DE202004012163U1 - System for hybridizing immobilized nucleic acid samples, in sealed hybridizing chambers, has a pressure assembly to build up the chamber pressures over ambient atmospheric levels to prevent the formation of air bubbles - Google Patents

System for hybridizing immobilized nucleic acid samples, in sealed hybridizing chambers, has a pressure assembly to build up the chamber pressures over ambient atmospheric levels to prevent the formation of air bubbles

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Abstract

A system (1) with hybridizing chambers (5), to hybridize immobilized specimens on carriers (27), having chambers which are defined by the gap between the carrier and a cover (26), and which can be filled with a fluid, is new. The cover seals the chambers against the ambient air. A system (1) with hybridizing chambers (5), to hybridize immobilized specimens on carriers (27), having chambers which are defined by the gap between the carrier and a cover (26), and which can be filled with a fluid, is new. The cover seals the chambers against the ambient air. The system has a pressure assembly to build up the pressures within the chambers by 100 mbar to 1.4 bar over the ambient atmospheric level, to prevent the formation of air bubbles. The pressure is supplied by a pump (8) or a pressure gas bottle, linked to the chambers by pressure lines (10,11) with valves (12).

Description

  • Die Erfindung betrifft gemäss dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs 1 ein System mit Hybridisierkammern zum Hybridisieren von auf Objektträgern immobilisierten Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten. The invention relates according to the preamble of independent claim 1, a system with Hybridisierkammern for hybridizing nucleic acid samples immobilized on slides, proteins, or tissue sections. Dabei ist jede Hybridisierkammer als ein im wesentlichen spaltförmiger, mit einer Flüssigkeit im wesentlichen befüllbarer Raum zwischen einem dieser Objektträger und einem Deckel definiert. In this case, each Hybridisierkammer as a substantially gap-shaped, defined by a liquid-fill substantially the space between one of these slides, and a lid. Je ein Deckel ist derart gegenüber einem Objektträger angeordnet, dass die Hybridisierkammer gegenüber der Umgebungsluft abgedichtet ist. A respective cover is arranged opposite an object support that the Hybridisierkammer is sealed from the ambient air. Ein solches System umfasst eine Einrichtung zum Verhindern von Luftblasen in den Hybridisierkammern. Such a system includes a means for preventing air bubbles in the Hybridisierkammern. Die Erfindung betrifft zudem, gemäss dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs 12, ein entsprechendes Verfahren zum Verhindern von Luftblasen in den Hybridisierkammern eines Systems zum Hybridisieren von auf Objektträgern immobilisierten Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten. The invention also relates to, according to the preamble of independent claim 12, a corresponding method for preventing air bubbles in the Hybridisierkammern a system for hybridizing nucleic acid samples immobilized on slides, proteins, or tissue sections. Gemäss diesem Verfahren werden alle im wesentlichen spaltförmigen, zwischen einem dieser Objektträger und einem Deckel angeordnete Hybridisierkammern mit einer Flüssigkeit im wesentlichen gefüllt. According to this method will all substantially slot-shaped, between one of these slides, and a lid arranged Hybridisierkammern filled with a liquid substantially. Dabei wird der Deckel derart gegenüber dem Objektträger angeordnet, dass die Hybridisierkammer gegenüber der Umgebungsluft abgedichtet ist. In this case, the cover is arranged opposite the slide, that the Hybridisierkammer is sealed from the ambient air.
  • Die Verwendung von DNA-Proben (DNA = Desoxyribosenukleinsäure) und insbesondere von Mikroarrays solcher Proben stellt der Forschung eine wichtige Technik zur gleichzeitigen bzw. simultanen Analyse von Tausenden von Genen zur Verfügung. The use of DNA probes (DNA = Desoxyribosenukleinsäure) and especially of microarrays of such samples, the research an important technique for the simultaneous or simultaneous analysis of thousands of genes are available. Diese Technik umfasst die Immobilisierung von DNA-Proben aus vielen Genen auf einer festen Substrat-Oberfläche, wie zB auf einem gläsernen Objektträger für ein Lichtmikroskop. This technique involves the immobilization of DNA samples from many genes on a solid substrate surface, such as on a glass slide for a light microscope. Die DNA-Proben werden bevorzugt in einem Array von Probenflecken oder "spots", dh in einem zweidimensionalen Gitter auf dem Substrat angeordnet und man kann später – ausgehend von einer bestimmten Position innerhalb eines solchen Arrays auf den Ursprung der entsprechenden DNA-Probe zurückschliessen. The DNA samples are preferably ie arranged in a two-dimensional grid on the substrate and can be later in an array of sample spots or "spots", - starting back close of a particular position within such an array to the origin of the corresponding DNA sample. Die Technik umfasst typischerweise die Kontaktierung des DNA-Proben-Arrays mit RNA-Muster-Suspensionen bzw. -Lösungen (RNA = Ribosenukleinsäure) um damit spezifische Nukleotidsequenzen in den DNA-Proben nachzuweisen. The technique typically comprises contacting the DNA sample arrays with RNA Pattern suspensions or solutions (RNA = Ribosenukleinsäure) in order to detect specific nucleotide sequences in the DNA samples. Typischerweise werden auch Muster-Suspensionen verwendet, welche DNA, cDNA und/oder Proteine bzw. Polypeptide enthalten. Typically also pattern suspensions are used which contain DNA, cDNA and / or proteins or polypeptides.
  • RNA-Muster können mit einem sogenannten "tag" oder "label", dh einem Molekül versehen sein, welches zB ein Fluoreszenzlicht mit einer spezifischen Wellenlänge aussendet. RNA samples can with a so-called "tag" or "label", ie a molecule be provided, for example, which emits a fluorescent light having a specific wavelength. Immobilisierte Proben können auch aminosäurehaltige (zB Proteine, Peptide) oder nukleinsäurehaltige (zB cDNA, RNA) Proben umfassen. Immobilized samples may also include amino acid-containing (eg, proteins, peptides) or nucleic acid-containing (eg, cDNA, RNA) include samples. Zu den immobilisierten Proben zugegebene Muster können beliebige Moleküle bzw. chemische Verbindungen umfassen, welche mit den immobilisierten Proben hybridisieren oder sich sonstwie mit diesen verbinden. added to the immobilized test sample may include any molecules or chemical compounds which hybridize to the immobilized samples or otherwise connect to these.
  • Unter guten experimentellen Bedingungen hybridisieren bzw. binden die RNA-Muster an die immobilisierten DNA-Proben und bilden mit diesen zusammen hybride DNA-RNA-Stränge. Under good experimental conditions hybridize or bind to the RNA sample to the immobilized DNA samples, and form together with these hybrid DNA-RNA strands. Für jede der immobilisierten DNA-Proben und für spezielle RNA-Muster kann man Unterschiede in der Hybridisierung unter den DNA-Proben durch die Messung der Intensität und der Wellenlängenabhängigkeit der Fluoreszenz jedes einzelnen Mikroarray-Elements feststellen und so herausfinden, ob der Grad der Genexpression in den untersuchten DNA-Proben variiert. For each of the immobilized DNA samples, and for specific RNA-pattern can be observed differences in hybridization among DNA samples by measuring the intensity and the wavelength dependence of fluorescence of each microarray element and find out as to whether the level of gene expression in varies the analyzed DNA samples. Mit der Verwendung von DNA-Mikroarrays können somit über die Expression von grossen Mengen von Genen und über deren Expressionsmuster umfassende Aussagen gemacht werden, obwohl nur geringe Mengen an biologischem Material eingesetzt werden müssen. With the use of DNA microarrays comprehensive statements can be made thus on the expression of large amounts of genes and their expression patterns although only small amounts need to be used on biological material.
  • DNA-Mikroarrays haben sich als erfolgreiche Werkzeuge etabliert und die Geräte zur Durchführung der DNA-Hybridisierung wurden laufend verbessert (vgl. zB DNA microarrays have established themselves as successful tools and equipment to perform DNA hybridization were continuously improved (see. Eg US 6,238,910 US 6,238,910 oder or EP 1 260 265 A1 EP 1260265 A1 des Anmelders der aktuellen Patentanmeldung). the assignee of the present patent application). Diese Dokumente offenbaren eine Vorrichtung zum Bereitstellen eines Hybridisierraums für die Hybridisierung von Nukleinsäureproben auf einem Objektträger. These documents disclose a device for providing a hybridization chamber for the hybridization of nucleic acid samples on a slide. Diese Vorrichtungen sind gegenüber dem Objektträger bewegbar ausgebildet und umfassen eine ringförmige Dichtung oder Dichtfläche zum Abschliessen des spaltförmigen Hybridisierraums gegenüber der Umgebungsluft, wobei durch die Dichtung oder Dichtfläche eine Oberfläche dieses Objektträgers beaufschlagt wird. These devices are designed to be movable relative to the slide and comprise an annular seal or sealing surface for closing the gap-shaped hybridization chamber relative to the ambient air, wherein a surface of this slide is urged by the seal or sealing surface. Zudem umfasst diese Vorrichtungen Leitungen zum Zu- bzw. Ableiten von Medien in den Hybridisierraum hinein bzw. aus dem Hybridisierraum heraus sowie eine Probenzuführung. In addition, these devices comprising ducts for supplying or extracting media into the hybridization chamber into or out from the hybridization chamber and a sample feed. Eine verbesserte Temperaturkontrolle und eine Bewegung der Flüssigkeit mit zB RNA-Mustern gegenüber auf dem Objektträger immobilisierten DNA-Proben ist ebenfalls offenbart. An improved temperature control and movement of the liquid with, for example, RNA samples over immobilized on the slide DNA samples is also disclosed.
  • Es kommt einerseits immer wieder vor, dass Luftblasen beim Einfüllen von Flüssigkeiten oder auch später in der Hybridisierkammer entstehen. It comes on the one hand again and again that air bubbles during filling of liquids or arise later in the Hybridisierkammer. Andererseits wurde versucht (vgl. zB On the other hand, an attempt was made (see. Eg US 6,186,659 US 6,186,659 ), Luftblasen gezielt als Agitationsmittel einzusetzen, um in der Hybridisierkammer eine gründlichere Durchmischung der Reagenzien zu erzielen. ) To use bubbles targeted as a means of agitation to achieve a more thorough mixing of the reagents in the Hybridisierkammer. Im allgemeinen sind aber im Hybridisiermedium anwesende Luftblasen nicht erwünscht, weil diese den meist sehr dünnen Flüssigkeitsfilm über den immobilisierten Proben stören. But in general present in the Hybridisiermedium bubbles are not desirable because they interfere with the usually very thin liquid film on the immobilized samples. Dies kann zu einer Inhomogenität der Verteilung von Reagenzien im Hybridisiermedium und damit zu einer Verfälschung der Hybridisier-Resultate führen; This can lead to an inhomogeneity of the distribution of reagents in Hybridisiermedium and to a distortion of Hybridisier-results; schlimmstenfalls verdrängen grössere Luftblasen sogar das Hybridisiermedium von Teilen der auf dem Objektträger immobilisierten Proben. at worst, large air bubbles displace even Hybridisiermedium of parts of the immobilized on the slide specimen.
  • Aus dem Stand der Technik sind zudem zahlreiche Methoden bekannt, um das spontane Auftreten von Luftblasen oder das Verbleiben derselben in der Kammer zu behindern. Numerous methods also are known from the prior art to hinder the spontaneous occurrence of air bubbles or remaining the same in the chamber. So wurde zB ein nichtparalleles Anordnen der die Hybridisierkammer definierenden Objektträger und Deckel vorgeschlagen (vgl. Thus a non-parallel arrangement of the Hybridisierkammer defining slides and cover proposed (see, for example, was. US 5,922, 591 US 5,922, 591 ), oder die Hybridisiermedien werden während dem ganzen Hybridisierprozess aus der Kammer hinaus und wieder hinein befördert. ), Or the Hybridisiermedien be transported during the entire Hybridisierprozess out of the chamber and back into it. Das Beimischen von Agenzien zu dem Hybridisiermedium, welche die Oberflächenspannung reduzieren oder das Behandeln der Oberflächen der Kammer mit wasserabstossenden chemischen Verbindungen mit dem Ziel, die Bildung von Luftblasen zu behindern, ist ebenfalls bekannt. The admixing of agents to the Hybridisiermedium which reduce the surface tension or treating the surfaces of the chamber with water-repellent chemical compounds with the aim of blocking the formation of air bubbles is also known.
