DE202006013102U1

DE202006013102U1 - Probenkammer für Untersuchungen zu Einflüssen auf Zellkulturen in Kege-Platte-Rheometern

Info

Publication number: DE202006013102U1
Application number: DE202006013102U
Authority: DE
Original assignee: MOS TECHNOLOGIES; Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Mos Technologies De; Odenthal-Schnittler Maria Dr De
Priority date: 2005-09-07
Filing date: 2006-08-25
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2016-08-26

Abstract

Probenkammer für Untersuchungen zu Einflüssen auf Zellkulturen in Platte-Kegel-Rheometern, die auf einer Kulturplatte in einer gasdichten und temperierten Umgebung angesiedelt sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenkammer einen gasdicht abgedichteten Probenraum (32) ausbildet, der den Bereich eines Scherspalts zwischen der Kulturplatte (1) und dem Kegel (2) einbezieht.

Description

Die Erfindung betrifft eine Probenkammer für Untersuchungen zu Einflüssen auf Zellkulturen in Kegel-Platte-Rheometern. Besonders interessante Anwendungen sind das Studium der Barrierefunktion, der Vitalität, der Migration, der Ausrichtung, der Integrität und der biochemischen Veränderungen von Epithel- und Endothelzellen als pathogenetischer Faktor unter dem Einfluss definierter Schubspannungen, Testmedien und Wirkstoffen.
Die Aufrechterhaltung eines konstanten Blutdrucks und Blutflusses ist eine wesentliche Voraussetzung für die Realisierung aller Körper- und Lebensfunktionen. Auf die Zellen des Blutgefäßsystems wirken unterschiedliche hämodynamische Kräfte. Wichtige Kräfte sind der Druck aufgrund der Füllung des Gefäßsystems und die Schubspannung (engl.: shear stress), hervorgerufen durch den Blutfluss. Der Druck wirkt auf die Endothelzellen, die als einschichtiges Plattenepithel die Blutgefäße auskleiden, und die darunter liegenden glatten Muskelzellen. Die tangentialen Schubspannungen wirken auf die Endothelzellen als Kraft pro Fläche. Ein veränderter Fluss wird von den Endothelzellen erkannt und zwecks Regulation des Blutflusses dem Gefäßmuskelzellen signalisiert.
Die Schubspannung im Gefäßsystem ist lokal unterschiedlich und kann bis etwa 10 Pa betragen. Es gibt Gefäßregionen mit hoher Schubspannung, aber auch Regionen, wo keine oder nur geringe Schubspannungen wirken. In einigen Regionen ändert sich die Schubspannung von laminar zu turbulent oder sogar bis zur Strömungsumkehr. Bevorzugt an diesen Stellen mit gestörten Flussbedingungen, wie Verengungen, Krümmungen oder Verzweigungen der Blutgefäße, können sich mit der Zeit atheriosklerotische Plaques ausbilden. Atheriosklerose ist eine weit verbreitete organische Störung des Herz-Kreislauf-Systems und zählt weltweit zu den häufigsten Todesursachen.
Zur Simulation von biomechanischen Kräften auf kultivierte Zellen wird ein in vitro System verwendet, das in Anlehnung an das Kegel-Platte-Prinzip eines Rheometers aufgebaut ist [1] [2] [3]. In der Probenkammer des Rheometers lassen sich gut in-vivo auftretende biomechanische Kräfte auf kultivierte Zellen simulieren, wodurch ein besseres Verständnis der Grundmechanismen, die auch in einer weit komplexeren in-vivo-Situation wirksam sind, möglich wird. Die Stärke der biomechanischen Stimulation durch Schubspannung ist in diesem Modell von der Viskosität des Kulturmediums, der Winkelgeschwindigkeit und dem Kegelwinkel abhängig. Durch Veränderung der Viskosität des Kulturmediums und durch Variation der Drehzahl des Kegels können die Strömungsverhältnisse in unterschiedlichen Blutgefäßen simuliert werden. Ein wesentlicher Vorteil des Kegel-Platte-Systems besteht in der Erzeugung von homogenen und definierten Schubspannungen, die auf den Zellrasen wirken. Die mit Hilfe des in vitro Modells gewonnenen Erkenntnisse über den Einfluss mechanischer Schubspannungen auf kultivierte Zellen, insbesondere auf die endotheliale Barrierefunktion kultivierter Zellen, kann in späteren Untersuchungen in vivo überprüft werden.
