DE202009016668U1 - Device for determining the antithrombotic effect of acetylsalicylic acid - Google Patents
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Abstract
Vorrichtung zur Bestimmung der antithrombotischen Wirkung der Acetylsalicylsäure in vitro mittels Untersuchung der funktionellen Thrombozytenaktivität vor und nach der Inkubation der biologischen Materialprobe mit Acetylsalicylsäure,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Vorrichtung umfasst:
Mittel zur Probeninkubation mit Acetylsalicylsäure bei einer Endkonzentration von 108 μMol/l im Laufe von 15 Minuten bei einer Temperatur von 37°C,
Mittel zur Thrombozyteninduktion mittels Adenosindiphosphat bei einer Endkonzentration von 1,0–5,0 μMol/l,
Mittel zur Bestimmung der Aggregationsaktivität der Thrombozyten im Vollblutimpedanzverfahren und
Mittel zur Ermittlung der Amplituden des Aggregationsvorgangs in Ohm zur 5. Minute ab dem Zeitpunkt der Adenosindiphosphatgabe an den Aggregationsdiagrammen.Apparatus for determining the antithrombotic effect of acetylsalicylic acid in vitro by assaying the functional platelet activity before and after the incubation of the biological material sample with acetylsalicylic acid,
characterized,
in that the device comprises:
Means for sample incubation with acetylsalicylic acid at a final concentration of 108 μmol / l over a period of 15 minutes at a temperature of 37 ° C,
Agent for platelet induction by means of adenosine diphosphate at a final concentration of 1.0-5.0 μmol / l,
Means for determining the aggregation activity of platelets in the whole blood impedance method and
Means for determining the amplitudes of the aggregation process in ohms for the 5th minute from the time of adenosine diphosphate addition on the aggregation diagrams.
Description
Die Erfindung bezieht sich auf das hochaktuelle Problem der modernen klinischen und vorbeugenden Medizin. Es handelt sich um die Kontrolle der Effektivität der antiaggreganten Therapie bei der Behandlung von Herz- und Kreislauferkrankungen, insbesondere des akuten Koronarsyndroms und des Myokardinfarkts.The The invention relates to the highly topical problem of the modern day clinical and preventive medicine. It is the control the effectiveness antiaggregated therapy in the treatment of cardiovascular diseases, especially acute coronary syndrome and myocardial infarction.
Als Hauptheilmittel mit antithrombotischer Wirkung zur Behandlung von Rekrudeszenzen der ischämischen Herzkrankheit gilt bis jetzt die Acetylsalicylsäure mit einem außerordentlich vorteilhaften Verhältnis von Nutzeffekt und Behandlungskosten [3]. Die Acetylsalicylsäure hat das Vermögen, die Sterblichkeit der Kranken nach dem Myokardinfarkt zu vermindern. Dieses Vermögen ist von anderen Eingriffen unabhängig. Es wurde durch zahlreiche internationale Forschungen überzeugend nachgewiesen (ISIS-2, IST, CAST).When Main remedy with antithrombotic effect for the treatment of Recrudescences of the ischemic Heart disease is so far the acetylsalicylic acid with an extraordinary favorable ratio of efficiency and treatment costs [3]. The acetylsalicylic acid has the Fortune, to reduce mortality of patients after myocardial infarction. This fortune is independent of other interventions. It has been convincing by numerous international researches detected (ISIS-2, IST, CAST).
Dabei wurde in der letzten Zeit festgestellt, dass es eine große Gruppe von Patienten gibt, bei denen die Acetylsalicylsäure die funktionelle Thrombozytenaktivität nicht im erforderlichen Maße unterdrücken kann. Darüber hinaus entstehen bei solchen Patienten ischämische Komplikationen trotz der Heilmitteleinnahme. Nach Angaben aus unterschiedlichen Quellen erweisen sich 4 bis 45% der Patienten als biochemisch resistent gegenüber der Wirkung der Acetylsalicylsäure [5, 7, 9].there It has recently been found that there is a large group of patients where acetylsalicylic acid does not have functional platelet activity to the extent necessary suppress can. About that In addition, ischemic complications arise in such patients despite the use of cures. According to information from different sources 4 to 45% of patients are biochemically resistant across from the effect of acetylsalicylic acid [5, 7, 9].
