-
Kardiovaskuläre Erkrankungen
in Form von Herzinfarkt, Schlaganfall und peripheren Gefäßverschlüssen zählen in
den Industrienationen zu den Haupttodesursachen. Die diesen Erkrankungen
zugrundeliegende Arteriosklerose, d.h. die zunehmende Gefäßeinengung,
ist ein multifaktoriell über
Jahrzehnte ablaufender Prozess, bei dem die Ablagerung von Cholesterin
in Gefäßwandzellen
eine zentrale Rolle spielt. Neben Rauchen, Bluthochdruck und erhöhten LDL-(Low-Density-Lipoprotein)-Cholesterin-Konzentrationen
zählen
erniedrigte HDL-(High-Density-Lipoprotein)-Cholesterin-Konzentrationen
zu den die Arteriosklerose begünstigenden
Faktoren (D Gordon & BM
Rifkind, (1989), New England Journal of Medicine 321:1311-1315).
-
Die
Konzentration des Apolipoproteins A-I (Apo A-I), des Hauptstrukturproteins
der HDL stellt einen Indikator für
das Risiko der Entwicklung kardiovaskulärer Erkrankungen dar (JJ Maciejko,
et al., (1983), New England Journal of Medicine, 309:385-9; P Puchois,
et al., (1987) Atherosclerosis, 68:35-40). Dabei deuten niedrige
Apo A-I Konzentrationen auf ein erhöhtes Risiko hin, während hohe
Apo A-I-Konzentrationen auf ein eher niedriges Risiko schließen lassen.
-
LDL
und HDL spielen bei der Ablagerung von Cholesterin in Gefäßwandzellen
eine inverse Rolle. Während
hohe LDL-Konzentrationen zu einer vermehrten Ablagerung von Cholesterin
in Gefäßwandzellen führen, indem
sie Cholesterin zu den peripheren Zellen transportieren und damit
die Arteriosklerose begünstigen, üben hohe
HDL-Konzentrationen eine protektive d. h. antiarteriosklerotische
Wirkung aus.
-
Die
antiarteriosklerotische Wirkung der HDL wird auf den sogenannten
reversen Cholesterintransport (RCT; S Eisenberg, (1984), Journal
of Lipid Research 25:1017-1058) zurückgeführt, bei dem Cholesterin über eine
HDL-Vermittlung
aus peripheren Zellen mobilisiert wird, um anschließend zur
Leber transportiert und dort zu Gallensäuren umgewandelt und über die
Gallenflüssigkeit
ausgeschieden zu werden.
-
Die
Cholesterinaufnahme erfolgt entweder über einen diffusionsähnlichen
Prozeß,
der auch von anderen im Blut zirkulierenden Cholesterinakzeptoren,
wie beispielsweise Albumin, induziert werden kann, oder aber über einen
HDL-spezifischen, rezeptor-abhängigen
Prozeß (WJ
Johnson et al., (1991), Biochimica Biophysica Acta 1085:273-298;
GH Rothblat et al., (1999), Journal of Lipid Research 40:781-796;
JF Oram & S Yokoyama,
(1997), Journal of Lipid Research 37:2473-2482). Dabei erfolgt die
Vermittlung der Rezeptorinteraktionen und die nachfolgende Aktivierung
zellulärer
Signalkaskaden durch das Apo A-I.
-
Die
bekannten Therapiekonzepte zur Behandlung und zur Prävention
von Arteriosklerose streben im wesentlichen die Reduktion der LDL
und ihrer Vorläufer
VLDL (Very-Low-Density-Lipoproteine) an. Dazu ist es beispielsweise
bekannt, Fibrate oder Nikotinsäurederivate
einzusetzen, die durch eine Verminderung der Synthese und durch
einen verstärkten
Abbau potentiell antherogener VLDL die Konzentration von Plasmatriglyzeriden
und Plasmacholesterin senken. Die Applikation dieser Substanzen
weist lediglich als Nebeneffekt eine Steigerung der HDL-Konzentration
auf, die mögli cherweise
darauf zurückzuführen ist,
daß bei
der Lipolyse der triglyzeridreichen VLDL- und HDL-Vorstufen generiert
werden. Diese nehmen nachfolgend auch am RCT teil (J Shepherd, (1993),
Postgraduate Medical Journal 69 Suppl 1: S34-41). Möglicherweise
induzieren Fibrate zudem die Apo A-I Synthese (ML Kashyap, (1998),
American Journal of Cardiology 82: 42U-48U).
-
Ebenso
ist es bekannt, durch die Applikation von Ionenaustauscherharzen
die Konzentration der potentiell antherogenen LDL zu senken. Dieser
Effekt beruht im wesentlichen darauf, daß die Ionenaustauscherharze
im Darm Gallensäuren
binden, die damit dem enterohepatischen Kreislauf entzogen und vermehrt
mit dem Stuhl ausgeschieden werden. Der somit erhöhte Entzug
von Cholesterin induziert eine Steigerung der LDL-Rezeptorexpression
in der Leber, was eine Konzentrationssenkung der LDL zur Folge hat.