Nach [1] bis [3] werden Zellen auf einer planparallele Platte, die bio-verträglich beschichtet wurde und aus durchsichtigem Material wie Glas oder Kunststoff besteht, kultiviert und in die Probenkammer eingesetzt. Ein sich drehender Kegel aus gleichfalls durchsichtigem Material erzeugt in einem ringförmigen Areal genau definierte Schubspannungen. Dadurch, dass das Gesamtsystem durchsichtig ist, lassen sich während der Schubspannungsapplikationen die kultivierten Zellen filmen und ihre morphologischen u. a. Parameter bestimmen. Eine Probenkammer kann als Einzelgerät mit einem Mikroskop zusammenarbeiten oder es werden mehrere Probenkammern z. B. auf einem Rotationstisch oder linear angeordnet, welcher über einen Präzisions-Servomotor angetrieben wird. In letzterem Fall ist das Mikroskop auf einem Linearverschiebetisch positioniert und lässt sich mit höchster Wiederholgenauigkeit bewegen. Durch eine Anordnung der Probenkammern auf einem Rotationstisch und einem Mikroskop auf einem Linearverschiebetisch können in jeder Probenkammer beliebig viele Zellkulturareale wiederholt angefahren werden und über einen Autofokus Zeitraffer-Aufnahmen automatisiert aufgenommen werden. Außerdem lassen sich Software-gesteuert dynamische Parameter, wie Migrationsgeschwindigkeit nach Richtung und Zeit, Formänderungen der Zellen u. a. aus den Zeitraffer-Aufnahmen als Funktion der Zeit ermitteln. Mit Hilfe der elektrischen Impedanzspektroskopie, die an das rheologische System angepasst wurde, können noch weitergehende Untersuchungen an den Zellkulturen erfolgen, beispielsweise unmittelbar betreffend die Barrierefunktion von Epithelzellen, Mesothelzellen oder Endothelzellen (allgemein barrierebildende Zellen).
Ein Problem bei Langzeituntersuchungen ist, dass die Experimente bei einer gegenüber der Raumtemperatur erhöhten Temperatur (37°C) durchgeführt werden müssen. Dies führt bei Untersuchungen über mehrere Tage zum Austrocknen der nur wenige Milliliter Kulturmedium enthaltenden Probenkammer. Da der Inkubator, der das Rheometer aufnimmt, mechanische, optische und elektronische Bauteile enthält, die feuchtigkeitsempfindlich sind, ist es ungünstig, die Atmosphäre des Inkubators mit Wasserdampf zu sättigen, um eine Austrocknung der Proben- bzw. Scherflüssigkeit zu verhindern.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Probenkammer eines rheologischen Kegel-Platte-Systems zur Untersuchung von Strömungseinflüssen und Einflüssen von Stoffen auf kultivierte Zellen so zu verbessern, dass Langzeitmessungen an Zellkulturen ohne eine Wasserdampfatmosphäre und/oder ohne sonstige Gas- oder Wirksubstanzmedien in einem Inkubator möglich werden und ohne dass das Kulturmedium austrocknet, wodurch die Beobachtungsergebnisse und Messungen verfälscht würden. Bevorzugt sollen dabei sowohl das externe Anziehen von Zellkulturen als auch die Langzeitmessungen auf ein und derselben Kulturplatte bequem möglich werden.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst, indem zur Verbesserung der Bedingungen bei Langzeitbeobachtungen der Probenraum der Probenkammer selbst geeignet gasdicht abgedichtet wird. Vorteilhafte Ausbildungen der Erfindung geben die Unteransprüche an.
