DE19942175A1 - Method for finding inhibitors of riboflavin biosynthesis - Google Patents

Method for finding inhibitors of riboflavin biosynthesis

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Abstract

A method is described for screening for the presence or absence of inhibition of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase activity comprising the following steps : (a) preparing a first aqueous mixture containing a protein having a plant-type 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase sequence, 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)pyrimidine-dione and 3,4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate; (b) reacting said first mixture during a predetermined period of time at a predetermined temperature and subsequently detecting the level of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine; (c) preparing a second aqueous mixture by including in said first mixture a predetermined amount of a chemical test sample; (d) reacting said second mixture during the predetermined period of time at the predetermined temperature and subsequently detecting the level of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine; (e) determining the presence of inhibition of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase by observation of whether the level detected in step (d) is lower than the level detected in step (b).

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Methode zum Auffinden von Inhibitoren der Ribo­ flavinbiosynthese. Sie bezieht sich weiterhin auf Pflanzenenzyme für die besagte Methode und DNA, die für besagte Enzyme kodiert. Außerdem bezieht sie sich auf eine Methode zur Hemmung der Riboflavinbiosynthese in Pflanzen sowie auf chemische Verbindungen, die eine derartige Hemmung ausüben.The invention relates to a method for finding inhibitors of ribo flavinbiosynthese. It also refers to plant enzymes for the said method and DNA encoding said enzymes. It also refers to a method for the inhibition of riboflavin biosynthesis in plants and on chemical compounds, who exercise such an inhibition.

Ein aussichtsreicher neuer Zugangsweg zum Auffinden neuer Herbizidtypen besteht im Screening von chemischen Substanzbibliotheken nach Substanzen, welche in einem Bio­ syntheseweg ein Enzym hemmen, das essentiell ist für Pflanzen, aber nicht für Menschen oder Tiere. Ein äusserst aussichtsreicher Biosyntheseweg dieser Art ist der Riboflavin­ biosyntheseweg. Alle zellulären Organismen benötigen Riboflavin als unersätzliche Kom­ ponente zahlreicher Redoxenzyme, von denen viele von zentraler Bedeutung für den Stoffwechsel sind. Alle Pflanzen erzeugen Riboflavin biosynthetisch, während alle Tiere Riboflavin mit der Nahrung aufnehmen müssen. Deshalb würde ein Inhibitor der pflanz­ lichen Riboflavinbiosynthese den tierischen Stoffwechsel nicht beeinflussen. Weiterhin ist der absolute Riboflavinbedarf für die zelluäre Aktivität niedrig. Deshalb kommen nur kleine Mengen der Riboflavinbiosynthese in Zellen vor. Dies bedeutet wiederum, dass nur kleine Inhibitormengen für solche Enzyme benötigt würden.A promising new way of finding new types of herbicides is the Screening of Chemical Libraries for Substances Contained in a Bio Synthesis inhibit an enzyme that is essential for plants, but not for humans or animals. An extremely promising biosynthetic pathway of this type is riboflavin biosynthetic pathway. All cellular organisms require riboflavin as an indispensable Kom component of numerous redox enzymes, many of which are of central importance to the Metabolism are. All plants produce riboflavin biosynthetically while all animals Riboflavin need to absorb food. Therefore, an inhibitor of the plant riboflavin biosynthesis does not affect animal metabolism. Furthermore is the absolute requirement for riboflavin for cellular activity is low. That's why only small ones come Levels of riboflavin biosynthesis in cells. This in turn means that only small ones Inhibitor amounts for such enzymes would be needed.

Der Riboflavinbiosyntheseweg (Abb. 1) wurde in Bakterien und Hefen relativ genau unter­ sucht. Die Biosynthese eines Moleküls Riboflavin (7) benötigt ein Molekül GTP und zwei Moleküle Ribulose-5-phosphat. GTP (1) wird zunächst in das spezifische Intermediat 2,5- Diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidindion (2) durch eine Reaktionsfolge von Desami­ nierung, Seitenkettenreduktion und Dephosphorylierung umgewandelt. Die Verbindung (3) wird zu 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin (4) umgewandelt durch Kondensation mit 3,4- Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat (5), welches enzymatisch erzeugt wird aus Ribulose-5- phosphat (6). The riboflavin biosynthesis pathway ( Figure 1) was relatively closely investigated in bacteria and yeasts. The biosynthesis of a molecule riboflavin (7) requires one molecule of GTP and two molecules of ribulose-5-phosphate. GTP (1) is first converted to the specific intermediate 2,5-diamino-6-ribosylamino-4 (3H) -pyrimidinedione (2) by a reaction sequence of deamination, side-chain reduction, and dephosphorylation. Compound (3) is converted to 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine (4) by condensation with 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate (5), which is enzymatically generated from ribulose-5-phosphate (6).

Als Gegenstand der Erfindung wird eine Methode zum Screening von Inhibitoren für ein Enzym der Riboflavinbiosynthese in Pflanzen oder für das Screening nach einem gegen einen spezifischen Inhibitor resistenten Enzym zur Verfügung gestellt. Als weiterer Ge­ genstand der Erfindung wird ein enzymatisch aktives Protein zur Verfügung gestellt für die Benutzung in einer solchen Screeningmethode, weiterhin wird eine DNA zur Verfügung gestellt, die das besagte Protein kodiert.As an object of the invention is a method for the screening of inhibitors for a Enzyme of riboflavin biosynthesis in plants or for screening for a specific inhibitor resistant enzyme provided. As another Ge object of the invention, an enzymatically active protein is provided for the Use in such a screening method, furthermore, a DNA is available which encodes said protein.