Aus nicht geklärten
Ursachen wird bei diesem Therapieansatz auch die Apo A-I Synthese
geringfügig
induziert (J Sheperd, (1989), Cardiology 76 Suppl 1: 65-71).
-
In
einem weiteren therapeutischen Ansatz wird durch die Applikation
von sogenannten HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren ebenso versucht, über eine
Hemmung der HMG-CoA-Reduktase, des Schlüsselenzyms der Choleristin
Biosynthese, und über
eine Steigerung der Expression der LDL-Rezeptoren in der Leber eine Senkung
der LDL-Konzentration zu erreichen. Diese auch als Statine bezeichneten
Substanzen können
eine Reduktion des potentiell antherogenen LDL-Cholesterins bis
zu 60 % erzielen (D Waters, et al., (1996), American Journal of
Medicine 101:4A34S-38S; The Lancet, (1996), 348:1339-1342; Cullen & G Assmann, (1997), American
Journal of Cardiology 15:1287-1294). Eine Modulation der HDL-Konzentration
durch die Applikation von Statinen erfolgt dagegen nicht, oder die
Applikation dieser Substanzen weist lediglich als Nebeneffekt eine (geringgradige)
Steigerung der HDL-Konzentration auf.
-
In
einem weiteren Ansatz wird Probucol als Lipidsenker appliziert.
Probucol mit seiner antioxidativen Wirkung wirkt einer chemischen
Modifikation von Lipoproteinen entgegen und senkt damit ihr atherogenes
Potential. Damit geht jedoch eine sichtbare Senkung der positiven
HDL-Konzentration einher.
-
Diese
bekannten therapeutischen Konzepte greifen übereinstimmend an der Senkung
der LDL-Konzentration, d. h. des "schädlichen" Cholesterins bzw.
der Vorläuferlipoproteine
VLDL, an. Eine Steigerung der HDL, d.h. des "nützlichen" Cholesterins, erfolgt
dabei bestenfalls in geringem Umfange als unbeabsichtigter Nebeneffekt
oder aber es wird einer HDL-Steigerung sogar entgegengewirkt, wie
beispielsweise durch die Applikation von Probucol. Eine gezielte
Modulation des HDL ist nicht möglich
und wird auch nicht angestrebt.
-
Alternative
Strategien versuchen, einer Arteriosklerose-Entwicklung durch den
Eingriff in den HDL-vermittelten reversen Cholesterintransport zu
begegnen. Dazu wird beispielsweise rekombinant hergestelltes Apo A-I
verwandt, das eine vermehrte Cholesterinausscheidung mit dem Stuhl
bewirkt (M Eriksson et al., (1999), Circulation 100:594-598). Dazu
muß das
rekombinante Apolipoprotein in kurzen Abständen intravenös infundiert
werden, so daß die
Therapie schwierig ist.
-
Ebenso
ist es bekannt, den RCT durch Erhöhung der zellulären Verfügbarkeit
von freiem Cholesterin durch Inhibition des Enzyms ACAT (Acyl: CoA-Cholesterin-Acyltransferase)
zu erhöhen.
ACAT verestert freies Cholesterin in der Zelle und reduziert damit
sein antherogenes Potential. Die Inhibition von ACAT beinhaltet somit
einen potentiell positiven und einen potentiell negativen Aspekt.
Der positive Effekt kommt dann zum Tragen, wenn das vermehrt anflalende
freie Cholesterin auch quantitativ die Zelle verlassen kann. Die
ACAT-Inhibition könnte
jedoch insbesondere bei hohen LDL-Konzentrationen oder nicht ausreichender
Effluxkapazität zu
einer Schaumzellbildung führen
und damit die Arterioskleroseentwicklung sogar begünstigen.
-
Davon
ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Substanz zur
Herstellung eines Arzneimittels und ein therapeutisches Konzept
bereitzustellen, das eine verbesserte Therapie und Prävention
von Arteriosklerose und die dadurch verursachten kardiovaskulären Erkrankungen,
insbesondere Herzinfarkt, Schlaganfall und peripheren Gefäßverschlüssen, ermöglicht.
-
Diese
Aufgabe wird gelöst
durch die Verwendung von Serin/Threonin-Protein-Phosphatase-Inhibitoren
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prävention
von Arteriosklerose und kardiovaskulären Erkrankungen.
-
Der
Erfindung liegt dabei der Gedanke zugrunde, durch die Applikation
von Serin/Threonin-spezifischen Protein-Phosphatase-Inhibitoren
die Aktivität
dieser Phosphatasen zu regulieren und damit den RCT zu stimulieren.