  • Aus Out US 6,458,526 US 6,458,526 ist eine Anordnung bekannt, mir welcher in den Hybridisierraum hineinragende „Blasenhälften 140" aus einem mit Lösungsmittel gesättigten Gas erzeugt werden. Es handelt sich bei diesen „Blasenhälften" eigentlich um kalottenförmige Grenzflächen von Gasräumen mit einem definierten Krümmungsradius. discloses an arrangement, which projects into the hybridization "bubble halves 140" are generated from a solvent-saturated gas me. It is in these "bubble halves" actually to dome-shaped boundary surfaces of gas chambers with a defined radius of curvature. Diese „Blasenhälften" befinden sich an definierten Stellen der Kammer, wo sie die Hybridisierung der Proben nicht stören können. In einem vom Hybridisierraum abgetrennten Kompartiment befindet sich ein Lösungsmittel 160, welches im Hybridisiermedium enthalten ist. Über diesem Lösungsmittel wird eine gesättigte Atmosphäre 150 aufrecht erhalten, welche konstant mit den Gasräumen hinter den „Blasenhälften 140" verbunden ist (vgl. This "bubble halves" are located at defined points of the chamber where they can not interfere with hybridization of the samples. In a separated from the hybridization compartment is a solvent 160 is contained in Hybridisiermedium. About this solvent is maintained 150 a saturated atmosphere which is constantly connected to the gas spaces behind the "bubble halves 140" (see FIG. 2 2 in in US 6,458,526 US 6,458,526 ). ). Damit wird konstant eine mit dem Lösungsmittel gesättigte Atmosphäre an die kalottenförmigen Grenzflächen gebracht und dadurch der Partialdruck des im Hybridisiermedium anwesenden Lösungsmittel so beeinflusst, dass allenfalls vorhandene Luftblasen schrumpfen und eliminiert werden. Thus becomes constant brought a saturated atmosphere with the solvent to the cup-shaped interfaces and thereby the partial pressure of the solvent present in the Hybridisiermedium so affected that are possibly present air bubbles to shrink and eliminated. Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass diese kalottenförmigen Grenzflächen mittels speziellen Vorrichtungen geschaffen und aufrechterhalten werden müssen. This method has the disadvantage that these cup-shaped interfaces have to be provided by means of specific apparatuses and maintained.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung betrifft das Bereitstellen eines alternativen Systems, mit welchem das Ausbilden von Luftblasen in einer Hybridisierkammer auf einfache Art und Weise verhindert werden kann. The object of the present invention relates to providing an alternative system by which the formation of air bubbles in a Hybridisierkammer in a simple manner can be prevented.
  • Diese Aufgabe wird gemäss dem kennzeichnenden Teil des unabhängigen Anspruchs 1 dadurch gelöst, dass ein eingangs beschriebenes System eine Druckeinrichtung zum Aufbauen eines Drucks in der Hybridisierkammer umfasst, der über dem in der Umgebungsluft herrschenden, normalen atmosphärischen Druck liegt. This object is achieved according to the characterizing part of the independent claim 1, that initially described system comprises a pressure means for establishing a pressure in the Hybridisierkammer that is above the pressure prevailing in the ambient air, normal atmospheric pressure. Zusätzliche, bevorzugte erfinderische Merkmale ergeben sich jeweils aus den abhängigen Ansprüchen. Additional preferred inventive features will become apparent from the dependent claims.
  • Das erfindungsgemässe System wird nun an Hand von schematischen, den Umfang der Erfindung nicht beschränkenden Zeichnungen von beispielhaften Ausführungsformen im Detail erläutert. The inventive system will now be explained with reference to the schematic, the scope of the invention non-limiting drawings of exemplary embodiments in detail. Dabei zeigen: They show:
  • 1 1 ein Schema eines zum Ausführen des erfindungsgemässen Verfahrens geeigneten Geräts bzw. Systems; a schematic of a suitable for carrying out the inventive method, device or system;
  • 2 2 einen der one of the 1 1 von from EP 1 260 265 A1 EP 1260265 A1 entsprechenden senkrechten Längsschnitt durch eine Anordnung mit einer Hybridisierkammer; corresponding vertical longitudinal section through an arrangement with a Hybridisierkammer;
  • 3 3 eine der one of the 2 2 entsprechende, schematische Ansicht einer Anordnung mit einer Hybridisierkammer, von unten gesehen; corresponding, schematic view of an arrangement with a Hybridisierkammer, seen from below;
  • 4 4 einen der one of the 2 2 entsprechenden, senkrechten Längsschnitt durch eine Anordnung mit einer Hybridisierkammer, Deckel des Systems aufgeklappt; corresponding vertical longitudinal section through an arrangement with a Hybridisierkammer, the lid of the system unfolded;
  • 5 5 einen der one of the 2 2 entsprechenden, senkrechten Längsschnitt durch eine Anordnung mit einer Hybridisierkammer, Deckel des Systems geschlossen. closed corresponding vertical longitudinal section through an arrangement with a Hybridisierkammer, the lid of the system.
  • 1 1 zeigt ein Schema eines zum Ausführen des erfindungsgemässen Verfahrens geeigneten Systems shows a scheme of a suitable for carrying out the inventive process system 1 1 . , Auf der linken Seite dieses Schemas sind eine Anzahl Gefässe On the left side of this scheme are a number of vessels 2 2 für die Aufbewahrung von flüssigen Hybridisiermedien, wie Waschflüssigkeiten ( W 3, W 2, W 1), Prähybridisier-Puffer (VP), Alkohol-Reinigungsflüssigkeit (AR), destilliertes Wasser (AD), sowie einen Behälter for the storage of liquid Hybridisiermedien as washing liquids (W 3, W 2, W 1), Prähybridisier buffer (VP), alcohol-cleaning fluid (AR), distilled water (AD), and a container 3 3 mit Inertgas (N2) dargestellt. with inert gas (N2), respectively. Jedem dieser Gefässe Each of these vessels 2 2 ist ein individuelles Ventil is an individual valve 4 4 vorgeschaltet, über welches diese Medien den (auf der rechten Seite dargestellten) Hybridisierkammern upstream, by means of which such media (shown on the right side) Hybridisierkammern 5 5 (S 1, S 2, S 3, S 4) zugeführt werden können. (S 1, S 2, S 3, S 4) can be fed. Die das Ventil The valve 4 4 umfassenden Medienleitungen comprehensive media lines 6 6 münden in eine Sammelleitung open into a manifold 7 7 , die wiederum in eine Förderpumpe That turn into a feed pump 8 8th mündet, der ein Belüftungsventil opens the vent valve a 9 9 vorgeschaltet ist. is connected upstream. Diese Förderpumpe This pump 8 8th saugt über die Sammelleitung draws on the manifold 7 7 flüssige Medien aus den Gefässen liquids from the vessels 2 2 an und pumpt sie über die Verteilleitung and it pumps through the distribution line 10 10 in die Einlassleitungen in the inlet lines 11 11 , die über ein Einlassventil Which via an inlet valve 12 12 in die Hybridisierkammern in the Hybridisierkammern 5 5 münden. lead. Die Hybridisiermedien verlassen die Hybridisierkammern The Hybridisiermedien leave the Hybridisierkammern 5 5 über eine Auslassleitung via an outlet 13 13 , welche je ein Auslassventil , Each of which an exhaust valve 14 14 umfassen und in eine Sammelleitung and include in a manifold 15 15 einmünden. open out. Diese Sammelleitung This manifold 15 15 mündet ihrerseits in eine Abfallleitung empties in turn into a waste line 16 16 , welche mittels eines Abfallventils Which by means of a drop valve 17 17 verschliessbar ist. be closed. Die Verteilleitung the distribution line 10 10 und die Sammellei tung and the processing Sammellei 15 15 können über eine Verbindungsleitung can via a connecting line 18 18 und ein Verbindungsventil and a connecting valve 19 19 miteinander kommunizieren. communicate with each other. Von dieser Verbindungsleitung This compound line 18 18 zweigt eine Entlastungsleitung branches a relief line 20 20 mit einem Entlastungsventil with a relief valve 21 21 ab und mündet in einen Sammelbehälter , and flows into a collecting tank 22 22 mit einer Be- bzw. Entlüftungsöffnung with an air vent 23 23 . , Dem Sammelbehälter the sump 22 22 nachgeschaltet ist eine Förderpumpe is downstream of a feed pump 24 24 , die über eine Übergangsleitung That a transition line 25 25 mit der Abfallleitung with the waste line 16 16 verbunden ist. connected is.
  • Zum besseren Verteilen der Hybridisiermedien in den Hybridisierkammern To better distribute the Hybridisiermedien in Hybridisierkammern 5 5 ist das System the system 1 1 mit einem Agitationsmechanismus bzw. mit einer Agitationseinrichtung with an agitation mechanism or with an agitator 32 32 ausgerüstet, wie diese aus der europäischen Patentanmeldung equipped as they exit the European patent application EP 1 260 265 A1 EP 1260265 A1 des Anmelders der aktuellen Patentanmeldung bekannt ist. is known to the applicant of the present patent application. Auf den Inhalt dieser Patentanmeldung On the content of this patent application EP 1 260 265 A1 EP 1260265 A1 wird hier ausdrücklich Bezug genommen, so dass dieser Inhalt als Teil der vorliegenden Patentanmeldung gilt. Express reference is made here, so that this content is considered part of the present patent application.
  • 2 2 zeigt einen der shows one of the 1 1 von from EP 1 260 265 A1 EP 1260265 A1 entsprechenden, senkrechten Längsschnitt durch eine Hybridisierkammer corresponding vertical longitudinal section through a Hybridisierkammer 5 5 . , Der Deckel The lid 26 26 dieser Anordnung ist gegenüber dem Objektträger this arrangement is compared with the slide 27 27 bewegbar (hier um eine Achse schwenkbar ausgebildet, so dass der Hybridisierraum movable (pivotable here about an axis so that the hybridization chamber 5 5 durch eine einfache Bewegung geöffnet und geschlossen werden kann. can be opened with a simple movement and closed. Eine ringförmige Dichtfläche An annular sealing surface 28 28 dient zum Abschliessen des Hybridisierraums serves to complete the hybridization chamber 5 5 durch Beaufschlagen einer Oberfläche by applying a surface 29 29 dieses Objektträgers This slide 27 27 . , Diese Dichtfläche This sealing surface 28 28 kann eine abgesetzte Oberfläche des Deckels may be a stepped surface of the lid 26 26 sein, welche flach auf der Oberfläche be that flat on the surface 29 29 des Objektträgers of the slide 27 27 liegt; lies; alternativ dazu kann zB auch eine Lippendichtung verwendet werden. alternatively, a lip seal can be used for example. Bevorzugt wird jedoch eine O-Ring-Dichtung als Dichtfläche Preferably, however, an O-ring seal as a sealing surface 28 28 . , Die Anordnung umfasst Leitungen The arrangement includes lines 11 11 , . 13 13 zum Zu- bzw. Ableiten von Medien in den Hybridisierraum for supplying or extracting media in the hybridization 5 5 hinein bzw. aus dem Hybridisierraum into and out of the hybridization chamber 5 5 heraus. out. Solche Medien können Reagenzien zum Durchführen der Hybridisierungsreaktion, wie zB Waschflüssigkeiten oder Puffer-Lösungen, aber auch inerte Gase (wie zB Stickstoff) zum Trocknen der Hybridisierungsprodukte auf den Objektträgern Such media, reagents for performing the hybridization reaction, for example washing liquids or buffer solutions, as well as inert gases (such as nitrogen) for drying the hybridization products on the slides 27 27 bzw. zum Ausblasen der Hybridisierkammern or for blowing out the Hybridisierkammern 5 5 und der Medienleitungen and the media lines 11 11 , . 13 13 sein. his. Diese Zu- bzw. Ableitungen This increase or derivatives 11 11 , . 13 13 für Hybridisiermedien münden bevorzugt in je einen Agitationsraum Hybridisiermedien preferably open into a respective agitation chamber 30 30 , . 30' 30 ' . , Die Anordnung umfasst zudem eine verschliessbare Musterzuführung The arrangement also comprises a closable specimen supply 31 31 , durch welche von Hand RNA-enthaltende Flüssigkeiten oder andere Musterflüssigkeiten zupipettiert werden können. Through which hand RNA-containing liquids or other liquids may be pipetted pattern. Die Musterzuführung The specimen supply 31 31 wird vorzugsweise mit einem Kunststoffpfropfen (nicht gezeigt) verschlossen. is preferably provided with a plastic plug (not shown). Alternativ dazu kann eine automatische bzw. robotisierte Musterzuführung vorgesehen werden, wie diese in unterschiedlichen Ausführungsformen in Alternatively can be provided an automatic or robotized specimen supply, as this in different embodiments EP 1 260 265 A1 EP 1260265 A1 offenbart sind. are disclosed.
