DE202008012041U1

DE202008012041U1 - Vaginal suppositories based on 3,3'-dindolylmethane (methindole)

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Publication number: DE202008012041U1
Application number: DE202008012041U
Authority: DE
Original assignee: KISSELEW WSEWOLOD IWANOWITSCH
Current assignee: KISSELEW WSEWOLOD IWANOWITSCH
Priority date: 2008-09-10
Filing date: 2008-09-10
Publication date: 2008-11-27
Anticipated expiration: 2018-09-11

Abstract

Mittel zur Behandlung von genitalen Kondylomen und neoplastischen Erkrankungen der Geschlechtsorgane in Form eines Vaginalzäpfchens,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Vaginalzäpfchen als Wirkstoff 3,3'-Diindolylmethan, einen lipophilen Grundstoff, der festes Süßwarenfett ist, Polyvinylpyrrolidon und Butylhydroxianisol oder Butylhydroxitoluol enthält, wobei das Mittel folgende Zusammensetzung in Masseprozent aufweist:
3,3'-Diindolylmethan 2,0–6,0
Polyvinylpyrrolidon 0,5–1,2
Butylhydroxianisol oder Butylhydroxitoluol 0,3–0,5
lipophiler Grundstoff Rest.Agents for the treatment of genital condylomata and neoplastic diseases of the reproductive organs in the form of a vaginal suppository,
characterized,
in that the vaginal suppository comprises as active ingredient 3,3'-diindolylmethane, a lipophilic base substance which is solid confectionery fat, polyvinylpyrrolidone and butylhydroxianisole or butylhydroxitoluene, the composition having the following composition in mass percentage:
3,3'-Diindolylmethane 2.0-6.0
Polyvinylpyrrolidone 0.5-1.2
Butylhydroxanisole or butylhydroxitoluene 0.3-0.5
lipophilic raw material rest.

Description

Die Erfindung gehört zum Gebiet der Medizin und der chemisch-pharmazeutischen Industrie, und betrifft Mittel zur Behandlung von genitalen Kondylomen und von neoplastischen Erkrankungen der Geschlechtsorgane (reproduktiven Organe).The Invention belongs to the field of medicine and chemical-pharmaceutical Industry, and concerns agents for the treatment of genital condylomata and of neoplastic diseases of the genital organs (reproductive Organs).

Die Papillomavirusinfektion ist die am meisten verbreitete Infektionskrankheit, die beim Geschlechtsverkehr übertragen wird. Nach statistischen Angaben werden über 50 Prozent der sexuell aktiven Bevölkerung während des Lebens mit dem Papillomavirus infiziert. Das biologische und medizinische Interesse an Papillomaviren erklärt sich damit, dass sie zu tumorproduzierenden Viren gehören, die fähig sind, eine gutartige Hyperplasie auszulösen, und einige Typen von Viren können die Entwicklung von bösartigen Tumoren der anogenitalen Gegend hervorrufen: Gebärmutterhalskarzinom, Krebs von Vulva, Scheide etc. Als Folge der Infizierung mit dem Papillomavirus gelten auch zervikale intraepitheliale Neoplasien (CIN), die als Präkanzerose betrachtet werden. Die DNS des Papillomavirus mit einem hohen onkogenen Risikograd (vorwiegend Typen 16 und 18) wird in 50–80% der Proben einer gemäßigten und schweren Dysplasie des Plattenepithels des Gebärmutterhalses und bei 90% invasiven Krebs festgestellt.The Papillomavirus infection is the most common infectious disease, which is transmitted during sexual intercourse. After statistical Data are about 50 percent of the sexually active population during of life infected with the papillomavirus. The biological and medical interest in papillomavirus is explained by that they belong to tumor-producing viruses that are capable are to cause a benign hyperplasia, and some Types of viruses can be the development of malignant Tumors of the anogenital area cause: cervix carcinoma, Cancer of vulva, vagina etc. As a result of infection with the Papillomavirus also includes cervical intraepithelial neoplasia (CIN), which are considered as precancerous. The DNS of the papillomavirus with a high oncogenic risk level (predominantly Types 16 and 18) becomes moderate in 50-80% of the samples and severe dysplasia of the squamous epithelium of the cervix and detected in 90% invasive cancer.

Der Gebärmutterhalskrebs nimmt den zweiten Platz unter bösartigen Neubildungen bei Frauen ein. Jährlich werden etwa eine halbe Million neuer Fälle dieser Erkrankung und 270.000 dadurch verursachte Todesfälle in der Welt registriert. Der standardmäßige Wert der Erkrankungshäufigkeitsziffer und Mortalitätskennziffer aufgrund von Gebärmutterhalskrebs beträgt dementsprechend 16,2 und 9 pro 100.000 Personen. Dabei werden ca. 52% aller Fälle von zervikalen Krebs in Asien registriert. In Russland sterben am Gebärmutterhalskrebs (4,8% unter allen bösartigen Tumoren bei Frauen) jährlich mehr als 6.000 Kranke (bei Frauen im Alter von 20 bis 40 Jahre ist der Gebärmutterhalskrebs die Haupttodesursache), die Erkrankungshäufigkeitsziffer ist ungefähr um das 2-fache höher.Of the Cervical cancer takes second place among malignant Neoplasms in women. Every year about one half a million new cases of this disease and 270,000 thereby causing deaths in the world registered. The default value of the incidence rate and mortality rate due to cervical cancer is accordingly 16.2 and 9 per 100,000 persons. About 52% of all cases of cervical cancer are in Asia registered. In Russia, cervix cancer is dying (4.8% among all malignant tumors in women) annually more than 6,000 patients (women between the ages of 20 and 40 years the cervix cancer is the main cause of death), the incidence rate is about 2 times higher.

Ein nach seiner Bedeutung nicht geringeres medizinisches Problem stellen gutartige Erscheinungen des Papillomavirus dar, zu denen Exophyt- und Endophytaffektionen unterschiedlicher Abschnitte des Epithels der Vulva, Scheide und des Gebärmutterhalses sowie der umgebenden Haut und der Schleimhaut, einschließlich des Anus, gehören. Die Exophytformen (genitale Kondylome) umfassen nach ihrem Aussehen und nach ihrer Größe verschiedenartige spitzenartige, papillare und papulöse Neubildungen, wobei eine sich anschließende sekundäre bakterielle Infektion nicht selten zu Komplikationen führt, und nicht nur von psychologischen, sondern auch von physischen Leiden der Patientin begleitet werden.One according to its importance do not pose a lesser medical problem benign lesions of the papillomavirus, to which exophyt and endophytopathies of different sections of the epithelium of the Vulva, vagina and cervix as well as the surrounding Skin and mucous membrane, including the anus, belong. The exophytic forms (genital condylomas) include their appearance and, according to their size, various pointed, papillary and papular neoplasms, with a subsequent secondary bacterial infection not uncommon to complications leads, and not only psychological, but also accompanied by physical suffering of the patient.

Die Häufigkeit von genitalen Kondylomen (genitalen Warzen), die die Folge der Infizierung mit gutartigen Typen der Papillomaviren ist, beträgt nach Angaben des Ministeriums für Gesundheitswesen der Russischen Föderation 26 Fälle pro 100.000 Personen. Die Endophytformen (subklinische Papillomavirusinfektion) sind unterschiedliche morphologische Veränderungen des Plattenepithels ohne äußerliche Wucherungen.The Frequency of genital condylomata (genital warts), the result of infection with benign types of papillomaviruses is, according to the Ministry of Healthcare of the Russian Federation 26 cases per 100,000 people. The endophyte forms (subclinical papillomavirus infection) are different morphological changes of the squamous epithelium without external growths.

Genitale Kondylome verursachen auch rekurrente respiratorische Papillomatose bei Kindern, was durch eine vertikale Virustransmission von der infizierten Mutter auf das Kind bedingt ist ( Minkina G. N., Manuchin I. B., Frank G. A. „Präkanzerose des Gebärmutterhalses", Moskau, Verlag, „Aerograph-Media", 2001 ).Genital condylomas also cause recurrent pulmonary respiratory papillomatosis in children, which is due to a vertical viral transmission from the infected mother to the child ( Minkina GN, Manuchin IB, Frank GA "Precancerous Cervix", Moscow, Publisher, "Aerograph-Media", 2001 ).

Als Hauptmethoden der Behandlung von genitalen Kondylomen und von neoplastischen präkanzerösen Erkrankungen der Geschlechtsorganen (reproduktiven Organe), die durch den Papillomavirus bedingt sind, gelten zurzeit chemische Destruktion, chirurgische Ausschneidung oder die Ablation. Diese Methoden werden nicht selten von Komplikationen begleitet, die den Einsatz von hochwertigen medizinischen Ausrüstungen verlangen und sich bei weitem nicht immer als effektiv erweisen. Dabei sind viele junge Frauen mit einem nicht ausgeprägten klinischen Bild der vaginalen Kondylomatose, die mit destruktiven Methoden nicht behandelt werden können, Infektionsträger und setzen ihre Geschlechtspartner und zukünftigen Kindern einer Gefahr aus.When Main methods of treatment of genital condylomas and neoplastic precancerous diseases of the sexual organs (reproductive organs) caused by the papillomavirus, Currently, chemical destruction, surgical excision or the ablation. These methods are not uncommon from complications accompanies the use of high quality medical equipment demand and by far not always prove to be effective. There are many young women with an undefined clinical picture of vaginal condylomatosis with destructive Methods can not be treated, infection carriers and put their sex partners and future children a danger.