-
Die
Stimulation des RCT durch Serin/Threonin-spezifische Protein-Phosphatase-Inhibitoren
beruht dabei auf folgendem Mechanismus:
Die Cholesterinmobilisierung über den
RCT setzt voraus, daß HDL-assoziiertes
oder freies Apo A-I an einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor binden
und damit membranständige
Lipasen, beispielsweise die Phospholipasen C und D sowie Adenylzyklasen
aktivieren kann. Dadurch entstehen Second-Messanger wie Diacylglycerin (DAG),
Phosphatidsäure
(PA) und cAMP. Diese aktivieren anschließend Proteinkinasen, beispielsweise die
Serin/Threonin-spezifische Proteinkinase C, die anschließend die
Phosphorylierung mindestens fünf
verschiedener Phosphoproteine induzieren kann, u.a. auch des ATP-Kassettentransporters
ABC-1. Die Phosphorylierung dieser Proteine aktiviert den Transport
intrazellulär
gespeicherten Cholesterins zur Zelloberfläche, von wo das Cholesterin
von freiem Apo A-I oder unspezifischen Cholesterinakzeptoren, wie
beispielsweise Albumin aufgenommen und zur Leber transportiert werden
kann.
-
Eine
andere Gruppe von Enzymen, die sogenannten Serin/Threonin-spezifischen
Protein-Phosphatasen (Ser/Thr-PPs) können diese Signalkaskade regulieren,
indem sie die Serin/Threonin-Aminosäurereste dephosphosphorylieren
und somit die entsprechenden Enzyme in ihrer Aktivität kontrollieren
(D Barford, (1996), Trends in Biochemical Science 21:407-412).
-
Der
Kern der Erfindung liegt nun darin, diese Serin/Threonin-spezifischen
Proteinphosphatasen zu inhibieren, und somit den Transport des Cholesterins
aus der Zelle zu erhöhen.
-
Die
erfindungsgemäße Verwendung
der Serin/Threonin-spezifischen Protein-Phosphatase-Inhibitoren
(nachfolgend auch Ser/Thr-PP-Inhibitoren) kann den Cholesterin-Netto-Efflux
deutlich erhöhen.
Diese Erhöhung
kann beispielsweise das 6- bis 8-fache des Effluxes von unbehandelten
Zellen betragen. So konnte gezeigt werden, daß die Applikation von Ser/Thr-PP-Inhibitoren in kultivierten
menschlichen Fibroblasten innerhalb einer nur 2-stündigen
Inkubationszeit zu einer Mobilisierung von bis zu 30 % des gesamten
zellulären Cholesterins
führen
kann, was – verglichen
mit dem Efflux ausschließlich
in Anwesenheit von Albumin – einer 6-fachen
Steigerung gleichkommt. Eine 8-fache Steigerung der Mobilisierung
intrazellulär
gespeicherten Cholesterins in Albumin-haltiges Medium kann durch
Pulse-Chase-Inkubation
mit 14C-Mevalonolacton oder 14C-Acetat
nachgewiesen werden.
-
Unterhalb
eines Sättigungsbereiches
können
die Serin/Threonin-spezifischen Protein-Phosphatase-Inhibitoren
eine konzentrationsabhängige
Wirkung zeigen, die im nanomolaren bis mikromolaren Bereich liegt,
so daß eine
pharmakologische Nutzung möglich
ist.
-
Ein
wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Verwendung liegt darin,
daß die
Ser/Thr-PP-Inhibitoren in der Spezifität und Effektivität ihrer
Wirkung dem Apolipoprotein-I entsprechen und sogar es in seiner
Effektivität übertreffen
können.
Daraus ergibt sich der weitere Vorteil, daß eine Modulation der den spezifischen Cholesterin-Efflux
induzierenden Signalkaskade durch die Ser/Thr-PP-Inhibitoren möglich sein
kann. So kann in kultivierten Zellen durch die Applikation von Ser/Thr-PP-Inhibitoren
eine Hyperphosphorylierung derselben Proteine erreicht werden, die
auch durch Apolipoprotein-I phosphoryliert werden. Dabei kann es
sich beispielsweise um 5 Phosphoproteine mit jeweils 14, 18, 65,
71 oder 250 kD handeln, von denen das 250 kD Protein als ATP-Kassettentransporter
identifiziert wurde. Des weiteren kann durch Ser/Thr-Kinase-Inhibitoren
swohl die Wirkung von Apo A-I als auch von Ser/Thr-PP-Inhibitoren
inhibiert werden.
