DE202012003212U1

DE202012003212U1 - Filter for the accumulation of cancer cells

Info

Publication number: DE202012003212U1
Application number: DE202012003212U
Authority: DE
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd; University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC; Resonac Corp
Priority date: 2011-08-23
Filing date: 2012-03-29
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2022-03-30
Also published as: JP5854456B2; CN202730123U; JP2013042689A

Abstract

Ein Filter zur Anreicherung von Krebszellen, bestehend aus einem Metallsubstrat, in dem mehrere Durchgangslöcher gebildet wurden, wobei die Öffnungsform der Durchgangslöcher mindestens eine Form ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Ellipse, einem Kreis, einem Rechteck, einem Quadrat, einem Rechteck mit abgerundeten Ecken und einem Polygon.A filter for the enrichment of cancer cells, consisting of a metal substrate in which a plurality of through-holes have been formed, the opening shape of the through-holes being at least one shape selected from the group consisting of an ellipse, a circle, a rectangle, a square, a Rectangle with rounded corners and a polygon.

Description

Technischer BereichTechnical part

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Filter, der im Blut zirkulierende Krebszellen (Circulating Tumor Cells, im Folgenden je nach Umständen auch ”CTCs” genannt) effizient einfangen kann.The present invention relates to a filter which can efficiently capture circulating tumor cells (hereinafter also called "CTCs" in the following, depending on the circumstances) in the blood.

Stand der TechnikState of the art

Die Anreicherung von Krebszellen ist für Forschung und Medizin äußerst wichtig; wenn man die Krebszellen im Blut anreichern könnte, könnte man das als Diagnostik für Krebs anwenden. Zum Beispiel ist der wichtigste Faktor bei der Prognose und Behandlung von Krebs, ob es bei der Erstuntersuchung und den Maßnahmen Metastasen der Krebszellen gibt oder nicht. Wenn die Verbreitung der Krebszellen in der Anfangszeit in peripheres Blut vordringt, ist der Nachweis von CTCs ein nützliches Mittel, um das Fortschreiten des Krankheitszustands zu bewerten. Da es im Blut jedoch überwältigend viele Blutbestandteile wie zum Beispiel rote und weiße Blutkörperchen gibt, ist es schwierig, die äußerst geringe Menge an CTCs nachzuweisen.The accumulation of cancer cells is extremely important for research and medicine; If you could accumulate the cancer cells in the blood, you could use that as a diagnostic for cancer. For example, the most important factor in the prognosis and treatment of cancer is whether there are metastases of the cancer cells at the initial examination and the measures or not. When the spread of cancer cells in the early days progresses into peripheral blood, the detection of CTCs is a useful means of assessing the progression of the disease state. However, since there are overwhelmingly many blood components in the blood, such as red and white blood cells, it is difficult to detect the extremely low levels of CTCs.

In den letzten Jahren wurde eine Methode vorgeschlagen, bei der man eine geringe Menge CTCs wirksam nachweisen kann, indem man einen Filter benutzt, der Parylene verwendet (siehe z. B. Patentreferenz 1).In recent years, a method has been proposed in which a small amount of CTCs can be efficiently detected by using a filter using Parylene (see, for example, Patent Reference 1).

Referenzen zum Stand der TechnikReferences to the state of the art

PatentreferenzenPatent References

Patent Reference 1: Publication Number: WO / 2010/135603

Überblick über die ErfindungOverview of the invention

Von der Erfindung zu lösende AufgabeProblem to be solved by the invention

Im Fall eines gewöhnlichen Krebspatienten, bei dem Metastasen begonnen haben, gibt es im Blut auf 10 Milliarden Blutzellen nur etwa 1 CTC. Es ist äußerst schwierig, diese extrem geringe Konzentration an CTCs effizient einzufangen.In the case of a common cancer patient who has metastasized, there are only about 1 CTC in blood for 10 billion blood cells. It is extremely difficult to efficiently capture this extremely low concentration of CTCs.

CTCs sind etwas größer als die Blutzellen im Blut, wie zum Beispiel rote oder weiße Blutkörperchen oder auch Blutplättchen. Folglich ist es logischerweise möglich, mit einem mechanischen Filterverfahren diese zellulären Bestandteile zu entfernen und die CTCs anzureichern. Jedoch gibt es unter den weißen Blutkörperchen auch Zellen, die etwa die gleiche Größe wie CTCs haben. Daher kam es vor, dass bei einem gewöhnlichen Filter viele weiße Blutkörperchen unter die angereicherten CTCs gemischt waren, und ein präziser Nachweis der CTCs schwierig war.CTCs are slightly larger than the blood cells in the blood, such as red or white blood cells or platelets. Consequently, it is logically possible to use a mechanical filtering process to remove these cellular constituents and enrich the CTCs. However, there are also cells that are about the same size as CTCs among white blood cells. Therefore, in a conventional filter, many white blood cells were mixed among the enriched CTCs, and accurate detection of the CTCs was difficult.

Folglich ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Filter bereitzustellen, der die Überreste an zellulären Bestandteilen, insbesondere weißen Blutkörperchen, reduzieren und CTCs mit einer hohen Einfangrate anreichern kann.Accordingly, the object of the present invention is to provide a filter which can reduce the remnants of cellular constituents, especially white blood cells, and accumulate CTCs at a high capture rate.

Mittel zur Lösung der AufgabestellungMeans for solving the task

Die vorliegende Erfindung stellt einen Filter zur Anreicherung von Krebszellen bereit, der aus einem Metallsubstrat besteht, in dem mehrere Durchgangslöcher geformt sind, und bei dem die Öffnungsforrm der Durchgangslöcher mindestens eine Form aus der Gruppe bestehend aus einer Ellipse, einem Kreis, einem Rechteck, einem Quadrat und einem Rechteck mit abgerundeten Ecken ist.The present invention provides a filter for accumulating cancer cells, which consists of a metal substrate in which a plurality of through-holes are formed, and in which the opening shape of the through-holes is at least one of the group consisting of an ellipse, a circle, a rectangle, a Square and a rectangle with rounded corners.