Bei der Infizierung des Epithelgewebes benutzt der Papillomavirus einen kompletten Satz von Mechanismen, die die Lebenstätigkeit einer infizierten Zelle seinen Interessen unterordnen. Es ist bekannt, dass die DNS des Papillomavirus die Synthese von zwei Proteinen E6 und E7 kodiert, die den Übergang von differenzierten Zellen in die S-Phase des Zellzyklus induzieren. Im Stadium der aktiven Reproduktion des Virus wird die Expression der Gene E6 und E7 vom Proteinprodukt des Gens E2 – vom Repressor der Transkription dieser Gene – reguliert. Gerade deswegen, solange sich der Virus im episomalen Zustand befindet, vollziehen sich gutartige Prozesse der Wucherung des infizierten Gewebes. Das Schlüsselereignis in der Malignisierung der Zellen ist die Integration des Virus ins Genom der Wirtszelle, die mit der Deletion des Gens E2 begleitet wird.In epithelial tissue infection, the papillomavirus uses a complete set of mechanisms that subordinate the life of an infected cell to its interests. It is known that the DNA of the papillomavirus encodes the synthesis of two proteins E6 and E7, which induce the passage of differentiated cells into the S-phase of the cell cycle. At the stage of active reproduction of the virus, the expression of genes E6 and E7 is regulated by the protein product of the E2 gene - the repressor of the transcription of these genes. Precisely because of this, as long as the virus is in the episomal state, benign processes of proliferation of the infected tissue take place. The key event in the malignancy of the cells is the integration of the virus into the genome of the host cell, which accompanies the deletion of the E2 gene becomes.

Die Kontrolle des Zellzyklus und der Differenzierung wird mittels onkogener Proteine E6 und E7 ausgeübt, die die „Schlüsselprotein"-Regulatoren der proliferativen Aktivität von Zellen inaktivieren: Proapoptosis-Protein p53 und das Protein des Retinoblastoms (pRB). Es wurde festgestellt, dass das Protein E7 fähig ist, einen stabilen Komplex mit dem Protein pRB zu bilden, wodurch dessen Degradierung ausgelöst wird, was zur Freisetzung des Transkriptionsfaktors E2F führt, der die Transkription von Genen stimuliert, die für die Replikation der DNS in der S-Phase des Zellzyklus erforderlich sind. Außerdem beeinflusst E7 die Aktivität einer Reihe von anderen Protein-Regulatoren des Zellzyklus wie A- und E-Zykline, cdk2-Kinase und die Inhibitoren der zyklinabhängigen Kinase p21 und p27.The Control of the cell cycle and differentiation is by oncogenic Proteins E6 and E7 exerted the "key protein" regulators inactivating cell proliferation activity: Proapoptosis protein p53 and the protein of retinoblastoma (pRB). It was determined, that the protein E7 is able to form a stable complex with to form the protein pRB, thereby triggering its degradation which leads to the release of the transcription factor E2F, which stimulates the transcription of genes responsible for the Replication of DNA in the S phase of the cell cycle are required. In addition, E7 affects the activity of a series from other cell cycle protein regulators such as A and E cyclins, cdk2 kinase and the inhibitors of cyclin-dependent kinase p21 and p27.

Es ist bekannt, dass in der Pathogenese der Virusinfektion, die zur Erhöhung der proliferativen Aktivität von infizierten Zellen gutartigen Charakters (und manchmal zu ihrer bösartigen Entartung) führt, das endokrine System eine bedeutende Rolle spielt, insbesondere der Spiegel und die Aktivität der weiblichen Geschlechtshormone-Östrogenen ( „Westnik dermatologii i wenerologii” [„Zeitschrift für Dermatologie und Venerologie"], 2000, Nr. 6, S. 20–23 ). Dabei wird eine relative Konstanz der proliferativen Zellaktivität im östrogenempfindlichen Gewebe mit Hilfe von speziellen metabolischen Mechanismen kontrolliert, die Östradiol (ein besonders aktives Östrogen) in seine biologisch aktiven Derivate konvertiert. Der Hauptpool des endogenen Östrogens wird mittels des sich in der Leber befindlichen Monooxygenationssystems von Zytochromen P-450 verwertet, das die Bildung. seiner Hydroxyderivate katalysiert, was deren Löslichkeit und nachfolgende Ausscheidung aus dem Körper über die Nieren und ableitenden Gallenwege erleichtert. Das fermentative System von Zytochromen P-450 gewährleistet die Konversion des Östradiols in zwei Hauptmetaboliten: 16_α-Hydroxyöstron (16_α-OHE1) und 2-Hydroxyöstron (2-OHE1) (1).It is known that in the pathogenesis of viral infection, which leads to an increase in the proliferative activity of infected cells of a benign nature (and sometimes to their malignant degeneration), the endocrine system plays an important role, in particular the level and activity of the female sex hormones. Estrogens ( "Westnik dermatologii i wenerologii"["Journal of Dermatology and Venereology"], 2000, No. 6, pp. 20-23 ). It controls the relative constancy of proliferative cell activity in estrogen-sensitive tissue using specific metabolic mechanisms that convert estradiol (a particularly active estrogen) into its biologically active derivatives. The main pool of endogenous estrogen is utilized by the hepatic monooxygenation system of cytochromes P-450, which inhibits their formation. catalyzes its hydroxy derivatives, which facilitates their solubility and subsequent excretion from the body via the kidneys and draining biliary tracts. The fermentative system of cytochromes P-450 ensures the conversion of estradiol into two major metabolites: 16 _α -hydroxyestrone (16 _α -OHE1) and 2-hydroxyestrone (2-OHE1) ( 1 ).

16_α-OHE1 gehört zur Kategorie der „aggressiven" Hormone, die einen dauerhaften karzinogenen Effekt hervorrufen ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, p. 3047–3051 ). Es ist bewiesen, dass dieser Effekt durch die Bildung von festen kovalenten Bindungen von 16_α-OHE1, der ein Agonist von Östrogen ist, mit Kernöstrogenrezeptoren bedingt ist. 2-OHE1 besitzt gemäßigte Funktionen, und normalisiert das Zeltwachstum im Unterschied zu 16_α-OHE1. Bei Erhöhung des 2-OHE1-Spiegels wird die Tendenz zum Tod von Tumorzellen und zur Prophylaxe von deren weiteren Bildung beobachtet.16 _α- OHE1 belongs to the category of "aggressive" hormones that cause a permanent carcinogenic effect ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, p. 3047-3051 ). It is proved that this effect is due to the formation of solid covalent bonds of 16 _α -OHE1 which is an agonist of estrogen in nuclear estrogen receptors. 2-OHE1 has moderate functions, and normalizes the cell growth, in contrast to 16 _α -OHE1. As the 2-OHE1 level is increased, the tendency for tumor cell death and prophylaxis for their further formation is observed.

Die Erforschung der Funktionen von diesen zwei Metaboliten ermöglichte die Feststellung einer eindeutigen Verbindung zwischen dem 16_α-OHE1-Spiegel und dem Risiko der Tumorentwicklung im östrogenabhängigen Gewebe und die Schlussfolgerung, dass das Verhältnis von 2-OHE1 zu 16_α-OHE1 gleichzeitig ein universeller Biomarker und ein zuverlässiges diagnostisches Kriterium für die Risikobestimmung und für die Prognostizierung der Entwicklung von östrogenabhängigen Tumoren ist.The investigation of the functions of these two metabolites allowed the detection of a unique connection between the 16 _α -OHE1 levels and the risk of tumor development in estrogen-dependent tissues and the conclusion is that the ratio of 2-OHE1 to 16 _α -OHE1 simultaneously a universal biomarkers and is a reliable diagnostic criterion for risk assessment and prognosis for the development of estrogen-dependent tumors.

Es ist seit langem bekannt, dass sich die Gewebeveränderungen im Zervikalkanal, die vom Papillomavirus verursacht werden, vorwiegend in den östrogenempfindlichen Zonen befinden. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass dort, wo eine aktive Expression der Proteine des Papillomavirus beobachtet wird, ein hohes Niveau der Synthese (16_α-OHE1) festgestellt wird, das mit dem Syntheseniveau in den Tumorzellen der Milchdrüsen vergleichbar ist.It has long been known that the tissue changes in the cervical canal caused by the papillomavirus are predominantly in the estrogen-sensitive zones. In addition, that where an active expression of the proteins of papillomavirus is observed a high level of synthesis (16 _α -OHE1) is determined which is comparable to the level of synthesis in the tumor cells of the mammary glands was determined.

