  • Geeignete verdauliche Kohlenhydrate umfassen Maltodextrin, hydrolysierte oder modifizierte Stärke oder Maisstärke, Glucosepolymere, Maisstärkesirup, Maisstärkesirupfeststoffe, Isomeratzucker, aus Reis gewonnene Kohlenhydrate, aus Erbsen gewonnene Kohlenhydrate, aus Kartoffeln gewonnene Kohlenhydrate, Tapioka, Saccherose, Glucose, Fructose, Saccherose, Honig, Zuckeralkohole (z. B. Maltitol, Erythritol, Sorbitol) oder Gemische davon. Vorzugsweise weist die Zusammensetzung wenig oder gar keine zusätzliche Lactose oder andere FODMAP-Kohlenhydrate auf. In der Regel liefern verdauliche Kohlenhydrate etwa 35 % bis etwa 55 % der Energie der nutritiven Zusammensetzung. Ein geeignetes verdauliches Kohlenhydrat ist Maltodextrin mit einem niedrigen Dextroseäquivalent (DE).
  • Geeignete Lipide umfassen mittelkettige Triglyceride (MCT) und langkettige Triglyceride (LCT). Vorzugsweise ist das Lipid ein Gemisch aus MCTs und LCTs. Beispielsweise können MCTs etwa 30 Gew.-% bis etwa 70 Gew.-% der Lipide umfassen, im Speziellen etwa 50 Gew.-% bis etwa 60 Gew.-%. MCTs bieten den Vorteil einer leichteren Verdauung, was für Menschen mit entzündetem oder geschwächtem Magen-Darm-Trakt von Bedeutung sein kann. In der Regel liefern Lipide etwa 35 % bis etwa 50 % der Energie der nutritiven Zusammensetzung. Die Lipide können essentielle Fettsäuren enthalten (Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren). Vorzugsweise liefern diese mehrfach ungesättigten Fettsäuren weniger als etwa 30 % der Gesamtenergie der Lipidquelle.
  • Geeignete Quellen für langkettige Triglyceride sind Rapsöl, Sonnenblumenöl, Palmöl, Sojaöl, Milchfett, Maiskeimöl, Öle mit hohem Ölsäuregehalt und Sojalecithin. Fraktionierte Kokosnussöle sind eine geeignete Quelle für mittelkettige Triglyceride. Das Lipidprofil der nutritiven Zusammensetzung ist vorzugsweise so gestaltet, dass ein Verhältnis von mehrfach ungesättigten Fettsäuren Omega-6 (n-6) zu Omega-3 (n-3) von etwa 4:1 bis etwa 10:1 vorliegt. Beispielsweise kann das n-6-zu-n-3-Fettsäureverhältnis etwa 6:1 bis etwa 9:1 betragen.
  • Die nutritive Zusammensetzung kann ebenso Vitamine und Mineralien umfassen. Soll die nutritive Zusammensetzung die einzige Nährstoffquelle sein, umfasst sie vorzugsweise ein vollständiges Vitamin- und Mineralprofil. Beispiele für Vitamine umfassen Vitamine A, B-Komplex (wie B1, B2, B6 und B12), C, D, E und K, Niazin und saure Vitamine wie Pantothensäure, Folsäure und Biotin. Beispiele für Mineralien umfassen Calcium, Eisen, Zink, Magnesium, lod, Kupfer, Phosphor, Mangan, Kalium, Chrom, Molybdän, Selen, Nickel, Zinn, Silicium, Vanadium und Bor.
  • Die nutritive Zusammensetzung kann ebenso ein Carotenoid wie Lutein, Lycopen, Zeaxanthin und Beta-Carotin umfassen. Die Gesamtmenge an enthaltenem Carotenoid kann von etwa 0,001 µg/ml bis etwa 10 µg/ml variieren. Lutein kann in einer Menge von etwa 0,001 µg/ml bis etwa 10 µg/ml, vorzugsweise etwa 0,044 µg/ml bis etwa 5 µg/ml Lutein enthalten sein. Lycopen kann in einer Menge von etwa 0,001 µg/ml bis etwa 10 µg/ml, vorzugsweise etwa 0,0185 µg/ml bis etwa 5 µg/ml Lycopen enthalten sein. Beta-Carotin kann etwa 0,001 µg/ml bis etwa 10 mg/ml, beispielsweise etwa 0,034 µg/ml bis etwa 5 µg/ml Beta-Carotin ausmachen.
  • Die nutritive Zusammensetzung enthält vorzugsweise ebenso geringere Konzentrationen an Natrium; beispielsweise etwa 300 mg/l bis etwa 400 mg/l. Die verbleibenden Elektrolyte können in Konzentrationen vorliegen, die so festgelegt sind, dass der Bedarf gedeckt wird, ohne dass die Nierenfunktion durch gelöste Stoffe übermäßig belastet wird. Beispielsweise liegt Kalium vorzugsweise in einem Bereich von etwa 1.180 bis etwa 1.300 mg/l vor; und Chlorid liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 680 bis etwa 800 mg/l vor.