Anhand eines Ausführungsbeispiels soll die Erfindung näher erläutert werden. In den zugehörigen Zeichnungen zeigen:
1 einen Kegel eines Kegel-Platte-Systems einer Probenkammer,
2 eine im Zentrum und am Rand mit Metall bedampfte Kulturplatte des Kegel- Platte-Systems der Probenkammer von der Seite gesehen,
3 die Kulturplatte nach 2 von oben gesehen,
4 einen Schnitt durch eine schematisiert dargestellte Probenkammer mit Fußring,
5 eine perspektivische Ansicht der Probenkammer mit Fußring ohne Kegeleinsatz und
6 eine Explosionsdarstellung der Probenkammer mit Fußring, Antrieb für den Kegeleinsatz und Stativarm.
In 1 ist schematisch ein vorzugsweise durchsichtiger Kegel 2 eines Kegel-Platte-System gezeigt.
2 zeigt die zugehörige exakt planparallele, kreisrunde Kulturplatte 1, vorzugsweise gleichfalls aus einem durchsichtigen Isoliermaterial. Im Zentrum und am Außenrand der Kulturplatte 1 ist eine sehr dünne Sperrschicht 4 aufgebracht. Als Material für die Sperrschicht 4 eigenen sich sowohl Kunststoffe als auch Metalle. Bevorzugt wird eine Metallschicht aufgedampft, wobei sich aufgrund der Korrosionsfestigkeit insbesondere Gold und Titan anbieten, wobei letzteres außerdem den Vorzug einer extremen Kratzfestigkeit besitzt. Die Sperrschicht 4 hat eine Stärke von ungefähr der mittleren Dicke der zu beobachtenden Zellen, im Beispiel Endothelzellen, welche während ihrer Anzucht, begrenzt von der Sperrschicht 4, ein ringförmiges Zellkulturareal 3 bilden. Hierzu kann der ringförmige Bereich zuvor mit einer hauchdünnen (100 bis 200 nm) Schicht 3 bio-verträglich präpariert sein. Die Sperrschicht verhindert ein unerwünschtes Zellwachstum ohne Störungen der Zellkultur über das ringförmige Zellkulturareal 3 hinaus, was insbesondere für Langzeituntersuchungen von Bedeutung ist.
Der durchsichtiger Kegel 2 mit einem sehr kleinen Platte-Kegel-Winkel α von beispielsweise 2,5° rotiert, angetrieben von einem hier nicht dargestellten Rotor, über der Kulturplatte 1, wobei die Kegelspitze im Zentrum der Kulturplatte 1 aus Gründen des Verschleißes wenige Mikrometer oberhalb der Sperrschicht 4 gelagert ist. Ein hier nicht dargestellter Wall begrenzt während der Versuche ein flüssiges Kulturmedium, welches, vom Kegel 2 in Drehung versetzt, eine definierte laminare Schubspannung τ auf die Zellkultur ausübt, da die Schubspannung τ auf die Zellkultur nach der bekannten rheometrischen Kegel-Platte-Beziehung τ = μ ω/αmit μ: Viskosität des Kulturmediums, ω: Winkelgeschwindigkeit des Kegels und α: Platte-Kegel-Winkel konstant ist.
Das Verhalten einer Zellkultur bei unterschiedlichen, frei definierbaren bis gegenläufigen Schubspannungsprofilen, Schubspannungspulsen sowie unterschiedlichen Medien und Wirkstoffen lässt Schlüsse auf die Vitalität, Migration, Ausrichtung, Integrität und biochemische Veränderungen der Endothelzellen zu. Insbesondere werden Schubspannungen appliziert, die typisch für venöse (0,1 PA) oder unterschiedliche arterielle (1,5–3,0 PA) Gefäße sind.
In 3 ist die Kulturplatte 1 nochmals in der Draufsicht dargestellt. Das Zentrum und der äußere Ring sind mit einer Metallschicht als Sperrschicht 4 bedampft. Mit 5 sind Übergänge von der Sperrschicht 4 zum Trägermaterial der Kulturplatte 1 bezeichnet. Die Sperrschicht 4 gibt die Grenze für das Zellwachstums der Zellen und damit des Zellkulturareals 3 vor. Das Zentrum und der Randbereich der Kulturplatte 1 bleiben frei von Zellen. Das Zellkulturareal 3 wächst entsprechend 2 ringförmig. Das Sperrschichtmuster der Sperrschicht 4 gemäß 2 und 3 bewirkt, dass der Kegel 2 keine Zellen beschädigen kann.