-
Ein
weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verwendung der Ser/Thr-PP-Inhibitoren besteht
in ihrer antiproliferativen Wirkung. Dies kann insbesondere dann
positiv genutzt werden, wenn die antiproliferative Wirkung der Ser/Thr-PP-Inhibitoren
die mitogene Wirkung des HDL ausgleichen kann. Dieser Effekt kann
gerade bei der Beeinflussung der Pathogenese von Arterioskleroseentwicklung
nutzbringend eingesetzt werden, da Wachstumsprozesse dabei eine
wesentliche Rolle spielen. Da die Ser/Thr-PP-Inhibitoren eine noch
weitaus stärkere
antiproliferative Wirkung als Apo A-I zeigen und z.B. den Bromdeoxyuridin-Einbau
in replizierende DNA noch mindestens 2-3-fach effektiver hemmen
können
als Apo A-I, kann die erfindungsgemäße Verwendung darüber hinaus
vorteilhaft in der Behandlung anderer proliferativer Prozene, also
z.B. von malignen Tumoren und gutartigen Geschwülsten, eingesetzt werden.
-
Die
erfindungsgemäße Verwendung
kann nicht nur vorteilhaft in der Prävention arteriosklerotischer Veränderungen
und damit zur Prävention
von kardiovaskulären
Ereignissen eingesetzt werden, sondern kann aufgrund ihres Wirkprinzips
auch dem Abbau bereits bestehender Gefäßwandverän derungen und arteriosklerotischer
Plaques und von anderen pathologischen Lipidansammlungen, beispielsweise
im Rahmen von Lipidspeichererkrankungen, dienen.
-
Des
weiteren kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung
für die
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Tangier-Krankheit
verwendet werden. Der Tangier-Krankheit liegt ein zellulärer Defekt
der Apo A-I-vermittelten
Cholesterinmobilisierung und der HDL-Bildung zugrunde, womit eine
Störung
der Apo A-I-vermittelten Signalübertragung
verbunden ist (M Walter et al., (1994), Biochemical, Biophysical
Research Communications 205:850-856; Francis, et al., (1995), Journal
of Clinical Investigation 96:78-87;
M. Walter et. al. (1996), Journal of Clinical Investigation 98:2315-2323).
Dies kann beispielsweise auf eine durch eine Stop-Kodon-Mutation
verursachte ABC-1-Defizienz zurückgehen.
Beispielsweise bei Tangier-Patienten, die noch Restaktivitäten im spezifischen
Cholesterin-Efflux aufweisen, wie z.B. Patienten mit heterozygoten
Mutationen ober bei Mutationen, die nicht mit einer kompletten Funktionseinbuße des ABC-1
einhergehen, kann die Applikation von Ser/Thr-PP-Inhibitoren erhebliche
therapeutische Verbesserungen eröffnen.
Da Ser/Thr-PP-Inhibitoren auch bei komplettem ABC-1-Mangel noch
eine erhebliche Restaktivität
bei der Cholesterineffluxverstärkung
von mind. 60 % aufweisen können,
ist darüber
hinaus auch die Therapie von homozygoten Tangier-Patienten möglich.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden die Ser/Thr-PP-Inhibitoren mit weiteren pharmakologisch wirksamen
Substanzen kombiniert, beispielsweise mit ACAT-Inhibitoren, da die
daraus resultierenden Synergieeffekte die Therapie arteriosklerotischer
Erkrankungen erheblich verbessern können. Diese beruhen im Falle
der ACAT-Inhibitoren auf der erhöhten
Verfügbarkeit
des zellulären
Cholesterins, das durch die Applikation der Ser/Thr-PP-Inhibitoren
anschließend
verstärkt
aus der Zelle abtransportiert werden kann.
-
Auch
die Kombination mit Statinen kann zu einer deutlichen Verbesserung
der Therapie führen.
Statine nämlich,
wie bereits ausgeführt,
senken den Anteil des "schädlichen" Cholesterins, während sie
die HDL-Konzentration kaum beeinflussen. Da die Ser/Thr-PP-Inhibitoren
ihrerseits, wie das Apo A-I,
den spezifischen Cholesterin-Efflux induzieren, wird durch die simultane
Applikation von Ser/Thr-PP-Inhibitoren und Statinen der für die Ausprägung arteriosklerotischer
Erkrankungen wesentliche Quotient aus LDL-Cholesterin und HDL-Cholesterin
positiv beeinflußt.
Er kann in besonders vorteilhafter Weise zur Abschätzung des
Erkrankungsrisikos herangezogen werden.
-
Besonders
vorteilhaft kann die Kombination eines oder mehrere Ser/Thr-PP-Inhibitoren mit Medikamenten
sein, die als (unerwünschte)
Nebenwirkung eine HDL-Konzentrationserniedrigung aufweisen, wie
z.B. der Lipidsenker Probucol, aber auch andere Medikamente bzw.
Hormone, wie Gestagene, Androgene, Kortikoide, β-Blocker und Thiaziddiuretika,
da eine niedrige HDL-Konzentration und Ser/Thr-PP-Inhibitoren synergistische
Effekte zeigen können.
Diese können
konzentrationsabhängig
variieren, und sind beispielsweise bei niedrigen Konzentrationen
der Inhibitoren stärker
ausgeprägt
als bei hohen Konzentrationen.