Die Routineuntersuchung der antithrombotischen Wirkung der Acetylsalicylsäure wird im bedeutenden Maße dadurch bedingt, dass die Klinik über keine Verfahren für ihre adäquate Labordiagnose verfügt. Die bekannten Verfahren zur Auswertung der individuellen Empfindlichkeit der Kranken gegenüber Acetylsalicylsäure (in Bezug auf die Kapillarblutungszeit, in Bezug auf das Exkretionniveau von 11-Dehydro-Thromboxan B2) sind wenig spezifisch und weisen eine ungenügende Reproduzierbarkeit auf [5].The routine examination of the antithrombotic effect of acetylsalicylic acid is largely due to the fact that the clinic has no procedures for its adequate laboratory diagnosis. The known methods for evaluating the individual sensitivity of patients to acetylsalicylic acid (in terms of the capillary bleeding time, with respect to the excretion level of 11-dehydro-thromboxane B 2 ) are less specific and have insufficient reproducibility [5].
Der nächste Stand der Technik (Prototyp) gegenüber dieser Erfindung ist das Verfahren zur Gütebeurteilung der Acetylsalicylsäureeinnahme [1] in Bezug auf ihren Einfluß auf die Kennwerte der durch unterschiedliche Agonisten induzierten Blutplättchenaggregation im thrombozytreichen Plasma (das Borns-Verfahren der optischen Aggregatometrie [6]). Dieses Verfahren ermöglicht es, die Geschwindigkeit und die Amplitude des Aggregationsvorgangs in vitro quantitativ einzuschätzen. Die Antiaggregationseigenschaften wurden gezielt untersucht. Dafür wurde vorher die Acetylsalicylsäurelösung in der Endkonzentration in der 25 mM-Küvette ins Prüfglas mit dem mit Thrombozyten angereicherten Plasma gefüllt und im Laufe von 10 Minuten inkubiert. Danach wurde ein Induktor (ADP oder Adrenalin) eingeführt. Die Aggregation wurde im Laufe von 10 Minuten registriert. Die Ergebnisse wurden mit den Kenndaten der Aggregation verglichen, die durch die Induktoren ohne vorläufige Einwirkung der Acetylsalicylsäure eingeleitet wurde. Dabei wurde die Gesamtkennzahl der Thrombozytenaggregation (TAGK) berechnet.Of the next Prior art (prototype) over this invention is the Method for quality assessment the intake of acetylsalicylic acid [1] regarding their influence on the characteristics of different agonist-induced platelet aggregation in the thrombocyte-rich plasma (the Borns method of optical aggregatometry [6]). This procedure allows it, the speed and the amplitude of the aggregation process quantitatively in vitro. The anti-aggregation properties were specifically investigated. For that was before the acetylsalicylic acid solution in the final concentration in the 25 mM cuvette in the test tube with filled with platelet-enriched plasma and over 10 minutes incubated. Thereafter, an inducer (ADP or adrenaline) was introduced. The Aggregation was registered within 10 minutes. The results were compared with the characteristics of the aggregation determined by the Inductors without preliminary Action of acetylsalicylic acid was initiated. The overall index of platelet aggregation was determined (TAGK) calculated.
Die Hauptmängel des genannten Verfahrens sind Folgende:
- 1) Geringe Empfindlichkeit und Genauigkeit des Verfahrens. Deswegen müssen hohe Konzentrationen der Acetylsalicylsäure eingesetzt werden. Das erklärt auch die fehlenden positiven Ergebnisse beim Einsatz von ADP als Agonist;
- 2) Dauer, Arbeitsaufwändigkeit und Kritikalität [4, 8] des Herstellungsvorgangs des mit Thrombozyten angereicherten Plasmas (TAP);
- 3) Während des Zentrifugierens werden die Blutplättchen wesentlichen mechanischen Einwirkungen ausgesetzt. Das verändert die Funktionalität erheblich und bedingt den Verlust der Fraktion der größten und aktivsten Zellen;
- 4) Während der Probenvorbereitung wird die natürliche Umgebung der Thrombozyten gestört. Das ermöglicht es nicht, den Einfluss von anderen die Funktionen der Thrombozyten steuernden Blutzellen auf Thrombozyten zu berücksichtigen;
- 5) Die Wahrscheinlichkeit der beachtlichen Dekonzentration von labilen Vermittlersubstanzen zum Messzeitpunkt nimmt zu [8].
- 1) Low sensitivity and accuracy of the process. Therefore, high concentrations of acetylsalicylic acid must be used. This also explains the lack of positive results with the use of ADP as agonist;
- 2) duration, laboriousness and criticality [4, 8] of platelet-enriched plasma (TAP) manufacturing process;
- 3) During centrifugation, the platelets are exposed to significant mechanical effects. This changes the functionality considerably and causes the loss of the fraction of the largest and most active cells;
- 4) During sample preparation, the natural environment of the platelets is disturbed. This does not make it possible to take into account the influence of other thrombocyte-controlling blood cell types on platelets;
- 5) The probability of considerable deconcentration of labile mediators at the time of measurement increases [8].