  • Die Anordnung umfasst eine medientrennende Agitationseinrichtung 32 zum Bewegen von Flüssigkeiten gegenüber auf der Oberfläche The assembly includes a media-separating agitation means 32 for moving liquids on the surface opposite 29 29 der Objektträger the slide 27 27 immobilisierten Proben von Nukleinsäuren, Proteinen oder Gewebeschnitten. immobilized samples of nucleic acids, proteins, or tissue sections. In der in In the in 2 2 gezeigten Ausführungsform umfasst die Agitationseinrichtung Embodiment shown comprises the agitation device 32 32 der Anordnung eine Membran the arrangement of a membrane 33 33 . , Diese Membran this membrane 33 33 trennt einen Druckraum separates a pressure chamber 34 34 , der über eine Druckleitung Which via a pressure line 35 35 mit einem Druckfluid (Gas oder Flüssigkeit) befüllbar ausgebildet ist, von einem Agitationsraum is formed can be filled with a pressurized fluid (gas or liquid) from an agitation chamber 30 30 , der über eine Agitationsleitung That an agitation pipe 36 36 mit dem Hybridisierraum with the hybridization 5 5 verbunden ist. connected is. Nach dem Erreichen des thermischen Gleichgewichtes der Anordnung, dem Zugeben eines bestimmten Volumens an RNA-Musterflüssigkeit und dem Verschliessen der Musterzuführung After reaching thermal equilibrium of the device, the addition of a given volume of RNA sample liquid and the closure of the specimen supply 31 31 wird über die Druckleitung is via the pressure line 35 35 vorzugsweise Luft oder ein anderes Gas (es könnte aber auch eine Flüssigkeit sein) stossweise in den Druckraum preferably air or another gas (es but could also be a liquid) intermittently into the pressure chamber 34 34 gebracht oder daraus abgelassen, so dass sich die Membran placed or discharged therefrom, so that the membrane 33 33 im gleichen Rhythmus durchbiegt und entsprechend den Agitationsraum bends in the same rhythm and according to the agitation chamber 30 30 verkleinert bzw. vergrössert. reduced or increased. Dadurch wird die Musterflüssigkeit im gleichen Rhythmus des Über- bzw. Unterdrucks und Entspannens im Hybridisierraum Thus, the sample liquid in the same rhythm of the over- or under-pressure and relaxation is in the hybridization 5 5 gegen das eine oder das andere Ende bewegt, wo sich vorzugsweise an der gegen das Innere des Hybridisierraums against one or the other end moves, where preferably on the hybridization chamber against the interior of 5 5 gerichteten Oberfläche facing surface 37 37 des Deckels of the lid 26 26 je ein Querströmkanal each one Querströmkanal 38 38 , . 38' 38 ' befindet. located.
  • Diese Querströmkanäle this Querströmkanäle 38 38 , . 38' 38 ' erleichtern einerseits das Querverteilen der in der Musterlösung enthaltenen RNA-Moleküle. one hand facilitate the distribution of the cross contained in the sample solution RNA molecules. Dadurch wird bewirkt, dass die Musterflüssigkeit bzw. die Waschflüssigkeiten homogen über das gesamte im Hybridisierraum This causes the sample liquid or the washing liquids homogeneously over the whole in the hybridization 5 5 anwesende Volumen verteilt werden. Volume present are distributed. Zudem dienen die Querströmkanäle In addition, the Querströmkanäle serve 38 38 , . 38' 38 ' auch als Flüssigkeits-Reservoir, so dass bei der durch die in der Vorrichtung eingebauten Agitationseinrichtung as a liquid reservoir, so that when built by the agitator in the apparatus 32 32 erzeugte Pendelbewegung (gefüllter Doppelpfeil) der Musterlösung nicht dazuführt, dass Teile des Hybridisierraums generated pendulum motion (solid double arrow) does not cause the sample solution, that parts of the hybridization chamber 5 5 unbeabsichtigt trocken liegen. are inadvertently dry.
  • Vorzugsweise ist ein zweiter, ebenfalls mit einer Membran Preferably, a second, also with a membrane 33' 33 ' versehener Agitationsraum Agitation-provided space 30' 30 ' über eine zweite Agitationsleitung a second agitation pipe 36' 36 ' mit dem Hybridisierraum with the hybridization 5 5 verbunden. connected. Wenn jetzt ein auf den Druckraum If now the pressure chamber 34 34 abgegebener Druckstoss die erste Membran given for each pressure pulse, the first membrane 33 33 in den ersten Agitationsraum in the first agitation chamber 30 30 drückt, wird dieser Impuls über die erste Agitationsleitung suppressed, this pulse via the first agitation pipe is 36 36 auf die Musterflüssigkeit im Hybridisierraum the specimen liquid in hybridization chamber 5 5 übertragen. transfer. Die Musterflüssigkeit weicht etwas gegen die zweite Agitationsleitung The sample liquid is slightly different from the second agitation pipe 36' 36 ' aus (kann diese sogar zum Teil füllen) und erhöht den Druck im zweiten Agitationsraum from (this may even fill in part) and increases the pressure in the second agitation chamber 30' 30 ' . , Dadurch biegt sich die zweite Membran Thereby the second diaphragm flexes 33' 33 ' nach oben und wird dabei elastisch gedehnt. upwards and is thereby elastically stretched. Sobald der Überdruck im Druckraum As soon as the pressure in the pressure chamber 34 34 nachlässt, federn beide Membranen subsides, feathers both membranes 33 33 , . 33' 33 ' in ihre Ruheposition zurück und bewegen die Musterflüssigkeit im Hybridisierraum in its rest position and move the specimen liquid in hybridization chamber 4 4 in die entgegengesetzte Richtung. in the opposite direction. Durch diese Pendelbewegung kann mit der gezeigten Anordnung eine Musterflüssigkeit mit einem minimalen Volumen (im Bereich von ca. 100 μl) in weniger als einer Minute praktisch homogen im Hybridisierraum By this reciprocating movement, with the arrangement shown, a sample liquid practically homogeneously with a minimal volume (in the range of about 100 .mu.l) in less than a minute in the hybridization 5 5 verteilt werden. are distributed. Vorzugsweise wird unmittelbar anschliessend an den Druckabbau im Druckraum Preferably, immediately following the pressure reduction in the pressure chamber 34 34 ein Unterdruck im Druckraum a negative pressure in the pressure chamber 34 34 erzeugt, so dass die dem vorangehenden Druckstoss entgegengesetzte Rückwärtsbewegung der Musterflüssigkeit im Hybridisierraum generated, so that the opposite to the preceding pressure surge backward movement of the sample liquid in the hybridization 5 5 noch verstärkt wird. is enhanced.
  • 3 3 zeigt eine Draufsicht auf die Anordnung von shows a plan view of the arrangement of 2 2 , von unten gesehen. As seen from below. Die O-Ring-Dichtung The O-ring seal 28 28 begrenzt lateral den Hybridisierraum limited laterally the hybridization 5 5 , der an seinen einander entgegengesetzten Enden je einen Querströmkanal Having at its opposite ends a Querströmkanal 38 38 , . 38' 38 ' aufweist, welche als Vertiefung in der Oberfläche has, as a recess in the surface which 37 37 des Deckels of the lid 26 26 vorgesehen sind. are provided. Der Objektträger The slide 27 27 (hier ein Glasobjektträger für die Lichtmikroskopie) und dessen Grifffeld (In this case a glass slide for light microscopy) and its Griffenfeld 55 55 sind gestrichelt eingezeichnet. are shown in dashed lines. Klar ersichtlich ist auch die Abdrückfeder Clear is also the kickout 56 56 , welche auf das Grifffeld Responsive to said Griffenfeld 55 55 des Objektträgers of the slide 27 27 drückt. suppressed. Beim Öffnen des Hybridisierraums When opening the hybridization chamber 5 5 erleichtert diese Abdrückfeder facilitates this kickout 56 56 die automatische Trennung des Objektträgers automatic disconnection of the object support 27 27 vom Deckel from the cover 26 26 . , Ebenfalls ersichtlich ist die Linienführung der Einlassleitung Also visible is the line of the inlet pipe 11 11 , der Auslassleitung , The outlet 13 13 und der Druckleitung and the pressure line 35 35 sowie die Anordnung der Agitationsräume and the arrangement of the agitation room 30 30 , . 30' 30 ' und der Musterzuführung and the specimen supply 31 31 . , Die Agitationsleitungen The agitation lines 36 36 , . 36' 36 ' und die Musterzuführung and the specimen supply 31 31 münden in den Querströmkanälen open into the Querströmkanälen 38 38 , . 38' 38 ' . ,
  • Alle Leitungen All lines 11 11 , . 13 13 , . 35 35 zum Zu- bzw. Abführen von Medien münden vorzugsweise in einer gemeinsamen Anschlussebene for supplying or discharging the media flow preferably in a common connection plane 57 57 des Deckels of the lid 26 26 , welche im Wesentlichen parallel zum Hybridisierraum Which is essentially parallel to the hybridization chamber 5 5 und vorzugsweise auf der gleichen Höhe wie der Hybridisierraum and preferably at the same height as the hybridization 5 5 angeordnet ist. is arranged. Die Mündungsöffnungen der Leitungen The orifices of the pipes 11 11 , . 13 13 , . 35 35 können wie gezeigt versetzt zu einander oder auf einer quer zu der Vor richtung can as shown offset to one another or to a direction transverse to the direction of the pre 1 1 verlaufenden Linie (nicht gezeigt) angeordnet sein. extending line (not shown) may be disposed. Aussparungen (leere Pfeile, vgl. Recesses (empty arrows, see FIG. 2 2 ) reduzieren den Wärmefluss von oder zu dem Deckel ) Reduce the flow of heat from or to the cover 26 26 . ,
  • Die Druckleitungen The pressure lines 35 35 , von welchen für jede der Hybridisierkammern Of which for each of the Hybridisierkammern 5 5 eine bestimmt ist, sind in a is determined in 1 1 gestrichelt dargestellt und gehen von einer Druckverteilleitung dashed lines and go from a Druckverteilleitung 39 39 aus. out. In diese Druckverteilleitung In this Druckverteilleitung 39 39 münden eine Ausgleichsleitung open a compensating line 40 40 mit einem Ausgleichsventil with a compensating valve 41 41 , eine Überdruckzuleitung A pressure supply line 42 42 mit einem Überdruckventil with a pressure relief valve 43 43 und eine Unterdruckzuleitung and a vacuum supply line 44 44 mit einem Unterdruckventil with a vacuum valve 45 45 . , Der Überdruck wird vorzugsweise mit einem kostengünstigen Gas (zB Luft) in einer Überdruckpumpe The overpressure is preferably an inexpensive gas (eg, air) in a positive pressure pump 46 46 erzeugt, in einem Überdruckbehälter produced in a pressure container 47 47 gespeichert und in die Überdruckzuleitung and stored in the pressure supply line 42 42 eingespeist. fed. Der Unterdruck wird in einer Untererdruckpumpe The negative pressure is in a Low-pressure pump 48 48 erzeugt, in einem Unterdruckbehälter generated in a vacuum vessel 49 49 gespeichert und in die Unterdruckzuleitung and stored into the vacuum supply line 44 44 eingespeist. fed.