-
Aufgrund
des vorgenannten Synergieeffektes bei niedrigen HDL- und Inhibitor-Konzentrationen
können
Ser/Thr-PP-Inhibitoren auch vorteilhaft bei anderen HDL-Mangel-Syndromen
eingesetzt werden, wie z.B. Apo A-I-Synthesedefekten, Apo A-I-Mutationen
mit herabgesetztem HDL-Cholesterin, LCAT (Lecithin: Cholesterin-Acyltransferase)-Mangel
der Fish-Eye-Erkrankung,
einem Lipoproteinlipase-Mangel oder anderen HDL-Mangel-Syndromen.
-
In
einer weiteren vorteilhaften Verwendung können Ser/Thr-PP-Inhibitoren
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung des Diabetes
mellitus verwendet werden. Auch hier können Ser/Thr-PP-Inhibitoren der
häufig
bei Diabetes-Patienten beobachteten stark erniedrigten HDL-Cholesterin-Kon zentration
entgegenwirken und so die damit einhergehende vorzeitige Arterioskleroseentwicklung
positiv beeinflussen.
-
Diese
Wirkung kann darauf zurückgeführt werden,
daß die
Ser/Thr-PP-Inhibitoren in menschilchen Fibrolasten, die Phosphorylase-Phosphatase,
als wichtiges Regulatorenzym des Gluctosestoffwechsels konzentrationsabhängig verstärken. Hinsichtlich
der Effektivität
weisen einzelne Inhibitoren Unterschiede auf, d.h. so ist Calyculin
effektiver als Okadsäure,
und das wiederum effektiver als Cantharidin. Es kann daraus abgeleitet
werden, daß Ser/Thr-PP-Inhibitoren
in menschlichen Haut-Fibrolasten nicht nur die zelluläre Cholesterinhomöostase,
sondern auch die Glucosehomöostase
beeinflussen, und daß die
Beeinflussung der Glucosehomöostase über dieselben
Signalwege vermittelt werden, über
die auch das Apo A-I einen Cholesterinefflux induziert.
-
Vorteilhafterweise
können
Ser/Thr-PP-Inhibitoren somit auch nutzbringend in der Therapie anderer Symptome
des Diabetes eingesetzt werden, beispielsweise bei einer auf eine
erhöhte
Aktivität
Ser/Thr-spezifischer Proteinphosphatasen zurückgehenden Pathogenese des
nicht-insulin-abhängigen
Diabetes und einer vermehrten Glykogeneinlagerung einschließlich des
damit verbundenen Übergewichts
(RN Margolis (1987), Life Sciences 41:2615-1622).
-
Ein
weiterer wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Verwendung der Ser/Thr-PP-Inhibitoren
besteht in ihrer eine Hyperphosphorylierung der ATRP-Kassettentransportern,
insbesondere des ABC-1 induzierenden Wirkung.
-
Erkrankungen,
die im wesentlichen auf einen Defekt eines ATP abhängigen Transports
zurückzuführen sind,
genutzt werden. Erfindungsgemäß können daher
Ser/Thr-PP-Inhibitoren vorteilhaft in therapeutischen Ansätzen zur
Behandlung der Cystischen Fibrose, der Adrenoleukodystrophie, der
Retinitis pigmentosa, der Sideroblastenanämie, der Ataxie, Stargardt-Krankheit
und anderer erblicher intrahepatischer Cholestasen verwendet werden.
Der Zusammenhang zwischen diesen Krankheitsbildern und Defekten
in ATP-Kassettentransportern ist in der Literatur beschrieben: T
Hoof, et al., Journal of Biological Chemistry 269:20575-20583; V
Feigenbaum, et al., (1996), Am J Hum Genet 58:1135-1144; DG Birch,
(1999), Mol Genet Metab 66:356-366; R Allikments, et al., (1999),
Hum Mol Genet 8.743-749; R Lewis et al., (1999), Am J Hum Genet
64:422-434; SS Strautnieks, et al., (1998), Nat Genet 20:233-238;
M Wada, et al., Hum Mol Genet 7:203-207.
-
In
einer vorteilhaften Ausführungsform
werden Ser/Thr-PP-Inhibitoren aus der Gruppe folgender Substanzen
ausgewählt:
Cantharidin, Calyculin, Okadasäure,
Endothall sowie deren Derivate, beispielsweise das Norcantharidin.
-
Die
Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen beschrieben, denen
folgende Methodik zugrundeliegt:
-
1. Verwendete Zellen:
-
Menschliche
Fibroblasten gesunder Kontrollpersonen und zweier homozygoter Tangierpatienten,
sowie Makrophagen der Zellinie THP-1 für die Immunpräzipitation
von ABC-1 und Cholesterineffluxmessungen, werden mit üblichen
Verfahren gewonnen. Die Gewinnung und Präparation der Fibroblasten ist
in verschiedenen Publikationen beschrieben, z.B. M Walter et al.,
(1995), Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 15:1975-1986; M Walter et
al., (1996), Journal of Clinical Investigation 98:2315-2323; M Walter
et al., (1994), Biochemical, Biophysical Research Communications,
205:850-856.