Durch diese Nachteile können keine optimalen genormten Bedingungen geschaffen werden, welche zur vollständigen Realisierung der Thrombozytenfunktionen nach ihrer Stimulation durch einen Induktor erforderlich sind. Ein beachtlicher Mangel der optischen Aggregatometrie besteht darin, dass es unmöglich ist, das Blut der Patienten mit ausgeprägter Hyperlipidämie zu untersuchen. Diese Untersuchung ist in der kardiologischen Praxis oft notwendig [8].By these disadvantages can no optimal standardized conditions are created which to the full Realization of platelet functions after their stimulation an inductor are required. A considerable defect of the optical Aggregatometry is that it is impossible to blood the patients with pronounced hyperlipidemia to investigate. This exam is in cardiology practice often necessary [8].
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zur Bestimmung der
antithrombotischen Wirkung der Acetylsalicylsäure in vitro mittels Untersuchung
der funktionellen Thrombozytenaktivität vor und nach der Inkubation
der biologischen Materialprobe mit Acetylsalicylsäure, wobei
die Vorrichtung umfasst:
Mittel zur Probeninkubation mit Acetylsalicylsäure bei einer
Endkonzentration von 108 μMol/l
im Laufe von 15 Minuten bei einer Temperatur von 37°C,
Mittel
zur Thrombozyteninduktion mittels Adenosindiphosphat bei einer Endkonzentration
von 1,0–5,0 μMol/l,
Mittel
zur Bestimmung Aggregationsaktivität der Thrombozyten im Vollblutimpedanzverfahren
und
Mittel zur Ermittlung der Amplituden des Aggregationsvorgangs
in Ohm zur 5. Minute ab dem Zeitpunkt der Adenosindiphosphatgabe
an den Aggregationsdiagrammen.The present invention is an apparatus for determining the antithrombotic effect of acetylsalicylic acid in vitro by assaying the functional platelet activity before and after the incubation of the biological material sample with acetylsalicylic acid, the apparatus comprising:
Means for sample incubation with acetylsalicylic acid at a final concentration of 108 μmol / l over a period of 15 minutes at a temperature of 37 ° C,
Agent for platelet induction by means of adenosine diphosphate at a final concentration of 1.0-5.0 μmol / l,
Means for determining aggregation activity of platelets in the whole blood impedance method and
Means for determining the amplitudes of the aggregation process in ohms at the 5th minute from the time of adenosine diphosphate addition to the aggregations diagrams.
Das
antithrombotische Vermögen
der Acetylsalicylsäure
in Prozent (C) kann nach folgender Formel berechnet werden:
Die konstruktiven Details der Vorrichtung ergeben sich für den Fachmann aufgrund seines allgemeinen Fachwissens im Hinblick auf die nachfolgende Darstellung des Verfahrens zur Bestimmung der antithrombotischen Wirkung, das mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt wird.The constructive details of the device will be apparent to those skilled in the art because of its general expertise with regard to the following Presentation of the method for the determination of the antithrombotic Effect that is performed with the device according to the invention.
Bei nachfolgendem Verfahren wird die antithrombotischen Wirkung der Acetylsalicylsäure in vitro mittels Untersuchung der funktionellen Thrombozytenaktivität vor und nach der Inkubation der biologischen Materialprobe mit Acetylsalicylsäure bestimmt. Die Aggregationsaktivität der Thrombozyten wird im Vollblut nach dem Impedanzverfahren ermittelt. Die Proben wurden mit Acetylsalicylsäure bei einer Endkonzentration von 108 μMol/l im Laufe von 15 Minuten inkubiert. Die Induktion der Thrombozyten wurde mittels Adenosindiphosphats bei einer Endkonzentration von 1,0–5,0 μMol/l ausgelöst.at Subsequent procedure is the antithrombotic effect of acetylsalicylic acid in vitro by examination of functional platelet activity before and determined after incubation of the biological material sample with acetylsalicylic acid. The aggregation activity platelets are detected in whole blood by the impedance method. The samples were taken with acetylsalicylic acid at a final concentration of 108 μmol / l incubated in the course of 15 minutes. The induction of platelets was triggered by adenosine diphosphate at a final concentration of 1.0-5.0 μmol / L.