Es sei zu unterstreichen, dass die Epithelzellen des Gebärmutterhalses normalerweise nicht fähig sind, die Umwandlung des Östradiols in 16_α-Hydroxyöstron zu gewährleisten. Die aktive Reproduktion des Papillomavirus induziert somit die Bildung des „aggressiven" Metaboliten in den infizierten Zellen ( Kisselew W. I., Kisselew O. I. Papillomaviren in der Entwicklung des Gebärmutterhalskrebses. St. P.-M.: Rosa mira, 2003 ).It should be emphasized that the epithelial cells of the uterine cervix usually are not able to ensure the conversion of estradiol in 16 _α -Hydroxyöstron. The active reproduction of the papillomavirus thus induces the formation of the "aggressive" metabolite in the infected cells ( Kisselew WI, Kisselew OI Papillomaviruses in the development of cervical cancer. St. P. M .: Rosa mira, 2003 ).

Zugleich wurde festgestellt, dass die mit dem Papillomavirus infizierten menschlichen Keratinozyten eine proliferative Aktivität in vitro zeigen, aber dabei keinen Tumorphänotyp bei der mikroskopischen Untersuchung zeigen. Die Zugabe der Zellen zu Kulturmedium von exogenen 16_α-OHE1 verwandelt diese in typisch kanzeröse Zellen ( Int. J. Cancer, 1991, v. 49, p. 867–869 ).At the same time, it has been found that human papillomavirus-infected human keratinocytes show proliferative activity in vitro but do not show a tumor phenotype on microscopic examination. The addition of the cells to the culture medium of exogenous _α -OHE1 16 turns it into typical cancerous cells ( Int. J. Cancer, 1991, v. 49, p. 867-869 ).

Somit bildet sich ein Teufelskreis, bei dem der Virus durch die Bildung einer „aggressiven" Form des Östradiols günstige Bedingungen für die Entwicklung eines Tumors schafft, indem die Synthese des Onkoproteins E7 stimuliert wird. Das Onkoprotein E7 aktiviert einerseits die Mechanismen der pathologischen Proliferation von Zellen, und blockiert andererseits immunologischen Antivirusschutz (2).This creates a vicious circle in which the virus creates favorable conditions for the development of a tumor by forming an "aggressive" form of estradiol by stimulating the synthesis of the oncoprotein E7, which on the one hand activates the mechanisms of pathological cell proliferation and on the other hand blocks immunological antiviral protection ( 2 ).

Zusammenfassend kann man schlussfolgern, dass die Infizierung von Epithelzellen mit dem Papillomavirus ein notwendiger, aber nicht ausreichender Faktor für deren Malignisierung ist. Für die Bildung einer unumkehrbaren Neoplasie sind erforderlich: 1) die Induktion von metabolischen Mechanismen zur Konversion von Östradiol in 16_α-OHE1, das bei der kanzerösen Entartung der mit dem Papillomavirus infizierten Zellen die Schlüsselrolle spielt; 2) aktive Expression von Onkogenen E6 und E7 durch den Virus, die durch das Zusammenwirken des Hormon-Rezeptor-Komplexes mit dem Promotor der DNS des Papillomavirus stimuliert wird; 3) die Induktion von multiplen Schädigungen der chromosomalen DNS in einer infizierten Zelle, die den Prozess der Tumortransformation vollendet.In summary, it can be concluded that the infection of epithelial cells with the papillomavirus is a necessary but insufficient factor for their malignancy. For the formation of a irreversible neoplasia are needed: 1) the induction of metabolic mechanisms for the conversion of estradiol in 16 _α -OHE1 that plays the key role in the degeneration of the cancerous cells infected with the papillomavirus; 2) active expression of oncogenes E6 and E7 by the virus stimulated by the interaction of the hormone-receptor complex with the papillomavirus DNA promoter; 3) the induction of multiple lesions of chromosomal DNA in an infected cell that completes the process of tumor transformation.

Im Zusammenhang mit dem Entstehen der Viruskonzeption der zervikalen Karzinogenese hat sich das Herangehen an die Behandlung von dysplastischen Prozessen des Gebärmutterhalses grundsätzlich geändert. Zurzeit beginnen chirurgische Methoden (wegen einer hohen Rückfallrate nach deren Verwendung) eine Nebenrolle zu spielen. Im Vordergrund steht jetzt die ätiopathogenetische Therapie, die zwei Hauptrichtungen hat: 1) die Einwirkung auf den ätiologischen Faktor-Papillomavirus; 2) die Blockierung der Hauptmechanismen der Karzinogenese.in the Related to the emergence of the virus concept of the cervical Carcinogenesis has become the approach to the treatment of dysplastic processes of the cervix basically changed. Surgical methods are currently starting (because of a high relapse rate after their use) play a minor role. In the foreground is now the etiopathogenetic therapy, the two Main directions has: 1) the action on the etiological Factor papillomavirus; 2) the blocking of the main mechanisms of the Carcinogenesis.

Zum jetzigen Zeitpunkt gibt es leider keine Arzneimittel, die auf den Papillomavirus selektiv einwirken. Besonders oft werden für die Behandlung der Papillomavirus-Infektion Interferon-Präparate (IFN) verwendet, d. h. das Protein, das von den Zellen des Immunsystems als Antwort auf die Stimulation mit den Virusantigenen produziert wird. Aber in den meisten Fällen führt sogar eine dauerhafte IFN-Therapie zur klinischen Verbesserung. Bekanntlich wird die Resistenz der mit dem Papillomavirus infizierten zervikalen Zellen gegen IFN-Einwirkung durch einen erhöhten Spiegel der Expression des Onkoproteins E7 bestimmt, das den Faktor der IFN-Regulierung intrazellulär inaktiviert, der die Transkription von Genen umfasst, die die Synthese von Antivirusproteinen kodieren.To the Unfortunately, there are no drugs available at the moment Selectively interact with papillomavirus. Especially often for the treatment of papillomavirus infection interferon preparations (IFN) used, d. H. the protein that comes from the cells of the immune system produced in response to stimulation with the viral antigens becomes. But in most cases even one leads permanent IFN therapy for clinical improvement. generally known will increase the resistance of the cervical papillomavirus infected Cells against IFN exposure by increased levels the expression of oncoprotein E7 determines the factor of IFN regulation Inactivates intracellularly, transcribing genes which encodes the synthesis of antiviral proteins.

Im Laufe von vielen Jahren wurde nach natürlichen und synthetischen Antitumorverbindungen gesucht, die fähig sind, die Entwicklung der Präkanzerose des Gebärmutterhalses zu stoppen. Endlich wurde diese Suche mit einem Erfolg gekrönt. Vor kurzem wurde eine chemische Verbindung mit antikarzinogenen Eigenschaften identifiziert: Indol-3-Carbinol (I3C) – ein Phytonutrient (Phytonährstoff), ein Isoflavonoid, das in Kreuzblütler-Gemüse enthalten ist.in the Over many years has been looking for natural and synthetic Sought for anti-tumor compounds that are capable of development to stop precancerous cervix. Finally this search was crowned with a success. In front recently became a chemical compound with anti-carcinogenic properties identified: indole-3-carbinol (I3C) - a phytonutrient (Phytonutrient), an isoflavonoid found in cruciferous vegetables is included.

Zahlreiche Angaben der Fachliteratur weisen darauf hin, dass eine dauerhafte Einnahme dieser Verbindung der Entwicklung von Tumoren im Gedärm, in Lungen, in Organen des weiblichen reproduktiven Systems vorbeugt. I3C stimuliert den Antitumoreffekt vieler Arzneimittel und reduziert die mutagene Aktivität von Karzinogenen.numerous Information in the literature indicates that a permanent Taking this compound the development of tumors in the intestines, in lungs, in organs of the female reproductive system. I3C stimulates the antitumor effect of many drugs and reduces it the mutagenic activity of carcinogens.

Die meisten Forschungen, die I3C gewidmet sind, betreffen seine Antitumoraktivität in den sogenannten östrogenabhängigen Organen und Geweben (Milchdrüsen, das Endometrium und der Gebärmutterhals), für die eine zyklische Veränderung des Niveaus der zellulären proliferativen Aktivität typisch ist. Die Einzigartigkeit der Wirkung von I3C besteht darin, dass diese chemische Verbindung beide Wege beeinflußt, indem ihr Funktionieren gestört und die zelluläre Proliferation dadurch verhindert wird. Einerseits hat I3C einen ausgeprägten antiöstrogenen Effekt, indem die Bildung des antiproliferativen 2-Hydroxyöstrons gefördert wird und somit das Verhältnis 2-OHE1/16_α-OHE1 zugunsten der ersten Substanz verbessert wird, und andererseits verhindert I3C die Phosphorylierung von zytoplasmatischen Proteinen – Teilnehmern der Kaskadentransmission, die von EGF induziert wird. Ein weiterer wichtiger Mechanismus der Antitumorwirkung von I3C ist seine Fähigkeit, die Apoptosis zu induzieren, d. h. den „programmierten Tod" von Tumorzellen durch das bax-bcl-System.Most research devoted to I3C concerns its antitumor activity in the so-called estrogen-dependent organs and tissues (mammary glands, the endometrium and the cervix), for which a cyclical change in the level of cellular proliferative activity is typical. The uniqueness of the action of I3C is that this chemical compound affects both pathways by disrupting their functioning and preventing cellular proliferation. On the one hand I3C has a distinct antiestrogenic effect by the formation of the anti-proliferative 2-Hydroxyöstrons is promoted, and thus the ratio of 2-OHE1 / 16 _α -OHE1 is improved in favor of the first substance, and I3C other hand, prevents the phosphorylation of cytoplasmic proteins - participants of the cascade Transmission which is induced by EGF. Another important mechanism of anti-tumor activity of I3C is its ability to induce apoptosis, that is, the "programmed death" of tumor cells by the bax-bcl system.