Als weiterer Gegenstand der Erfindung werden Inhibitoren sowie eine Methode zur Hem­ mung eines Enzyms in der Riboflavinbiosynthese zur Verfügung gestellt. (Herr Wäch­ tershäuser: könnten Sie bitte die vorstehenden Absätze auf Richtigkeit durch­ sehen?)Another object of the invention are inhibitors and a method for Hem tion of an enzyme in riboflavin biosynthesis. (Mr. Wäch Houses: Could you please read the preceding paragraphs for accuracy see?)

Wir haben entdeckt, dass die Genome von Pflanzen, insbesondere Arabidopsis thaliana, ein Gen enthalten, welches für ein Protein mit einer Signalsequenz und eine Sequenz mit 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthaseaktivitäil beinhaltet. Wir haben dieses Enzym ex­ primiert und haben gezeigt, dass es benutzt werden kann zum Screening einer chemi­ schen Bibliothek von Inhibitoren. Dabei kann das Protein mit oder ohne Signalsequenz eingesetzt werden.We have discovered that the genomes of plants, in particular Arabidopsis thaliana, contain a gene coding for a protein with a signal sequence and a sequence with 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase activity. We have this enzyme ex and have shown that it can be used to screen a chemi library of inhibitors. The protein may be with or without a signal sequence be used.

Insbesondere haben wir eine Methode zur Verfügung gestellt zum Screening nach An­ wesenheit oder Abwesenheit von 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase, welche die fol­ genden Schritte umfasst:
In particular, we have provided a method for screening for the presence or absence of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase comprising the following steps:

  • a) Herstellung einer ersten wässrigen Mischung enthaltend ein Protein mit einer pflanz­ lichen 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazins ynthasesequenz, 5-Amino-6-ribitylamino- 2,4(1H,3H)-pyrimidindion und 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat,a) Preparation of a first aqueous mixture containing a protein with a plant 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine ynthase sequence, 5-amino-6-ribitylamino- 2,4 (1H, 3H) -pyrimidinedione and 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate,
  • b) Reaktion der ersten Mischung während einer vorbestimmten Zeit bei einer vor­ bestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Konzentration von 6,7- Dimethyl-8-ribityllumazin,b) Reaction of the first mixture during a predetermined time at a vor temperature and subsequent determination of the concentration of 6,7- Dimethyl-8-ribityllumazine,
  • c) Herstellung einer zweiten wässrigen Mischung unter Einschluß einer vorbestimmten Menge einer chemischen Testprobe in die besagte erste Mischung,c) Preparation of a second aqueous mixture including a predetermined one Amount of a chemical test sample in said first mixture,
  • d) Reaktion der besagten zweiten Mischung während der vorbestimmten Zeit bei der vorbestimmten Temperatur und anschließende Detektion von 6,7-Dimethyl-8-ribityl­ lumazin, d) Reaction of said second mixture during the predetermined time in the predetermined temperature and subsequent detection of 6,7-dimethyl-8-ribityl lumazin,  
  • e) Bestimmung der Anwesenheit einer Hemmung von 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin­ synthase dadurch, dass beobachtet wird, ob die in Schritt d) beobachtete Konzentra­ tion niedriger ist als die Konzentration in Schritt b).e) Determination of the presence of an inhibition of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase by observing whether the concentra observed in step d) tion is lower than the concentration in step b).

Weiterhin haben wir eine Methode zur Verfügung gestellt für das Screening nach An­ wesenheit oder Abwesenheit von Resistenz gegen Hemmung von 6,7-Dimethyl-8-ribityl­ lumazinsynthaseaktivität, welche die folgenden Schritte umfasst:
Furthermore, we have provided a method for screening for the presence or absence of resistance to inhibition of 6,7-dimethyl-8-ribityl lumazine synthase activity comprising the following steps:

  • a) Herstellung einer ersten wässrigen Mischung, welche ein Protein mit einer mutierten pflanzentypischen 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthasesequenz sowie 5-Amino-6- ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion und 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat ent­ hält,a) Preparation of a first aqueous mixture containing a protein with a mutant plant-typical 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase sequence and 5-amino-6 ribitylamino-2,4 (1H, 3H) -pyrimidinedione and 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate ent holds,
  • b) Umsetzung der besagten ersten Mischung während einer vorbestimmten Zeitdauer und einer vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Konzen­ tration von 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin,b) reacting said first mixture for a predetermined period of time and a predetermined temperature and then determining the concentration tration of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine,
  • c) Herstellung einer zweiten wässrigen Mischung durch Zugabe einer vorherbestimm­ ten Menge eines spezifischen Inhibitors für 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase zur besagten ersten Mischung,c) Preparation of a second aqueous mixture by addition of a predetermined th amount of a specific inhibitor for 6,7-dimethyl-8-ribityllumazinsynthase to said first mixture,
  • d) Umsetzung der besagten zweiten Mischung während der vorherbestimmten Zeit­ dauer bei der vorherbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinkonzentration,d) reacting said second mixture for the predetermined time duration at the predetermined temperature and subsequent determination of the 6,7-dimethyl-8-ribityllumazinkonzentration,
  • e) Bestimmung der Anwesenheit von Resistenz gegen Hemmung der 6,7-Dimethyl-8- ribityllumazinsynthase in dem beobachtet wird, ob die gemessene Konzentration in Schritt d) ähnlich ist zur gemessenen Konzentration in Schritt b).e) Determination of the presence of resistance to inhibition of 6,7-dimethyl-8- ribityllumazine synthase in which it is observed whether the measured concentration in Step d) is similar to the measured concentration in step b).