  • Die nutritive Zusammensetzung kann ebenso verschiedene andere herkömmliche Inhaltsstoffe wie Konservierungsmittel, Emulgatoren, Verdickungsmittel, Puffer, Fasern und Präbiotika (z. B. Fructooligosaccharide, Galactooligosaccharide), Probiotika (z. B. B. animalis subsp. lactis BB-12, B. lactis HN019, B. lactis Bi07, B. infantis ATCC 15697, L. rhamnosus GG, L. rhamnosus LGG DSM 33156, L. rhamnosus HNOOI, L. acidophilus LA-5, L. acidophilus NCFM, L. fermentum CECT5716, B. longum BB536, B. longum AH1205, B. longum AH1206, B. breve M-16V, L. reuteri ATCC 55730, L. reuteri ATCC PTA-6485, L. reuteri DSM 17938), oxidationshemmende/entzündungshemmende Verbindungen einschließlich Tocopherole, Carotenoide, Ascorbat/Vitamin C, Ascorbylpalmitat, Polyphenole, Glutathion und Superoxiddismutase (Melone), andere biologisch aktive Faktoren (z. B. Wachstumshormone, Zytokine, TFG-β), Färbemittel, Aromastoffe und Stabilisatoren, Schmiermittel und so weiter enthalten.
  • Die nutritive Zusammensetzung kann als ein lösliches Pulver, ein flüssiges Konzentrat oder eine gebrauchsfertige Formulierung formuliert werden. Die Zusammensetzung kann einem Menschen, der einer solchen bedarf, über eine nasale Magenernährungssonde oder oral verabreicht werden. Es können auch verschiedene Aromastoffe oder andere Additive vorliegen.
  • Die nutritiven Zusammensetzungen können mit allen gängigen Herstellungstechniken zur Herstellung nutritiver Zusammensetzungen in fester oder flüssiger Form hergestellt werden. Beispielsweise kann die Zusammensetzung durch Kombinieren verschiedener Nahrungslösungen hergestellt werden. Eine Protein-in-Fett-Nahrungslösung kann durch Erhitzen und Mischen der Lipidquelle und dann Zugeben eines Emulgators (z. B. Lecithin), fettlöslicher Vitamine und zumindest eines Teils der Proteinquelle unter Erhitzen und Rühren hergestellt werden. Dann wird eine Kohlenhydrat-Nahrungslösung durch Zugeben von Mineralien, Spuren- und Ultraspurenmineralien, Verdickungs- oder Suspendiermitteln zu Wasser unter Erhitzen und Rühren hergestellt. Die resultierende Lösung wird für 10 Minuten unter weiterem Erhitzen und Bewegen gehalten, bevor Kohlenhydrate zugegeben werden (z. B. die HMOs und verdauliche Kohlenhydratquellen). Die resultierenden Nahrungslösungen werden dann unter Erhitzen und Bewegen miteinander vermischt und der pH wird auf 6,6-7,0 eingestellt, wonach die Zusammensetzung Hochtemperatur-Kurzzeitverarbeitung unterzogen wird, während der die Zusammensetzung wärmebehandelt, emulgiert und homogenisiert wird, und kann dann abkühlen. Es werden wasserlösliche Vitamine und Ascorbinsäure zugegeben, der pH wird auf den gewünschten Bereich eingestellt, nach Bedarf werden Aromastoffe zugegeben und Wasser wird zugegeben, um den gewünschten Gesamtfeststoffgehalt zu erreichen.
  • Für ein flüssiges Produkt kann die resultierende Lösung dann aseptisch verpackt werden, um eine aseptisch verpackte nutritive Zusammensetzung zu bilden. In dieser Form kann die nutritive Zusammensetzung in verabreichungsfertiger oder konzentrierter flüssiger Form vorliegen. Alternativ kann die Zusammensetzung sprühgetrocknet und verarbeitet und als ein rekonstituierbares Pulver verpackt werden.
  • Ist das nutritive Produkt eine verabreichungsfertige nutritive Flüssigkeit, beträgt vorzugsweise die Gesamtkonzentration an HMOs in der Flüssigkeit, bezogen auf das Gewicht der Flüssigkeit, etwa 0,1 % bis etwa 1,5 %, einschließlich etwa 0,2 % bis etwa 1,0 %, beispielsweise etwa 0,3 % bis etwa 0,7 %. Ist das nutritive Produkt eine konzentrierte nutritive Flüssigkeit, beträgt vorzugsweise die Gesamtkonzentration an HMOs in der Flüssigkeit, bezogen auf das Gewicht der Flüssigkeit, etwa 0,2 % bis etwa 3,0 %, einschließlich etwa 0,4 % bis etwa 2,0 %, beispielsweise etwa 0,6 % bis etwa 1,5 %.