Der mit dem Papillomavirus assoziierte Gebärmutterhalskrebs wurde auch als potentielle Anwendungsmöglichkeit für die I3C-Therapie untersucht. Die ersten vielversprechenden Ergebnisse wurden im Jahre 1999 von einer Gruppe USA-Forscher am Modell von transgenen Mäusen erhalten, die im Genom eine integrierte Form vom Papillomavirus-16 enthielten. Davor wurde festgestellt, dass die Ernährung dieser Mäuse mit einer Diät, zu der 17-_α-Östradiol gehört, bei diesen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs führt ( J. Cell. Biochem., 2000, 34 (Supp.): 103–114 ). Bei weiteren Forschungen ist es gelungen, die Vielartigkeit der Antitumoraktivitäten von I3C in vom Papillomavirus transformierten Zellen des Zervikalepithels nachweisbar zu bestätigen. In vitro und in vivo wurde nachgewiesen:

1) I3C hebt die östradiolabhängige Induktion des Onkogens E7 auf, indem das Niveau der Expression des Onkoproteins E7 somit drastisch reduziert wird und indem die hormonabhängige Proliferation von infizierten Zellen verhindert wird;
2) I3C normalisiert den Metabolismus von Östradiol in den Zellen, die mit dem Papillomavirus infiziert sind, indem die Bildung des karzinogenen Metaboliten 16_α-OHE1 verhindert wird, der die Expression von Onkogenen des Papillomavirus fördert;
3) I3C induziert die Apoptosisprozesse der mit dem Papillomavirus infizierten Zellen, indem der selektive Tod der Zellen mit Tumoreigenschaften ausgelöst wird ( J. Nutrit, 2001, 131, 3294–3302 ).

Cervical cancer associated with papillomavirus has also been studied as a potential application for I3C therapy. The first promising results were obtained in 1999 from a group of USA researchers on the model of transgenic mice that contained an integrated form of papillomavirus-16 in the genome. Previously, it was found that feeding these mice with a diet that included 17- _α- estradiol leads to the development of cervical cancer ( J. Cell. Biochem., 2000, 34 (Supp.): 103-114 ). Further research has been able to demonstrably confirm the diversity of anticancer activities of I3C in papillomavirus-transformed cervical epithelial cells. In vitro and in vivo it was demonstrated:

1) I3C abolishes the estradiol-dependent induction of the oncogene E7, thus drastically reducing the level of expression of oncoprotein E7 and preventing the hormone-dependent proliferation of infected cells;
2) I3C normalizes metabolism of estradiol in cells that are infected with the papillomavirus by the formation of carcinogenic metabolites _α is prevented -OHE1 16, which promotes the expression of oncogenes papilloma virus;
3) I3C induces the apoptosis processes of cells infected with the papillomavirus by using the selective Death of cells with tumor properties is triggered ( J. Nutrit, 2001, 131, 3294-3302 ).

Die Antitumoraktivität von I3C als Mittel zur Prophylaxe und Behandlung des Gebärmutterhalskrebses wurde auch vor kurzem durch placebokontrollierte klinische Forschungen bestätigt ( Gynecol. Oncol, 78, 123–129, 2000 ). Bei Patientinnen mit CIN des II. und III. Grades, die täglich 200–400 mg I3C (Prüfgruppe) eingenommen haben, wurde bei 47% der Fälle eine volle Tumorregression beobachtet, während in der Kontrollgruppe kein Fall der Regression festgestellt wurde.The anti-tumor activity of I3C as a prophylactic and cervical cancer treatment has also been recently confirmed by placebo-controlled clinical research ( Gynecol. Oncol, 78, 123-129, 2000 ). In patients with CIN II and III. In those who took 200-400 mg I3C daily (test group), full tumor regression was observed in 47% of cases, whereas no regression was observed in the control group.

Bei der Besprechung der Antitumor- und Antivirusaktivität von I3C muss man berücksichtigen, dass für diese Verbindung eine außerordentliche Instabilität typisch ist und dass sie leicht einer Oligomerisation unterliegt, die im saueren Medium verstärkt ist. Dabei ist das wichtigste oligomere Produkt von I3C die dimere Form-3,3'-Diindolylmethan (DIM). Wie pharmakokinetische Forschungen nachgewiesen haben, verwandelt sich peroral eingenommenes I3C unter der Einwirkung saueren Mediums im Magen fast sofort in DIM ( Ameson DW, Hurwitz A, McMahon, Robaugh D: Presence of 3,3'-diindolylmethane in human plasma after oral administration of indole-3-carbinol (abstr.) Proc. Am. Assoc. Canser Res, 40, 2833, 1999 ).When discussing the antitumor and antiviral activity of I3C, it must be remembered that this compound is characterized by extreme instability and is readily subject to oligomerization that is enhanced in the acidic medium. The most important oligomeric product of I3C is the dimeric form-3,3'-diindolylmethane (DIM). As proven by pharmacokinetic research, peroral ingestion of I3C under the action of acidic medium in the stomach almost immediately turns into DIM ( Ameson DW, Hurwitz A, McMahon, Robaugh D: Presence of 3,3'-diindolylmethane in human plasma after oral administration of indole-3-carbinol (Abstr.) Proc. At the. Assoc. Canser Res, 40, 2833, 1999 ).

Experimentell wurde bewiesen, dass praktisch alle multiplen Antitumormechanismen, die von I3C in vitro und in vivo induziert werden, auch für DIM kennzeichnend sind.experimental It has been proven that practically all multiple anti-tumor mechanisms, which are induced by I3C in vitro and in vivo, also for DIM are distinctive.

In Rahmen einer der jüngsten experimentellen Forschung wurde die Fähigkeit von DIM nachgewiesen, die Apoptosis von mit dem Papillomavirus infizierten zervikalen menschlichen Keratinozyten unter in vitro Bedingungen auszulösen. An einer von drei untersuchten Zelllinien des zervikalen Karzinoms zeigte DIM dabei eine um das Mehrfache größere Effektivität als I3C (der Wert (LD50) betrug jeweils 50–60 mkM für DIM und 200 mkM für I3C), aber ebenso wie sein metabolischer Vorgänger (I3C) löste DIM keine Apoptosisveränderungen in normalen (nicht transformierten) Keratinozyten aus ( J. Nutrit, 2001, 131, 3294–3302 ).In one of the most recent experimental studies, DIM's ability to induce apoptosis of papillomavirus-infected cervical human keratinocytes under in vitro conditions has been demonstrated. In one of three cervical carcinoma cell lines studied, DIM showed several times greater efficacy than I3C (the value (LD50) was 50-60 mKM for DIM and 200 mkM for I3C, respectively), as was its metabolic precursor (I3C). DIM did not induce apoptosis changes in normal (non-transformed) keratinocytes ( J. Nutrit, 2001, 131, 3294-3302 ).

Vor einigen Jahren wurde mittels Microarray-Analyse festgestellt, dass die Ähnlichkeit der Antitumor- und Antivirusaktivität von I3C und DIM auch auf der submolekularen (genetischen) Ebene zum Ausdruck kommt. In den Zelllinien des zervikalen Karzinoms veränderte DIM – ähnlich wie I3C – konstitutiv die Transkription von mehr als 100 Genen, deren größter Teil die Zellproliferation (die Apoptosis) direkt oder indirekt sowie die Expression von Onkogenen des Papillomavirus in den mit dem Virus infizierten Zellen kontrolliert ( J. Nutr. 132, 3314–3324, 2002 ).Several years ago, it was found by microarray analysis that the similarity of the antitumor and antiviral activity of I3C and DIM is also expressed at the sub-molecular (genetic) level. In the cell lines of cervical carcinoma, DIM constitutively altered the transcription of more than 100 genes, most of which directly or indirectly controls cell proliferation (apoptosis) and expression of papillomavirus oncogenes in the cells infected with the virus, similar to I3C ( J. Nutr. 132, 3314-3324, 2002 ).