Auf der Grundlage der Screeningmethode haben wir damit eine generelle Lösung bereit­ gestellt für das Problem der Bereitstellung von Inhibitoren sowie eine Methode für die Hemmung der Riboflavinbiosynthese in Pflanzen.Based on the screening method we have a general solution ready posed for the problem of providing inhibitors as well as a method for the Inhibition of riboflavin biosynthesis in plants.

Die Erfindung wird nun im Detail beschriebenThe invention will now be described in detail Identifizierung des Lumazinsynthasegens von Arabidopsis thalianaIdentification of the lumazine synthase gene of Arabidopsis thaliana

Die bekannte Aminosäuresequenz von ribE Protein von E. coli (Mörtl et al.) wurde benutzt zur Suche in der Sequenzdatenbank des Institute for Genomic Research (Rockville, USA) (Accession Nr. AC004005). Signifikante Ähnlichkeit wurde gefunden bei einem Segment des BAC Klons F6E13 von Arabidopsis thaliana Chromosom II (Abb. 2). Die Exons der Sequenz waren vorausgesagt worden durch das Computerprogramm xgrail und das vor­ hergesagte Protein war unzutreffend als Riboflavinsynthase zugeordnet worden.The known amino acid sequence of E. coli ribE protein (Mörtl et al.) Was used to search the sequence database of the Institute for Genomic Research (Rockville, USA) (Accession No. AC004005). Significant similarity was found in a segment of the BAC clone F6E13 of Arabidopsis thaliana chromosome II ( Figure 2). The exons of the sequence had been predicted by the computer program xgrail and the predicted protein had been incorrectly assigned as riboflavin synthase.

Sequenzvergleiche zeigen, dass das E. coli ribE Protein über seine ganze Länge ähnlich ist zu der Sequenz, die vom Arabidopsis thaliana Gen F6E13.18 kodiert wird. Die ver­ mutete Lumazinsynthase von Arabidopsis thaliana spezifiziert jedoch auch eine N-termi­ nale Peptidsequenz mit einem hohen Gehalt an Serin und Threonin (ungefähr 67 Amino­ säuren), welche keine Ähnlichkeit mit irgend einer Sequenz in der Datenbank besitzt und die kein Äquivalent im E. coli Protein hat.Sequence comparisons show that the E. coli ribE protein is similar over its entire length is to the sequence encoded by the Arabidopsis thaliana gene F6E13.18. The ver However, mutant lumazine synthase from Arabidopsis thaliana also specifies an N-termi nale peptide sequence with a high content of serine and threonine (about 67 amino acids) which bears no resemblance to any sequence in the database and which has no equivalent in E. coli protein.

Klonierung, Expression und Reinigung der Lumazinsynthase aus Arabidopsis thalianaCloning, expression and purification of lumazine synthase from Arabidopsis thaliana

Die Konstruktion eines Expressionsvektors geht aus von cDNA. Das ribE Gen wird durch PCR mit spezifischen Primern und mit cDNA aus der entsprechenden Pflanze als Matrize amplifiziert. Alternativ kann die cDNA aus einem existierenden EST-Klon hervorgehen. Das RibE Protein von Arabidopsis thaliana enthält eine Signalsequenz von etwa 67 Aminosäuren, die sich als nicht essentiell für die Enzymaktivität erwiesen.The construction of an expression vector is based on cDNA. The ribE gene is through PCR with specific primers and with cDNA from the corresponding plant as a template amplified. Alternatively, the cDNA may be derived from an existing EST clone. The RibE protein of Arabidopsis thaliana contains a signal sequence of about 67 Amino acids that proved to be non-essential for enzyme activity.