-
Die
Cholesterinbeladung der etwa 90 % konfluenten Zellen erfolgt 48
h bei 37°C
in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) in Anwesenheit von Fibroblasten
Basalmedium (Bio Whittacker), 0.5 mM Mevalonolacton, 1 mg/ml bovinem
Serumalbumin und 1 % Antibiotika/Antimykotika-Lösung (Sigma).
-
2. Präparation der Lipoproteine und
des Apolipoprotein A-I:
-
HDL3, die Apo A-I-haltige Hauptfraktion der
HDL, wird mittels differentieller Ultrazentrifugation (d = 1.125-1.210
g/ml) aus frischem menschlichen Plasma isoliert und gegen 0.3 mM
Tris-HCl Puffer (pH 6.8), 0.15 M NaCl, dialysiert. Apo A-I wird
mittels HPLC präpariert,
wie in A von Eckardstein et al., (1990), Journal of Biological Chemistry
265:8610-8617 beschrieben.
-
3. Cholesterineffluxmessungen:
-
Nach
Cholesterinbeladung der Zellen mit dem Cholesterinvorläufermolekül Mevalonolacton
werden die Zellen mit PBS-Albumin (PBS mit 1 mg/ml Albumin) gewaschen
und für
2 h bei 37°C
in bikarbonatfreiem DMEM-Hepes, 1 mg/ml Albumin mit unterschiedlichen
Konzentrationen HDL, Apo A-I oder entsprechendem Phosphatase-Inhibitor
inkubiert. Nach der zweistündigen
Inkubationszeit werden die Effluxmedien gesammelt, die Zelllayer
werden mit 1 ml PBS-Albumin gewaschen und die Waschlösung jeweils
mit den Effluxmedien vereinigt. Die Cholesterinmasse in den Effluxmedien
wird mit Gaschromatographie nach P Cullen et al., (1997), Analytical
Biochemistry, 251:39-44 gemessen. 5 μg 5b-cholestan-3a-ol wird zu
den Effluxmedien als interner Standard addiert. Nach Derivatisierung
mit Trimethylsilylether wird die Cholesterinmessung mit einem Dani 8521
Gaschromathographen (Monza, Italien) vorgenommen, ausgestattet mit
einem programmierbaren Injektor (PTV), einer CP-Wax 57CB Silikakapillarsäule (25
m × 0.32
mm ID, 0.2 μm
Filmdicke, Chromspec, Bridgewater, NJ), einem Flammenionisationsdetektor
und einem Chromatogramm Datenprozessor MT2 (Kontron, Neufahrn).
Das zelluläre
freie und veresterte Cholesterin wird nach P Cullen et al., (1997),
Journal of Lipid Research, 38:401-409 in der HPLC-Methodik getrennt,
wobei eine Kontron Anlage (Neufahrn, Deutsch land) und eine 3 μm Spherisorb
ODS2 250 × 4
mm Säule
(Phase Separations, Queensferry, UK) eingesetzt wird. Die Mobilisierung
intrazellulär
gespeicherten Cholesterins wird nach dünnschichtgromatographischer
Auftrennung der Cholesterinderivate in Effluxmedium und Zellextrakten
und Auswertung mittels Phosphoimager vorgenommen, nachdem die Zellen
zuvor mit 10 μCi 14C-Acetat oder 14C-Mevalonolacton
mittels Pulse-Chase-Technik markiert
werden, wie in M Walter et al., (1994), Biochemical, Biophysical
Research Communications, 205:850-856 beschrieben.
-
Calyculin,
Cantharidin, Okadasäure,
Tyrphostin A25 oder Vanadat können
von Calbiochem (Bad Soden, Deutschland) bezogen werden. Alle Radionuklide
können
von Amersham (Braunschweig, Deutschland) geliefert werden. Alle
anderen Reagenzien sind bei Sigma (Deisenhofen, Deutschland) in
der höchstmöglichen Reinheit
erhältlich.
-
4. Nachweis der Phosphoproteine:
-
Die
Zellen werden zweimal in phoshatfreier Lösung (Na+-Hepes-Puffer),
bestehend aus 132 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.2 mM MgCl2,
10 mM Glukose, 10 mM Hepes und 2.5 mM Natriumpyruvat, pH 7.4, bei
37°C gewaschen
und mit 5mCi 32 P-markiertem Orthophosphat
für 2 h
bei 37°C
inkubiert.