Zum Schluss soll noch eine vor kurzem beschriebene wichtige Eigenschaft von DIM erwähnt werden: seine immunomodulierende Aktivität. Es wurde nachgewiesen, dass DIM unter in vitro Bedingungen die IFN_α-abhängigen Signalkaskaden durch die Aktivierung der Expression der Rezeptoren IFN_α sowie anderer IFN-responsiver Regulatorproteine in den Tumorzellen stimuliert ( Cells. Mol. Pharmacol, 2006, 69, 430–439 ). Unter Berücksichtigung der hohen Antivirus- und Antitumoraktivität von IFN_α kann diese Eigenschaft eine große klinische Bedeutung für die Verwendung von DIM zur Behandlung der durch Papillomavirus bedingten zervikalen Dysplasien haben.Finally, mention should be made of a recently described important feature of DIM: its immunomodulating activity. It has been demonstrated that DIM stimulates the IFN _α- dependent signaling cascades under in vitro conditions by activating the expression of the receptors IFN _α as well as other IFN-responsive regulatory proteins in the tumor cells ( Cells. Mol. Pharmacol, 2006, 69, 430-439 ). Considering the high antiviral and antitumor activity of IFN _α , this property may have great clinical significance for the use of DIM for the treatment of papillomavirus-related cervical dysplasia.

Zusammenfassend kann man schlussfolgern, dass ein Präparat auf DIM-Basis eine hohe Antitumor- und Antivirusaktivität gegen die mit dem Papillomavirus infizierten Zellen haben soll.In summary One can conclude that a preparation based on DIM a high antitumor and antiviral activity against those with cells infected with papillomavirus.

Zwar ist Methindol eine stabilere Verbindung als Indol-3-Carbinol jedoch hat es eine niedrigere biologische Zugänglichkeit, was seine Verwendung als Arzneimittel beschränken kann.Though however, methindole is a more stable compound than indole-3-carbinol it has a lower biological accessibility, which restrict its use as a medicinal product.

Zur Erhöhung der Löslichkeit und biologischen Zugänglichkeit wurden verschiedene Arzneimittelformen von DIM entwickelt. Aber sie haben auch einige Nachteile. Deswegen bleibt die Suche nach neuen effektiveren Zusammensetzungen nach wie vor aktuell.to Increase in solubility and biological accessibility Various forms of drugs have been developed by DIM. But They also have some disadvantages. That's why the search for new more effective compositions are still up-to-date.

Bekannt sind DIM-Vaginalzäpfchen zur Behandlung der Leishmaniose, die folgenderweise erhalten werden: durch die Erwärmung von Cetostearyl-Alkohol mit dem Wirkstoff sowie durch die Zufügung von Ceramiden oder ihrer Derivate und der nachfolgenden Zugabe des erhaltenen Gemisches zur Triglyceridbasis und Formung von Zäpfchen ( WO 2005/107747 , 17.11.2005).DIM vaginal suppositories are known for the treatment of leishmaniasis, which are obtained by heating cetostearyl alcohol with the active ingredient and by adding ceramides or their derivatives and subsequently adding the resulting mixture to the triglyceride base and forming suppositories ( WO 2005/107747 , 17.11.2005).

Bekannt ist das Patent US 6689387 , 10.02.2004, das verschiedene Formen von Diindolylmethan zur Behandlung von Mastalgie und Endometriose beschreibt. Unter anderem wird hervorgehoben, dass die Verwendung in Form von Zäpfchen mit herkömmlichen Bindemitteln und mit Trägern wie Triglyceride möglich ist.The patent is known US 6689387 , 10.02.2004, which describes various forms of diindolylmethane for the treatment of mastalgia and endometriosis. Among other things, it is emphasized that the use in the form of suppositories with conventional binders and with carriers such as triglycerides is possible.

Bekannte Zäpfchen gewährleisten keine prolongierte Wirkung des Wirkstoffes, die für die Behandlung der Papillomavirusinfektion erforderlich ist. Außerdem erfordert die Heilung von neoplastischen Störungen viel Zeit. Darüber hinaus lösen Triglyceridbasen bei dauerhafter Verwendung eine Ulzeration der Schleimhaut aus.Known Suppositories do not guarantee a prolonged effect of the active substance necessary for the treatment of papillomavirus infection is required. It also requires the healing of neoplastic Disturbances a lot of time. In addition, solve Triglyceride bases with permanent use an ulceration of the Mucous membrane out.

Als am nächsten kommende Publikation wird auf das Patent RU 2196568 hingewiesen.The closest publication is on the patent RU 2196568 pointed.

Diese Lösung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe und Behandlung von Tumoren, die mit Papillomaviren assoziiert sind, und zwar der Dysplasie und des Gebärmutterhalskrebses sowie der Larynxpapillomatose. Die Erfindung besteht darin, dass eine Zusammensetzung auf Basis von Indol-3-Carbinol als Wirkstoff, gegebenenfalls in Form von Vaginalzäpfchen auf Vitepsol-Basis, vorgeschlagen wird. Da der Wirkstoff ziemlich instabil ist, kann damit keine effektive Behandlung gewährleistet werden.These Solution relates to a pharmaceutical composition for Prophylaxis and treatment of tumors associated with papillomaviruses dysplasia and cervical cancer and laryngeal papillomatosis. The invention is that a composition based on indole-3-carbinol as active ingredient, optionally in the form of vaginal suppositories based on vitepsol, is proposed. Since the drug is quite unstable, can so that no effective treatment is guaranteed.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Entwicklung einer Arzneimittelform für eine effektivere Behandlung von genitalen Kondylomen und neoplastischen Erkrankungen ohne Nebenwirkungen, wobei diese Arzneimittelform während Lagerung stabil bleiben soll.The Object of the present invention is the development of a Pharmaceutical form for a more effective treatment of genital Condylomas and neoplastic diseases without side effects, being remain stable during storage should.

Die gestellte Aufgabe wird durch ein Präparat gelöst, dass ein Vaginalzäpfchen („Zervikon") darstellt, das als Wirkstoff Methindol (3,3'-Diindolylmethan – DIM), lipophilen Grundstoff, der ein festes Süßwarenfett ist, Polyvinylpyrrolidon und Butylhydroxyanisol oder Butylhydroxianisol in folgender Zusammensetzung (Masseprozent) enthält: Methindol 2,0–6,0 Polyvinylpyrrolidon 0,5–1,2 Butylhydroxianisol oder Butylhydroxitoluol 0,3–0,5 Lipophiler Grundstoff Rest The stated object is achieved by a preparation which constitutes a vaginal suppository ("cervicon") comprising as active ingredient methindol (3,3'-diindolylmethane-DIM), lipophilic raw material which is a solid confectionery fat, polyvinylpyrrolidone and butylhydroxyanisole or butylhydroxianisole in the following Composition (mass%) contains: Methindol 2.0-6.0 polyvinylpyrrolidone 0.5-1.2 Butylhydroxianisole or butylhydroxitoluene 0.3-0.5 Lipophilic raw material rest

Methindol ist in einer Menge von 0,045–0,110 g pro Dosis enthalten.Methindol is contained in an amount of 0.045-0.110 g per dose.

Als lipophiler Grundstoff wird vorzugsweise festes Süßwarenfett verwendet, wie festes Fett Typ „A" oder „B", möglich ist aber auch die zusätzliche Zugabe von Emulgatoren, Äthern der Phthalsäure und Spiritus, von gehärteten pflanzlichen Ölen, Wachs, Paraffin, Lanolin, Kochfett, Kakaoöl.When lipophilic raw material is preferably solid confectionery fat used, such as solid grease type "A" or "B" possible but is also the additional addition of emulsifiers, ethers phthalic acid and spirit, of hydrogenated vegetable oils, Wax, paraffin, lanolin, cooking fat, cocoa oil.

Bekanntlich haben feste Süßwarenfette eine kleinkörnige Struktur, die in einem engen Intervall schmelzen, sowie gute Plastizität und sind mit vielen Stoffen leicht mischbar. Süßwarenfette werden auf Basis von Palmkernfett sowie auf Basis von gehärtetem Fett (Talgöl) zubereitet.generally known Solid sweetener fats have a small grain size Structure that melt in a tight interval, as well as good plasticity and are easily miscible with many substances. confectionary fats are based on palm kernel fat as well as on the basis of hardened Fat (tallow oil) prepared.

Außerdem wurde festgestellt, dass bei der Verwendung dieser Basis mit Polyvinylpyrrolidon und mit einem Antioxidationsmittel praktisch keine unerwünschte Einwirkung auf die Schleimhaut erfolgt, wie im Falle der Basen, die vorwiegend aus Triglyceriden bestehen, wie Vitepsol, Estarinum, die in der pharmazeutischen Praxis breit verwendet sind.Furthermore it was found that when using this base with polyvinylpyrrolidone and virtually no undesirable with an antioxidant Exposure to the mucous membrane takes place, as in the case of the bases, consisting mainly of triglycerides, such as Vitepsol, Estarinum, which are widely used in pharmaceutical practice.

Butylhydroxianisol und Butylhydroxitoluol sind synthetische Produkte, die zu den Phenol-Derivaten gehören. Sie weisen eine effektive oxydationsverhindernde Wirkung auf und sind bekannte Konservierungsmittel. Deren Zugabe zur Zäpfchenmasse verleiht einen zusätzlichen Effekt der Einwirkung auf eine beschädigte Schleimhaut.butylhydroxyanisole and butylhydroxitoluene are synthetic products that are the phenolic derivatives belong. They have an effective anti-oxidant Affect and are known preservatives. Their encore to the suppository mass gives an extra Effect of the action on a damaged mucous membrane.