  • In einer anderen Ausführungsform liegt die nutritive Zusammensetzung in einer Einheitsdosierform vor. Die Einheitsdosierform kann einen akzeptablen lebensmitteltauglichen Träger, z. B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Gemische aus Ethanol in Wasser, Wasser und Emulsionen wie eine Öl/Wasser- oder Wasser/Öl-Emulsion, sowie verschiedene Benetzungsmittel oder Hilfsstoffe enthalten. Die Einheitsdosierform kann ebenso andere Materialien enthalten, die bei der Verabreichung an einen Menschen keine nachteilige, allergische oder anderweitig unerwünschte Reaktion hervorrufen. Die Träger und anderen Materialien können Lösungsmittel, Dispergiermittel, Beschichtungen, die Absorption fördernde Mittel, Mittel für kontrollierte Freisetzung und einen oder mehrere inerte Hilfsstoffe wie Stärken, Polyole, Granuliermittel, mikrokristalline Cellulose, Verdünnungsmittel, Schmiermittel, Bindemittel und Lösungsvermittler umfassen.
  • Vorzugsweise umfasst die Einheitsdosierform primär HMOs mit einer Mindestmenge an Bindemitteln und/oder Hilfsstoffen. Einheitsdosierformen sind besonders geeignet, wenn sie nutritiv unvollständig oder nicht als die alleinige Nährstoffquelle vorgesehen sind.
  • Eine Einheitsdosierform kann oral verabreicht werden, z. B. als eine Tablette, Kapsel oder ein Pellet, die eine vorbestimmte Menge des Gemisches enthalten, oder als ein Pulver oder Granulat, die eine vorbestimmte Konzentration des Gemisches enthalten, oder ein Gel, eine Paste, Lösung, Suspension, Emulsion, ein Sirup, Bolus, eine Latwerge oder Aufschlämmung in einer wässerigen oder nicht-wässerigen Flüssigkeit, die eine vorbestimmte Konzentration des Gemisches enthalten. Eine oral verabreichte Zusammensetzung kann ein oder mehrere Bindemittel, Schmiermittel, inerte Verdünnungsmittel, Aromastoffe und Feuchthaltemittel umfassen. Eine oral verabreichte Zusammensetzung, wie eine Tablette, kann gegebenenfalls beschichtet und so formuliert sein, dass sie anhaltende, verzögerte oder kontrollierte Freisetzung der HMOs bereitstellt.
  • Eine Einheitsdosierform kann ebenso mittels einer nasalen Magenernährungssonde oder direkter Infusion in den Magen-Darm-Trakt oder Magen verabreicht werden.
  • Eine Einheitsdosierform kann ebenso Therapeutika wie Antibiotika, Probiotika, Analgetika und Entzündungshemmer umfassen.
  • Die richtige Dosierung einer nutritiven Zusammensetzung für einen Menschen kann in herkömmlicher Weise basierend auf Faktoren wie der Konzentration an HMOs, dem Zustand des Menschen, dem Immunstatus, dem Körpergewicht und dem Alter bestimmt werden. Die erforderliche Menge an HMOs würde in der Regel im Bereich von etwa 1 g bis etwa 15 g pro Tag liegen, in bestimmten Ausführungsformen zwischen etwa 2 g und etwa 10 g pro Tag, beispielsweise etwa 3 g bis etwa 7 g pro Tag. Angemessene Dosierregime können mittels dem Fachmann bekannter Methoden bestimmt werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann das Gemisch aus HMOs als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert sein. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten, z. B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Gemische aus Ethanol in Wasser, Wasser und Emulsionen wie eine Öl/Wasser- oder Wasser/Öl-Emulsion, sowie verschiedene Benetzungsmittel oder Hilfsstoffe. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann ebenso andere Materialien enthalten, die bei der Verabreichung an einen Menschen keine nachteilige, allergische oder anderweitig unerwünschte Reaktion hervorrufen. Die Träger und anderen Materialien können Lösungsmittel, Dispergiermittel, Beschichtungen, die Absorption fördernde Mittel, Mittel für kontrollierte Freisetzung und einen oder mehrere inerte Hilfsstoffe wie Stärken, Polyole, Granuliermittel, mikrokristalline Cellulose, Verdünnungsmittel, Schmiermittel, Bindemittel und Lösungsvermittler umfassen.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können oral verabreicht werden, z. B. als eine Tablette, Kapsel oder ein Pellet, die eine vorbestimmte Menge enthalten, oder als ein Pulver oder Granulat, die eine vorbestimmte Konzentration enthalten, oder ein Gel, eine Paste, Lösung, Suspension, Emulsion, ein Sirup, Bolus, eine Latwerge oder Aufschlämmung in einer wässerigen oder nicht-wässerigen Flüssigkeit, die eine vorbestimmte Konzentration enthalten. Oral verabreichte Zusammensetzungen können Bindemittel, Schmiermittel, inerte Verdünnungsmittel, Aromastoffe und Feuchthaltemittel umfassen. Oral verabreichte Zusammensetzungen, wie Tabletten, können gegebenenfalls beschichtet und so formuliert sein, dass sie anhaltende, verzögerte oder kontrollierte Freisetzung des Gemisches darin bereitstellen.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können ebenso mittels eines rektalen Zäpfchens, Aerosolschlauches, einer nasalen Magenernährungssonde oder direkter Infusion in den Magen-Darm-Trakt oder Magen verabreicht werden.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können ebenso Therapeutika wie Antibiotika, Probiotika, Analgetika und Entzündungshemmer umfassen. Die richtige Dosierung einer pharmazeutischen Zusammensetzung kann in herkömmlicher Weise basierend auf Faktoren wie der Konzentration an HMOs, dem Zustand des Menschen, dem Immunstatus, dem Körpergewicht und dem Alter bestimmt werden. Die erforderliche Menge an HMOs würde in der Regel im Bereich von etwa 1 g bis etwa 15 g pro Tag liegen, in bestimmten Ausführungsformen zwischen etwa 2 g und etwa 10 g pro Tag, beispielsweise etwa 3 g bis etwa 7 g pro Tag. Angemessene Dosierregime können mittels dem Fachmann bekannter Methoden bestimmt werden.