4 zeigt den prinzipiellen Aufbau einer Probenkammer des Rheometers.
Ein Fußring 10 nimmt einen ringförmigen Kulturplattenträger 11 der Probenkammer auf, auf dem seinerseits die kreisrunde Kulturplatte 1 fixiert ist. Der hochgezogene Rand des Kulturplattenträgers 11 bildet gleichzeitig einen Wall für das Kulturmedium, welches durch den Kegel 2 in Rotation versetzt wird und Scherspannung auf die Zellkultur ausübt. Der Kegel 2 rotiert je nach Programm mit einer beliebig einstellbaren gleichförmigen Geschwindigkeit, einem beliebig einstellbaren Geschwindigkeitsprofil, einem beliebig einstellbaren Impulsmuster und/oder in gegenläufigen Drehrichtungen.
Entsprechend ändert sich die Scherspannung. Unter Zwischenschaltung eines gummielastischen Dicht- und Fixierrings 12 wird von oben ein Ringeinsatz 13 auf den Kulturplattenträger 11 gesteckt. Der Kulturplattenträger 11 und der Ringeinsatz 13 sind somit leicht lösbar werkzeuglos verbunden.
Auf dem Ringeinsatz 13 ist eine Dichtung, im Beispiel ein Lippendichtring 14, mit Hilfe eines Anpressrings 15 und mehreren Schrauben 16 befestigt. Nach einer Ausführungsvariante bildet der Kulturplattenträger 11 mit dem Ringeinsatz 13 ein einteiliges Formteil, wobei dann der Dichtlippenring 14 direkt auf dem Flansch dieses Formteils geklemmt ist und eine gasdichte Abdichtung des Probenraums 32 schafft, welcher den Scherspalt zwischen der Kulturplatte 1 und dem Kegel 2 einbezieht. Nach anderen Ausführungsformen ist der Ringeinsatz 13 aus mehreren Formteilen gebildet. Der Lippendichtring 14 verhindert, dass bei Langzeituntersuchungen eine Austrocknung des Kulturmediums erfolgt, was die Messungen verfälschen würde. Diese Dichtung ist so angeordnet, dass sie ein leichtes Auswechseln der Kulturplatte 1 erlaubt, da es wünschenswert ist, die Zellkultur in einem Brutschrank zu züchten und möglichst ungestört in die Probenkammer des rheologischen Systems einzuführen. Ein Umsetzen der Zellkultur von einer Unterlage auf eine andere würde zu unerwünschten Veränderungen der Zellen führen.
Der Kegel 2 sitzt in einem flanschringförmigen Kegelhalter 17. Der Kegelhalter 17 hält sich magnetisch am nicht näher dargestellten Rotor, wobei zwei Mitnehmer 18 in den Rotor eingreifen. Der Kegelhalter 17 taucht in den Ringraum des Ringeinsatzes 13 ein. Die Lippendichtring 14 dichtet den Probenraum 32 nach außen hin ab, wodurch sich das Kulturmedium im Probenraum 32 über mehrere Tage halten kann ohne einzutrocknen. Andererseits erlaubt der weichelastische Lippendichtring 14 die Rotation des Kegelhalters 17 und damit des Kegels 2. Selbstverständlich kann anstelle eines Lippendichtrings 14 jedes andere geeignete Dichtmittel eingesetzt werden, beispielsweise eine Labyrinthdichtung. An einer oder mehreren Stellen führen radial durch den Ringeinsatz 13 feine Kanäle 19, durch welche, beispielsweise über Kanülen, gasförmige oder flüssige Zusätze in den Probenraum 32 hineingepumpt oder abgesaugt werden können. Im Fuß ring 10, im Ringeinsatz 13 oder im Kulturplattenträger 11 kann außerdem eine Temperaturgeregelte Heizung 20 zum Temperieren des Probenraums 32 integriert sein.