Als Polyvinylpyrrolidon wird vorzugsweise niedermolekulares Polyvinylpyrrolidon verwendet zum Beispiel, der Marken Kollidon CL, CL-M- mit Molekularmasse 12600 ± 2700 oder Povidon mit Masse 8000 ± 2000.When Polyvinylpyrrolidone is preferably low molecular weight polyvinylpyrrolidone used, for example, the brands Kollidon CL, CL-M- with molecular mass 12600 ± 2700 or povidone with mass 8000 ± 2000.

Das Herstellungsverfahren der Zäpfchen besteht darin, dass Komponenten des lipophilen Grundstoffes geschmolzen werden, ein Teil des lipophilen Grundstoffes wird mit dem Wirkstoff bis zum Erhalt einer homogenen Suspension separat gerührt, zum abgekühlten restlichen Teil des Grundstoffes werden Polyvinylpyrrolidon und ein Antioxydationsmittel hinzugefügt, und dann wird die erhaltene Suspension bis zum homogenen Zustand vermischt und die Zäpfchen werden durch Ausgießung in Formen mit den erforderlichen vorgegebenen Maßen geformt.The Method of preparation of the suppositories is that Components of the lipophilic base are melted, a Part of the lipophilic raw material is mixed with the active ingredient Obtaining a homogeneous suspension stirred separately, for cooled residual part of the base material are polyvinylpyrrolidone and an antioxidant is added, and then the resulting suspension is mixed until homogeneous and the suppositories are made by pouring into molds molded with the required dimensions.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Abbildungen erklärt:The The invention is explained by the following figures:

1 erläutert den Östradiol-Metabolismus, 1 explains the estradiol metabolism,

2 erläutert die Rolle von Östrogenen bei der Karzinogenese von Epithelzellen des Gebärmutterhalses, die mit dem Papillomavirus infiziert sind. 2 describes the role of estrogens in the carcinogenesis of cervical epithelial cells infected with the papillomavirus.

3 zeigt: die Transkription des Gens E7 in den Zellen CaSki in Anwesenheit von Östradiol (3A – 1 – vor der Zugabe von Östradiol, 2 – die Inkubation innerhalb von 4 Stunden, 3 – innerhalb von 24 Stunden, 4 – innerhalb von 48 Stunden) und in Anwesenheit von Östradiol + Zervikon (3B – 1 – vor der Zugabe von Östradiol + Zervikon, 2 – die Inkubation innerhalb von 4 Stunden, 3 – innerhalb von 24 Stunden, 4 – innerhalb von 48 Stunden). 3 shows: the transcription of the gene E7 in the cells CaSki in the presence of estradiol ( 3A - 1 - before the addition of estradiol, 2 - the incubation within 4 hours, 3 - within 24 hours, 4 - within 48 hours) and in the presence of estradiol + cervicon ( 3B - 1 - before the addition of estradiol + cervicon, 2 - the incubation within 4 hours, 3 - within 24 hours, 4 - within 48 hours).

4 zeigt die Induktion der Apoptosis in Anwesenheit von Zervikon (auf der 4 shows the induction of apoptosis in the presence of Zervikon (on the

4A – in den Zellen ist die Kondensierung von Chromatin sichtbar, die vom Zelltod zeugt). 4A - in the cells, the condensation of chromatin is visible, which testifies to cell death).

Die Erfindung wird anhand folgender Beispiele illustriert. Beispiel 1 Vaginalzäpfchen, die enthalten: Diindolylmethan 0,05 g 3,3'-Diindolylmethan 0,05 g Festes Fett Typ „A" 2,02 g Kollidon CL 0,02 g Butylhydroxianisol 0,01 g

Insgesamt – 2,1 g

Beispiel 2 Vaginalzäpfchen, die enthalten:

Diindolylmethan 1,0 g 3,3'-Diindolylmethan 0,1 g Festes Fett Typ „A" 1,97 g Kollidon CL 0,02 g Butylhydroxitoluol 0,01 g

Insgesamt – 2,1 g

The invention is illustrated by the following examples. Example 1 Vaginal Suppositories Containing:

Diindolylmethan 0.05 g 3,3'-Diindolylmethan 0.05 g Solid grease type "A" 2.02 g Kollidon CL 0.02 g butylhydroxyanisole 0.01 g

Total - 2.1 g

Example 2 Vaginal Suppositories Containing:

Diindolylmethan 1.0 g 3,3'-Diindolylmethan 0.1 g Solid grease type "A" 1.97 g Kollidon CL 0.02 g butylated 0.01 g

Total - 2.1 g

Beispiel 3Example 3

Materialien und Methoden.Materials and methods.

Experimentelles Modell. Als Modell wurden verwendet: die Zelllinie des Zervikalkarzinoms CaSki, die multiple Kopien des integrierten Genoms des Papillomavirus 16 enthält, sowie die Zelllinie C33-A (ohne DNS des Papillomavirus) und kultivierte Epithelzellen aus der Zervikalgegend von Patientinnen mit der Diagnose „Papillomavirus induzierte Dysplasie".Experimental Model. The model used was: the cell line of cervical carcinoma CaSki, the multiple copies of the integrated genome of papillomavirus 16, as well as the cell line C33-A (without DNA of the papillomavirus) and cultured epithelial cells from the cervical region of patients with the diagnosis "papillomavirus induced dysplasia".

Die Zellen wurden im Medium RPMI-1640 unter Zusatz von 10-prozentigen fötalem Bovinen Serum gehalten. Die Zäpfchen wurden gemäß Beispiel 1 in wäßrig-alkoholischer Lösung aufgelöst, die 20% Ethanol enthielt, und zu den Zellen auf solche Weise zugefügt, dass die endgültige Konzentration der Zusammensetzung an 3,3'-Diindolylmethans 50 mkM betrug.The Cells were added in medium RPMI-1640 with the addition of 10% fetal bovine serum. The suppositories were according to Example 1 in aqueous-alcoholic Dissolved solution containing 20% ethanol, and added to the cells in such a way that the final Concentration of the composition of 3,3'-diindolylmethane 50 mkM amounted to.

Ausscheidung der Ribonukleinsäure (RNS). Die Zellsuspension wurde mit 0,5 ml der lysierten Lösung vermischt, die 4M Guanidinthiocyanin, 0,2% SDS, 25 mM Natriumcitrat (p7,0) enthielt, dann mit Vortex innerhalb von 10 s suspensiert und im Eisbad 15 Minuten lang lysiert.excretion ribonucleic acid (RNA). The cell suspension was washed with 0.5 ml of the lysed solution, the 4M guanidine thiocyanine, 0.2% SDS, 25 mM sodium citrate (p7.0), then vortexed inside of 10 s and lysed in an ice bath for 15 minutes.

Danach wurden in das Reagenzglas 50 mkl 2M Natriumacetat (pH 4,0) und 500 mkl Phenol eingebracht, das Gemisch wurde intensiv geschüttelt, zentrifugiert und die wäßrige Phase entnommen. Die Prozedur wurde zweimal wiederholt und dann wurde der wäßrigen Phase das gleiche Volumen Isopropanol zugefügt. Nach zwei Stunden Inkubation im Kühlschrank bei 20°C wurde das Sediment gesammelt, zentrifugiert und in 50 mkl TE-Puffe gelöst.After that 50 ml of 2M sodium acetate (pH 4.0) and 500 ml were added to the test tube mkl of phenol, the mixture was shaken vigorously, centrifuged and the aqueous phase removed. The procedure was repeated twice and then the aqueous Phase the same volume of isopropanol added. After two Hours incubation in the refrigerator at 20 ° C was collected the sediment, centrifuged and dissolved in 50 mkl TE-buffer.

Analyse der Transkription des Gens E7 des Papillomavirus 16. Die Untersuchung der Transkription des Gens E7 wurde mittels Northern-Hybridisierung durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden 10 mkg summarischer Ribonukleinsäure, die aus der Zellsuspension ausgeschieden wurde, mit Elektrophorese im formaldehydhaltigen Agarosegel aufgetrennt und auf Nitrozellulosefilter übertragen. Eine Probe für die Hybridisierung wurde mittels Amplifikation des Fragmentes des Gens E7 in Anwesenheit von markierten dTTP (p32) vorbereitet. Als Matrize für die Amplifikation wurde das Plasmid pTHE716 verwendet, dass das Onkogen E7 des Papillomavirus 16 enthält.analysis the transcription of the E7 gene of the papillomavirus 16. The investigation Transcription of the E7 gene was by Northern hybridization carried out. For this purpose, 10 mkg became more summary Ribonucleic acid excreted from the cell suspension was separated by electrophoresis in the formaldehyde-containing agarose gel and transferred to nitrocellulose filters. A sample for the hybridization was carried out by amplification of the fragment of the Gene E7 prepared in the presence of labeled dTTP (p32). When The template for the amplification was the plasmid pTHE716 used that the papillomavirus E7 oncogene contains 16.