-
Nach
einer 30 minütigen
Inkubationsperiode bei 37°C
wird die Reaktion mit SDS-Lösung,
bestehend aus 62.5 mM Tris, 10 % SDS (w/v), 10 % Glyzerin (v/v),
0,6 % DL-Dithiothreitol (w/v) und Spuren von Bromphenolblau, pH
6.8, gestoppt. Die Proben werden nach kurzer Erhitzung auf 95°C in 100 μl Aliquots
(entsprechend 20-30 μg
Protein) auf ein 5%-iges, ein 7.5%-iges und ein 10%-iges SDS-Gel
aufgetragen. Die Gele werden nach dem Lauf getrocknet, und die in
die jeweiligen Phosphoproteine inkorporierte Radioaktivität wird mit einem
Phosphoimager quantifiziert und mit der ImageQuant Software (Molecular
Dynamics, Sunnyvale, USA) ausgewertet (J Neumann et al., (1993),
American Journal of Physiology 265:H257-266). ABC-1 wird in 32P- und 33P-markierten
Zellextrakten mit Hilfe eines Antipeptid Antikörpers durch Immunfällung und
anschließender elektrophoretischer
Auftrennung identifiziert. THP-1 Monozyten von der American Type
Culture Collection werden mit Azetyl-LDL (100 μg/ml; 24 h) cholesterin-beladen.
Die Zellen werden mit 100 μCi/ml 33P für
4 h markiert, gewaschen und mit den Phosphatase-Inhibitoren 30 min
inkubiert. Die Reaktion wird durch Zufügen von 0.05 M NaOH gestoppt.
-
5. Messung des Zellwachstums:
-
Der
Einfluß von
Apo A-I, HDL und Phosphatase-Inhibitoren auf das Wachstum der Zellen
wird durch Messung der DNA-Synthese verfolgt. Hierzu wird der Bromdeoxyuridin
(BrdU) Einbau in DNA mit Hilfe eines ELISA-Testkits quantifiziert
(Roche, Mannheim). Fibroblasten werden in den ELISA Vertiefungen
ausgesät
und in DMEM, 10 % FCS für
6 h inkubiert. Nach Waschen der Zellen und Inkubation in DMEM, 1
mg/ml Albumin für
20 h wird eine nochmalige 20 h Inkubation in Anwesenheit von HDL,
10% FCS, Apo A-I oder Albumin (Kontrolle) angeschlossen. Entsprechend
der Vorschrift des Herstellers wird der Peroxidase-gekoppelte Antikörper für 2 h zugegeben.
Die Einbaurate wird mittels Immunfluoreszenz mit einem Dynatech
MR600 Gerät
bei 450 nm gemessen.
-
6. Messung der Phosphorylase-phosphatase
Aktivität:
-
Die
Phosphorylase-phosphatase Aktivität wird durch Freisetzung von 32P aus Phoshorylase a in Fibroblasten-Homogenaten
in Ab- und Anwesenheit verschiedener Inhibitor-Konzentrationen gemessen,
entsprechend einer etablierten Methodik (J. Neumann et al., (1993),
American Journal of Physiology 265:H257-266). Das Inkubationsgemisch
enhält
0,1 mM E DTA, 5mM Caffein, 20 mM Tris HCl (pH 7.0 bei 37°C) und 0,1
% β-Mercaptoethanol.
Die Reaktion wird durch Zugabe von Homogenat gestartet und durch
Zugabe von 50 % Trichloressigsäure
gestoppt. Das präzipitierte Protein
wird abzentrifugiert (14000 g, 4°C,
5 min) und die Radioaktivität
wird in TriCarb (Ganbesra-Packard) gemessen.
-
Beispiele
-
Beispiel 1:
-
Einfluß verschiedener Agonisten (Albumin,
Apo A-I und Ser/Thr-PP-Inhibitoren) auf den Cholesterinefflux aus menschlichen
Fibroblasten
-
Dargestellt
ist der Netto-Cholesterinausstrom aus menschlichen Fibroblasten
4 h nach Zugabe von Apo A-I oder Ser/Thr-PP-Inhibitoren in Anwesenheit
von 1 mg/ml Albumin. Die gesamte Cholesterinmasse im Zellkulturüberstand
wird mittels Gaschromatographie gemessen. Der Cholesterinausstrom
in Anwesenheit von Albumin allein wird als 100% Wert definiert.
Der 100% Wert liegen bei 1.7 μg
Cholesterin pro mg Zellprotein. Angegeben ist jeweils der Mittelwert ± Standardabweichung
(n = 4).
-
In
Fibroblasten des Tangier-Patienten TD1 mit kompletter ABC1-Defizienz
(Patient beschrieben in: S Rust et al., (1999), Nature Genetics
22:352-355) ist
die durch Ser/Thr-PP-Inhibitoren verursachte Cholesterineffluxsteigerung
abgeschwächt,
aber noch vorhanden. In Fibroblasten des Tangier-Patienten TD2 mit
inkomplettem Defekt (Patient beschrieben in: M Walter et al., (1994),
Biochemical, Biophysical Research Communications 205:850-856) ist
die durch Ser/Thr-PP-Inhibitoren verursachte Cholesterineffluxsteigerung
nicht oder nur insignifikant vermindert.