  • Der Inertgasbehälter the inert gas 3 3 ist über ein Gasventil is a gas valve 50 50 und eine Gasleitung and a gas line 51 51 mit der Verteilleitung with the distribution line 10 10 verbunden, welche über Einlassleitungen connected which via inlet lines 11 11 und je ein Einlassventil and an intake valve per 12 12 in die Hybridisierkammern in the Hybridisierkammern 5 5 münden. lead. Mit Inertgas (zB mit Stickstoffgas) können je nach Ventilstellungen alle Hybridisierkammern With inert gas (eg nitrogen gas) may vary depending on valve positions all Hybridisierkammern 5 5 (einzeln oder in Gruppen) via die Verteilleitung (Individually or in groups) via the distribution line 10 10 und die Einlassleitungen and the inlet lines 11 11 über die Auslassleitungen via the outlet 13 13 und die Sammelleitung and the manifold 15 15 ausgeblasen werden. be blown out.
  • Werden nur das Gasventil Only the gas valve 50 50 , das Verbindungsventil , The connecting valve 19 19 und das Entlastungsventil and the relief valve 21 21 geöffnet, so kann die Verteilleitung open, then the distribution line 10 10 in den Sammelbehälter in the collection 22 22 ausgeblasen werden. be blown out. Werden nur das Gasventil Only the gas valve 50 50 , das Verbindungsventil , The connecting valve 19 19 und das Abfallventil and the waste valve 17 17 geöffnet, so können die Verteilleitung opened to the distribution line can 10 10 und die Sammelleitung and the manifold 15 15 über die Abfallleitung on waste management 16 16 ausgeblasen werden. be blown out.
  • 4 4 zeigt einen der shows one of the 2 2 entsprechenden, senkrechten Längsschnitt durch eine Anordnung mit einer Hybridisierkammer corresponding vertical longitudinal section through an arrangement with a Hybridisierkammer 5 5 , wobei der Klapprahmen Wherein the folding frame 54 54 mit dem darin eingesetzten Deckel with the lid inserted therein 26 26 des Systems the system 1 1 aufgeklappt ist. is opened. Bevorzugt sind die Deckel the lids are preferably 26 26 parallel zueinander und in einer Vierergruppe angeordnet, weil diese Anordnung gerade ein Mass für eine Kontaktplatte parallel to each other and arranged in a group of four, because this arrangement just one measure of a contact plate 53 53 des Temperaturkontrollthermostaten zulässt, auf welche ein Transportrahmen the temperature control thermostat allows to which a transport frame 52 52 in der Grösse einer Mikroplatte mit vier parallel zu einander angeordneten Objektträgern the size of a microplate which is arranged parallel to each four slides 27 27 passt. fits. Jede dieser Vierergruppen ist einer an ein Temperatursteuergerät angeschlossenen Kontaktplatte Each of these groups of four is one connected to a temperature control unit contact plate 53 53 zugeordnet. assigned. Eine solche Kontaktplatte Such a contact plate 53 53 ist somit zur flä chigen Aufnahme der vier Objektträger is thus to sur fa speaking receiving the four slides 27 27 eines Transportrahmens a transport frame 52 52 ausgebildet. educated. Der Rahmen The frame 52 52 umfasst Längswände, Querwände und im Wesentlichen parallel zu den Querwänden verlaufende Zwischenwände. comprises longitudinal walls, transverse walls and substantially centered about the transverse walls extending parallel intermediate walls. Diese Wände umgeben Öffnungen, welche den Rahmen These walls surround openings that frame the 52 52 vollständig durchdringen, wobei diese Öffnungen den direkten Kontakt zwischen der Kontaktplatte completely penetrate these openings direct contact between the contact plate 53 53 des Thermostaten und den Objektträgern the thermostat and the slides 27 27 ermöglichen. enable. Weil die Objektträger Because the slide 27 27 im Rahmen as part of 52 52 sanft federnd gehalten sind und weil die Kontaktplatte are gentle resiliently held and because the contact plate 53 53 so ausgebildet ist, dass der Rahmen is formed so that the frame 52 52 ihr gegenüber etwas abgesenkt werden kann, liegen die Objektträger it can be lowered over something lying slides 27 27 direkt auf der Oberfläche der Kontaktplatte directly on the surface of the contact plate 53 53 . , Jede Vierergruppe einer Verfahrenseinheit umfasst eine um eine Achse Each group of four a process unit comprises a about an axis 58 58 schwenkbare und gegenüber einer Grundplatte and pivotable relative to a base plate 59 59 verriegelbaren Klapprahmen lockable hinged frame 54 54 mit vier Sitzen, wobei in jeden dieser Sitze ein Deckel with four seats, in each of these seats, a lid 26 26 einlegbar ist. can be inserted. Jede solche Verfahrenseinheit umfasst zudem eine Anschlussplatte Any such process unit also includes a connection plate 60 60 zum dichtenden Verbinden je einer Einlassleitung for sealingly connecting a respective inlet conduit 11 11 , Auslassleitung , outlet line 13 13 und Druckleitung and pressure pipe 35 35 des Systems the system 1 1 mit der Einlassleitung with the inlet line 11 11 , Auslassleitung , outlet line 13 13 und Druckleitung and pressure pipe 35 35 eines Deckels a lid 26 26 . , Als Dichtungen für diese Verbindungen werden vorzugsweise auf der Systemseite angeordnete O-Ringe bevorzugt (nicht gezeigt). As seals for these connections arranged on the system side O-rings are preferably preferred (not shown).
  • 5 5 zeigt einen der shows one of the 2 2 entsprechenden, senkrechten Längsschnitt durch eine Anordnung mit einer Hybridisierkammer corresponding vertical longitudinal section through an arrangement with a Hybridisierkammer 5 5 , wobei der in einen Klapprahmen Wherein the folding frame in a 54 54 eingesetzte Deckel lid used 26 26 des Systems geschlossen ist. the system is closed. Alle vier Hybridisierräume All four Hybridisierräume 5 5 einer durch eine Kontaktplatte a through a contact plate 53 53 und einen solchen Klapprahmen and such a folding frame 54 54 definierten Vierergruppe sind somit der Temperaturkontrolle eines Temperatursteuergeräts zugeordnet. defined group of four temperature control of a temperature control unit are thus assigned. Jede Vierergruppe einer Verfahrenseinheit umfasst, wie oben beschrieben, eine um eine Achse Each group of four comprises a process unit, as described above, about an axis 58 58 schwenkbare und gegenüber einer Grundplatte and pivotable relative to a base plate 59 59 verriegelbaren Klapprahmen lockable hinged frame 54 54 mit vier Sitzen, wobei in jeden dieser Sitze ein Deckel with four seats, in each of these seats, a lid 26 26 einlegbar ist. can be inserted. Um sicherzustellen, dass die Deckel To ensure that the lid 26 26 planparallel zu den Objektträgern plane parallel to the slides 27 27 platziert werden können, weist der Klapprahmen can be placed, the folding frame 54 54 zudem noch ein Mittelgelenk (nicht gezeigt) mit einer zur Achse Moreover, even a center joint (not shown) with respect to the axis 58 58 parallelen Beweglichkeit auf. parallel to mobility. Damit die Dichtungen So that the seals 28 28 die Hybridisierräume the Hybridisierräume 5 5 zuverlässig abschliessen, wird über den Klapprahmen reliably conclude, is the folding frame 54 54 ein zusätzlicher Druck auf die Deckel an additional pressure on the lid 26 26 ausgeübt, dies kann über Schrauben, Kipphebel oder ähnliche bekannte Vorrichtungen (nicht gezeigt) bewerkstelligt werden. exercised, this can by means of screws, rocker arm or similar known devices (not shown) can be accomplished.
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass mittels Erzeugen eines Überdrucks in den Hybridisierkammern The present invention is based on the realization that by means of generating a positive pressure in the Hybridisierkammern 5 5 das spontane Auftreten von Luftblasen während dem Hybridisieren verhindert werden kann. the spontaneous occurrence of air bubbles can be prevented during the hybridization. Dabei soll der Kammer-Druck über dem in der Umgebungsluft herrschenden, normalen atmosphärischen Druck liegen. Should here be the chamber pressure above the pressure prevailing in the ambient air, normal atmospheric pressure. Bevorzugt wird ein Kammerdruck, der mindestens um 100 mbar bis maximal um 1.4 bar höher ist als der Umgebungsdruck. a chamber pressure up to a maximum of 1.4 bar higher by at least 100 mbar than the ambient pressure is preferred. Selbst höhere Drücke in der Kammer sind möglich, falls ihnen ein genügend grosser Anpressdruck zum Dichthalten der Kammer entgegenwirkt. Even higher pressures in the chamber are possible if counteracting them a sufficiently large pressure to the sealing maintaining the chamber.
  • Tatsächlich treten unter diesen Druckverhältnissen während der Hybridisierung keine Luftblasen mehr auf. Actually occur under these pressure conditions during hybridization no more air bubbles. Der diesem Phänomen zu Grunde liegende Funktionsmechanismus ist nicht restlos aufgeklärt. The working mechanism of this phenomenon underlying has not been completely elucidated. Es wird jedoch angenommen, dass der erhöhte Druck einerseits die Diffusionsrichtung im Bereich der O-Ring-Dichtung However, it is believed that the increased pressure on the one hand the diffusion direction in the region of the O-ring seal 28 28 bestimmt bzw. definiert, so dass keine Gasmoleküle der Umgebungsluft mehr in die Hybridisierkammer determined or defined so that no more gas molecules of the ambient air into the Hybridisierkammer 5 5 diffundieren können. can diffuse. Andererseits findet auf Grund ihrer Druckabhängigkeit sicher auch eine Verschiebung der Phasengrenzen im Hybridisiermedium statt, so dass die spontane Luftblasenbildung unterdrückt wird. On the other hand, a shift of the phase boundaries in Hybridisiermedium place due to their dependence on pressure rather than safe so that the spontaneous formation of air bubbles is suppressed. Im Zusammenhang mit dieser Erfindung werden deshalb alle Gasblasen im Hybridisiermedium – ungeachtet des Entstehungsprozesses in der Hybridisierkammer therefore in the context of this invention all gas bubbles in Hybridisiermedium - regardless of the development process in the Hybridisierkammer 5 5 – als „Luftblasen" bezeichnet. - referred to as "bubbles".
  • Erfindungsgemäss kann der verlangte Überdruck in den Hybridisierkammern According to the invention, the required pressure in the Hybridisierkammern 5 5 mittels einer Flüssigkeit, wie zB mittels eines von der Förderpumpe by means of a liquid, such as by means of a from the feed pump 8 8th in die Hybridisierkammern in the Hybridisierkammern 5 5 gedrücktes Hybridisiermedium aus einem der Gefässe Hybridisiermedium pressed down from one of the vessels 2 2 erreicht werden (vgl. be achieved (see. 1 1 ). ). Falls ein diese Hybridisierkammer If a this Hybridisierkammer 5 5 umfassendes System comprehensive system 1 1 eine Agitationseinrichtung an agitator 32 32 zum Bewegen der Hybridisiermedien gegenüber den immobilisierten Proben aufweist, so umfasst dieses System bevorzugt auch ein Federelement, welches den durch die Agitationseinrichtung for moving said Hybridisiermedien over the immobilized samples, this system also preferably includes a spring member which by the agitation device 32 32 erzeugten Druckunterschieden federnd entgegenwirkt. resiliently counteracts pressure differences generated. Ein solches Federelement kann ein elastisches Rohrstück (nicht gezeigt) in einer entsprechenden Zu- oder Ableitung zu der Hybridisierkammer Such a spring element may be an elastic tube piece (not shown) in a corresponding feed or discharge to the Hybridisierkammer 5 5 sein; his; es kann aber auch ein federnd beaufschlagtes Expansionsgefäss (nicht gezeigt) vorgesehen sein, welches über eine Leitung mit der Hybridisierkammer but it can be provided (not shown), a resiliently acted upon expansion vessel which via a line with the Hybridisierkammer 5 5 verbunden ist. connected is.