Mit dem Filter der vorliegenden Erfindung kann man die Überreste an zellulären Bestandteilen reduzieren und CTCs mit einer hohen Einfangrate anreichern. Hierbei bedeutet Überreste, dass Zellen nicht durch den Filter hindurchgehen, sondern oberhalb des Filters hängenbleiben. Da Metall sehr gut bearbeitbar ist, lässt sich der Filter mit höherer Präzision fertigen. Dadurch kann man die Überreste an zellulären Bestandteilen reduzieren und eine hohe CTC-Einfangrate erzielen.With the filter of the present invention, one can reduce the remnants of cellular components and accumulate CTCs at a high capture rate. Remains means that cells do not pass through the filter, but get stuck above the filter. Since metal is very easy to process, the filter can be manufactured with higher precision. This can reduce the remnants of cellular components and achieve a high CTC capture rate.

Da Metall außerdem steifer als andere Materialien wie zum Beispiel Plastik ist, bleiben dessen Größe und Form auch bei äußerer Krafteinwirkung erhalten. Deshalb kann man davon ausgehen, dass Blutbestandteile, die etwas größer als die Durchgangslöcher sind (insbesondere die weißen Blutkörperchen) dazu gebracht werden können, dass sie sich verformen und hindurchgehen, so dass eine präzise Isolierung und Anreicherung möglich wird. Unter den weißen Blutkörperchen gibt es auch Zellen, die etwa genauso groß sind wie CTCs, deshalb kommt es vor, dass man nicht allein aufgrund des Größenunterschieds nur CTCs in hoher Konzentration differenzieren kann. Da jedoch weiße Blutkörperchen verformbarer sind als Krebszellen, können sie durch äußere Krafteinwirkung wie zum Beispiel Ansaugen oder Druck auch durch ein Loch durchgehen, das kleiner ist als sie selbst, und können so von den CTCs isoliert werden. In addition, because metal is stiffer than other materials such as plastic, its size and shape are retained even when external force is applied. Therefore, it can be expected that blood components that are slightly larger than the through holes (especially the white blood cells) can be made to deform and go through, allowing for precise isolation and accumulation. Among the white blood cells, there are also cells that are about the same size as CTCs, so it is not only because of the difference in size that one can only differentiate CTCs in high concentration. However, because white blood cells are more deformable than cancer cells, they can also pass through a hole smaller than themselves by external force such as aspiration or pressure and can thus be isolated from the CTCs.

Dadurch, dass die Öffnungsform der Durchgangslöcher mindestens eine Form aus der Gruppe bestehend aus einer Ellipse, einem Kreis, einem Rechteck, einem Quadrat, einem Rechteck mit abgerundeten Ecken und einem Polygon ist, können die Zellen nur schwer die Durchgangslöcher verstopfen, und man kann die Durchlässigkeit für die Blutzellen im Blut erhöhen und eine hohe CTC-Einfangrate erreichen.The fact that the opening shape of the through holes is at least one of the group consisting of an ellipse, a circle, a rectangle, a square, a rectangle with rounded corners and a polygon, the cells are difficult to clog the through holes, and you can Increase blood cell permeability and achieve a high CTC capture rate.

Für das Metallsubstrat sollte man mindestens ein Metall aus der Gruppe bestehend aus Gold, Silber, Kupfer, Aluminium, Wolfram, Nickel, Chrom, Edelstahl und einer Legierung von diesen als Hauptbestandteil nehmen.For the metal substrate, at least one of the group consisting of gold, silver, copper, aluminum, tungsten, nickel, chromium, stainless steel and an alloy thereof should be used as a main component.

Da diese Metalle sehr gut bearbeitbar sind, lässt sich der Filter mit noch höherer Präzision fertigen. Dadurch kann man die Überreste an zellulären Bestandteilen reduzieren und eine noch höhere CTC-Einfangrate erzielen.Since these metals are very easy to process, the filter can be manufactured with even higher precision. This allows one to reduce the remnants of cellular components and achieve an even higher CTC capture rate.

Die Öffnungsform der Durchgangslöcher sollte ein Rechteck oder ein Rechteck mit abgerundeten Ecken sein, dessen kurze Seiten eine Seitenlänge von 5,0 bis 15,0 μm haben. Das Rechteck mit abgerundeten Ecken bezeichnet eine Form, die als zwei langen Seiten gleicher Länge und zwei Halbkreisen besteht. Dadurch, dass die Öffnungsform der Durchgangslöcher ein Rechteck oder ein Rechteck mit abgerundeten Ecken der oben genannten Größe ist, kann ein Verstopfen des Filters noch wirksamer verhindert werden.The opening shape of the through holes should be a rectangle or a rectangle with rounded corners whose short sides have a side length of 5.0 to 15.0 μm. The rectangle with rounded corners denotes a shape consisting of two long sides of equal length and two semicircles. Characterized in that the opening shape of the through holes is a rectangle or a rectangle with rounded corners of the above size, clogging of the filter can be more effectively prevented.

Das durchschnittliche Öffnungsverhältnis der Durchgangslöcher sollte bei 0,1 bis 50% liegen. Dadurch, dass das durchschnittliche Öffnungsverhältnis in diesem Bereich liegt, kann man eine noch höhere CTC-Einfangrate erzielen.The average opening ratio of the through holes should be 0.1 to 50%. By having the average aperture ratio in this range, one can achieve an even higher CTC capture rate.