  • Die Verwendung eines Gemisches aus HMOs gemäß der vorliegenden Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenso auf die Verwendung eines Gemisches, das aus oder im Wesentlichen aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL und gegebenenfalls Lactose besteht, für medizinische Zwecke.
  • Einzelne HMOs haben bekanntermaßen vorteilhafte gesundheitsbezogene Wirkungen und beeinflussen bekanntermaßen bakterielle und virale Infektionen. Während die isolierten einzelnen HMOs selbst vorteilhaft sind, haben kombinatorische Gemische aus HMOs, wie hierin beschrieben, eine synergistische Wirkung bei der Behandlung von Infektionen, im Vergleich zu isolierten einzelnen Komponenten.
  • Ein Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL und gegebenenfalls Lactose besteht, einschließlich der bereits offenbarten bevorzugten oder stärker bevorzugten Ausführungsformen, oder eine Zusammensetzung, die das Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL und gegebenenfalls Lactose besteht, umfasst, einschließlich der bereits offenbarten bevorzugten oder stärker bevorzugten Ausführungsformen, zur Verwendung bei der Behandlung, Vorbeugung und/oder Linderung einer Krankheit und/oder eines Leidens in Verbindung mit dem Mikrobiom-Ungleichgewicht. Alternativ bezieht sich ein Aspekt der Erfindung auf ein Verfahren zur Behandlung, Vorbeugung und/oder Linderung einer Krankheit und/oder eines Leiden in Verbindung mit einem Mikrobiom-Ungleichgewicht bei einem Menschen, umfassend das Verabreichen eines Gemisches, das aus oder im Wesentlichen aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL und gegebenenfalls Lactose besteht, oder einer Zusammensetzung, die das Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL und gegebenenfalls Lactose besteht, umfasst, an den Menschen. Üblicherweise kann ein Gemisch aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I und DFL gemäß der vorliegenden Erfindung zur Modulation des Mikrobioms eines Menschen verwendet werden, z. B. zur Erhöhung der Bifidobacterium-Dichte und Barnesiella-Dichte, wobei die Modulation die Firmicutes-Dichte, insbesondere von Clostridia, verringert.
  • Ferner bezieht sich ein anderer Aspekt der Erfindung auf ein Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL und gegebenenfalls Lactose besteht, einschließlich der bereits offenbarten bevorzugten und stärker bevorzugten Ausführungsformen, oder eine Zusammensetzung, die das Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL und gegebenenfalls Lactose besteht, umfasst, einschließlich der bereits offenbarten bevorzugten und stärker bevorzugten Ausführungsformen, zur Verwendung bei der Behandlung eines und/oder Minderung des Risikos für einen breiten Bereich bakterieller oder viraler Infektionen bei einem Menschen. Alternativ bezieht sich ein Aspekt der Erfindung auf ein Verfahren zur Behandlung eines und/oder Minderung des Risikos für einen breiten Bereich bakterieller oder viraler Infektionen bei einem Menschen, umfassend das Verabreichen eines Gemisches, das aus oder im Wesentlichen aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL und gegebenenfalls Lactose besteht, oder einer Zusammensetzung, die das Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL und gegebenenfalls Lactose besteht, umfasst, an einen Menschen. Infektionen können in mehreren Körperteilen entstehen, die nicht nur auf das Darmmikrobiom beschränkt sind, sondern auch in anderen Teilen des Körpers, die der äußeren Umwelt ausgesetzt sind, wie Haut, Haare, Ohren, Augen, Nase und dem Atmungssystem. Ein oder mehrere HMOs des Gemisches gemäß der vorliegenden Erfindung können das Anhaften pathogener Bakterien, wie Pseudomonas aeruginosa oder Campylobacterjejuni, uropathogener und enteropathogener Escherichia coli, bestimmter Salmonella-Spezies und/oder des Pneumonie verursachenden Pathogens Pseudomonas aeruginosa, sowie Viren wie des Norovirus inhibieren. Ein oder mehrere HMOs des Gemisches gemäß der vorliegenden Erfindung können ebenso direkt an pathogene Toxine binden, wie Toxine aus Clostridium difficile. Ein oder mehrere HMOs des Gemisches gemäß der vorliegenden Erfindung können als ein Immunsystemmodulator dienen und die Darmgesundheit durch die Stimulation von Bifidobakterien beeinflussen. Ein oder mehrere HMOs des Gemisches gemäß der vorliegenden Erfindung können das Wachstum von Gruppe-B-Streptokokken sowohl bei Säuglingen als auch in Muttermilch inhibieren. Gruppe-B-Streptokokken sind eine der Hauptursachen für neonatale Sepsis, Pneumonie und Meningitis. Ein oder mehrere HMOs des Gemisches gemäß der vorliegenden Erfindung können direkt an die Shiga-Toxine Stx2 und Stx1B5 von Shigella dysenteriae binden. Ein oder mehrere HMOs des Gemisches gemäß der vorliegenden Erfindung haben höchstwahrscheinlich aufgrund der Bindung an bakterielle Exotoxine das Potential zur Minderung des Risikos für Infektionskrankheiten, die von bakteriellen oder viralen Pathogenen verursacht werden.