Das technische Ergebnis der vorgeschlagenen Erfindung besteht in der Erhöhung der Empfindlichkeit, der Genauigkeit und der Reproduzierbarkeit des Verfahrens sowie in der Verkürzung der Analysezeit.The technical result of the proposed invention is in the increase the sensitivity, the accuracy and the reproducibility of the Procedure as well as in the shortening the analysis time.
Dabei wird folgender positiver Effekt erreicht:
- 1) Die Messungen werden bei physiologischen Konzentrationen der Acetylsalicylsäure und des Adenosindiphosphats durchgeführt;
- 2) Die Bestimmungsreproduzierbarkeit entspricht den an die medizinische Verfahren gestellten Anforderungen;
- 3) Die Analysezeit wird bis zu 20 Minuten verkürzt;
- 4) Das Blut der an Hyperlipidämie erkrankten Patienten kann erforscht werden.
- 1) The measurements are carried out at physiological concentrations of acetylsalicylic acid and adenosine diphosphate;
- 2) The determination reproducibility corresponds to the requirements imposed on medical procedures;
- 3) The analysis time is shortened up to 20 minutes;
- 4) The blood of patients suffering from hyperlipidemia can be investigated.
Unter
Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung
kann die antithrombotische Wirkung von Acetylsalicylsäure wie
folgt bestimmt werden:
Die Blutproben werden der antekubitalen
Vene entnommen und mittels 3,8%iger Natriumcitratlösung im Volumenverhältnis 9:1
stabilisiert. Während
der Untersuchung wird das Blut in abgedeckten Kunststoffprüfgläsern bei
Raumtemperatur aufbewahrt. Dabei müssen die allgemein geltenden
Vorsichtsmaßnahmen
beim Umgang mit Blutzellen eingehalten werden.Using the device according to the invention, the antithrombotic effect of acetylsalicylic acid can be determined as follows:
The blood samples are taken from the antecubital vein and stabilized using 3.8% sodium citrate solution in a volume ratio of 9: 1. During the examination, the blood is stored in covered plastic test tubes at room temperature. In doing so, the generally applicable precautionary measures when handling blood cells must be adhered to.
Die Analyse der funktionellen Thrombozytenaktivität wird frühestens 15 Minuten danach und spätestens 2 Stunden nach der Blutnahme vorgenommen. Die Analyse erfolgt mit Hilfe eines Impedanz-Aggregationsmessgeräts Al-300 bei 37°C. Dabei wird der Küvetteninhalt bei einer Drehzahl von 1000 U/min vermengt. Das Volumenverhältnis von Blut und Agonist beträgt dabei 11:1.The Analysis of functional platelet activity will be made no earlier than 15 minutes thereafter and no later than 2 hours after the blood sample was taken. The analysis is done with Help of an impedance aggregation meter Al-300 at 37 ° C. there becomes the cuvette contents mixed at a speed of 1000 rpm. The volume ratio of blood and agonist amounts doing 11: 1.
Um die Aggregation zu induzieren, wird die ADP-Lösung aus Diagnose-Sätzen der Fa. Sigma (Sigma diagnostics, platelet aggregation reagent, USA) bei einer Endkonzentration von 1,0–5,0 μMol/l eingesetzt. Diese Lösung wird in Übereinstimmung mit den Herstellerempfehlungen vorbereitet.Around To induce aggregation, the ADP solution is made up of diagnostic kits Sigma (Sigma diagnostics, platelet aggregation reagent, USA) used at a final concentration of 1.0-5.0 μmol / l. This solution will in accordance with prepared according to the manufacturer's recommendations.
Die Untersuchungen des Aggregationszustands der Thrombozyten werden für jeden Patienten zweimal durchgeführt und zwar vor und nach der Blutinkubation mit Acetylsalicylsäure.The Investigations of the aggregation state of platelets will be for each Patients performed twice before and after blood incubation with acetylsalicylic acid.