Die Filterdicke sollte bei 3 bis 100 μm liegen. Ein Filter mit einer Membrandicke in diesem Bereich ist gut handhabbar, und auch für eine präzise Fertigung geeignet.The filter thickness should be 3 to 100 μm. A filter with a membrane thickness in this range is easy to handle, and also suitable for precise production.

Der Filter sollte für Krebszellen in peripherem Blut, in Aszites oder in einem Pleuraerguss verwendet werden, und sollte für Krebszellen von kleinzelligem Lungenkrebs oder nicht-kleinzelligem Lungenkrebs verwendet werden.The filter should be used for cancer cells in peripheral blood, in ascites or in a pleural effusion, and should be used for cancer cells of small cell lung cancer or non-small cell lung cancer.

Für die Anreicherung dieser Krebszellen ist die Zusammensetzung des Filters besonders geeignet.For the enrichment of these cancerous cells, the composition of the filter is particularly suitable.

Wirkung der ErfindungEffect of the invention

Mit der vorliegenden Erfindung kann man einen Filter bereitstellen, mit dem man die Überreste an weißen Blutkörperchen reduzieren und CTCs mit einer hohen Einfangrate anreichern kann.With the present invention, one can provide a filter that can reduce the remnants of white blood cells and accumulate CTCs at a high capture rate.

Kurze Erläuterung der FigurenBrief explanation of the figures

1(A) ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform des Filters. 1(B) ist eine Draufsicht der Durchgangslöcher des Filters in einer Ausführungsform. 1 (A) is a schematic representation of an embodiment of the filter. 1 (B) FIG. 10 is a plan view of the through holes of the filter in an embodiment. FIG.

Ausführungsformen der ErfindungEmbodiments of the invention

Im Folgenden wird, unter Umständen unter Bezugnahme auf die Abbildungen, eine geeignete Ausführungsform erklärt. Bei der Erklärung der Figuren wird demselben Element jeweils dieselbe Nummer zugeordnet, und sich wiederholende Erklärungen werden abgekürzt. Außerdem sind zugunsten eines leichteren Verständnisses einzelne Teile in den Figuren übertrieben gezeichnet; die Größenverhältnisse stimmen nicht unbedingt mit denen in der Erklärung überein.In the following, a suitable embodiment will be explained with reference to the figures. In the explanation of the figures, the same number is assigned the same number and repetitive explanations are abbreviated. In addition, in order to facilitate understanding, individual parts in the figures are exaggerated; the proportions do not necessarily match those in the declaration.

1(A) ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform des Filters. Der Filter (100) besteht aus einem Substrat (20), in dem mehrere Durchgangslöcher (10) gebildet sind. Die Öffnungsform der Durchgangslöcher (10) ist ein Rechteck mit abgerundeten Ecken. Die Anordnung der Durchgangslöcher (10) kann eine wohlgeordnete Anordnung sein wie in 1(A), sie kann aber auch eine kreuzweise Anordnung sein, bei der die Reihen verschoben angeordnet sind, oder auch eine beliebig angeordnete, zufällige Anordnung. 1 (A) is a schematic representation of an embodiment of the filter. The filter ( 100 ) consists of a substrate ( 20 ), in which several through holes ( 10 ) are formed. The opening shape of the through holes ( 10 ) is a rectangle with rounded corners. The arrangement of the through holes ( 10 ) may be a well-ordered arrangement as in 1 (A) , but it can also be a cross-arrangement, in which the rows are arranged shifted, or even an arbitrarily arranged, random arrangement.

1(B) ist eine Draufsicht der Durchgangslöcher (10) des Filters in der oben genannten Ausführungsform. Die Öffnungsform der Durchgangslöcher (10) ist eine Form, bei der ein Rechteck mit den kurzen Seiten a und den langen Seiten b an den kurzen Seiten mit zwei Halbkreisen mit dem Radius c verbunden ist. In einer Ausführungsform betragen a, b und c jeweils 8, 22 und 4 μm. 1 (B) is a plan view of the through holes ( 10 ) of the filter in the above embodiment. The opening shape of the through holes ( 10 ) is a shape in which a rectangle having the short sides a and long sides b on the short sides is connected to two semicircles of radius c. In one embodiment, a, b and c are 8, 22 and 4 μm, respectively.

Das Material des Substrats (des Filters) ist ein Metall. Als Metall kann man beispielsweise Edelmetalle wie Gold und Silber, unedle Metalle wie Kupfer, Aluminium, Wolfram, Nickel und Chrom, und eine Legierung von diesen anführen, aber es ist nicht darauf beschränkt. Es kann ein chemisches Element als Metall verwendet werden, es können zugunsten der Funktionalität aber auch Legierungen mit anderen Metallen oder Metalloxide verwendet werden. Mit Hinblick auf den Preis und eine einfache Beschaffung ist es günstig, Nickel, Kupfer und Metalle, die diese als Hauptbestandteil haben, zu verwenden. Hierbei bezeichnet Hauptbestandteil einen Bestandteil von mindestens 50 Gew.-% des Materials, aus dem das Substrat besteht. In diesem Metall kann man Durchgangslöcher bilden, indem man Verfahren wie zum Beispiel die Fotolitografie anwendet.The material of the substrate (the filter) is a metal. As the metal, for example, noble metals such as gold and silver, base metals such as copper, aluminum, tungsten, nickel and chromium, and an alloy of these may be mentioned, but it is not limited thereto. A chemical element may be used as the metal, but alloys with other metals or metal oxides may be used in favor of the functionality. In terms of price and easy procurement, it is convenient to use nickel, copper and metals having them as the main ingredient. Here, major ingredient means a component of at least 50% by weight of the material of which the substrate is made. In this metal, through holes can be formed by using methods such as photolithography.