  • Ferner bezieht sich ein anderer Aspekt der Erfindung auf eine nicht-medizinische Verwendung eines Gemisches, das aus oder im Wesentlichen aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL und gegebenenfalls Lactose besteht, einschließlich der bereits offenbarten bevorzugten und stärker bevorzugten Ausführungsformen, oder einer Zusammensetzung, die das Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL und gegebenenfalls Lactose besteht, umfasst, einschließlich der bereits offenbarten bevorzugten und stärker bevorzugten Ausführungsformen, zur Aufrechterhaltung der kommensalen Homöostase der Darmmikrobiota bei einem Menschen.
  • Ferner bezieht sich ein anderer Aspekt der Erfindung auf eine nicht-medizinische Verwendung eines Gemisches, das aus oder im Wesentlichen aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL und gegebenenfalls Lactose besteht, einschließlich der bereits offenbarten bevorzugten und stärker bevorzugten Ausführungsformen, oder einer Zusammensetzung, die das Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL und gegebenenfalls Lactose besteht, umfasst, einschließlich der bereits offenbarten bevorzugten und stärker bevorzugten Ausführungsformen, für das Nahrungsmanagement eines Menschen.
  • Überdies verbessert das Gemisch, das aus oder im Wesentlichen aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL und gegebenenfalls Lactose besteht, einschließlich der bereits offenbarten bevorzugten und stärker bevorzugten Ausführungsformen, die Lebensfähigkeit nützlicher Probiotika in wässerigen Zusammensetzungen. Es ist herausgefunden worden, dass probiotische Stämme, z. B. Lactobacillus rhamnosus-Stämme, in Gemischen mit HMOs eine signifikant erhöhte Regeneration und Lebensfähigkeit aufweisen, wenn sie mit einem flüssigen Umfeld mit niedrigem pH, wie Magensäure oder sauren Getränken, in Kontakt kommen. Daher kann die Kombination des Gemisches aus HMOs gemäß der vorliegenden Erfindung mit probiotischen Stämmen, vorzugsweise lyophilisierten Probiotika, sowohl einen verlässlichen Weg der Abgabe einer zählbaren Menge an Probiotika an einen Wirt (Mensch oder Tier), wie beispielsweise in Pharmazeutikum-ähnlichen Formen, in nutritiven Zusammensetzungen oder in Form von Lebensmitteln bieten.
  • Auch wenn die Erfindung unter Bezugnahme auf Ausführungsformen beschrieben worden ist, versteht es sich, dass verschiedene Modifikationen innerhalb des Umfangs der Erfindung möglich sind.
  • Es werden die folgenden nummerierten Aspekte der Erfindung bereitgestellt:
    1. 1. Ein Gemisch, das im Wesentlichen aus 3-FL als Komponente A, LNFP-I als Komponente B, 2'-FL als Komponente C, LNDFH-I als Komponente D, DFL als Komponente E und gegebenenfalls Lactose als Komponente F besteht.
    2. 2. Das Gemisch gemäß Aspekt 1, das im Wesentlichen aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL und Lactose besteht, wobei vorzugsweise
      • - Komponente D mit 8-13 Mol-% oder 14-22 Gew.-% und/oder
      • - Komponente E mit 9,5-17,5 Mol-% oder 11,5-19 Gew.-% und/oder
      • - Komponenten D+E mit 17,5-30,5 Mol-% oder 25,5-41 Gew.-%, bezogen auf die Komponenten A, B, C, D, E und F zusammengenommen, vorliegt/vorliegen oder
      • - Komponente D mit 2-22 Mol-% oder 5-34 Gew.-% oder
      • - Komponente E mit 7-24 Mol-% oder 6-29 Gew.-%, bezogen auf die Komponenten A, B, C, D, E und F zusammengenommen, vorliegt, vorausgesetzt, dass Komponenten D+E mit 23,5-33 Mol-% oder 30,5-43 Gew.-% vorliegen.
    3. 3. Das Gemisch gemäß Aspekt 1 oder 2, wobei
      • - Komponenten A+B+C mit 41,5-67 Mol-% oder 41-66 Gew.-% vorliegen, wobei vorzugsweise mehr von Komponente B als von Komponente C vorliegt, oder
      • - Komponenten A+B+C mit 40,5-54,5 Mol-% oder 41-54 Gew.-% vorliegen, wobei vorzugsweise Komponente A mit 21-27 Mol-% vorliegt.