Für ein Einsetzen oder Herausnehmen der Kulturplatte 1 wird unter leichtem Druck der Hände die Verbindung zwischen dem Kulturplattenträger 11 und dem Ringeinsatz 13 gelöst, wobei der Dicht- und Fixierring 12 nachgibt, oder es wird die gesamte Baugruppe herausgenommen. Je nach Arbeitsweise wird der Kulturplattenträger 11 mit dem Ringeinsatz 13 und der Kulturplatte 1 oder nur die Kulturplatte 1 entnommen oder eingelegt. Bei einer Variante, bei der der Kegelhalter 11 und der Ringeinsatz 13 ein Formteil als Ganzes bilden, wird dieses Formteil 11/13 entnommen. Die Kulturplatte 1 allein kann außerdem auch nach dem Abheben des Kegelhalters 17 entnommen werden, da sie durch die Öffnung des Lippendichtrings 14 hindurchpasst. Mit dem Pfeil ist eine nicht näher dargestellte Optik angedeutet, die das Beobachten der Zellen während der Versuche erlaubt. Die Kulturplatte 1 ist in vorteilhafter Weise – wie anhand der 2 und 3 beschrieben – hergerichtet.
Für spezielle Untersuchungen, wie zur Barrierefunktion von Epithel- und Endothelzellen als pathogenetischer Faktor unter dem Einfluss definierter Schubspannungen, kann die Kulturplatte 1 auch in der Weise modifiziert werden, dass Messungen des transzellularen elektrischen Widerstandes einer Zellkulturprobe in einem Kulturmedium möglich sind. Derartige Messungen lassen unabhängig von optischen Beobachtungen und Zeitraffer-Filmaufzeichnungen auch elektrisch detektierbare Änderungen in der Barrierefunktion von Endothel- oder Epithel-Mesothelzellen unter unterschiedlichsten Bedingungen zu.
Hierzu werden gemäß 5, die eine zusammengebaute Probenkammer auf einem Fußring 10 des Rheometers in perspektivischer Ansicht zeigt, auf die Kulturplatte 1 aus Isolierstoff (Glas) beispielsweise drei radial abstehende Außenelektroden 21 und eine zentrale Gegenelektrode 22 aufgedampft. Auf der Kulturplatte 1 wird eine Zellkultur gezüchtet, die in vorteilhafter Weise durch die anhand der 1 bis 2 beschriebenen Maßnahmen im Areal begrenzt wird. Die aufgedampften Metall-Elektroden (Gold) 21, 22 haben beispielsweise eine Schichtdicke von 200–300 nm. Die Elektroden 21, 22 sind mit Anschlüssen kontaktiert, die an ein Impedanz-Messgerät geführt sind, wobei eine Wechselspannung (10 Hz–1 MHz) angelegt wird. Mit Hilfe eines Vergleichsschaltkreises kann der transendotheliale oder ggf. transepitheliale Widerstand der Zellschicht unter Schubspannung gemessen werden, der auf eine mehr oder weniger intakte Barrierefunktion der Zellen im Zellkulturareal 3 schließen lässt, die in einem Kulturmedium auf der Kulturplatte 1 der Schubspannung ausgesetzt sind. Mit Hilfe eines Computers und einer speziellen Software erfolgt die Aufzeichnung und Auswertung der Messergebnisse, wie über die Migrationsgeschwindigkeit und Formänderung der Zellen. Über Kapillaren 19 durch entsprechende Kanäle können wiederum je nach Versuch unterschiedliche Kulturmedien oder Wirkstoffe der Zellprobe zugesetzt oder abgeführt werden. Da die Zellprobe gasdicht umschlossen und temperiert ist, lassen sich auch Langzeituntersuchungen mit Gasen über mehrere Tage anstellen, wie zum Beispiel mit potentiell toxischen Gasen oder unter hypoxischen Bedingungen.
Die Bauteile der Probenkammer gemäß 5 sind im Vergleich zum Schnitt nach 4 baukastenartig speziell für Untersuchungen auf der Grundlage von Messungen des elektrischen Widerstandes eines einschichtigen Plattenepithels zusammengestellt. In den Fußring 10 ist der Kulturplattenträger 11 eingelegt, der die Kulturplatte 1 trägt, deren Rand von einem Begrenzungsring 23 begrenzt ist. Die Kulturplatte trägt die Außenelektroden 21 und unter Einhaltung eines Isolationsabstandes die zentrale Gegenelektrode 23. Der Ringeinsatz 13 trägt eine elektrische Kupplung, zu der Leiterbahnen von den Elektroden 21, 22 führen. Der Lippendichtring 14 ist zwischen den Ringeinsatz 13 und den Anpressring 15 geklemmt. Durch Kanäle im Ringeinsatz 13 führen Kapillaren 19 für eine Versorgung des Probenraums während der Untersuchungen mit Medien oder Wirkstoffen. In 4 ist der Kegelhalter 17 nicht eingesetzt.