Als Öffnungsform der Durchgangslöcher können zum Beispiel eine Ellipse, ein Kreis, ein Rechteck, ein Quadrat, ein Rechteck mit abgerundeten Ecken und ein Polygon angeführt werden. Mit Hinblick darauf, dass man effizient Krebszellen einfangen kann, ist ein Kreis, ein Rechteck oder ein Rechteck mit abgerundeten Ecken günstig. Mit Hinblick auf das Verhindern eines Verstopfens des Filters ist ein Rechteck oder ein Rechteck mit abgerundeten Ecken besonders günstig.As the opening shape of the through holes, for example, an ellipse, a circle, a rectangle, a square, a rectangle with rounded corners, and a polygon may be cited. Considering that one can efficiently capture cancer cells, a circle, a rectangle or a rectangle with rounded corners is favorable. With a view to preventing clogging of the filter, a rectangle or a rectangle having rounded corners is particularly favorable.

Die Größe einer gewöhnlichen CTC liegt bei einem Durchmesser von mindestens 10 μm. Hierbei bezeichnet der Zellendurchmesser bei einer Beobachtung unter dem Mikroskop die längste aller Strecken, die 2 beliebige Punkte auf dem Umriss der Zelle verbinden. Dabei ist es mit Hinblick auf die Durchlässigkeit von zellulären Bestandteilen und die CTC-Einfangleistung günstig, wenn der durchschnittliche Lochdurchmesser der Durchgangslöcher bei 5 bis 15 μm liegt, noch günstiger ist es, wenn er bei 6 bis 12 μm liegt, und besonders günstig ist es, wenn er bei 7 bis 10 μm liegt. In der vorliegenden Beschreibung bezeichnet der Lochdurchmesser bei einer anderen als kreisförmigen Öffnungsform, zum Beispiel einer Ellipse, einem Rechteck oder einem Polygon, jeweils den größten. Durchmesser einer Kugel, die durch die Durchgangslöcher durchgehen würde. Der Lochdurchmesser der Durchgangslöcher ist dann, wenn die Öffnungsform zum Beispiel ein Rechteck oder ein Rechteck mit abgerundeten Ecken ist, die Länge der kurzen Seite dieses Rechtecks oder Rechtecks mit abgerundeten Ecken, und wenn die Öffnungsform ein Polygon ist, der Durchmesser des Inkreises dieses Polygons. Wenn die Öffnungsform ein Rechteck oder ein Rechteck mit abgerundeten Ecken ist, bildet sich, selbst wenn in einem Durchgangsloch eine CTC oder ein weißes Blutkörperchen eingefangen wurde, in Richtung der langen Seite der Öffnungsform eine Lücke. Da diese Lücke Flüssigkeiten durchlässt, kann man so ein Verstopfen des Filters verhindern.The size of a conventional CTC is at least 10 μm in diameter. In this case, the diameter of a cell under observation under the microscope is the longest of all the distances connecting 2 arbitrary points on the outline of the cell. At this time, it is favorable from the viewpoint of the permeability of cellular components and the CTC trapping performance when the average hole diameter of the through holes is 5 to 15 μm, more favorable when it is 6 to 12 μm, and particularly favorable when it is at 7 to 10 microns. In the present specification, the hole diameter at a shape other than a circular shape, for example, an ellipse, a rectangle or a polygon, is the largest one. Diameter of a ball that would pass through the through holes. The hole diameter of the through holes is, for example, when the opening shape is a rectangle or a rectangle with rounded corners, the length of the short side of this rectangle or rectangle with rounded corners, and if the opening shape is a polygon, the diameter of the inscribed circle of that polygon. When the opening shape is a rectangle or a rectangle having rounded corners, even if a CTC or a white blood cell has been trapped in a through hole, a gap is formed toward the long side of the opening shape. Since this gap lets fluids through, you can prevent so a clogging of the filter.

Das durchschnittliche Öffnungsverhältnis der Durchgangslöcher des Filters sollte günstigerweise bei 0,1 bis 5% liegen, noch günstiger bei 0,5 bis 40%, besonders günstig bei 1 bis 30% und am allergünstigsten bei 1 bis 10%. Öffnungsverhältnis bezeichnet hierbei auf einem bestimmten Bereich auf dem Filter die von den Durchgangslöchern eingenommene Fläche gegenüber der Fläche dieses Bereichs. Das durchschnittliche Öffnungsverhältnis bezeichnet die von den Durchgangslöchern eingenommene Fläche gegenüber der Fläche des ganzen Filters. Mit Hinblick auf die Verhinderung von Verstopfungen ist es umso günstiger, je größer das durchschnittliche Öffnungsverhältnis ist, aber wenn es 50% übersteigt, kann es sein, dass die Stabilität des Filters abnimmt und die Fertigung schwieriger wird. Wenn es ferner kleiner als 0,1% ist, kann es sein, dass die Krebszellen-Anreicherungsleistung des Filters sinkt, da leichter Verstopfungen entstehen.The average opening ratio of the through holes of the filter should desirably be 0.1 to 5%, more favorably 0.5 to 40%, more favorably 1 to 30% and most favorable 1 to 10%. Aperture ratio here refers to the area occupied by the through holes on a certain area on the filter with respect to the area of this area. The average aperture ratio refers to the area occupied by the through holes versus the area of the whole filter. With respect to the prevention of clogging, the larger the average aperture ratio, the better it is, but if it exceeds 50%, the stability of the filter may decrease and the manufacturing becomes more difficult. Further, if it is less than 0.1%, the cancer cell enrichment performance of the filter may decrease because of obstruction.