    4. 4. Das Gemisch gemäß einem der vorstehenden Aspekte, wobei
      • - Komponente A mit 19-24,5 Mol-% oder 15-20 Gew.-% vorliegt,
      • - Komponente B mit 12,5-15,5 Mol-% oder 19-22 Gew.-% vorliegt,
      • - Komponente C mit 7-10 Mol-% oder 6-8 Gew.-% vorliegt,
      • - Komponente D mit 11-14 Mol-% oder 18-22 Gew.-% vorliegt,
      • - Komponente E mit 14,5-17,5 Mol-% oder 16-19 Gew.-% vorliegt und
      • - Komponente F mit 25-30 Mol-% oder 15-19 Gew.-% vorliegt.
    5. 5. Das Gemisch gemäß Aspekt 1, das im Wesentlichen aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I und DFL besteht, wobei vorzugsweise
      • - Komponente D mit 10-17,5 Mol-% oder 16-25,5 Gew.-%, und/oder
      • - Komponente E mit 12-23,5 Mol-% oder 13-22 Gew.-%, und/oder
      • - Komponenten D+E mit 22-41 Mol-% oder 29-47,5 Gew.-%, bezogen auf die Komponenten A, B, C, D und E zusammengenommen, vorliegt/vorliegen oder
      • - Komponente D mit 3,5-29,5 Mol-% oder in 6-39 Gew.-%, und/oder
      • - Komponente E mit 9-32 Mol-% oder in 7,5-34,5 Gew.-%,
      bezogen auf die Komponenten A, B, C, D und E zusammengenommen, vorliegt, vorausgesetzt, dass Komponenten D+E mit 31,5-41 Mol-% oder 36,5-49 Gew.-% vorliegen.
    6. 6. Das Gemisch gemäß Aspekt 5, wobei
      • - mehr von Komponente B in dem Gemisch vorliegt als von Komponente C oder
      • - Komponenten A+B+C mit 57-70 Mol-% oder 51-64,5 Gew.-% vorliegen, wobei vorzugsweise Komponente A mit 29-35,5 Mol-% vorliegt.
    7. 7. Das Gemisch gemäß Aspekt 1, 5 oder 6, wobei
      • - Komponente A mit 29-33 Mol-% oder 20-24,5 Gew.-% vorliegt,
      • - Komponente B mit 18-21,5 Mol-% oder 23-25,5 Gew.-% vorliegt,
      • - Komponente C mit 10-12,5 Mol-% oder 7,5-9,5 Gew.-% vorliegt,
      • - Komponente D mit 15-17,5 Mol-% oder 22-25,5 Gew.-% vorliegt,
      • - Komponente E mit 20,5-23,5 Mol-% oder 19,5-22 Gew.-% vorliegt.
    8. 8. Eine Zusammensetzung, die das Gemisch gemäß einem der vorstehenden Aspekte umfasst, wobei die Zusammensetzung vorzugsweise ferner ein Probiotikum, stärker bevorzugt L. rhamnosus, insbesondere L. rhamnosus LGG DSM 33156, umfasst.
    9. 9. Ein Verfahren zum Erhalt des Gemisches gemäß einem der Aspekte 1 bis 7, wobei das Verfahren das Umsetzen von 3-FL, LNFP-I und 2'-FL in der Gegenwart einer α1-3/4-Transfucosidase unter Erzeugung eines Reaktionsgemisches und dann Entfernen der α1-3/4-Transfucosidase und gegebenenfalls Lactose aus dem Reaktionsgemisch umfasst, wobei die α1-3/4-Transfucosidase vorzugsweise die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:1 mit den folgenden Mutationen: W135F-A174N-N274A-E413R umfasst oder daraus besteht.
    10. 10. Ein Gemisch oder eine Zusammensetzung gemäß einem der Aspekte 1 bis 8 zur Verwendung als ein Medikament, vorzugsweise
      • - wobei das Mikrobiom eines Menschen moduliert ist, oder
      • - wobei die Verwendung das Behandeln eines und/oder Mindern des Risikos für einen breiten Bereich bakterieller oder viraler Infektionen bei einem Menschen ist.