Das amplifizierte DNA-Fragment wird durch zwei aufeinanderfolgende PCR-Amplifikatio­ nen mit modifizierenden Primern verändert. In der ersten PCR-Reaktion wird vor dem Startkodon in einer optimalen Distanz zum 5'-Ende eine ribosomale Bindungsstelle einge­ führt. Eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym, z. B. BamHI, Sall oder PstI wird am 3'-Ende eingeführt. Die bevorzugte Erkennungsstelle ist BamHI. In der zweiten PCR-Re­ aktion wird das Produkt der ersten als Matrize benützt. Am 5'-Ende wird eine Erkennungs­ stelle für das Restriktionsenzym EcoRI stromauf von der ribosomen Bindungsstelle mit einem modifizierenden Primer eingeführt. Das amplifizierte DNA-Fragment wird in einen Vektor inseriert, der zur autonomen Replikation im Wirtsorganismus befähigt ist. Auf diese Weise wird ein rekombinantes Plasmid erhalten, welches die besagte DNA enthält. Das rekombinante Plasmid wird in den Wirtsmikroorganismus, z. B. Escherichia coli oder Bacillus subtilis transformiert. Der bevorzugte Wirt ist E. coli. Manche Pflanzenproteine können in Wirtsorganismen nur schwach exprimiert werden. Um das Expressionsniveau zu erhöhen und/oder um die Reinigung des Proteins zu erleichtern kann das rekombinan­ te Plasmid ein Gen oder Teile eines Gens einschließen, welche ohne Stopkodon dem ribE Gen im gleichen Leserahmen vorausgehen. Ein bevorzugtes Gen für diesen Zweck ist das malE Gen von E. coli. Die Expression einer solchen rekombinanten DNA erzeugt ein Fu­ sionsprotein zwischen dem Maltose-bindenden Protein (MBP) aus E. coli und dem pflanzlichen RibE Protein. Verschiedene Konstrukte werden in Abb. 3 gezeigt. Abb. 3A zeigt ein Konstrukt mit einer mutmaßlichen Signalsequenz S. Abb. 3B zeigt ein Konstrukt ohne die mutmaßliche Signalsequenz. Abb. 3C zeigt ein Konstrukt mit Maltosebinde­ protein und ohne mutmaßliche Signalsequenz.The amplified DNA fragment is altered by two consecutive PCR amplifications with modifying primers. In the first PCR reaction, a ribosomal binding site is inserted in front of the start codon at an optimal distance to the 5 'end. A recognition site for a restriction enzyme, e.g. B. BamHI, Sall or PstI is introduced at the 3 'end. The preferred recognition site is BamHI. In the second PCR reaction, the product of the first is used as a template. At the 5 'end, a restriction enzyme EcoRI site is introduced upstream of the ribosome binding site with a modifying primer. The amplified DNA fragment is inserted into a vector capable of autonomous replication in the host organism. In this way, a recombinant plasmid containing said DNA is obtained. The recombinant plasmid is introduced into the host microorganism, e.g. B. Escherichia coli or Bacillus subtilis transformed. The preferred host is E. coli. Some plant proteins are weakly expressed in host organisms. To increase the level of expression and / or to facilitate the purification of the protein, the recombinant plasmid may include a gene or parts of a gene which, without stop codon, precede the ribE gene in the same reading frame. A preferred gene for this purpose is the malE gene of E. coli. The expression of such a recombinant DNA generates a fusion protein between the maltose-binding protein (MBP) from E. coli and the plant RibE protein. Various constructs are shown in Figure 3. Figure 3A shows a construct with a putative signal sequence S. Figure 3B shows a construct without the putative signal sequence. Fig. 3C shows a construct with maltose binding protein and no putative signal sequence.

Die Stämme, welche den Expressionsvektor erhalten können in gebräuchlichen Kultur­ medien bei 15 bis 40°C kultiviert werden. Die bevorzugte Temperatur ist 37°C. Der E. coli Stamm wird induziert mit 0,5 bis 2 mM lsopropyl-β-D-thiogalactosid bei einer opti­ schen Dichte von 0,5 bis 0,8. Die Zellen werden 2 bis 12 Stunden inkubiert, vorzugsweise 5 Stunden. Anschließend werden die Zellen mit Lysozym lysiert und/oder mit einem Soni­ fier aufgebrochen. Der Zellextrakt mit MBP-ribE Fusionsprotein wird gereinigt durch Affini­ tätschromatographie mit einem Amyloseharz. Es wird ein Protein erhalten, welches die korrekte Faltungsstruktur hat und demzufolge die gewünschte Enzymaktivität zeigt.The strains which can obtain the expression vector in common culture media are cultivated at 15 to 40 ° C. The preferred temperature is 37 ° C. The E. coli strain is induced with 0.5 to 2 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside at opti density of 0.5 to 0.8. The cells are incubated for 2 to 12 hours, preferably 5 hours. Subsequently, the cells are lysed with lysozyme and / or with a Soni broke up. The cell extract with MBP-ribE fusion protein is purified by Affini chromatography with an amylose resin. It is obtained a protein which the has correct folding structure and consequently shows the desired enzyme activity.

Screening für die Anwesenheit oder Abwesenheit von Hemmung der 6,7-Dimethyl-8-ribi­ tyllumazinsynthaseScreening for the presence or absence of inhibition of 6,7-dimethyl-8-ribi tyllumazinsynthase