6 zeigt Einzelheiten zum Aufbau des Rheometers unter Verwendung der Probenkammer mit einer Elektroden-bedampften Kulturplatte 1 nach 5 in Explosionsdarstellung. Das Rheometer besitzt einen oberen Stativarm 31 und einen unteren Fußring 10. In den unteren Fußring 10 ist der Kulturplattenträger 11 der Probenkammer eingelegt. Der Kulturplattenträger 11 nimmt die exakt planparallele, kreisrunde Kulturplatte 1 auf, welche wie oben stehend beschrieben hergerichtet ist. Das heißt, die Kulturplatte 1 trägt drei radial abstehende Außenelektroden 21 und eine großflächige Gegenelektrode 22, die gleichfalls herausgeführt ist. Außerdem sind die bereits beschriebenen Maßnahmen zur Begrenzung eines ringförmigen Zellkulturareals 3 getroffen. Den Rand der Kulturplatte 1 begrenzt der Begrenzungsring 23 aus Isolierstoff, der auf die Kulturplatte 1 aufgeklebt ist. Dieser Begrenzungsring 23 verhindert den Kurzschluss der Elektroden 21, 22. Auf der Kulturplatte 1 liegt außerdem ein Abstandsring 24 aus Isolierstoff auf, auf dem seinerseits eine Ringplatine 25 liegt. Die Leiterzüge der Ringplatine 25 kontaktieren die Elektroden 21, 22. Auf der Ringplatine 25 liegt eine flache Isolierringscheibe 26, die die Ringplatine 25 elektrisch von dem Ringeinsatz 13 trennt. Der Ringeinsatz 13 trägt in dieser Ausführung Kontaktstifte 27, die die Ringplatine 25 kontaktieren und Leiterzüge, die zu dem elektrischen Steckerteil 28 führen. Über Kapillaren 19 in den Kanälen des Ringeinsatzes 13 ist der Probenraum 32 von außen zugänglich für die Zu- und Abfuhr von Medien und Wirkstoffen. Der Kulturplattenträger 11 ist mit dem Ringeinsatz 13 über den Dicht- und Fixierring 12 lösbar verbunden. Damit sind wiederum leichte Zugänglichkeit und Auswechselbarkeit bezüglich der Kulturplatte 1 gegeben, das heißt, die Zellkultur lässt sich auf der Kulturplatte 1 außerhalb des rheologischen Systems in einem Brutschrank züchten. Auf den Ringeinsatz 13 ist der schon beschriebene Lippendichtring 14 mit Hilfe des Anpressrings 15 und Schrauben 16 gespannt, der die gasdichte Abdichtung des Probenraums 32 gegenüber dem Kegelhalter 17 und damit nach außen besorgt und dennoch die Rotation des Kegelhalters 17 zulässt. Der durchsichtige Kegel 2 ist in den Kegelhalter 17 eingepasst. Der Kegelhalter 17 lässt sich aus dem hohlen Ringeinsatz 13 leicht herausnehmen und wieder einsetzen, weil der Lippendichtring 14 sehr weich ist. Mit Hilfe von kleinen Dauermagneten 29 wird der Kegelhalter 17 an dem Rotor 30 gehalten, wobei die beiden Mitnehmer 18 für Form- und Kraftschluss zum Rotor 30 sorgen. Der den Rotor 30 treibende Antrieb ist im Stativarm 31 des Rheometers untergebracht.
Für rein optische Beobachtungen lässt sich zuletzt der beschriebene Aufbau baukastenartig entsprechend modifizieren, das heißt, die speziellen Bauteile für optische und elektrische Untersuchungen sind auswechselbar, abrüstbar und aufrüstbar, so dass grundsätzlich mit ein und demselben Rheometer gearbeitet werden kann.