    11. 11. Eine Verwendung des Gemisches gemäß einem der Aspekte 1 bis 8 zur Verbesserung der Lebensfähigkeit von Probiotika, vorzugsweise L. rhamnosus, stärker bevorzugt L. rhamnosus LGG DSM 33156, in einer wässerigen Zusammensetzung.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Eine Lösung von 3-FL (4,278 kg, testkorrigiert, 8,76 Mol), LNFP-I (3,807 kg, testkorrigiert, 4,46 Mol) und 2'-FL (2,072 kg, testkorrigiert, 4,24 Mol) in Wasser (17,5 kg) wurde in einen 20-Liter-Fermenter überführt. Der pH der Lösung wurde mit einer 7 % HCI-Lösung auf 6,0 eingestellt. Gefriergetrocknetes Pulver (11,6 g) der W135F-A174N-N274A-E413R-Mutante von Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC15697 (Aminosäurenummerierung gemäß SEQ ID NO:1, siehe WO 2016/063261 ) wurde in Wasser (100 g) gelöst und der obigen Lösung zugegeben, dann wurde das Reaktionsgemisch bei 25 °C für 18 Stunden gerührt, gefolgt von Erhitzen auf bis zu 55 °C über 4 Stunden und das Rühren wurde bei dieser Temperatur für 2 Stunden fortgesetzt. Anschließend wurde der pH des Gemisches mit einer 7 % HCI-Lösung auf 5,0 eingestellt und das Gemisch wurde über 1 Stunde auf bis zu 70 °C erhitzt und bei dieser Temperatur für 2 Stunden gehalten. Dann konnte das Gemisch auf 15 °C abkühlen, während das Enzym ausfiel. Dann wurde die erhaltene Suspension ultrafiltriert (15 kDa Keramikmembran, 0,5 m2, Transmembrandruck: 5,8-5,9 bar, Temperatur: 19-24 °C) und 28,05 kg Permeat wurden gesammelt. Das Permeat wurde mikrofiltriert (0,2 µm PES-Membran) und gefriergetrocknet, was 10,57 g Pulver ergab (Saccharide durch HPLC: 95 Gew.-%, von denen 3-FL 16 Gew.-% ausmacht, LNFP-I 19 Gew.-% ausmacht, 2'-FL 7 Gew.-% ausmacht, LNDFH-I 18 Gew.-% ausmacht, DFL 17 Gew.-% ausmacht und Lactose 18 Gew.-% ausmacht; Proteingehalt durch Bradford-Test: < 6 ppm).
  • Beispiel 2
  • Gemäß dem in Beispiel 1 offenbarten Protokoll wurden die folgenden Zusammensetzungen bei verschiedenen Donator-Akzeptor-Verhältnissen erhalten:
    relatives Molverhältnis
    Start- Produkt
    Donator Akzeptor
    3-FL LNFP-I 2'-FL 3-FL LNFP-I 2'-FL LNDFH-I DFL Lactose
    0,51 0,49 0,23 0,14 0,08 0,12 0,16 0,27
    0,24 0,25
    0,52 0,48 0,23 0,16 0,06 0,15 0,14 0,26
    0,28 0,20
    0,51 0,49 0,23 0,20 0,03 0,20 0,08 0,26
    0,38 0,21
    0,52 0,48 0,23 0,12 0,10 0,09 0,19 0,27
    0,19 0,29
    0,51 0,49 0,23 0,07 0,17 0,03 0,23 0,25
    0,10 0,39
    0,50 0,50 0,21 0,13 0,09 0,11 0,16 0,30
    0,25 0,25
    0,76 0,24 0,55 0,05 0,02 0,09 0,10 0,19
    0,12 0,12
    0,68 0,32 0,44 0,08 0,03 0,10 0,13 0,22
    0,16 0,16
    0,35 0,65 0,08 0,23 0,18 0,11 0,15 0,25
    0,32 0,33
    0,26 0,74 0,04 0,28 0,24 0,10 0,13 0,21
    0,36 0,38
  • Beispiel 3
  • Lösungen von lyophilisiertem Lactobacillus rhamnosus (Probio-Tec® LGG®, Chr. Hansen, hinterlegt bei der DSMZ-Kultursammlung unter der Zugriffsnummer DSM 33156, 0,4 mg/ml) und HMOs (2'-FL, 2'-FL/DFL in einem Gewichtsverhältnis von 6,1:1 bzw. das HMO-Gemisch aus Beispiel 1,5% Gew./Vol.) in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH = 3) wurden auf 37 °C erwärmt und für etwa 30 s kräftigt vermengt, bis es keine sichtbaren Klumpen mehr gab. Die Kontrolle enthielt nur das Probiotikum. Die Röhrchen wurden bei 37 °C für 3 h inkubiert. Die Proben wurden weiter verdünnt und 100 µl wurden in zweifacher Ausfertigung auf MRS-Agarplatten verteilt, die für 48 h bei 37 °C in Anaerobierkammern inkubiert wurden. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte mit Standardabweichung von koloniebildenden Einheiten (CFU) pro Milliliter, berechnet aus LGG-Kolonien auf Agarplatten ausgedrückt (1).
  • Lyophilisiertes LGG, gelöst mit dem HMO-Gemisch gemäß der Erfindung, zeigte eine signifikant verbesserte Regeneration und Überlebensfähigkeit im Vergleich zu der Kontrolle oder einigen der Inhaltsstoffe des HMO-Gemisches nach 3 Stunden Inkubation bei 37 °C unter sauren Bedingungen bei pH 3,0, bewertet durch Koloniezählung. Die Daten lassen darauf schließen, dass die verringerte Regeneration und Lebensfähigkeit von L. rhamnosus nach einer Exposition zu niedrigen pH-Bedingungen, z. B. im Magen oder in einem sauren Getränkt, in der Gegenwart von HMOs verhindert werden kann.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll als elektronisches Dokument. Dieses kann sowohl in DEPATISnet als auch im DPMAregister aufgerufen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
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Claims (19)

  1. Gemisch, umfassend, im Wesentlichen bestehend aus oder bestehend aus 3-FL als Komponente A, LNFP-I als Komponente B, 2'-FL als Komponente C, LNDFH-I als Komponente D, DFL als Komponente E und gegebenenfalls Lactose als Komponente F.