  • Alternativ dazu kann auch Inertgas aus dem Behälter Alternatively, also an inert gas from the container 3 3 in die Verteilleitung in the distribution line 10 10 und die Einlassleitungen and the inlet lines 11 11 gedrückt und über je ein Einlassventil pressed and each one inlet valve 12 12 der verlangte Druck in den mit Proben und Hybridisiermedien bereits gefüllten Hybridisierkammern the required pressure in the samples and Hybridisiermedien already filled Hybridisierkammern 5 5 aufgebaut werden. being constructed. Bevorzugt sind Inertgase wie N 2 (Stickstoff), die keine chemische Wechselwirkung oder Reaktionen mit den Hybridisiermedien eingehen. Inert gases are preferred, such as N 2 (nitrogen), which do not undergo chemical interaction or reactions with the Hybridisiermedien. Es kann zudem von Vorteil sein, wenn die Inertgase in den Hybridisiermedien nicht löslich sind. It can also be advantageous if the inert gases are not soluble in the Hybridisiermedien. Zudem besteht die Möglichkeit, das aus einer Druckpumpe und einem Druckbehälter (ähnlich wie bei den mit It is also possible that (from a pressure pump and a pressure vessel similar to the one with 46 46 und and 47 47 bezeichneten Elementen in designated elements in 1 1 ) stammende Gas in die Verteilleitung ) Derived gas in the distribution line 10 10 einzuleiten. initiate. Nach dem Druckaufbau können alle Ventile wieder geschlossen und die Hybridisierung durchgeführt werden. After pressure build all the valves can be closed again and the hybridization be performed. Dabei dient das so aufgebaute Gaskissen, welches direkt mit dem für die Hybridisierung verwendeten Flüssigkeitsvolumen in Verbindung steht, als Federelement zum federnden Entgegenwirken auf die Agitationsdruckunterschiede. Here, the thus constructed gas cushion, which is directly related to the material used for the hybridization volume of liquid in connection, as a spring element for resiliently counteracting the agitation pressure differences used. Falls dies, zB wegen eines minimalen aber konstanten Druckverlustes über die O-Ring-Dichtungen If so, for example due to a minimum but constant pressure drop across the O-ring seals 28 28 , erforderlich sein sollte, kann der verlangte Kammerdruck während der zumeist viele Stunden dauernden Hybridisierung sporadisch korrigiert oder erneuert bzw. konstant gehalten werden. Should be required, the required chamber pressure can be corrected during the usually many hours lasting hybridization sporadically or renewed or held constant. Zu diesem Zweck können wahlweise auch eines oder beide der Ventile For this purpose, one or both may optionally the valves 12 12 , . 14 14 (vgl. (see. 1 1 ) offen gehalten werden. ) Be kept open.
  • Eine weitere Alternative (in den Figuren nicht dargestellt) besteht darin, eine Druckpumpe und einen Druckbehälter (ähnlich wie die mit Another alternative (not shown in the figures) is (a pressure pump and a pressure vessel similar to the 46 46 und and 47 47 bezeichneten Elemente in designated elements in 1 1 ) oder einen Gasbehälter (wie zB der N 2 -Behälter ) Or a gas tank (such as the N 2 tank 3 3 in in 1 1 ) mit der Sammelleitung ) To the manifold 15 15 zu verbinden und den Druck in den Hybridisierkammern and to connect the pressure in the Hybridisierkammern 5 5 über ein Öffnen der Auslassventile an opening of the exhaust 14 14 aufzubauen. build. Eine zusätzliche Alternative zum Bereitstellen eines Gaskissens, das als Federelement zum federnden Entgegenwirken auf die Agitationsdruckunterschiede dient, besteht darin, das aus einer Druckpumpe und einem Druckbehälter (ähnlich wie die mit An additional alternative for providing a gas cushion which serves as a spring element for resiliently counteracting the agitation pressure differences, is that (from a pressure pump and a pressure vessel similar to that with 46 46 und and 47 47 bezeichneten Elemente in designated elements in 1 1 ) oder aus einem Gasbehälter (wie zB der N 2 -Behälter ) Or (from a gas container such as the N 2 tank 3 3 in in 1 1 ) stammende Gas in eine der Leitungen zu führen, welche in zumindest eine der Verteilleitung lead) derived gas in one of the lines, which in at least one of the distribution 10 10 oder Sammelleitung or manifold 15 15 münden. lead. Entsprechend können eines oder beide der Ventile According to one or both of the valves can 12 12 , . 14 14 (vgl. (see. 1 1 ) offen gehalten werden. ) Be kept open.
  • Wird ein System If a system 1 1 mit Anordnungen verwendet, welche (wie oben beschrieben) zwei Agitationsmembranen used with arrangements which (as described above) two membranes agitation 33 33 , . 33' 33 ' umfassen, so kann während dem vorbereitenden Agitieren der Hybridisationsmedien in den Hybridisierkammern include, the Hybridisationsmedien, during the preparatory agitation in the Hybridisierkammern 5 5 oder auch während dem Hybridisieren selbst, die Agitationseinrichtung or even during the hybridization itself, the agitator 32 32 verwendet werden. be used. Dabei muss einfach ein Agitationsdruck im Druckraum Here, just have an agitation pressure in the pressure chamber 34 34 erzeugt werden, der um ca. 0.5 bis 1 bar höherer ist als der gewünschte Kammerdruck von 100 mbar bis 1.4 bar über dem Umgebungsdruck. are generated, the bar is higher by about 0.5 to 1 than the desired chamber pressure of 100 mbar to 1.4 bar above the ambient pressure. Der für die Agitation aufzuwendende Druck bewegt sich (je nach Umgebungsdruck) somit im Bereich von ca. 1.6 – 2.4 bar. The expended for agitation pressure thus moves (depending on ambient pressure) in the range of about 1.6 - 2.4 bar. Die zweite Membran The second membrane 33' 33 ' bildet in diesem Fall ein Federelement, welches diesem Agitationsdruck federnd entgegen wirkt. in this case forms a spring element which acts resiliently against this agitation pressure.
  • Typischerweise wird eine Hybridisierung wie folgt durchgeführt: Typically, hybridization is carried out as follows:
    • a) Ausspülen von Luftblasen und Flüssigkeitsresten aus der Verteilleitung a) purging of air bubbles and residual fluid from the distributor 10 10 und der Sammelleitung and the manifold 15 15 . , Zu diesem Zweck werden nur die Ventile For this purpose, only the valves 4 4 (AD), (AD), 19 19 und and 17 17 geöffnet und es wird mit der Förderpumpe opened and it is with the feed pump 8 8th destilliertes Wasser aus dem Gefäss Distilled water from the vessel 2 2 (AD) über das Ventil (AD) via the valve 4 4 (AD) in die Verteilleitung (AD) in the distribution line 10 10 gepumpt. pumped. Das destillierte Wasser strömt durch das Verbindungsventil The distilled water flows through the connecting valve 19 19 in die Sammelleitung into the manifold 15 15 und von dort über das Abfallventil and from there via the waste valve 17 17 in die Abfallleitung in the waste line 16 16 . , Gleichzeitig werden die Hybridisierkammern At the same time Hybridisierkammern be 5 5 aufgebaut. built up. Dies geschieht durch das Auflegen von (vorzugsweise in einem Transportrahmen This is done by laying up (preferably in a transport frame 52 52 gehaltenen) Objektträgern held) slides 27 27 mit darauf immobilisierten Proben auf die Kontaktplatte with immobilized thereon samples on the contact plate 53 53 eines Thermostats, durch das Einsetzen von Deckeln a thermostat, by the insertion of lids 26 26 in den Klapprahmen the folding frame 54 54 des Systems the system 1 1 zum Hybridisieren von auf Objektträgern for hybridizing on slides 27 27 immobilisierten Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten und durch das Verschliessen der Hybridisierkammern immobilized nucleic acid probes, proteins, or tissue sections and through the closing of the Hybridisierkammern 5 5 mittels Herunterklappen der Deckel by folding down the lid 26 26 auf die Objektträger to the slides 24 24 (vgl. (see. 4 4 und and 5 5 ). ). Dieses Herunterklappen verbindet die Enden der Einlassleitungen This folding down connects the ends of the intake pipes 11 11 , der Auslassleitungen , The outlet 12 12 und der Druckleitungen and the pressure lines 35 35 der Agitationseinrichtung the agitator 32 32 jeder einzelnen Hybridisierkammer each Hybridisierkammer 5 5 mit den entsprechenden Leitungsenden des Systems with the respective lead ends of the system 1 1 . , Vorzugsweise werden – entsprechend den vier in einem Transportrahmen Preferably, - corresponding to the four in a transport frame 52 52 aufgenommenen Objektträgern Slides recorded 27 27 – vier Deckel - four cover 26 26 in einen Klapprahmen in a folding frame 54 54 eingesetzt. used.
    • b) Füllen und Thermostatisieren der Hybridisierkammern b) filling and thermostatting of Hybridisierkammern 5 5 mit Prähybridisier-Puffer. with Prähybridisier buffer. Zu diesem Zweck werden nur die Ventile For this purpose, only the valves 4 4 (VP), (VP) 12 12 , . 14 14 und and 17 17 geöffnet und es wird mit der Förderpumpe opened and it is with the feed pump 8 8th Prähybridisier-Puffer aus dem Gefäss Prähybridisier buffer from the vessel 2 2 (VP) über das Ventil (VP) via the valve 4 4 (VP) in die Verteilleitung (VP) in the distribution line 10 10 und von dort über die Einlassventile and from there via the inlet valves 12 12 in die Hybridisierkammern in the Hybridisierkammern 5 5 gepumpt. pumped. Ein Teil des Prähybridisier-Puffers verlässt die Hybridisierkammern Part of Prähybridisier buffer leaves the Hybridisierkammern 5 5 über die Auslassventile on the exhaust valves 14 14 und die Sammelleitung and the manifold 15 15 und gelangt über das Abfallventil and passes via the waste valve 17 17 in die Abfallleitung in the waste line 16 16 . , Dieser Vorgang verlangt besondere Beachtung, weil hier zum ersten Mal Luftblasen in die Hybridisierkammern This process requires special attention because for the first time air bubbles in the Hybridisierkammern 5 5 eingeschleppt werden können. can be introduced.
    • c) Ausblasen der Verteilleitung c) blowing out of the distribution 10 10 und der Sammelleitung and the manifold 15 15 . , Zu diesem Zweck werden nur die Ventile For this purpose, only the valves 9 9 , . 19 19 und and 17 17 geöffnet und es wird mit der Förderpumpe opened and it is with the feed pump 8 8th Luft über das Belüftungsventil Air through the ventilation valve 9 9 angesaugt und über die Verteilleitung aspirated and the distribution line 10 10 , das Verbindungsventil , The connecting valve 19 19 in die Sammelleitung into the manifold 15 15 und von dort über das Abfallventil and from there via the waste valve 17 17 in die Abfallleitung in the waste line 16 16 gepumpt. pumped.
    • d) Probenzugabe in die Hybridisierkammern d) sample addition in the Hybridisierkammern 5 5 . , Zu diesem Zweck werden nur die Ventile For this purpose, only the valves 14 14 und and 21 21 geöffnet. open. Die Proben werden mit einer Pipette über die Musterzuführung The samples are mixed with a pipette on the specimen supply 31 31 im Deckel in the lid 26 26 in die Hybridisierkammern in the Hybridisierkammern 5 5 gepresst. pressed. Dadurch wird ein entsprechendes Volumen Prähybridisier-Puffer aus den Hybridisierkammern As a result, a corresponding volume Prähybridisier buffer from the Hybridisierkammern 5 5 in die Auslassleitung into the outlet 13 13 mit den geöffneten Auslassventilen with open exhaust valves 14 14 verdrängt. repressed. Dies wiederum verdrängt ein entsprechende Volumen Luft aus der Sammelleitung This in turn displaces a corresponding volume of air from the manifold 15 15 . , Diese verdrängte Luft strömt durch das geöffnete Entlastungsventil This displaced air flows through the open relief valve 21 21 in die Entlastungsleitung in the relief line 20 20 und gelangt in den Sammelbehälter and enters the collection container 22 22 , den sie über die Entlüftungsöffnung , Held through vent 23 23 verlässt. leaves. Dieser Vorgang verlangt besondere Beachtung, weil hier zum zweiten Mal Luftblasen in die Hybridisierkammern This process requires special attention because here for the second time air bubbles in the Hybridisierkammern 5 5 eingeschleppt werden können. can be introduced.