Lumazinsynthase katalysiert die Bildung von 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin durch Konden­ sation von 5-Amino-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion mit 3,4-Dihydroxy-2-butanon- 4-phosphat (Neuberger et al., 1986; Volk, 1988). Das Enzym benötigt keine Cofaktoren und zeigt volle katalytische Aktivität in Anwesenheit eines Ghelators wie z. B. EDTA. 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat wird enzymatisch hergestellt aus Ribulose-5- phosphat durch Einwirkung von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthase (Richter et al., 1992). Der Enzymtest kann gestartet werden durch hinzufügen einer oder mehrerer benötigter Substanzen zu einer Mischung der anderen Substanzen. Vorzugsweise wird 5- Amino-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion zugefügt zu einer Lösung von 3,4- Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat und Enzym in einem Puffer bei pH 6,5 bis 8,0, vorzugs­ weise 7,0. Die Reaktionsmischung kann 1 bis 60 Min. bei 10 bis 40°C inkubiert werden. Vorzugsweise wird sie 5 Min. bei 37°C inkubiert. Der Enzymtest kann gestoppt werden durch Denaturierung des Enzyms mit Trichloressigsäure, Aceton oder Natriumdodecyl­ sulfat. Vorzugsweise erfolgt die Denaturierung mit Trichloressigsäure. Der Test wird aus­ geführt in anderweitig identischen Mischungen mit oder ohne Zusatz eines möglichen In­ hibitors. Das Enzymprodukt, 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin kann direkt ohne Derivatisierung nachgewiesen werden, vorzugsweise photometrisch, insbesondere nach Reinigung durch HPLC. Das Lumazin kann identifiziert werden durch seine Absorption bei 410 nm. Der Extinktionskoeffizient ist 10300 M-1cm-1. Das Produkt kann auch fluorometrisch nach­ gewiesen werden bei einer Excitationswellelänge von 408 nm und einer Emissions­ wellenlänge von 487 nm. 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin kann auch ohne Enzymkatalyse gebildet werden (Bacher et al., 1996). Für eine exakte Bestimmung der Enzymaktivität ist es deshalb erforderlich, die nicht enzymatisch gebildete Lumazinmenge von der Gesamt­ menge an gebildetem Lumazin zu subtrahieren. Lumazine synthase catalyzes the formation of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine by condensation of 5-amino-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H) -pyrimidinedione with 3,4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate (Neuberger et al., 1986; Volk, 1988). The enzyme does not require cofactors and shows full catalytic activity in the presence of a helper such as. Eg EDTA. 3,4-Dihydroxy-2-butanone-4-phosphate is produced enzymatically from ribulose-5-phosphate by the action of 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase (Richter et al., 1992). The enzyme assay can be started by adding one or more required substances to a mixture of the other substances. Preferably, 5-amino-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H) -pyrimidinedione is added to a solution of 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate and enzyme in a buffer at pH 6.5 to 8 , 0, preferably as 7.0. The reaction mixture can be incubated at 10 to 40 ° C for 1 to 60 min. Preferably, it is incubated for 5 min. At 37 ° C. The enzyme assay can be stopped by denaturing the enzyme with trichloroacetic acid, acetone or sodium dodecyl sulfate. Preferably, the denaturation is carried out with trichloroacetic acid. The test is carried out in otherwise identical mixtures with or without the addition of a possible inhibitor. The enzyme product, 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine can be detected directly without derivatization, preferably photometrically, in particular after purification by HPLC. The lumazine can be identified by its absorbance at 410 nm. The extinction coefficient is 10300 M -1 cm -1 . The product can also be detected fluorometrically with an excitation wavelength of 408 nm and an emission wavelength of 487 nm. 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazine can also be formed without enzyme catalysis (Bacher et al., 1996). For an exact determination of the enzyme activity, it is therefore necessary to subtract the non-enzymatically produced amount of lumazine from the total amount of lumazine formed.

Die isolierte DNA kodiert spezifisch für ein Protein mit einer pflanzentypischen Sequenz von 6,7-Dimethyl-8-ribityfsynthase, wobei sie entweder einen einzelnen offenen Lese­ rahmen für das besagte Protein oder zusätzlich mindestens einen weiteren offenen Lese­ rahmen für ein anderes Enzym des Flavinweges enthalten kann.The isolated DNA specifically encodes a protein with a plant-specific sequence of 6,7-dimethyl-8-ribityfs synthase, either a single open reading framework for the said protein or additionally at least one further open reading framework for another enzyme of the flavin pathway.

Der Ausdruck "pflanzentypische Sequenz" bedeutet in einem Sinne eine Sequenz, wie sie in einer Pflanze vorkommt (mit oder ohne Signalsequenz), in einem breiteren und genaue­ ren Sinne bedeutet sie eine Sequenz aus einem Sequenzraum, welcher aufgebaut wird unter Benutzung einer spezifischen Pflanzen-6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase (mit oder ohne Signalsequenz) als Referenzsequenz. Anschließend die Erstellung eines Alignments der besagten Referenzsequenz mit mindestens einer weiteren pflanzlichen 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthasesequenz und Ermittlung einer Menge von äquivalen­ ten Aminosäuren für jede Position in besagtem Alignment aus der Variabilität aus dieser Position. Jede Sequenz, die in diesem Sequenzraum enthalten ist besitzt mit hoher Wahr­ scheinlichkeit die beabsichtigte Enzymaktivität und ist hochhomolog zu Pflanzenenzymen.The term "plant-typical sequence" in a sense means a sequence such as occurring in a plant (with or without signal sequence), in a broader and more accurate In other words, it means a sequence from a sequence space that is being constructed using a specific plant 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase (with or no signal sequence) as a reference sequence. Subsequently, the creation of a Alignments of said reference sequence with at least one other plant 6,7-dimethyl-8-ribityllumazin synthase sequence and determination of an amount of equivalency amino acids for each position in said alignment from the variability of these Position. Any sequence that is contained in this sequence space possesses high true the intended enzyme activity and is highly homologous to plant enzymes.

Es ist überraschend, dass die isolierten Proteine in funktioneller Form mit der beabsichtig­ ten Enzymaktivität und Faltung erhalten wurden. Diese funktionelle Kompetenz definiert eine Untermenge von Substanzen aus einer viel größeren Menge von Substanzen, die alle die gleiche Sequenz besitzen.It is surprising that the isolated proteins are in functional form with the intended th enzyme activity and folding were obtained. This functional competence defines a subset of substances from a much larger amount of substances that all have the same sequence.

Für den Screeningvorgang kann ein spezifisches Pflanzenenzym benutzt werden, welches entsprechend den angezielten Pflanzen ausgewählt wird. Es ist auch möglich, eine pflan­ zentypische Enzymsequenz (mit oder ohne Signalsequenz) zu konstruieren, die im Durchschnitt einer Untermenge von Pflanzenenzymsequenzen aus einer Menge von an­ gezielten Pflanzen am nächsten kommt. For the screening process, a specific plant enzyme can be used which selected according to the targeted plants. It is also possible to have a pflan zypical enzyme sequence (with or without signal sequence) to be constructed in the Average of a subset of plant enzyme sequences from an amount of targeted plants comes closest.  