  2. Gemisch nach Anspruch 1, umfassend, im Wesentlichen bestehend aus oder bestehend aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL und Lactose.
  3. Gemisch nach Anspruch 1 oder 2, wobei - Komponente D 8-13 Mol-% oder 14-22 Gew.-% beträgt und/oder - Komponente E 9,5-17,5 Mol-% oder 11,5-19 Gew.-% beträgt und/oder - Komponenten D+E 17,5-30,5 Mol-% oder 25,5-41 Gew.-% betragen, bezogen auf die Komponenten A, B, C, D, E und F zusammengenommen.
  4. Gemisch nach Anspruch 1 oder 2, wobei - Komponente D 2-22 Mol-% oder 5-34 Gew.-% beträgt oder - Komponente E 7-24 Mol-% oder 6-29 Gew.-% beträgt, bezogen auf die Komponenten A, B, C, D, E und F zusammengenommen, vorausgesetzt, dass die Komponenten D+E 23,5-33 Mol-% oder 30,5-43 Gew.-% betragen.
  5. Gemisch nach Anspruch 3, wobei die Komponenten A+B+C mit 41,5-67 Mol-% oder 41-66 Gew.-% vorliegen, wobei vorzugsweise mehr von Komponente B als von Komponente C vorliegt.
  6. Gemisch nach Anspruch 4, wobei die Komponenten A+B+C mit 40,5-54,5 Mol-% oder 41-54 Gew.-% vorliegen, wobei vorzugsweise Komponente A mit 21-27 Mol-% vorliegt.
  7. Gemisch nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei - Komponente A 19-24,5 Mol-% oder 15-20 Gew.-% beträgt, - Komponente B 12,5-15,5 Mol-% oder 19-22 Gew.-% beträgt, - Komponente C 7-10 Mol-% oder 6-8 Gew.-% beträgt, - Komponente D 11-14 Mol-% oder 18-22 Gew.-% beträgt, - Komponente E 14,5-17,5 Mol-% oder 16-19 Gew.-% beträgt und - Komponente F 25-30 Mol-% oder 15-19 Gew.-% beträgt.
  8. Gemisch nach Anspruch 1, umfassend, im Wesentlichen bestehend aus oder bestehend aus 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I und DFL.
  9. Gemisch nach Anspruch 1 oder 8, wobei - Komponente D 10-17,5 Mol-% oder 16-25,5 Gew.-% beträgt und/oder - Komponente E 12-23,5 Mol-% oder 13-22 Gew.-% beträgt und/oder - Komponenten D+E 22-41 Mol-% oder 29-47,5 Gew.-% betragen, bezogen auf die Komponenten A, B, C, D und E zusammengenommen.
  10. Gemisch nach Anspruch 1 oder 8, wobei - Komponente D 3,5-29,5 Mol-% oder 6-39 Gew.-% beträgt und/oder - Komponente E 9-32 Mol-% oder 7,5-34,5 Gew.-% beträgt, bezogen auf die Komponenten A, B, C, D und E zusammengenommen, vorausgesetzt, dass die Komponenten D+E 31,5-41 Mol-% oder 36,5-49 Gew.-% betragen.
  11. Gemisch nach Anspruch 9, wobei mehr von Komponente B in dem Gemisch vorliegt als von Komponente C.
  12. Gemisch nach Anspruch 10, wobei die Komponenten A+B+C mit 57-70 Mol-% oder 51-64,5 Gew.-% vorliegen, wobei vorzugsweise Komponente A mit 29-35,5 Mol-% vorliegt.
  13. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 und 8 bis 12, wobei - Komponente A 29-33 Mol-% oder 20-24,5 Gew.-% beträgt, - Komponente B 18-21,5 Mol-% oder 23-25,5 Gew.-% beträgt, - Komponente C 10-12,5 Mol-% oder 7,5-9,5 Gew.-% beträgt, - Komponente D 15-17,5 Mol-% oder 22-25,5 Gew.-% beträgt, - Komponente E 20,5-23,5 Mol-% oder 19,5-22 Gew.-% beträgt.
  14. Zusammensetzung, umfassend das Gemisch nach einem der vorstehenden Ansprüche.
  15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, ferner umfassend ein Probiotikum, vorzugsweise L. rhamnosus, stärker bevorzugt L. rhamnosus LGG DSM 33156.
  16. Zusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15, die eine nutritive, pharmazeutische oder eine kosmetische Zusammensetzung ist.
  17. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 13, erhalten oder erhältlich durch ein Verfahren, umfassend das Umsetzen von 3-FL, LNFP-I und 2'-FL in der Gegenwart einer α1-3/4-Transfucosidase unter Erzeugung eines Reaktionsgemisches und dann Entfernen der α1-3/4-Transfucosidase und gegebenenfalls Lactose aus dem Reaktionsgemisch.
  18. Gemisch nach Anspruch 17, wobei die α1-3/4-Transfucosidase die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:1 mit den folgenden Mutationen: W135F-A174N-N274A-E413R umfasst oder daraus besteht.
  19. Gemisch nach Anspruch 17 oder 18, wobei das Verfahren unter im Wesentlichen pufferfreien Bedingungen durchgeführt wird.
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