Massenspektrometrische Analyse (GS-MS) von Metaboliten des Östradiols. Proben wurden aus dem Überstand der Zellen vorbereitet, die mit Östradiol und mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in Konzentrationen von jeweils 1 und 50 mkM bearbeitet wurden. In den Überstand (5 ml) wurde deuteriertes Östradiol als Standard eingebracht und auf eine C 18 Sep-Pak Säule (Water Associates, Milford, MA) aufgetragen.Mass spectrometry Analysis (GS-MS) of metabolites of estradiol. rehearse were prepared from the supernatant of the cells containing estradiol and with the composition of the invention were processed in concentrations of 1 and 50 mkM respectively. In the supernatant (5 ml) was deuterated estradiol introduced as standard and on a C 18 Sep-Pak column (Water Associates, Milford, MA).

Die Elution von Steroiden wurde mit Methanol-Ascorbinsäure-Lösung durchgeführt. Der Gesamtumfang des Eluats wurde durch leichte Erwärmung bei 50°C unter Vakuum auf 0,5 ml gebracht, und der Rest der Probe wurde in flüssigem Stickstoff getrocknet. Jede Probe wurde in 10 mkl Piridin und 50 mkl Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA) gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur gelassen. Je 2 mkl jeder Probe wurden mit einem Gasmassenspektrometer analysiert. Analyseergebnisse wurden in ng/mg Zellprotein angegeben.The Elution of steroids was with methanol-ascorbic acid solution carried out. The total volume of the eluate was slight Heating at 50 ° C under vacuum to 0.5 ml, and the remainder of the sample was dried in liquid nitrogen. Each sample was diluted in 10 mM Piridin and 50 mM Bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) and overnight at room temperature calmly. Each 2 mkl of each sample was analyzed with a gas mass spectrometer analyzed. Analysis results were reported in ng / mg cell protein.

Test der Biotransformation von Östrogenen. Die Analyse der Biotransformation wurde radiometrisch durchgeführt, die auf der Bildung von 3H2O aufgrund Übertragung eines Protons von spezifisch markierten Östradiol beruht, wie in Telang NT, Brandlow HL and Osborne MP „In vitro biotransformation of estradiol by explant cultures of murine mammary tissues" Breast Cancer Res. Treat. 1989, 13, 173–181 beschrieben.Test of biotransformation of estrogens. Biotransformation analysis was performed radiometrically based on the formation of 3H2O due to the transfer of a proton from specifically labeled estradiol, as in Telang NT, Brandlow HL and Osborne MP "In vitro biotransformation of estradiol by explant cultures of murine mammary tissues" Breast Cancer Res. Treat. 1989, 13, 173-181 described.

Markiertes Östrogen wurde den Zellen der Monoschicht in 0,1%-Lösung Propylenglykol zugefügt. Nach 24 Stunden Inkubation wurde die Radioaktivität der Kulturflüssigkeit gemessen. Von den erhaltenden Werten wurde der Pegel der Hintergrundbiotransformation im Kulturmedium ohne Zellen extrahiert und in mg Protein, bestimmt nach der Lowry-Methode, umgerechnet.Marked estrogen was added to the cells of the monolayer in 0.1% solution of propylene glycol added. After 24 hours of incubation, the radioactivity became the culture fluid measured. Of the preserving values became the level of background biotransformation in the culture medium extracted without cells and in mg protein, determined by the Lowry method, converted.

Experimenteller Teil.Experimental part.

Untersuchung der Expression von Onkogenen des Papillomavirus in den transformierten Zellen unter Einwirkung von Indinol. Die Expression des Gens E7 des Papillomavirus 16 wurde an der Zelllinie CaSki erforscht, die bis 500 Kopien des Genoms des Papillomavirus 16 im integrierten Zustand enthielt. Ins Kulturmedium wurde Östradiol (Endkonzentration 1 mkM) und die Zusammensetzung nach Beispiel 1 (Endkonzentration von DIM 50 mkM) eingebracht, die Inkubation erfolgte über 4, 24 und 48 Stunden. In den genannten Zeitintervallen wurden die Zellen gesammelt, summarische Ribonukleinsäure ausgeschieden und der Expressionspegel des Gens E7 mittels Northern-Hybridisierung bestimmt. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt.Investigation of the expression of papillomavirus oncogenes in the transformed cells under the influence of indinol. The expression of the E7 papillomavirus 16 gene was investigated on the CaSki cell line containing up to 500 copies of the papillomavirus 16 genome in the integrated state. Estradiol (final concentration 1 mcM) and the composition according to Example 1 (final concentration of DIM 50 mcM) were introduced into the culture medium and incubation was carried out for 4, 24 and 48 hours. The cells were collected, total ribonucleic acid secreted and the level of expression of the E7 gene determined by Northern hybridization at the time intervals indicated. The results are in 3 shown.

In diesem Experiment wurde der Expressionspegel des Gens E7 in den Zellen CaSki unter Zufügung von Östradiol ins Kulturmedium erforscht.In In this experiment, the level of expression of the E7 gene in the Cells CaSki with the addition of estradiol ins Researched culture medium.

Aus den Ergebnissen, die in 3 dargestellt sind, ist sichtbar, dass Östradiol die Synthese der Matrix-RNS des Gens E7 wesentlich induziert, wobei dieser Effekt mit der Zeit (3A) zunimmt, und der Zusatz der erfindungsgemäßen Zusammensetzung diesen Effekt praktisch völlig (3B) nivelliert.From the results in 3 can be seen that estradiol substantially induces the synthesis of the matrix RNA of the E7 gene, this effect over time ( 3A ) and the addition of the composition according to the invention practically completely eliminates this effect ( 3B ) leveled.

Untersuchung von Besonderheiten des Metabolismus von Östradiol in Epithelzellen, die vom Papillomavirus infiziert sind. Wie vorher festgestellt wurde, wird in den Zellen, die mit Papillomavirus vom Hochrisikotyp transformiert sind, eine Veränderung des Östradiol-Metabolismus in Richtung der Bildung des „aggressiven" 16_α-Hydroxyöstrons beobachtet. Dieser Metabolit hat karzinogene Eigenschaften und kann kovalente Komplexe mit östrogenen Rezeptoren bilden, wobei dauerhafte hormonabhängige Effekte ausgelöst werden und wobei unter anderem die Expression von Onkogenen des Papillomavirus stimuliert wird. Von uns wurde der Einfluss von Indinol auf den Östradiol-Metabolismus erforscht, insbesondere die Bildung von 16_α-Hydroxyöstron in den Zellen, die mit Papillomavirus transformiert wurden (s. Tabelle). Bildung von 16_α-Hydroxyöstron in Zellen, die mit Papillomavirus 16 transformiert sind Nr. Typ von Zellen % 16_α-Hydroxyöstron in mkg Zellprotein Östradiol Östradiol + Zervikon 1 CaSki Papillomavirus (+) 16,0 ± 0,1 2,2 ± 0,5 2 C 33-A Papillomavirus (–) 0,08 ± 0,03 0,08 ± 0,08 3 Zervikales Epithel 0,7 ± 0 0,5 ± 0,1 4 Zervikales Epithel aus transformierten Zonen 12,6 ± 0,5 2,1 ± 0,3 Investigation of specificities of the metabolism of estradiol in epithelial cells infected by the papillomavirus. As previously stated, in the cells transformed with high risk papillomavirus, a change in estradiol metabolism is directed towards the formation of the "aggressive" ven "observed 16 _α -Hydroxyöstrons. This metabolite has carcinogenic properties and can form covalent complexes with estrogenic receptors, permanent hormone-dependent effects are triggered and wherein, inter alia, the expression of oncogenes papilloma virus is stimulated. From us the influence of Indinol was on the researched estradiol metabolism, in particular the formation of 16 _α -Hydroxyöstron in cells transformed with papilloma virus (s. Table). Formation of 16 _α -Hydroxyöstron in cells transformed with papilloma virus 16 No. Type of cells % 16 _α- hydroxyestrone in mkg of cell protein estradiol Estradiol + cervicon 1 CaSki Papillomavirus (+) 16.0 ± 0.1 2.2 ± 0.5 2 C 33-A papillomavirus (-) 0.08 ± 0.03 0.08 ± 0.08 3 Cervical epithelium 0.7 ± 0 0.5 ± 0.1 4 Cervical epithelium from transformed zones 12.6 ± 0.5 2.1 ± 0.3

Beispiel 4Example 4

Untersuchung der Induktion der Apoptosis von Zellen, die vom Papillomavirus in Anwesenheit des Präparates nach Beispiel 2 transformiert wurden.examination induction of apoptosis of cells derived from papillomavirus in Presence of the preparation according to Example 2 transformed were.

Von uns wurde die Fähigkeit des Präparates untersucht, die Apoptosis von Zellen zu induzieren, die mit dem Papillomavirus infiziert wurden.From we were examined the ability of the drug to induce apoptosis of cells with the papillomavirus were infected.