-
-
-
Beispiel 2:
-
Einfluß von HDL, Apo A-I und Ser/Thr-PP-Inhibitoren
auf den zellulären
Cholesteringehalt
-
Fibroblastenkulturen
werden in 60-mm Zellkulturplatten bis zur Präkonfluenz angezüchtet und
mit der Cholesterinvorstufe Mevalonolacton beladen. Die Kulturen
wurden in DMEM inkubiert, entweder ohne Zusatz oder mit 1 mg/ml
Rinderalbumin plus die angegebenen Konzentrationen HDL, Apo A-I,
Calyculin A, Cantharidin, Okadasäure
für 4 h
bei 37°C.
Nach der Inkubation wurden freies Cholesterin (FC) und verestertes
Cholesterin (VC) mit der oben beschriebenen HPLC-Methodik gemessen.
Das Gesamtcholestrin (GC) wird aus der Summe von FC and VC Masse
gebildet. Die Cholesterinmasse wird als μg Cholesterin pro mg Zellprotein
angegeben. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± S.D. von drei Kulturplatten.
Die Veränderung
der Cholesterinmasse (Δ)
wird als Differenz zwischen Cholesterin-beladenen Zellen, jeweils
mit und ohne Additiv berechnet (in Klammern sind die relativen Veränderungen
in % angegeben). * p < 0.05,
** p < 0.01, verglichen
mit Cholesterin-beladenen Zellen ohne Additiv.
-
-
Beispiel 3:
-
Einfluß verschiedener Agonisten (Albumin,
Apo A-I und Ser/Thr-PP-Inhibitoren) auf die Mobilisierung intrazellulären Cholesterins.
-
Dargestellt
ist der Ausstrom von de novo synthetisiertem intrazellulärem Cholesterin
aus menschlichen Fibroblasten 4 h nach Zugabe von Apo A-I oder Ser/Thr-PP-Inhibitoren
in Anwesenheit von 1 mg/ml Albumin. Die Markierung intrazellulären Cholesterins
erfolgt mit [14C]-Mevalonolacton. Der Cholesterinausstrom in
Anwesenheit von Albumin allein wird als 100% Wert definiert, gemessen
in dpm. Angegeben ist jeweils der Mittelwert ± Standardabweichung (n =
5).
-
-
Beispiel 4:
-
Einfluß verschiedener Agonisten (Albumin,
Apo A-I und Ser/Thr-PP-Inhibitoren) auf das Wachstumsverhalten von
Fibroblasten
-
Das
Zellwachstum wird mit Hilfe eines ELISA-Kits durch BrdU Einbau in
replizierende DNA gemessen. Die Inkorporationrate wird durch Quantifizierung
der Immunfluoreszenz eines Peroxidase markierten Anti-BrdU Antikörpers bestimmt
(bei 450 nm). Der 100% Wert entspricht der Inkorporationsrate in
Anwesenheit von Albumin.
-
-
-
1
-
Die
1a zeigt den Einfluß von Ser/Thr-PP-Inhibitoren
auf den Phosphorylierungsgrad Apo A-I-sensitiver Phosphoproteine
(das heißt
von Proteinen, die durch Apo A-I phosphoryliert werden). Der Phosphorylierungsgrad
wird nach einer 30-minütigen Inkubation
in Anwesenheit von Calyculin A
Okadasäure (∎) oder
Cantharidin (❍)
gemessen. Der basale Phosphorylierungsgrad (in Anwesenheit von Albumin)
wird als 100% Wert definiert.
-
Die 1b zeigt den Einfluß von Cantharidin (CANT) auf
Apo A-I-sensitive Phosphoproteine in Fibroblasten einer gesunden
Kontrollperson und eines homozygoten Tangierpatienten mit kompletter
ABC1-Defizienz in unbeladenen und Cholesterin-beladenen (CHOL +)
Zellen. Insbesondere in Cholesterin-beladenen Zellen induziert Cantharidin
eine verstärkte
Phosphorylierung der Apo A-I-sensitiven Phosphoproteine und verhält sich
in dieser Hinsicht wie Apo A-I. In Tangierzellen ist die ABC-1-Phosphorylierung
aufgrund einer kompletten ABC1-Defizienz bei diesem Patienten völlig aufgehoben.
Die anderen Apo A-I-sensitiven Phosphoproteine werden auch in Tangierzellen
zumindest partiell phosphoryliert. Diese Proteine sind bislang nicht
identifiziert und daher mit ihrem geschätzten Molekulargewicht angegeben.
-
2
-
Die 2 zeigt
den Einfluß von
Calyculin A (a), Okadasäure
(b) und Cantharidin (c) auf die Phosphorylase Phosphatase Aktivität in Zellhomogenaten
humaner Hautfibroblasten. Die Phosphorylase Phosphatase Aktivität wurde
wie im Textteil beschrieben gemessen und als % der Kontrolle (DMSO)
angegeben.