Die Filterdicke sollte günstigerweise bei 3 bis 100 μm liegen, noch günstiger bei 5 bis 50 μm und besonders günstig bei 10 bis 30 μm. Wenn die Substratdicke dünner als 3 μm ist, kann es sein, dass die Stabilität des Filters abnimmt und die Handhabung schwierig wird. Wenn die Substratdicke 100 μm übersteigt, kann es sein, dass man mehr Material als nötig verbraucht und mehr Zeit für die Fertigung braucht, und dies daher von den Kosten her von Nachteil ist, und dass die präzise Fertigung selbst schwierig wird.The filter thickness should desirably be from 3 to 100 .mu.m, more favorably from 5 to 50 .mu.m, and more favorably from 10 to 30 .mu.m. When the substrate thickness is thinner than 3 μm, the stability of the filter may decrease and the handling becomes difficult. If the substrate thickness exceeds 100 μm, it may be necessary to use more material than necessary and take more time for fabrication, and therefore, it is disadvantageous in terms of cost, and precision manufacturing itself becomes difficult.

Im Folgenden wird ein Verfahren zur Herstellung des Filters der vorliegenden Ausführungsform erklärt. Das Verfahren zur Herstellung des Filters ist nicht in besonderer Weise begrenzt, zum Beispiel lassen sich Herstellungsverfahren aufführen, die Fotolitografie anwenden, oder die Ätzen oder Elektroplattieren beinhalten. Im Folgenden wird ein Herstellungsverfahren erklärt, das Fotolitografie verwendet. Zuerst wird auf einen Träger beispielsweise aus Edelstahl eine lichtempfindliche Fotolackschicht (Belichtungsschicht) aufgeklebt. Als nächstes wird auf der Belichtungsschicht eine Maske fixiert, die das Muster der Öffnungsform der Filterdurchgangslöcher aufweist. Anschließend wird von oberhalb der Maske Licht (aktive Strahlung) eingestrahlt. Nach dem Bestrahlen mit Licht entfernt man den Träger, wenn sich auf der Belichtungsschicht ein Träger befindet, dann entwickelt man, indem man beispielsweise durch Nassentwicklung in einer Entwicklungsflüssigkeit wie z. B. einer wässrigen Alkalilösung, einer Wasser-Entwicklungsflüssigkeit oder einem organischen Lösungsmittel, oder durch Trockenentwicklung der unbelichtete Teil entfernt, und bildet so das Fotolackmuster heraus. Anschließend wird das entwickelte Fotolackmuster als Maske genommen und auf dem Substrat, das nicht mit einer Maske versehen ist und freiliegt, eine Plattierung vorgenommen. Als Plattierungsverfahren können z. B. Kupferplattierung, Lötplattierung, Nickelplattierung oder Goldplattierung aufgeführt werden. Wenn man nach der Plattierungsbehandlung die plattierte Schicht vom Träger und der Belichtungsschicht ablöst, kann man die plattierte Schicht abnehmen. Diese plattierte Schicht ist der Filter. Man kann die Oberfläche des abgenommenen Filters auch einer Aufrauungsbehandlung unterziehen. Als Verfahren für die Aufrauungsbehandlung können beispielsweise physikalische Behandlungen wie chemisches Ätzen mit einer sauren oder basischen wässrigen Lösung, oder Sandstrahlen aufgeführt werden.Hereinafter, a method of manufacturing the filter of the present embodiment will be explained. The method of making the filter is not particularly limited, for example List manufacturing processes that use photolithography or include etching or electroplating. The following explains a manufacturing method using photolithography. First, a light-sensitive photoresist layer (exposure layer) is adhered to a support of, for example, stainless steel. Next, a mask having the pattern of the opening shape of the filter through holes is fixed on the exposure layer. Subsequently, light is irradiated from above the mask (active radiation). After irradiation with light, the support is removed, if there is a support on the exposure layer, then developed by, for example, by wet development in a developing liquid such. Example, an aqueous alkali solution, a water-developing liquid or an organic solvent, or removed by dry development, the unexposed part, and thus forms the photoresist pattern out. Subsequently, the developed resist pattern is taken as a mask and plating is performed on the substrate which is not provided with a mask and is exposed. As a plating process z. Copper plating, solder plating, nickel plating or gold plating. When the plating layer of the support and the exposure layer is peeled off after the plating treatment, the plated layer can be removed. This plated layer is the filter. It is also possible to subject the surface of the removed filter to a roughening treatment. As the method for the roughening treatment, there may be mentioned, for example, physical treatments such as chemical etching with an acidic or basic aqueous solution, or sandblasting.

In einer Ausführungsform kann man CTCs anreichern, indem der Filter in den Fließweg eingebaut, und das Blut dem Fließweg zugeführt wird. Für die Zuführung des Blutes zum Fließweg kann man mehrere Methoden aufführen, beispielsweise eine Methode, bei der aus der Richtung des Eingangs des Fließwegs Druck angewandt wird, eine Methode, bei der aus der Richtung des Ausgangs des Fließwegs ein verminderter Druck eingesetzt wird, eine Methode, bei der eine Peristaltikpumpe verwendet wird. Für den Flächeninhalt des verwendeten Filters sind, z. B. für den Fall, dass die CTCs aus 1 ml Blut angereichert werden sollen, 1,0 bis 10,0 cm² geeignet.In one embodiment, CTCs can be accumulated by incorporating the filter into the flow path and delivering the blood to the flow path. For the supply of the blood to the flow path can be listed several methods, for example, a method in which pressure is applied from the direction of the entrance of the flow path, a method in which a reduced pressure is used from the direction of the exit of the flow path, a method in which a peristaltic pump is used. For the area of the filter used, z. For example, if the CTCs are to be enriched from 1 ml of blood, 1.0 to 10.0 cm ^{2 is} suitable.