    • e) Gleichmässiges Verteilen der Hybridisiermedien in den Hybridisierkammern e) uniformly distributing the Hybridisiermedien in the Hybridisierkammern 5 5 und gegenüber den auf den Objektträgern and towards the on the slides 27 27 immobilisierten Proben. immobilized samples. Zu diesem Zweck sind zuerst alle Ventile geschlossen. To this end, all valves are first closed. Dann wird der Kammerdruck wie schon beschrieben erhöht und die Agitationseinrichtung Then, the chamber pressure is increased as already described and the agitator 32 32 in Betrieb genommen. put into operation. Alle eventuell in den Hybridisierkammern All possibly in the Hybridisierkammern 5 5 vorhandenen Luftblasen werden bei diesem Druckaufbau eliminiert. existing air bubbles are eliminated in this pressure buildup.
    • f) Hybridisieren der Proben während beispielsweise 17 Stunden. f) hybridizing the samples during for example 17 hours. Währen der Hybridisierung können die Medien in den Hybridisierkammern During the hybridization, the media in the Hybridisierkammern 5 5 konstant oder intermittierend agitiert werden. be agitated constantly or intermittently. Dieser Vorgang verlangt besondere Beachtung, weil hier Luftblasen spontan in den Hybridisierkammern This process requires special attention because here bubbles spontaneously in Hybridisierkammern 5 5 entstehen können. may arise. Um dies zu verhindern, kann der Kammerdruck während der Hybridisierung korrigierend angepasst und konstant gehalten bzw. gemäss einem individuellen Programm verändert werden. To prevent this, the chamber pressure can be adjusted by correcting during hybridization and kept constant or changed in accordance with an individual program. Ein solches Programm kann das Erhöhen und Erniedrigen des Kammerdruckes in bestimmten Druck- und Zeitschritten definieren, so dass ein schonendes Hybridisieren der Proben gewährleistet ist, die eine solch spezielle Behandlung verlangen. Such a program can define the increase and decrease of the chamber pressure in certain pressure and time steps so that a gentle hybridizing the samples is ensured that require such special treatment.
    • g) Waschen der hybridisierten Proben mit Puffern. g) washing of the hybridized samples of buffers. Zu diesem Zweck wird zuerst der Kammerdruck auf Normaldruck reguliert, indem die Auslassventile To this end, the chamber pressure is first adjusted to atmospheric pressure by the exhaust valves 14 14 und das Abfallventil and the waste valve 17 17 geöffnet werden. be opened. Darauf werden Waschflüssigkeiten mittels der Förderpumpe Thereupon washing liquids by means of the feed pump 8 8th sequentiell und je nach Bedarf aus den Gefässen sequentially and as needed from the vessels 2 2 durch die entsprechend geöffneten Ventile by the corresponding open valves 4 4 in die Verteilleitung in the distribution line 10 10 und von da über die geöffneten Einlassventile and from there via the open intake valves 12 12 und die Einlassleitungen and the inlet lines 11 11 in die Hybridisierkammern in the Hybridisierkammern 5 5 gepumpt. pumped. Die Waschflüssigkeiten und Waschabfälle verlassen die Hybridisierkammern The washings and washing waste leaves the Hybridisierkammern 5 5 über die Auslassleitungen via the outlet 13 13 und die bereits geöffneten Auslassventile and the already opened outlet valves 14 14 , werden in der Sammelleitung , Are in the collection line 15 15 zusammengeführt und durch das geöffnete Abfallventil together and through the open waste valve 17 17 in die Abfallleitung in the waste line 16 16 abgeführt. dissipated.
    • h) Trocknen der hybridisierten Proben auf den Objektträgern h) drying the hybridized samples on the slides 27 27 . , Zu diesem Zweck werden nur die Ventile For this purpose, only the valves 12 12 , . 14 14 und and 17 17 geöffnet. open. Darauf wird das Inertgasventil Then, the inert gas valve 50 50 geöffnet und die Verteilleitung opened and the distribution line 10 10 , die Einlassleitungen Which inlet lines 11 11 , die Hybridisierkammern That Hybridisierkammern 5 5 , die Auslassleitungen Which outlet 13 13 und die Sammelleitung and the manifold 15 15 über das geöffnete Abfallventil through the open waste valve 17 17 und die Abfallleitung and the waste line 16 16 mit Inertgas durchgespült bis die Proben trocken sind. with inert gas flushed until the samples are dry. Anschliessend könne die fertigen Proben entnommen werden. Then the finished samples could be taken.
  • Alternativ zum eben beschriebenen Verfahrensschritt h) erfolgt das Trocknen der hybridisierten Proben auf den Objektträgern Alternatively, the method just described step h) drying of the hybridised samples is carried out on the slides 27 27 , indem nur die Ventile By using only the valves 12 12 , . 14 14 und and 21 21 geöffnet werden. be opened. Darauf wird das Inertgasventil Then, the inert gas valve 50 50 geöffnet und die Verteilleitung opened and the distribution line 10 10 , die Einlassleitungen Which inlet lines 11 11 , die Hybridisierkammern That Hybridisierkammern 5 5 , die Auslassleitungen Which outlet 13 13 und die Sammelleitung and the manifold 15 15 über das geöffnete Entlastungsventil via the open relief valve 21 21 , die Entlastungsleitung , The relief line 20 20 , den Sammelbehälter , The collection 22 22 und die Entlüftungsöffnung and the ventilation opening 23 23 mit Inertgas durchgespült bis die Proben trocken sind. with inert gas flushed until the samples are dry.
  • Bevorzugt wird auch eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens, bei der auf die zweite Membran Also, an alternative embodiment of the inventive method, it is preferable in the second membrane 33' 33 ' der Agitationseinrichtung the agitator 32 32 verzichtet werden kann. can be dispensed with. Zu diesem Zweck muss ein anderes Medium die Funktion dieses Federelements übernehmen. To this end, another medium must assume the function of this spring element. Dies wird dadurch erreicht, dass nach dem Einfüllen aller an der Hybridisierung teilnehmenden Proben und Medien in die Hybridisierkammern This is achieved in that after the filling of all participating in the hybridization sample and media into the Hybridisierkammern 5 5 alle Ventile geschlossen (vgl. Schritte a–d) und darauf die Auslassventile all the valves closed (see FIG. Steps a-d) and then the exhaust valves 13 13 wieder geöffnet werden. be reopened. Damit wird das mit Luft gefüllte Volumen der Sammelleitung Thus, the volume filled with air, the manifold 15 15 sowie der direkt anschliessende Teil der Abfallleitung and the directly subsequent part of the waste management 16 16 mit den mit Flüssigkeit gefüllten Volumina der Hybridisierkammern with the fluid-filled volumes of the Hybridisierkammern 5 5 verbunden. connected. Die zwischen den geschlossenen Ventilen The agreements concluded between the valves 17 17 , . 19 19 sowie 21 und den Musterflüssigkeiten in den Hybridisierkammern and 21 and the sample liquids in the Hybridisierkammern 5 5 eingeschlossene Luft ist elastisch komprimierbar und bildet nun das gewünschte Federelement. trapped air is resiliently compressible and now forms the desired spring element.
  • Alternativ kann der Schritt c) mit einem Inertgas (zB N 2 ) ausgeführt werden: In diesem Fall können chemische Wechselwirkungen zwischen dem gasförmigen Federelement N 2 und den Proben ausgeschlossen werden. Alternatively, the step c) can be carried out with an inert gas (eg, N 2): In this case, chemical interactions between the gaseous spring element may include N 2, and the samples are excluded.
  • Physikalisches Ausführungsbeispiel Physical embodiment
  • In einer ersten Versuchsreihe wurde die physikalischen Grundlagen untersucht. In a first test series the physical principles was examined. Dazu wurden mehrere 100 Objektträger ohne Proben bearbeitet. For this, several 100 slides were processed without samples. Die vorzugsweise aus einem Elastomer bestehenden O-Ring-Dichtungen The preferably made of an elastomeric O-ring seals 28 28 aus zB Neopren, Silikon, gedrehtem PTFE, Polyethylen oder Viton verhinderten alle erfolgreich einen Flüssigkeitsverlust. of, for example neoprene, silicone, twisted PTFE, polyethylene or Viton all successfully prevented a loss of fluid. Grundvoraussetzung ist selbstverständlich, dass der Anpressdruck auf den Deckel The basic requirement is to be understood that the contact pressure on the lid 26 26 , den O-Ring , The O-ring 28 28 und den Objektträger and the slide 27 27 genügend gross, dh deutlich höher als der erzeugte Kammerdruck ist. , That is large enough substantially higher than the chamber pressure generated. Die verwendeten Hybridisierkammern The Hybridisierkammern used 5 5 umfassten zwischen dem Deckel included between the lid 26 26 und dem Objektträger and the slide 27 27 eine Fläche von 21 × 65 mm. an area of ​​21 × 65 mm. Der Kammerdruck wurde um 1 bar, dh um 10 5 N/m 2 über den Normaldruck der Umgebung angehoben. The chamber pressure was around 1 bar, ie raised by 10 5 N / m 2 above the normal pressure of the environment. Bei einer aktuellen, wirksamen Fläche von 13.65 cm 2 oder 1.365 × 10 –3 m 2 musste somit eine Kraft von mehr als 136.5 N bzw. von ca. 13.9 kp pro Hybridisierkammer In a current, active area of 13.65 cm 2 or 1.365 × 10 -3 m 2 thus had a force of more than 136.5 N or of about 13.9 kp per Hybridisierkammer 5 5 aufgewendet werden, damit sich diese nicht spontan öffnen konnten. be expended so that they could not open spontaneously. Es wird angenommen, dass auch andere Dichtungsformen und Dichtungsmaterialien genügen und einen Flüssigkeitsaustritt verhindern, falls eine entsprechend dem Überdruck in der Hybridisierkammer It is believed that other forms of sealing and sealing materials meet and prevent fluid leakage if a corresponding to the pressure in the Hybridisierkammer 5 5 gewählte Schliesskraft auf den Deckel Selected closing the lid 26 26 , die Dichtung , Gasket 28 28 und den Objektträger and the slide 27 27 ausgeübt wird. is applied.
  • Während beim Standardgerät SN22 im Laufe des Bearbeitens von Slides bzw. Objektträgern mit hydrophoben Oberflächen regelmässig Luftblasen zu beobachten waren, wurden beim erfindungsgemässen Prototypen keinerlei Luftblasen festgestellt. While having hydrophobic surfaces bubbles were observed regularly in the standard device SN22 in the course of processing of slides or slides in the inventive prototypes no bubbles were observed.
  • Biologisches Ausführungsbeispiel Biological embodiment
  • Zum Durchführen eines Beispiels einer erfindungsgemäss unter erhöhtem Druck durchgeführten Hybridisierung wurden zwei Systeme zeitparallel und unabhängig voneinander eingesetzt. For performing an example of the present invention carried out under elevated pressure hybridization were two systems in parallel and time given separately. Es handelt sich dabei um ein Standardgerät des Anmelders (Tecan HS 400, Seriennummer This is a standard device of the applicant (Tecan HS 400, serial number 22 22 ; ; kurz SN22 genannt), welches bei Normaldruck betrieben wurde und um einen erfindungsgemässen Prototypen (kurz PT3 genannt), der bei einem um 0.8 bis 1.0 bar erhöhtem Kammerdruck betrieben wurde. briefly called SN22), which was operated at normal pressure, and (to an inventive prototype PT3 for short), which was operated at a about 0.8 to 1.0 bar superatmospheric chamber pressure. Beide Geräte waren mit einem einander entsprechenden Agitationsmechanismus ausgerüstet, wie er grundsätzlich weiter oben beschrieben wurde. Both devices were equipped with a mutually corresponding agitation mechanism as was generally described above. Diese Agitationseinrichtung This agitator 32 32 in SN22 wurde mit ca. 0.5 bar, diejenige in PT3 mit einem Agitationsdruck von ca. 1.5 bar betrieben. SN22 in that bar was approximately 0.5, operated in PT3 with an agitation pressure of about 1.5 bar. Bei beiden Geräte wurde das Einhalten der genauen Temperatur vorher überprüft; In both devices, the adherence to the exact temperature was checked before; sie wurden (abgesehen von den erwähnten, testbedingten Unterschieden) mit genau gleichen Parametern (zB Temperaturen) betrieben. they were operated (apart from the mentioned test variability) with exactly the same parameters (such as temperatures). Dadurch wurde ermöglicht, dass von den erzielten Resultaten direkte Rückschlüsse auf die Ursachen gezogen werden konnten. This allowed direct conclusions that could be drawn on the causes of the results obtained.