Für die quantitative Bewertung der Zellüberlebensfähigkeit sowie des Anteils an Zellen, die sich in der Apoptosis befinden, wurde eine Kombination von zwei Farbstoffen verwendet: 1) bromhaltiges Ethydium, das in Zellen mit beschädigter Membran (d. h. in tote und nekrotische Zellen) eindringt und deren Kerne Brillantorange (fast Rot) färbt, und 2) Akridinorange (Akridingelb), das lebende Zellen Brillantgrün färbt, und die Beobachtung der verschiedenen Phasen der Kondensierung von Chromatin und das Blebbing der Membran ermöglicht. In den Zellen, die sich in den späteren Stadien der Apoptosis befinden, werden brillantorange Bereiche von kondensierten Chromatins im Kern beobachtet, was sie von nekrotischen Zellen unterscheidet, die gleichmäßig orange gefärbt sind. Der Anteil der Zellen im Apoptosiszustand wurde prozentual im Verhältnis zu deren Gesamtanzahl berechnet.For the quantitative assessment of cell viability and the proportion of cells that are in apoptosis, a combination of two dyes was used: 1) bromine-containing Ethydium found in cells with damaged membrane (i.e. into dead and necrotic cells) and their kernels brilliant orange (almost red) colors, and 2) acridine orange (Akridingelb), the Living cells Brilliant green colors, and observation the different phases of the condensation of chromatin and that Blebbing of the membrane allows. In the cells that are to be located in the later stages of apoptosis observed bright orange areas of condensed chromatin in the nucleus, what makes them different from necrotic cells, evenly are colored orange. The proportion of cells in the apoptotic state was calculated as a percentage of their total number.

Zellen CaSki und C 33-A wurden mit dem Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33342 (Sigma) im Kulturmedium mit einer Konzentration von 5 mkl/ml bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert, dann in 2-prozentigen Paraformaldehyd bei Raumtemperatur 10 Minuten lang fixiert, dann wurden sie mit Phosphatsalzpuffer einmal gewaschen und mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops Opton analysiert.cell CaSki and C 33-A were labeled with the fluorescent dye Hoechst 33342 (Sigma) in the culture medium at a concentration of 5 mkl / ml Incubated at 37 ° C for 30 minutes, then in 2% paraformaldehyde fixed at room temperature for 10 minutes, then they were washed with Phosphate salt buffer washed once and using a fluorescence microscope Opton analyzed.

Wie Experimente gezeigt haben, wurden nach der 24-ständigen Inkubation von CaSki-Zellen im Kulturmedium, das das erfindungsgemäße Präparat (DIM-Endkonzentration 50 mkM) enthielt, im Gesichtsfeld über 50% Apoptosiszellen (s. 4A) beobachtet, während in der Zelllinie C 33-A bei gleichen Bedingungen der prozentuale Anteil an Zellen im Apoptosiszustand nicht mehr als 5% (4B) betrug: As experiments have shown, after the 24-hour incubation of CaSki cells in the culture medium containing the preparation according to the invention (final concentration of DIM 50 mcM), more than 50% apoptosis cells (see FIG. 4A ), while in the cell line C 33-A, under the same conditions, the percentage of cells in the apoptosis state is not more than 5% ( 4B ) amounted to:

Beispiel 5. Erforschung der Einwirkung auf genitale Kondylome.Example 5. Investigation of the action on genital condylomas.

Durchgeführt wurden auch Forschungen an Patientinnen mit der Diagnose „genitales spitzes Kondylom".Carried out also researches on patients diagnosed with "genital pointed condyle ".

Die Diagnostik wurde auf Basis zytologischer, histologischer Untersuchung von Gewebeproben, der Bestimmung von Papillomavirus-Antikörpern und der Ermittlung von Papillomavirus-DNS und des Onkoproteins E7 durchgeführt.The Diagnosis was based on cytological, histological examination of tissue samples, the determination of papillomavirus antibodies and identification of papillomavirus DNA and the oncoprotein E7 carried out.

Aus einer Gruppe von 25 Patientinnen wurden in ungefähr 90% der Fälle die genitalen Kondylome mit anderen urogenitalen Infektionen assoziiert. Ungefähr 10% der Patientinnen wurden vorher mit der Elektrokoagulationsmethode behandelt.Out In a group of 25 patients, approximately 90% of the cases the genital condylomas with other genitourinary ones Associated infections. About 10% of patients became previously treated with the electrocoagulation method.

15 Patientinnen wurden zweimal täglich Vaginalzäpfchen nach Beispiel 2 und 10 Patientinnen wurden Vaginalzäpfchen nach Beispiel 1 über einen Zeitraum von 10–12 Wochen bis genitale Warzen verschwunden waren, eingeführt. Bei einer Kontrolluntersuchung nach anderthalb Jahren gab es in der Hauptgruppe keine Rückfälle an spitzen Kondylomen, bei 3 Patientinnen wurden Rückfälle festgestellt. Es wurde zusätzliche Behandlung mit Dosensteigerung verordnet.Fifteen patients received vaginal suppositories according to Example 2 twice daily and 10 patients underwent vaginal suppositories according to Example 1 over a period of 10-12 weeks until genital warts disappeared were introduced. At one-and-a-half-year follow-up, there was no recurrence of acute condylomata in the main group, and relapse was noted in 3 patients. Additional treatment with dose increase was prescribed.

Schlüsseconclusions

Die von uns durchgeführten Forschungen ergaben, dass die neue Arzneimittelform Zervikon (Vaginalzäpfchen, die die Substanz Methindol (3,3'-Diindolylmethan – DIM) enthalten) eine hohe spezifische Antitumoraktivität gegen menschliche Epithelzellen hat, die mit dem Papillomavirus infiziert sind, wobei die Antitumoraktivität über folgende Mechanismen realisiert wird:

1. Zervikon hebt die östradiolabhängige Induktion des Onkogens E7 des Papillomavirus 16 auf, indem die hormonabhängige Proliferation von infizierten Zellen verhindert wird.
2. Zervikon normalisiert den Metabolismus von Östradiol in den Zellen, die mit dem Papillomavirus infiziert sind, indem die Bildung des karzinogenen Metaboliten 16_α-Hydroxyöstron verhindert wird, das die Expression von Onkogenen des Papillomavirus stimuliert.
3. Zervikon induziert die Apoptosisprozesse der mit dem Papillomavirus infizierten Zellen, wodurch ein selektiver Tod der Zellen mit Tumoreigenschaften ausgelöst wird.

Our research showed that the new drug form Zervikon (vaginal suppositories containing methindol (3,3'-diindolylmethane-DIM)) has a high specific antitumor activity against human epithelial cells infected with papillomavirus, with antitumour activity realized by the following mechanisms:

1. Zervikon abolishes the estradiol-dependent induction of papillomavirus 16 E7 oncogene by preventing the hormone-dependent proliferation of infected cells.
2. Zervikon normalizes metabolism of estradiol in cells that are infected with the papillomavirus by the formation of carcinogenic metabolites is prevented 16 _α -Hydroxyöstron that stimulates the expression of oncogenes of the papilloma virus.
3. Zervikon induces the apoptosis processes of papillomavirus-infected cells, causing selective death of cells with tumor properties.

Es gibt allen Grund zu glauben, dass das neue Präparat, das in Form von Vaginalzäpfchen lokal verwendet wird, im Vergleich zu oral einzunehmendem DIM (in der gleichen Endkonzentration) und seinem metabolischen Vorgänger (I3C), der im Magen-Darm-Trakt in DIM umgewandelt wird, eine größere Antitumor- und Antivirusaktivität gegen die mit Papillomavirus infizierten Zervikalzellen hat.It There is every reason to believe that the new drug, the in the form of vaginal suppositories is used locally, in comparison oral DIM (in the same final concentration) and its metabolic precursor (I3C), in the gastrointestinal tract converted into DIM, a major anti-tumor and antiviral activity against those infected with papillomavirus Has cervical cells.

Somit kann das Präparat zur Behandlung von dysplastischen Prozessen des Gebärmutterhalses empfohlen werden, die durch Papillomaviren bedingt sind. Außerdem gewährleisten die Vaginalzäpfchen die erforderliche Zeit bei hoher biologischer Zugänglichkeit des Wirkstoffes, wodurch es möglich ist die Vaginalzäpfchen bei schwer kurablen Pathologien wie genitalen Kondylomen, zu verwenden.Consequently The drug can be used to treat dysplastic processes of the cervix caused by papillomaviruses are conditional. In addition, the vaginal suppositories ensure the time required with high biological accessibility of the active substance, which makes it possible for the vaginal suppositories in hard-to-cure pathologies such as genital condylomas.

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Claims

An agent for the treatment of genital condylomata and neoplastic diseases of the reproductive organs in the form of a vaginal suppository, characterized in that the vaginal suppository comprises as active ingredient 3,3'-diindolylmethane, a lipophilic base substance which is solid confectionery fat, polyvinylpyrrolidone and butylhydroxianisole or butylhydroxitoluene, the agent has the following composition in percent by mass: 3,3'-diindolylmethane 2.0-6.0 polyvinylpyrrolidone 0.5-1.2 butylhydroxianisole or butylhydroxitoluene 0.3-0.5 lipophilic base radical.

Means according to claim 1, characterized in that the lipophilic raw material contains type A solid fat.