Ausführungsbeispieleembodiments

Ausführungsbeispiel 1Embodiment 1

Herstellung des FiltersProduction of the filter

Der Fotolackfilm (Photec H-Y920, 20 μm Dicke, Produkt der Hitachi Chemical K. K.) wurde auf eine Seite einer 10 mm großen, eckigen Edelstahlplatte (SUS304, Oberflächenbeschaffenheit 3/4H, Dicke 100 μm, Produkt der Nisshin Steel (K. K.)) geklebt. Die Klebebedingungen waren eine Rollentemperatur von 105°C, ein Druck von 0,5 MPa und eine Liniengeschwindigkeit von 1 m/Minute. Anschließend wurde der Negativfilm, der so geformt wurde, dass die lichtdurchlässigen Teile Rechtecke mit abgerundeten Ecken von 8 × 30 μm sind, dass dessen Abstände in Richtung der kurzen Achse 60 μm und in Richtung der langen Achse 60 μm betragen, auf der Oberfläche, auf die der Fotolackfilm der Edelstahlplatte geklebt wurde, stehengelassen. Dieses Rechteck mit abgerundeten Ecken hat die in 1(B) gezeigte Form, wobei a, b und c jeweils 8, 22 und 4 μm betragen. Hierbei bezeichnet die Richtung der langen Achse die Richtung der langen Seiten des Rechtecks mit abgerundeten Ecken, und die Richtung der kurzen Achse bezeichnet die Richtung, die zur Richtung der langen Achse orthogonal ist. Bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel wurde ein Negativfilm verwendet, bei dem die Rechtecke mit abgerundeten Ecken, die in die gleiche Richtung gerichtet sind, in einheitlichen Abständen in Richtung der langen Achse und in Richtung der kurzen Achse ausgerichtet sind.The photoresist film (Photec H-Y920, 20 μm thickness, product of Hitachi Chemical KK) was adhered to one side of a 10 mm square stainless steel plate (SUS304, surface finish 3 / 4H, thickness 100 μm, product of Nisshin Steel (KK)) , The bonding conditions were a roll temperature of 105 ° C, a pressure of 0.5 MPa and a line speed of 1 m / minute. Then, the negative film formed so that the translucent parts are rectangles having rounded corners of 8 × 30 μm, whose pitches are 60 μm in the direction of the short axis and 60 μm in the direction of the long axis, on the surface The photo resist film of the stainless steel plate was glued, left standing. This rectangle with rounded corners has the in 1 (B) shown form, wherein a, b and c are each 8, 22 and 4 microns. Here, the direction of the long axis denotes the direction of the long sides of the rectangle with rounded corners, and the direction of the short axis indicates the direction orthogonal to the direction of the long axis. In the present embodiment, a negative film was used in which the rectangles having rounded corners directed in the same direction are aligned at uniform intervals in the long axis direction and the short axis direction.

Anschließend wurden unter einem Vakuum von maximal 600 mmHg von oberhalb der Edelstahlplatte, auf der der Negativfilm angebracht wurde, unter Verwendung eines UV-Bestrahlungsgeräts, 100 mJ/cm² UV-Strahlen eingestrahlt. Danach wurde in einer 1%igen, wässrigen Natriumcarbonatlösung die Entwicklung vorgenommen, und oberhalb der Edelstahlplatte eine Fotolackschicht gebildet. Auf dem Grundmaterial dieses Fotolackfilms wurde in einer Nickelplattierungsflüssigkeit, die so vorbereitet wurde, dass der pH-Wert 4,5 betrug, bei 50°C ungefähr 20 Minuten lang eine Nickelplattierung vorgenommen. Die Zusammensetzung der Nickelplattierungsflüssigkeit ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Zusammensetzung der Plattierungsflüssigkeit Konzentration (g/l) Nickelsulfaminsäure 450 Nickelchlorid 5 Borsäure 30 Then, under a vacuum of at most 600 mmHg from above the stainless steel plate on which the negative film was mounted, using a UV irradiation apparatus, 100 mJ / cm ² UV rays were irradiated. Thereafter, development was carried out in a 1% aqueous sodium carbonate solution, and a photoresist layer was formed above the stainless steel plate. On the base material of this resist film, nickel plating was performed at 50 ° C. for about 20 minutes in a nickel plating liquid prepared to have a pH of 4.5. The composition of the nickel plating liquid is in Table 1 shown. Table 1 Composition of the plating liquid Concentration (g / l) Nickelsulfaminsäure 450 nickel chloride 5 boric acid 30

Die abgenommene Nickelplattierungsschicht wurde von der Grundmaterial-Edelstahlplatte abgelöst, der Fotolackfilm in einer Alkali-Ablöseflüssigkeit abgelöst, und der Filter aus Ausführungsbeispiel 1 mit einer Dicke von 20 μm und einem durchschnittlichen Öffnungsverhältnis von 6,7% erhalten.The removed nickel plating layer was peeled from the base material stainless steel plate, the photoresist film peeled off in an alkali peeling liquid, and the filter of Embodiment 1 having a thickness of 20 μm and an average aperture ratio of 6.7% was obtained.

Ausführungsbeispiel 2Embodiment 2

Der Filter aus Ausführungsbeispiel 2 wird mit einer Dicke von 20 μm und einem durchschnittlichen Öffnungsverhältnis von 1,4% genauso hergestellt wie in Ausführungsbeispiel 1, außer dass die Fotolackschicht gebildet wird, indem ein Negativfilm verwendet wird, in dem kreisförmige, lichtdurchlässige Teile mit 8 μm Durchmesser so gebildet sind, dass sie mit einer Konzentration von 10.000 Stück/cm² in gleichen Abständen angeordnet sind.The filter of Embodiment 2 is made with a thickness of 20 μm and an average aperture ratio of 1.4% in the same manner as in Embodiment 1, except that the photoresist layer is formed by using a negative film in which circular transmissive parts of 8 μm are used Diameters are formed so that they are arranged at a concentration of 10,000 pieces / cm ² at equal intervals.