  • Die Hybridisierungsprozedur (Pufferzubereitung, Musterinjektion, Programmdefinierung an den verwendeten Hybridisier-Systemen) wurde gemäss den techni schen Instruktionen von Alopex (ALOPEX GmbH, Fritz-Hornschuch-Str. 9, D-95326 Kulmbach, Bundesrepublik Deutschland) durchgeführt. The hybridization procedure (buffer preparation, sample injection, Programmdefinierung to the used Hybridisier systems) was carried out in accordance with the technical rule instructions from Alopex (ALOPEX GmbH, Fritz-Hornschuch-Str. 9, D-95326 Kulmbach, Germany). In die Hybridisier-Systeme SN22 und PT3 wurden jeweils je zwei Objektträger two each respective slides were in the Hybridisier systems SN22 and PT3 27 27 eingesetzt und bei 43 °C bzw. bei 61 °C prozessiert. used and processed at 43 ° C or at 61 ° C. Von den folgenden bearbeiteten Proben werden die Resultate besprochen: Of the following processed samples, the results are discussed: 43°C 43 ° C 43°C 43 ° C HS 400 SN22 HS 400 SN22 HS 400 PT3 HS 400 PT3 Objektträger #29, #31 Slides # 29, # 31 Objektträger #24, #27 Slides # 24, # 27 61°C 61 ° C 61°C 61 ° C HS 400 SN22 HS 400 SN22 HS 400 PT3 HS 400 PT3 Objektträger #33, #34 Slides # 33, # 34 Objektträger #35, #37 Slides # 35, # 37
  • Verwendet wurde ein Testkit „HybCheck" von Alopex mit der Kit-Chargennummer: 040524). Dieser Testkit dient zur Überprüfung der Hybridisier-Systeme und ist so ausgelegt, dass die Hybridisiertemperaturen vordefiniert sind und dass die „OK" Signale nur bei exaktem Einhalten der vorgesehenen Temperaturen sowie der relevanten Testparameter in Bezug auf Waschen, Agitieren und Trocknen abgegeben werden. a test kit "HybCheck" of Alopex with the kit lot number is used. 040 524) This kit is used to verify the Hybridisier systems and is designed so that the Hybridisiertemperaturen are predefined and that the "OK" signals only with an exact adherence to the prescribed temperatures well as relevant test parameters are given in terms of washing, agitating and drying. Bei den auf den Objektträgern The on slides 27 27 immobilisierten Proben handelt es sich hier um Oligonukleotide, deren Empfindlichkeit auf Temperaturdifferenzen bekannt ist. immobilized samples are here to oligonucleotides whose sensitivity is known to temperature differences.
  • Das ausgeführte Programm für jeden Probelauf lautet im Detail: The running program for each test run is in the details:
    • a) Zubereitung der „HybCheck Waschpuffer 1 und 2 lt. Herstellerangaben; a) Preparation of "HybCheck wash buffer 1 and 2 according to the manufacturer's instructions.
    • b) Lösen von lyophilisierten, fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden in 250 μl auf eine Hybridisiertemperatur (43 °C bzw. 61 °C) vorgewärmtem HybCheck Puffer für die Hybridisierung; b) dissolving lyophilized, fluorescently labeled oligonucleotides in 250 .mu.l to a Hybridisiertemperatur (43 ° C or 61 ° C) preheated HybCheck buffer for hybridization;
    • c) Einlegen von je 2 Objektträgern (mit je 6 Sub Arrays) auf Position 1 und 2 in das Hybridisier-System, Verwendung der grossen Hybridisierungskammern (63,5 mm × 20 mm); c) placing each of 2 slides ((each with 6 sub arrays) at position 1 and 2 in the Hybridisier system, using large hybridization chambers 63.5 mm × 20 mm);
    • d) Schliessen der Hybridisierungskammern und Starten des Hybridisierungsprogrammes; d) closing of the hybridization chambers and starting the hybridization program;
    • e) Hybridisierungsprogramm: 1. Erstes Waschen bei 43 °C bzw. 61 °C, Dauer 30 sec; e) hybridization program: 1. First washing at 43 ° C and 61 ° C, time 30 sec; 2. Injektion von 105 μl der Oligonukleotidlösung bei 43 °C bzw. 61 °C in jede Kammer; 2. injection of 105 ul of the oligonucleotide at 43 ° C and 61 ° C in each chamber; 3. Hybridisierung bei 43 °C bzw. 61 °C; 3. Hybridization at 43 ° C and 61 ° C; bei starker Agitation und während 60 min; under strong agitation and during 60 min; 4. Waschschritt 1 bei 23 °C (Kanal 1) während 30 sec; 4. Wash step 1 at 23 ° C (passage 1) for 30 sec; Absaugen während 30 sec; Suction for 30 sec; 2 Wiederholungen; 2 repeats; 5. Waschschritt 2 bei 23 °C (Kanal 2) während 30 sec; 5. Wash step 2 at 23 ° C (passage 2) for 30 sec; Absaugen während 30 sec; Suction for 30 sec; 2 Wiederholungen; 2 repeats; 6. Trocknen der objektträger während 3 min bei 23 °C; 6. Drying of the slides for 3 min at 23 ° C;
    • f) Nach Beendigung der Hybridisierung wurden beide Objektträger herausgenommen und in einen Laser Scanner (Tecan LS400) eingelegt; f) After completion of hybridization, both slides were taken out and (Tecan LS400) in a laser scanner inserted;
    • g) Messeinstellung des Laser Scanners: 1. Scan Mode: einzelne Wellenlänge 2. Laserwellenlänge: 543 nm (grün) 3. Filterwellenlänge: 590 nm 4. Gain: 165 5. Autofokus Modus: NS Autofokus, Ebene 1 6. Scan Resolution: 10 μm 7. Pinhole: klein 8. Oversampling Faktor: 1 g) measurement settings of the laser scanner: 1. Scan Mode: single wavelength 2. Laser wavelength: 543 nm (green) 3. Filter wavelength: 590 nm 4. Gain: 165 5. Auto Focus Mode: NS autofocus, level 1 6. Scan Resolution: 10 7. micron pinhole: small 8. oversampling factor: 1
    • h) Nach Messung im Laser Scanner wurden die erhaltenen Rohdaten ausgewertet wie folgt: h) After the measurement of the laser scanner, the raw data obtained were evaluated as follows:
  • Hybridisierung bei 43 °C: Hybridization at 43 ° C:
    • 1. 6 Sub Arrays (6×9 Spots) auf einem Objektträger (Microslide) 1. 6 sub arrays (6 x 9 spots) on a glass slide (Micro Slide)
    • 2. Perfect Match (PM) bei 43 °C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array) 2. Perfect Match (PM) at 43 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
    • 3. Mismatch 1 (MM1) bei 43 °C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array) 3. Mismatch 1 (MM1) at 43 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
    • 4. Mismatch 2 (MM2) bei 43 °C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array) 4. Mismatch 2 (MM2) at 43 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
    • 5. Negative Controls: 36 Spots pro Slide (6 pro Sub Array) 5. Negative Controls: 36 spots per slide (6 per sub array)
    • 6. Von allen PM's und MM1's pro Microslide (24 Einzelwerte) wurde der Mittelwert, die Standartabweichung und der CV berechnet. 6. Of all the PM's and MM1's per Microslide (24 individual values) the mean, standard deviation and CV was calculated. Dabei gilt: CV = (Standartabweichung/Mittelwert) × 100 Where: CV = (standard deviation / mean) x 100
    • 7. Diskriminierung PM:MM1 (1:5) sowie Diskriminierung PM:MM2 (1:20) berechnet 7. Discrimination PM: MM1 (1: 5) and discrimination PM: MM2 (1:20) calculated
    • 8. Die CV-Wert und die Diskriminierungs-Werte als „OK" (falls CV über ein ganzes Slide < 18%) oder „failed" angegeben. 8. The CV value and the discrimination values ​​as "OK" (if CV over an entire slide <18%) indicated or "failed".
  • Hybridisierung bei 61 °C: Hybridization at 61 ° C:
    • 1. 6 Sub Arrays (6×9 Spots) auf einem Objektträger (Microslide) 1. 6 sub arrays (6 x 9 spots) on a glass slide (Micro Slide)
    • 2. Perfect Match (PM) bei 61°C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array) 2. Perfect Match (PM) at 61 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
    • 3. Mismatch 1 (MM1) bei 61°C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array) 3. Mismatch 1 (MM1) at 61 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
    • 4. Mismatch 2 (MM2) bei 61°C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array) 4. Mismatch 2 (MM2) at 61 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
    • 5. Negativkontrollen: 36 Spots pro Slide (6 pro Sub Array) 5. Negative controls: 36 spots per slide (6 per sub array)
    • 6. Von allen PM's und MM1's pro Microslide (24 Einzelwerte) wurde der Mittelwert, die Standartabweichung und der CV berechnet. 6. Of all the PM's and MM1's per Microslide (24 individual values) the mean, standard deviation and CV was calculated. Dabei gilt: CV =(Standartabweichung/Mittelwert) × 100 Where: CV = (standard deviation / mean) x 100
    • 7. Diskriminierung PM:MM1 (1:5) sowie Diskriminierung PM:MM2 (1:20) berechnet 7. Discrimination PM: MM1 (1: 5) and discrimination PM: MM2 (1:20) calculated
    • 8. Die CV-Werte und die Diskriminierungs-Werte als „Ok" (falls CV über ein ganzes Slide < 18%) oder „failed" angegeben. 8. The CV values ​​and the discrimination values ​​as "OK" (if CV over an entire slide <18%) indicated or "failed".
  • Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt: 43 °C / HS 400 SN22 The following results were obtained: 43 ° C / HS 400 SN22 CV Perfect Match CV Perfect Match OK OK CV Mismatch 1 CV mismatch 1 OK OK Diskriminierung Perfect Match and Mismatch 1 Discrimination perfect match and mismatch 1 OK OK Diskriminierung Perfect Match and Mismatch 2 Discrimination perfect match and mismatch 2 OK OK Spotqualität spot quality OK OK Negativkontrollen negative controls OK OK Es wurde kein Gradient beobachtet There was no gradient observed
    43 °C / HS 400 PT3 43 ° C / HS 400 PT3 CV Perfect Match CV Perfect Match OK OK CV Mismatch 1 CV mismatch 1 OK OK Diskriminierung Perfect Match and Mismatch 1 Discrimination perfect match and mismatch 1 OK OK Diskriminierung Perfect Match and Mismatch 2 Discrimination perfect match and mismatch 2 OK OK Spotqualität spot quality OK OK Negativkontrollen negative controls OK OK Es wurde kein Gradient beobachtet There was no gradient observed
    61 °C / HS 400 SN22 61 ° C / HS 400 SN22 CV Perfect Match CV Perfect Match OK OK CV Mismatch 1 CV mismatch 1 OK OK Diskriminierung Perfect Match and Mismatch 1 Discrimination perfect match and mismatch 1 OK OK Diskriminierung Perfect Match and Mismatch 2 Discrimination perfect match and mismatch 2 OK OK Spotqualität spot quality #33 failed, #34 OK # 33 failed, # 34 OK Negative Controls negative Controls OK OK Es wurde kein Gradient beobachtet There was no gradient observed
    61°C / HS 400 PT3 61 ° C / HS 400 PT3 CV Perfect Match CV Perfect Match OK OK CV Mismatch 1 CV mismatch 1 OK OK Diskriminierung Perfect Match and Mismatch 1 Discrimination perfect match and mismatch 1 OK OK Diskriminierung Perfect Match and Mismatch 2 Discrimination perfect match and mismatch 2 OK OK Spotqualität spot quality failed failed Negativkontrollen negative controls OK OK Es wurde kein Gradient beobachtet There was no gradient observed
  • Die gezeigten Resultate belegen nicht nur, dass beide verwendeten Geräte sehr brauchbare Resultate liefern. The results shown demonstrate not only that the two devices used provide very useful results. Vielmehr sind die in den beiden Geräten SN22 und PT3 erzielten Resultate (nach Temperaturen geordnet) einander so ähnlich, dass ein Einfluss des erhöhten Druckes auf die Hybridisierung ausgeschlossen werden kann. Rather, the results obtained in the two devices SN22 and PT3 are (in order of temperatures), so similar that an influence of the increased pressure can be excluded on the hybridization.