Beispiel 1: Konstruktion eines ExpressionsklonsExample 1: Construction of an expression clone

Das mutmaßliche ribE Gen (Gen F6E13.18) von E, coli wurde durch PCR amplifiziert un­ ter Benutzung einer cDNA Bibliothek (Minet et al.) als Matrize. (Fehler im Original, es müsste von A. thaliana heißen)The putative ribE gene (F6E13.18 gene) of E, coli was amplified by PCR a Using a cDNA library (Minet et al.) As a template. (Error in the original, it should be called by A. thaliana)

Erste PCR:
Die Reaktionsmischung enthielt 10 pmol Primer 5'- GGAGAAATTAACCATGAAGTCATTAGCTTCGCCG-3', 10 pmol Primer 5'- TCATGTGGATCCATGGAACGAGCCGAG-3', 10 ng cDNA, 1 µl Taq Polymerase, 10 µl Puffer (Eurogentec), 6 µl MgCl2 (25 mM, Eurogentec) und 20 nmol dNTPs in einem Ge­ samtvolumen von 100 µl.First PCR:
The reaction mixture contained 10 pmol primer 5'-GGAGAAATTAACCATGAAGTCATTAGCTTCGCCG-3 ', 10 pmol primer 5'-TCATGTGGATCCATGGAACGAGCCGAG-3', 10 ng cDNA, 1 ul Taq polymerase, 10 ul buffer (Eurogentec), 6 ul MgCl 2 (25 mM, Eurogentec ) and 20 nmol dNTPs in a total volume of 100 μl.

Die Mixtur wurde 5 Min. bei 94°C denaturiert. Es wurden 30 PCR-Zyklen (60 Sec. bei 95 °C, 45 Sec. bei 50°C, 45 Sec. bei 72°C) ausgeführt. Nach weiteren 7 Min. Inkubation bei 72°C wurde die Mischung auf 4°C gekühlt und die DNA wurde der Elektrophorese auf einem 0,8% Agarosegel unterworfen. Die Bande bei 750 bp wurde mit einem Gel­ extraktionskit gereinigt (Qiagen). Das DNA-Fragment wurde mit einem Skalpell aus der Agarose ausgeschnitten. Pro Volumen ausgeschnittenes Gel wurden 3 Volumina Puffer QX1 (Qiagen) zugefügt. Die Mischung wurde 10 Min. bei 50°C inkubiert. Ein Gelvolumen Isopropanol wurde hinzugefügt. Um die DNA zu binden wurde die Mischung auf eine Qiaquick-Säule aufgetragen und 1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert. Das Eluat wurde verworfen. 0,75 ml Puffer PE (Qiagen) wurden zu der Säule hinzugefügt und die Zentrifu­ gation wurde wiederholt. Das Eluat wurde verworfen und die Säule wurde erneut 1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert. Anschließend wurde die Säule in ein sauberes 1,5 ml Ep­ pendorfröhrchen gestellt. 50 µl bidestilliertes, steriles H2O werden auf die Säule aufgetra­ gen. Es wird erneut 1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert. Das Eluat enthielt die gereinigte DNA.The mixture was denatured at 94 ° C for 5 min. 30 PCR cycles (60 sec at 95 ° C, 45 sec at 50 ° C, 45 sec at 72 ° C) were performed. After a further 7 min. Incubation at 72 ° C, the mixture was cooled to 4 ° C and the DNA was electrophoresed on a 0.8% agarose gel. The band at 750 bp was purified with a gel extraction kit (Qiagen). The DNA fragment was excised from the agarose with a scalpel. 3 volumes of buffer QX1 (Qiagen) were added per volume of cut gel. The mixture was incubated at 50 ° C for 10 min. A gel volume of isopropanol was added. To bind the DNA, the mixture was applied to a Qiaquick column and centrifuged at 14,000 rpm for 1 min. The eluate was discarded. 0.75 ml of Buffer PE (Qiagen) was added to the column and the centrifugation was repeated. The eluate was discarded and the column was again centrifuged at 14,000 rpm for 1 min. Subsequently, the column was placed in a clean 1.5 ml Ep pendorfröhrchen. 50 μl bidistilled, sterile H 2 O are applied to the column. It is again centrifuged for 1 min. At 14,000 rpm. The eluate contained the purified DNA.

Zweite PCR (zwei identische PCRs mit jeweils 100 µl wurden ausgeführt um eine höhere Ausbeute zu erhalten):
Die Reaktionsmischung enthielt 10 pmol Primer CAATTTGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATG-3', 10 pmol %'- TCATGTGGATCCATGGAACGAGCCGAG-3', 1 µl Taq Polymerase (1 E), 10 µl Puffer (Taq-Puffer, Eurogentec), 6 µl MgCl2 (25 mM), 5 µl gereinigtes PCR1-Produkt und 20 nmol dNTPs in einem Gesamtvolumen von 100 µl. (Satz im engl. Text unvollständig)Second PCR (two identical PCRs of 100 μl each were carried out to obtain a higher yield):
The reaction mixture contained 10 pmol primer CAATTTGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATG-3 ', 10 pmol%' -TTCATGTGGATCCATGGAACGAGCCGAG-3 ', 1 μl Taq polymerase (1E), 10 μl buffer (Taq buffer, Eurogentec), 6 μl MgCl 2 (25 mM), 5 μl purified PCR1 product and 20 nmol dNTPs in a total volume of 100 μl. (Sentence in English text incomplete)

Die Mischung wurde 5 Min. bei 94°C denaturiert. Es wurden 30 PCR-Zyklen (60 Sec. bei 94°C, 45 Sec. bei 50°C, 45 Sec. bei 72°C) durchgeführt. Nach weiteren 7 Min. Inkuba­ tion bei 72°C wurde die Mischung auf 4°C gekühlt und die DNA wurde mit einem PCR- Reinigungskit (Qiagen) gereinigt.The mixture was denatured at 94 ° C for 5 min. There were 30 PCR cycles (60 sec 94 ° C, 45 sec. at 50 ° C, 45 sec. at 72 ° C). After another 7 min. Inkuba at 72 ° C, the mixture was cooled to 4 ° C and the DNA was analyzed with a PCR Cleaning kit (Qiagen) cleaned.