Herstellung einer kleinzelligen LungenkrebszelllinieProduction of a small cell lung cancer cell line

NCI-H69-Zellen, die kleinzellige Lungenkrebszelllinien sind, wurden in einem RPMI-1640-Nährmedium, das 10% fetales Kälberserum (FBS) enthielt, unter Bedingungen von 37°C und 5% CO₂ stehen gelassen und kultiviert. Nachdem die Zellen durch eine Trypsin-Behandlung von der Petrischale abgelöst und wiedergewonnen wurden, und unter Verwendung einer phosphatgepufferten Flüssigkeit (Phosphate buffered saline, PBS) ausgewaschen wurden, wurden die NCI-H69-Zellen angefärbt, indem sie in einem 10 μm CellTracker Red CMTPX (Life Technologies Japan, K. K.) bei 37°C 30 Minuten lang stehen gelassen wurden. Danach wurden Zellklumpen losgelöst, indem sie in einer PBS ausgewaschen und in einer Trypsin-Behandlung bei 37°C 3 Minuten lang stehen gelassen wurden. Dann wurden sie, nachdem die Trypsin-Behandlung im Nährmedium abgebrochen wurde und sie in einer in einer PBS ausgewaschen wurden, in einer PBS, die 2 mM EDTA und 0,5% Bovines Serumalbumin (BSA) enthielt (im Folgenden ”2mMEDTA-0,5%BSA-PBS” genannt), suspendiert.NCI-H69 cells, which are small cell lung cancer cell lines, were left to stand and cultivated in an RPMI 1640 nutrient medium containing 10% fetal calf serum (FBS) under conditions of 37 ° C and 5% CO ₂ . After the cells were detached from the petri dish by trypsinization and recovered and washed out using phosphate buffered saline (PBS), the NCI-H69 cells were stained by placing them in a 10 μm Cell Tracker Red CMTPX (Life Technologies Japan, KK) were allowed to stand at 37 ° C for 30 minutes. Thereafter, cell clumps were detached by washing in a PBS and allowed to stand in a trypsin treatment at 37 ° C for 3 minutes. Then, after the trypsin treatment in the nutrient medium was stopped and they were washed out in one in a PBS, they were in a PBS containing 2 mM EDTA and 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA) (hereinafter "2mMEDTA-0, 5% BSA-PBS ").

Anreicherung von CTCs in BlutprobenEnrichment of CTCs in blood samples

Der Filter im Ausführungsbeispiel wurde an ein eingestelltes CTC-Rückgewinnungsgerät montiert. Das CTC-Rückgewinnungsgerät weist einen Fließweg für die Zuführung von Blutproben und Reagenzien auf, und der Eingang dieses Fließwegs ist an ein Reservoir angeschlossen, das eine Spritze verarbeitet und hergestellt hat. Indem in dieses Reservoir nacheinander Blutproben und Reagenzien eingeführt wurden, konnte man die Arbeitsschritte Einfangen der CTCs, Anfärben und Auswaschen leicht kontinuierlich durchführen.The filter in the embodiment was mounted to a set CTC recovery apparatus. The CTC recovery apparatus has a flow path for the delivery of blood samples and reagents, and the entrance of this flow path is connected to a reservoir that has processed and manufactured a syringe. By successively introducing blood samples and reagents into this reservoir, the steps of capturing the CTCs, staining and rinsing were easily performed continuously.

In das CTC-Rückgewinnungsgerät wurden Blutproben eingeführt und Krebszellen angereichert. Als Blutprobe wurde eine Probe benutzt, für die in gesundes Blut, das in einem Dinatrium-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthaltenden Vakuum-Blutentnahmeröhrchen abgenommen wurde, auf 1 ml Blut 1000 Krebszellen gemischt wurden. Als Krebszellen wurden die oben genannten humanen kleinzelligen Lungenkrebszelllinien NCI-H69 verwendet.Blood samples were introduced into the CTC recovery device and cancer cells were enriched. As the blood sample, a sample was used for which 1,000 blood cells were mixed into 1 ml of blood in healthy blood taken in a vacuum blood collection tube containing disodium ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). As cancer cells, the above-mentioned human small cell lung cancer cell lines NCI-H69 were used.

Zunächst wurde ins Reservoir 1 ml 2mMBDTA-0,5%BSA-PBS eingeführt, und oberhalb des Filters eingefüllt. Anschließend wurde der Fluss unter Verwendung einer Peristaltikpumpe mit einer Fließgeschwindigkeit von 200 μl/Minute gestartet. Nach etwa 5 Minuten wurde in das Reservoir 1 ml der Blutprobe eingeführt. Dadurch wurden die Krebszellen auf dem Filter eingefangen.First, 1 ml of 2mMBDTA-0.5% BSA-PBS was introduced into the reservoir and filled in above the filter. Subsequently, the flow was started using a peristaltic pump at a flow rate of 200 μl / min. After about 5 minutes, 1 ml of the blood sample was introduced into the reservoir. This captured the cancer cells on the filter.

Nach 5 Minuten wurden in das Reservoir 2 ml 2mMEDTA-0,5%BSA-PBS eingeführt, um die Blutbestandteile auszuwaschen.After 5 minutes, 2 ml of 2mMEDTA-0.5% BSA-PBS was introduced into the reservoir to wash out the blood components.