  • Das erfindungsgemässe Verhindern von Luftblasen ist nicht auf den Einsatz in Hybridisierkammern beschränkt. The inventive prevent air bubbles is not limited to use in Hybridisierkammern. Auch andere Geräte können so ausgebildet sein, dass in ihnen das Auftreten von unerwünschten Luftblasen verhindert werden kann. Other devices may also be formed so that in them the occurrence of undesired air bubbles can be prevented. Solche Geräte oder Instrumente können zB aus dem Bereich der Microfluidics-Technologie stammen, wie etwa „Lab on a Chip" – Systeme. Such devices or instruments can, for example in the field of microfluidics technology derived, such as "lab on a chip" - systems.

Claims (16)

  1. System ( system ( 1 1 ) mit Hybridisierkammern ( ) (With Hybridisierkammern 5 5 ) zum Hybridisieren von auf Objektträgern ( ) For hybridizing (on slides 27 27 ) immobilisierten Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten, wobei jede Hybridisierkammer ( ) Immobilized sample nucleic acids, proteins, or tissue sections, each Hybridisierkammer ( 5 5 ) als ein im wesentlichen spaltförmiger, mit einer Flüssigkeit im wesentlichen befüllbarer Raum zwischen einem dieser Objektträger ( ) (As a substantially gap-shaped, with a liquid-fill substantially the space between one of these slides 27 27 ) und einem Deckel ( ) And a lid ( 26 26 ) definiert ist, und wobei der Deckel ( ) Is defined, and wherein the lid ( 26 26 ) derart gegenüber dem Objektträger ( ) In such a way relative to the slide ( 27 27 ) angeordnet ist, dass die Hybridisierkammer ( ), Is arranged that the Hybridisierkammer ( 5 5 ) gegenüber der Umgebungsluft abgedichtet ist, wobei das System ( ) Is sealed from the ambient air, said system ( 1 1 ) eine Einrichtung zum Verhindern von Luftblasen in den Hybridisierkammern ( ) A means for preventing air bubbles in the Hybridisierkammern ( 5 5 ) umfasst, dadurch gekennzeichnet , dass diese Einrichtung zum Verhindern von Luftblasen in den Hybridisierkammern ( ), Characterized in that said means for preventing air bubbles in the Hybridisierkammern ( 5 5 ) als Druckeinrichtung zum Aufbauen eines Kammer-Drucks in den Hybridisierkammern ( ) As a means for establishing a chamber pressure (in the Hybridisierkammern 5 5 ) ausgebildet ist, wobei dieser Kammer-Druck über dem in der Umgebungsluft herrschenden, normalen atmosphärischen Druck liegt. is formed), said chamber pressurized above the pressure prevailing in the ambient air, normal atmospheric pressure.
  2. System ( system ( 1 1 ) gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Druckeinrichtung zum Aufbauen eines Kammer-Drucks in einem Bereich zwischen 100 mbar bis 1.4 bar über dem normalen atmosphärischen Druck in der Umgebungsluft ausgebildet ist. ) According to claim 1, characterized in that the pressure device for establishing a chamber pressure in a range between 100 mbar to 1.4 bar is formed above the normal atmospheric pressure in the ambient air.
  3. System ( system ( 1 1 ) gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Druckeinrichtung eine Druckquelle ( ) According to claim 1 or 2, characterized in that the printing device (a pressure source 8 8th , . 3 3 ) umfasst, welche über unter Druck setzbare Leitungen ( ) Includes that (on pressurizable lines 9 9 , . 51 51 ) mit den Hybridisierkammern ( ) (With the Hybridisierkammern 5 5 ) verbindbar ist. ) Is connectable.
  4. System ( system ( 1 1 ) gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Druckquelle eine Förderpumpe ( ) According to claim 3, characterized in that the pressure source (a feed pump 8 8th ) oder eine Druckgasflasche ( ) Or a pressurized gas bottle ( 3 3 ) umfasst. ) Includes.
  5. System ( system ( 1 1 ) gemäss Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die unter Druck setzbaren Leitungen ( ) According to claim 3 or 4, characterized in that the pressurizable lines ( 9 9 , . 51 51 ) ein Verbindungsventil ( ), A connecting valve ( 19 19 ), eine Verteilleitung ( (), A distribution line 10 10 ), eine Sammelleitung ( ), A manifold ( 15 15 ) sowie für jede der Hybridisierkammern ( () As well as for each of the Hybridisierkammern 5 5 ) ein Einlassventil ( ) An inlet valve ( 12 12 ) und ein Auslassventil ( ) And an exhaust valve ( 14 14 ) umfassen. ) Include.
  6. System ( system ( 1 1 ) gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die unter Druck setzbaren Leitungen ( ) According to claim 5, characterized in that the pressurizable lines ( 9 9 , . 51 51 ) zudem eine Abfallleitung ( ) Also a waste line ( 16 16 ) mit einem Abfallventil ( ) (With a waste valve 17 17 ) und eine Entlastungsleitung ( ) And a relief line ( 20 20 ) mit einem Entlastungsventil ( ) (With a relief valve 21 21 ) umfasst. ) Includes.
  7. System ( system ( 1 1 ) gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Agitationseinrichtung ( ) According to one of the preceding claims, characterized in that it (a agitation device 32 32 ) umfasst, mit welcher Flüssigkeiten in den Hybridisierkammern ( ) Comprises at which the liquids in the Hybridisierkammern ( 5 5 ) gegenüber den auf den Objektträgern ( ) Compared to the (on the slides 27 27 ) immobilisierten Proben bewegt werden können. ) Immobilized samples can be moved.
  8. System ( system ( 1 1 ) gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Agitationseinrichtung ( ) According to claim 7, characterized in that the agitator ( 32 32 ) eine Überdruckpumpe ( ) A pressure pump ( 46 46 ) und einen Überdruckbehälter ( ) And a pressure vessel ( 47 47 ) umfasst, welche mit je einem Druckraum ( ) Includes, which (each with a pressure chamber 34 34 ) eines Deckels ( () Of a lid 26 26 ) verbindbar sind, wobei der Deckel ( are connected), the cover ( 26 26 ) zudem eine Membran ( ) Further comprises a membrane ( 33 33 ) umfasst, welche den Druckraum ( ) Includes that (the pressure chamber 34 34 ) von einem Agitationsraum ( ) (By an agitation chamber 30 30 ) trennt. ) Separates.
  9. System ( system ( 1 1 ) gemäss Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Agitationseinrichtung ( ) According to claim 7 or 8, characterized in that the agitation means ( 32 32 ) eine Unterdruckpumpe ( ) A vacuum pump ( 48 48 ) und einen Unterdruckbehälter ( ) And a vacuum tank ( 49 49 ) umfasst, welche mit je einem Druckraum ( ) Includes, which (each with a pressure chamber 34 34 ) eines Deckels ( () Of a lid 26 26 ) verbindbar sind, wobei der Deckel ( are connected), the cover ( 26 26 ) zudem eine Membran ( ) Further comprises a membrane ( 33 33 ) umfasst, welche den Druckraum ( ) Includes that (the pressure chamber 34 34 ) von einem Agitationsraum ( ) (By an agitation chamber 30 30 ) trennt. ) Separates.
  10. System ( system ( 1 1 ) gemäss einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Agitationseinrichtung ( ), Characterized in, according to one of claims 7 to 9, wherein the agitation means ( 32 32 ) ein Federelement umfasst, welche einem auf den Druckraum ( ) Comprises a spring element, which one (on the pressure chamber 34 34 ) ausgeübten Über- oder Unterdruck entgegenwirkt. Over- or) exerted negative pressure counteracts.
  11. System ( system ( 1 1 ) gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Federelement als im Deckel ( ) According to claim 10, characterized in that the spring element than in the cover ( 26 26 ) angeordnete, zweite Membran ( ) Arranged (second membrane 33' 33 ' ) oder als in der Sammelleitung ( () Or in the manifold 15 15 ) zwischen dem Abfallventil ( ) (Between the waste valve 17 17 ), dem Verbindungsventil ( (), The connecting valve 19 19 ) und dem Entlastungsventil ( ) And the relief valve ( 21 21 ) angeordneter Luftraum ausgebildet ist. ) Arranged airspace is formed.
  12. System ( system ( 1 1 ) gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Erzeugung des geforderten Kammerdruckes mittels einer Flüssigkeit oder mittels eines Gases ausgebildet ist. ) According to one of the preceding claims, characterized in that it is designed to generate the required chamber pressure by means of liquid or by means of a gas.
  13. System ( system ( 1 1 ) gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit zum Erzeugen des Kammer-Drucks ein von einer Förderpumpe ( ) According to claim 12, characterized in that the liquid chamber for generating the pressure (from a feed pump 8 8th ) in eine Verteilleitung ( ) (In a distribution line 10 10 ) und über Einlassventile ( () And intake valves 11 11 ) gegen die Flüssigkeit in den Hybridisierkammern ( ) (Against the liquid in the Hybridisierkammern 5 5 ) gedrücktes Hybridisiermedium ist. ) Pressed down Hybridisiermedium is.
  14. System ( system ( 1 1 ) gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Gas zum Erzeugen des Kammer-Drucks von einer Förderpumpe ( ) According to claim 12, characterized in that the gas for generating the pressure chamber (of a feed pump 8 8th ) über ein Belüftungsventil ( ) (About a vent valve 9 9 ) angesogene Luft oder ein in einem Behälter ( ) Aspirated air or in a container ( 3 3 ) gespeichertes Inertgas ist, wobei dieses Gas über eine Verteilleitung ( is) stored inert gas, which gas (via a distribution 10 10 ) und über Einlassventile ( () And intake valves 11 11 ) gegen die Flüssigkeit in den Hybridisierkammern ( ) (Against the liquid in the Hybridisierkammern 5 5 ) gedrückt wird. ) Is pressed.
  15. System ( system ( 1 1 ) gemäss einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Druckraum ( ) According to one of claims 12 to 14, characterized in that it (a pressure chamber 34 34 ) umfasst, der im Deckel ( ) Which (in the cap 26 26 ) angeordnet ist und mit einer Membran ( ) And with a membrane ( 33 33 ) gegenüber einem Agitationsraum ( ) Relative to a agitation chamber ( 30 30 ) abgetrennt ist, in welchem ein Agitationsdruck aufgebaut werden kann, der um 0.5 bis 1 bar höherer ist als der gewünschte Kammer-Druck ) Is separated, in which an agitation pressure may be built up which is higher by 0.5 bar to 1 than the desired chamber pressure
  16. System ( system ( 1 1 ) gemäss Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es eine zweite, im Deckel ( ) According to claim 15, characterized in that there is a second, in the cover ( 26 26 ) angeordnete Membran ( ) Arranged membrane ( 33' 33 ' ) oder ein mit einem Gas gefülltes Volumen einer Sammelleitung ( ) Or filled with a gas volume of a manifold ( 15 15 ) und einer direkt an diese anschliessenden Abfallleitung ( ) And a (directly adjoining this waste line 16 16 ) umfasst, die zwischen geschlossenen Ventilen ( ) Which (between the valves closed, 17 17 , . 19 19 , . 21 21 ) liegen und ein Federelement bilden, welches diesem Agitationsdruck entgegen wirkt. ) Lie and form a spring element which counteracts this agitation pressure.
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R150 Term of protection extended to 6 years

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R151 Term of protection extended to 8 years

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