5 Volumina Puffer PB (Qiagen) wurden zu 1 Volumen der PCR-Reaktion hinzugefügt, auf eine Qiaquick-Säule aufgetragen und 1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert. Das Eluat wurde verworfen. 0,75 ml Puffer PE (Qiagen) wurden auf die Säule aufgetragen und die Zentrifugation wurde wiederholt. Plasmid pNCO113 (Stüber et al., 1980) wurde aus 20 ml einer Übernachtkultur von pNCO113 in E. coli XL-1 Blue Zellen isoliert unter Benutzung des Plasmidisolierungskits Nucleobond AX100 (Macherey & Nagel).5 volumes of buffer PB (Qiagen) were added to 1 volume of the PCR reaction a Qiaquick column and centrifuged for 1 min. At 14,000 rpm. The eluate was discarded. 0.75 ml buffer PE (Qiagen) was applied to the column and the Centrifugation was repeated. Plasmid pNCO113 (Stüber et al., 1980) was prepared from 20 ml an overnight culture of pNCO113 in E. coli XL-1 Blue cells isolated using of the plasmid isolation kit Nucleobond AX100 (Macherey & Nagel).

Das PCR-Produkt und das Plasmid pNCO113 wurden verdaut mit den Restriktions­ enzymen EcoRI und BamHI. Die Reaktionsmischung enthielt 20 µl OPA Puffer (Pharmacia), 2 µl EcoRI (20 E, Pharmacia), 2 µl BamHI (20 E, Pharmacia), 2,5 µg PCR2- Produkt bzw. 5,0 µg pNCO113 in einem Gesamtvolumen von 100 µl H2O. Die Mischung wurde 4 Stunden bei 37°C inkubiert und mit einem PCR-Reinigungskit gereinigt. Das ver­ daute PCR2-Produkt und das Plasmid pNCO113 wurden zusammen ligiert mit T4-Ligase unter Erhalt des Plasmids pNCOribE(AT). Die Reaktionsmischung enthielt 50 fmol pNCO113, 100 fmol PCR2-Produkt, 4 µl Puffer (Gibco) und 1 µl T4-Ligase (1 E, Gibco) in einem Gesamtvolumen von 20 µl. Die Mixtur wurde über Nacht bei 4°C inkubiert, mit einem PCR-Reinigungskit gereinigt und in elektrokompetente E. coll XL-1 Blue Zellen (Bullock et al., 1987) elektrotransformiert.The PCR product and the plasmid pNCO113 were digested with the restriction enzymes EcoRI and BamHI. The reaction mixture contained 20 μl OPA buffer (Pharmacia), 2 μl EcoRI (20 μl, Pharmacia), 2 μl BamHI (20 μl, Pharmacia), 2.5 μg PCR2 product or 5.0 μg pNCO113 in a total volume of 100 μl H 2 O. The mixture was incubated for 4 hours at 37 ° C and purified with a PCR purification kit. The ver daute PCR2 product and the plasmid were ligated together pNCO113 with T 4 ligase to give plasmid pNCOribE (AT). The reaction mixture contained 50 fmol pNCO113, 100 fmol PCR2 product, 4 ul buffer (Gibco) and 1 ul T4 ligase (1 U, Gibco) in a total volume of 20 ul. The mixture was incubated overnight at 4 ° C, purified with a PCR purification kit, and electrotransformed into electrocompetent E. coli XL-1 Blue cells (Bullock et al., 1987).

Herstellung der elektrokompetenten Zellen: Ein Liter Luria-Bertani Medium wurde mit 10 ml einer frischen Übernachtkultur beimpft. Die Zellen wurden bei 37°C unter heftigem Schütteln bis zu einer optischen Dichte von 0,5 bis 0,7 kultiviert. Die Suspension wurde 20 Min. auf Eis gekühlt und in einem kalten Rotor 15 Min. bei 4.000 g zentrifugiert. Der Über­ stand wurde entfernt und der Niederschlag wurde in 1 Liter eiskaltem, sterilem 10% Gly­ cerin resuspendiert. Die Zellen wurden zwei mal wie beschrieben abzentrifugiert und der Niederschlag wurde beim ersten mal in 0,5 Liter und beim zweiten mal in 20 ml eiskaltem 10% Glycerol aufgenommen. Die Suspension wurde erneut zentrifugiert und der Nieder­ schlag wurde resuspendiert in 2 bis 3 ml eiskaltem 10% Glycerol. Die Suspension wurde in Aliquots von 80 µl eingeforen und in flüssigem Stickstoff gelagert. Preparation of the electrocompetent cells: One liter of Luria-Bertani medium became 10 inoculated into a fresh overnight culture. The cells became vigorous at 37 ° C Shake cultured to an optical density of 0.5 to 0.7. The suspension became 20 Chilled on ice and centrifuged in a cold rotor for 15 min. At 4,000 g. The over was removed and the precipitate was dissolved in 1 liter of ice-cold, sterile 10% Gly cerin resuspended. The cells were centrifuged twice as described and the Precipitation was ice cold the first time in 0.5 liters and the second time in 20 ml 10% glycerol added. The suspension was centrifuged again and the lower Beat was resuspended in 2 to 3 ml of ice-cold 10% glycerol. The suspension was frozen in aliquots of 80 μl and stored in liquid nitrogen.  