Nach weiteren 10 Minuten wurde die Pumpenfließgeschwindigkeit auf 20 μl/Minute geändert, in das Reservoir 600 μl Zellfärbeflüssigkeit (Hoechst 33342 0,5 μg/ml) eingeführt, und die Krebszellen oder weißen Blutkörperchen auf dem Filter fluoreszierend angefärbt. Nachdem die auf dem Filter angefangenen Zellen 30 Minuten lang angefärbt wurden, wurden in das Reservoir 1 ml 2mMEDTA-0,5%BSA-PBS eingeführt, um die Zell auszuwaschen.After a further 10 minutes, the pump flow rate was changed to 20 μl / minute, 600 μl of cell staining liquid (Hoechst 33342 0.5 μg / ml) was introduced into the reservoir, and the cancer cells or white blood cells were fluorescently stained on the filter. After the cells started on the filter were stained for 30 minutes, 1 ml of 2mMEDTA-0.5% BSA-PBS was introduced into the reservoir to wash out the cell.

Anschließend wurde unter Verwendung eines mit einem computergesteuerten, elektrobetriebenen Gestell und einer gekühlten Digitalkamera (DP70, Qlympus K. K.) ausgestatteten Fluoreszenzmikroskops (BX61, Olympus K. K.) der Filter beobachtet, und die Anzahl der Krebszellen und der weißen Blutkörperchen auf dem Filter gezählt. Um die von Hoechst 33342 und CellTracker Red CMTPX herrührende Fluoreszenz zu beobachten, wurde ein Bild erstellt, indem jeweils einzeln ein WU- und ein WIG-Filter, (Olympus K. K.) verwendet wurde. Als bilderstellende und -analysierende Software wurde Lumina Vision (Mitani K. K.) verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Der Versuch wurde jeweils 3 Mal ausgeführt, das Ergebnis ist als Durchschnittswert ± die Standardabweichung angegeben. Die Rückgewinnungsrate der Krebszellen (Einfangrate) wird nach folgender Formel berechnet: Krebszellen-Rückgewinnungsrate (%) Anzahl der auf dem Filter rückgewonnenen Krebszellen/Anzahl der in die Blutprobe gemischten Krebszellen × 100 Tabelle 2 Ausführungsbeispiel 1 Ausführungsbeispiel 2 Substratmaterial Nickel Nickel Öffnungsform der Durchganglöcher Rechteck mit abgerundeten Ecken Kreis Größe der Durchgangslöcher 8 × 30 μm 8 μmϕ Anzahl der Überreste an weißen Blutkörperchen (in Stück) 697 ± 84 2657 ± 730 Krebszellen-Rückgewinnungsrate (%) 74,9 ± 10,5 49,2 ± 7,4 Then, using a computer-equipped electro-powered rack and a cooled digital camera (DP70, Qlympus KK) equipped with a fluorescence microscope (BX61, Olympus KK), the filter was observed and the number of cancer cells and white blood cells counted on the filter. To observe the fluorescence derived from Hoechst 33342 and CellTracker Red CMTPX, an image was taken by individually using a WU and a TIG filter (Olympus KK). As image-forming and -analysing software Lumina Vision (Mitani KK) was used. The results are shown in Table 2. The test was carried out 3 times in each case, the result being given as an average value ± the standard deviation. The recovery rate of the cancer cells (capture rate) is calculated according to the following formula: Cancer cell recovery rate (%) Number of cancer cells recovered on the filter / Number of cancer cells mixed in the blood sample × 100 Table 2 Embodiment 1 Embodiment 2 substrate material nickel nickel Opening shape of the through holes Rectangle with rounded corners circle Size of the through holes 8 × 30 μm 8 μmφ Number of remnants of white blood cells (in pieces) 697 ± 84 2657 ± 730 Cancer cell recovery rate (%) 74.9 ± 10.5 49.2 ± 7.4

Durch die Verwendung eines Metallfilters mit geeigneter Öffnungsform wurde die Anzahl der in die Krebszellen gemischten, wiedergewonnenen weißen Blutkörperchen reduziert. Außerdem ist die Rückgewinnungsrate der Krebszellen gestiegen. Auch unter Verwendung von anderen Krebszellen als der NCI-H69-Linie wurde das gleiche Ergebnis erhalten. Bei einem Filter mit einem Rechteck mit abgerundeten Ecken als Öffnungsform war die Anzahl der zurückgebliebenen weißen Blutkörperchen geringer und die Rückgewinnungsrate der Krebszellen höher als bei einem Filter mit einer kreisförmigen Öffnungsform.The use of a metal filter of suitable aperture shape has reduced the number of white blood cells blended into the cancer cells. In addition, the recovery rate of cancer cells has increased. Also using other cancer cells than the NCI-H69 line, the same result was obtained. In a filter having a rectangle with rounded corners as an opening shape, the number of remaining white blood cells was lower and the recovery rate of the cancer cells was higher than that of a filter having a circular opening shape.

ZeichenerklärungExplanations

10 Through holes, 20 substrate 30 Surface, 100 Filter, a short side, b long side, c radius.

Claims

A filter for accumulating cancer cells, consisting of a metal substrate in which a plurality of through holes have been formed, wherein the opening shape of the through holes is at least one shape selected from the group consisting of an ellipse, a circle, a rectangle, a square, a Rectangle with rounded corners and a polygon.

The cancer cell accumulating filter according to claim 1, wherein at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, copper, aluminum, tungsten, nickel, chromium, stainless steel and an alloy thereof is selected as the main component of the metal substrate.

The cancer cell enrichment filter according to claim 1 or 2, wherein the opening shape of the through holes is a rectangle or a rectangle having rounded corners whose short side is 5.0 to 15.0 μm in length.

The cancer cell enrichment filter according to any one of claims 1 to 3, wherein the average aperture ratio of the through holes is 0.1 to 50%.

A cancer cell accumulating filter according to any one of claims 1 to 4, whose thickness is 3 to 100 μm.

A cancer cell enrichment filter according to any one of claims 1 to 5, which is for cancer cells in peripheral blood, in ascites or in a pleural effusion.

A cancer cell enrichment filter according to any one of claims 1 to 6, which is for cancer cells of small cell lung cancer or non-small cell lung cancer.