Die Inkubationszeit beträgt 15 Minuten bei einer Temperatur von 37°C. Die physiologische Endkonzentration der Acetylsalicylsäure und das Volumenverhältnis Blut/Acetylsalicylsäurelösung während der Inkubation wurden bestimmt, indem die Aggregation mittels Aspirin im Blut der gesunden Spender (25–45-jährige Männer, n = 26) um 50% inhibiert wurde. Somit betrugen die physiologische Endkonzentration der Acetylsalicylsäure und das Volumenverhältnis Blut/Acetylsalicylsäurelösung dementsprechend 108 μMol/l und 50:1. Unter diesen Bedingungen wird die Möglichkeit aufrechterhalten, die Verschiebungen in beide Richtungen bei Entstehung von zusätzlichen Reizen zu erkennen und eine optimale Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu erzielen.The Incubation time is 15 minutes at a temperature of 37 ° C. The physiological final concentration of acetylsalicylic acid and the volume ratio Blood / acetylsalicylic acid solution during the Incubation was determined by aggregation using aspirin in the blood of healthy donors (25-45-year-old males, n = 26) was inhibited by 50%. Thus, the physiological final concentration of acetylsalicylic acid and the volume ratio Blood / acetylsalicylic acid solution accordingly 108 μmol / l and 50: 1. Under these conditions, the possibility of maintaining the shifts in both directions when additional Recognizing stimuli and optimal reproducibility of the results to achieve.
Die Verarbeitung der Aggregationsdiagramme erfolgt nach allgemein gültigen kennzeichnenden Punkten der Aggregationskennlinien [2], wobei die Prozessamplitude in Ohm gegen die 5. Minute ab ADP-Einführung festgestellt wird, wenn die Dosisempfindlichkeit und die Aggregationsintensität bereits eindeutig sichtbar sind.The Processing of the aggregation diagrams takes place according to generally valid characteristic points the aggregation characteristics [2], where the process amplitude in ohms against the 5th minute from ADP introduction is detected when the dose sensitivity and the aggregation intensity already are clearly visible.
Das
Inhibitionsvermögen
(antithrombotisches Vermögen)
der Acetylsalicylsäure
wird prozentual (C) nach folgender Formel berechnet:
Ein
Beispiel zur Auswertung und Verarbeitung der resultierenden Aggregationsdiagramme
und Berechnung des antithrombotischen Vermögens der Acetylsalicylsäure an diesen
Diagrammen ist in
Das Verfahren wurde in der Klinik der Staatlichen Föderationsanstalt V. A. Almasov's Föderationszentrum für Herz-, Blut- und Endokrinologie von Rosmedtechnologie erprobt. 25 Patienten mit rheumatischen Herzfehlern wurden untersucht. Die Vergleichsgruppe bestand aus 26 praktisch gesunden Spendern (25–45-jährige Männer). Der Mittelwert der inhibierenden Wirkung der Acetylsalicylsäure in der Vergleichsgruppe betrug 46,7%. 8,0% der Patienten in der Versuchsgruppe der Patienten mit rheumatischen Herzfehlern (n = 25) wurden gegenüber Acetylsalicylsäure absolut unempfindlich. Eine niedrigere inhibierende Wirkung der Acetylsalicylsäure wurde in dieser Gruppe bei den Kranken (n = 12) mit thromboembolischen Komplikationen (34,2% gegen 57,6%, p < 0,05) beobachtet. Das erreichte Ergebnis zeugt von einem hohen Diagnosevermögen und von der klinischen Notwendigkeit, den antithrombotischen Effekt der Acetylsalicylsäure bei der Vorbeugung von Thrombosen und Thromboembolien zu bestimmen, der den Kern bei der Entwicklung von Herz-Kreislaufpathologien darstellt.The Procedure was in the clinic of the State Federation V.A. Almasov's Federation Center for heart, Blood and endocrinology tested by Rosmedtechnologie. 25 patients with rheumatic heart defects were examined. The comparison group consisted of 26 practically healthy donors (25-45-year-old men). The mean of the inhibitory Effect of acetylsalicylic acid in the comparison group was 46.7%. 8.0% of patients in the Experimental group of patients with rheumatic heart defects (n = 25) were compared acetylsalicylic acid absolutely insensitive. A lower inhibiting effect of acetylsalicylic acid was in this group among the sick (n = 12) with thromboembolic Complications (34.2% vs 57.6%, p <0.05). The result achieved testifies to a high diagnostic capacity and clinical Need to contribute to the antithrombotic effect of acetylsalicylic acid the prevention of thrombosis and thromboembolism, the represents the core in the development of cardiovascular pathologies.
Um die Reproduzierbarkeit und die Zuverlässigkeit zu beurteilen, wurden Parallelmessungen des Inhibitionsvermögens der Acetylsalicylsäure im Blut von 28 Patienten durchgeführt. Der Variabilitätskoeffizient des Versuchs beträgt 8,6% und entspricht somit den an die medizinischen Laborversuche gestellten Anforderungen.Around to assess the reproducibility and reliability Parallel measurements of the inhibitory capacity of acetylsalicylic acid in the blood of 28 patients performed. The coefficient of variability of the experiment 8.6% and thus corresponds to the medical laboratory tests requirements.
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