Zitierte Literaturstellen:

[1] M. H. Buschmann, P. Dieterich, N. A. Adams, H.-J. Schnittler. 2005. Analysis of Flow in a Cone-and-Plate apparatus With Respect to Spatial and Temporal Effects on Endothelial Cells. Biotechnology an Bioengineering. 89: 493–502.
[2] H.J. Schnittler, R.P. Franke, U. Akbay, C. Mrowietz, D. Drenckhahn. 1993. Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells. Am. J Physiol. 265: C 289–98.
[3] J. Seebach, P. Dieterich, F. Luo, H. Schillers, D. Vestweber, H. Oberleithner, H.J. Galla, and H.J. Schnittler. 2000. Endotherial Barrier Function under Laminar Fluid Sher Stress. Laboratory Investigation, 80; 1819–31;

1: Kulturplatte
2: Kegel
3: ringförmiges Zellkulturareal
4: Sperrschicht
5: Sperrschichtrand
10: Fußring
11: Kulturplattenträger
12: Dicht- und Fixierring
13: Ringeinsatz
14: Lippendichtring
15: Anpressring
16: Klemmschraube
17: Kegelhalter
18: Mitnehmer
19: Kanal, Kapillare
20: Heizung
21: Außenelektrode
22: Gegenelektrode
23: Begrenzungsring
24: Abstandsring
25: Ringplatine
26: Isolierringscheibe
27: Kontaktstifte
28: elektrische Kupplung
29: Dauermagnet
30: Rotor
31: Stativarm
32: Probenraum mit Scherspalt zwischen Kegel und Platte

Claims

Probenkammer für Untersuchungen zu Einflüssen auf Zellkulturen in Platte-Kegel-Rheometern, die auf einer Kulturplatte in einer gasdichten und temperierten Umgebung angesiedelt sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenkammer einen gasdicht abgedichteten Probenraum (32) ausbildet, der den Bereich eines Scherspalts zwischen der Kulturplatte (1) und dem Kegel (2) einbezieht.
Probenkammer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Kegel (2) in einem Kegelhalter (17) fixiert ist, dass die Kulturplatte (1) auf einem Kulturplattenträger (11) fixiert ist und dass eine Dichtung (14) den Ringspalt zwischen dem Kulturplattenträger (11) und dem Kegelhalter (17) – oder den Ringspalt zwischen einem mit dem Kulturplattenträger (11) gasdicht verbundenen Ringeinsatz (13) und dem Kegelhalter (17) – gasdicht abdichtet.
Probenkammer nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichtung (14) als weichelastischer Lippendichtring (14) ausgeführt ist, der am Kulturplattenträger (11) oder am Ringeinsatz (13) befestigt ist.
Probenkammer nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Kulturplattenträger (11) mit dem Ringeinsatz (13) einteilig ist oder über einen leicht lösbaren Dicht- und Fixierring (12) geklemmt ist.
Probenkammer nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in einen Fußring (10) für die Probenkammer, in den Kulturplattenträger (11) und/ oder in den Ringeinsatz (13) eine Temperatur-geregelte Heizung 20 zum Temperieren des Probenraums (32) integriert ist.
Probenkammer nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Kegel (2) und die Kulturplatte (1) aus durchsichtigem Material (Glas, Plexiglas) sind und optische Beobachtungen zulassen.
Probenkammer nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf die Kulturplatte (1) nach außen geführte Elektoden (21, 22) aufgedampft sind, welche Messungen des transzellularen elektrischen Widerstandes eines Zellkulturmediums erlauben.
Probenkammer nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Ringplatine (25) die Anschlüsse der Elektroden (21, 22) abgreift und zu einer an einem Ringeinsatz (13) befestigten elektrischen Kupplung (28) führt.
Probenkammer nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in den Probenraum (32) mindestens eine Kapillare (19) für ein zu- oder abzuzuführendes Gas- oder Wirksubstanzmedium führt.
Probenkammer nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturplatte (1) eine Sperrschicht (4) trägt, die ein ringförmiges Zellkulturareal (3) begrenzt.