Elektrotransformation mit einem Gene Pulser Apparat von Biorad: Die elektrokompetenten Zellen wurden bei Raumtemperatur aufgetaut und auf Eis gestellt. 40 µl der Zell­ suspension wurden mit 1 µl der Ligationsmischung gemischt und in eine sterile 0,2 cm Küvette (Biorad) überführt. Die Suspension wurde auf den Boden geschleudert und die Küvette wurde in den Küvettenschlitten. Der Küvettenschlitten wurde in die Kammer plat­ ziert und ein Puls mit 2,5 kV, 25 µF, Pulse Controller 200 Ohm wurde appliziert. Die Kü­ vette wurde aus der Kammer entfernt und die Zellen wurden in 1 ml SOC Medium (2% Caseinhydrolysat, 0,5% Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM Glukose) suspendiert. Die Suspension wurde unter Schütteln bei 37°C 1 Stunde inkubiert und auf LB Medium mit einem Gehalt von 150 mg Ampicillin pro Liter plattiert. Plasmide wurden aus verschiedenen Klonen isoliert (pNCOribE(AT)1-10).Electro-transformation with a Gene Pulser apparatus from Biorad: The electrocompetent cells were thawed at room temperature and placed on ice. 40 μl of the cell suspension were mixed with 1 μl of the ligation mixture and transferred to a sterile 0.2 cm cuvette (Biorad). The suspension was thrown to the ground and the cuvette was slid in the cuvette. The cuvette slide was placed in the chamber and a pulse of 2.5 kV, 25 μF, Pulse Controller 200 ohm was applied. The cuvette was removed from the chamber and cells were resuspended in 1 ml of SOC medium (2% casein hydrolyzate, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl 2 , 10 mM MgSO 4 , 20 mM Glucose). The suspension was incubated with shaking at 37 ° C for 1 hour and plated on LB medium containing 150 mg ampicillin per liter. Plasmids were isolated from various clones (pNCOribE (AT) 1-10).

Die Plasmide wurden aus 5 ml einer frischen Übernachtkultur mit dem Miniplasmid­ isolierungskit von Qiagen isoliert. Das Zellpellet wurde in 0,3 ml einer Lösung mit einem Gehalt von 50 mM Tris Hydrochlorid, pH 8,0, 10 mM EDTA und 100 µg RNase pro ml re­ suspendiert. 0,3 ml 200 mM Natriumhydroxid mit einem Gehalt von 1% SDS wurden zu­ gefügt und die Mischung wurde 5 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. 0,3 ml kaltes, 3,0 M Natriumacetat, pH 5,5 wurden zugefügt und die Mischung wurde 10 Min. auf Eis inkubiert und anschließend 15 Min. bei 14.000 UpM in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Über­ stand wurde entfernt und auf einen Qiagen-Tip 20 aufgetragen, welcher vorher äqulibriert wurde mit 1 ml 50 mM MOPS, pH 7,0, mit einem Gehalt von 750 mM NaCl, 15% Ethanol und 0,15% Triton X-100. Der Qiagen-Tip wurde 4 mal gewaschen mit 1 ml einer Lösung mit einem Gehalt von 50 mM MOPS, pH 7,0, 1000 mM NaCl und 1% Ethanol. Die DNA wurde mit 0,8 ml 50 mM Tris Hydrochlorid, pH 8,5 mit einem Gehalt von 1250 mM NaCl und 15% Ethanol eluiert. Die DNA wurde mit 0,7 Volumina Isopropanol gefällt, bei 14.000 UpM 30 Min. zentrifugiert und mit 1 ml kaltem 70% Ethanol gewaschen. Die DNA Se­ quenz des rekombinanten Plasmids wurde mit der automatisierten Dideoxynukleotid­ sequenziermethode bestimmt unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenzer von Appiied Biosystems Inc. mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software.The plasmids were prepared from 5 ml of a fresh overnight culture with the miniplasmid Insulation kit isolated from Qiagen. The cell pellet was dissolved in 0.3 ml of a solution with a Content of 50 mM Tris hydrochloride, pH 8.0, 10 mM EDTA and 100 μg RNase per ml of re suspended. 0.3 ml of 200 mM sodium hydroxide containing 1% SDS became and the mixture was incubated for 5 min. at room temperature. 0.3 ml cold, 3.0 M Sodium acetate, pH 5.5 was added and the mixture was incubated on ice for 10 min and then centrifuged for 15 min. at 14,000 rpm in a bench top centrifuge. The over was removed and applied to a Qiagen tip 20, which was previously equilibrated was treated with 1 ml of 50 mM MOPS, pH 7.0, containing 750 mM NaCl, 15% ethanol and 0.15% Triton X-100. The Qiagen tip was washed 4 times with 1 ml of a solution containing 50 mM MOPS, pH 7.0, 1000 mM NaCl and 1% ethanol. The DNA was treated with 0.8 ml of 50 mM Tris hydrochloride, pH 8.5, containing 1250 mM NaCl and 15% ethanol eluted. The DNA was precipitated with 0.7 volumes of isopropanol, at 14,000 Centrifuged for 30 min and washed with 1 ml of cold 70% ethanol. The DNA Se The sequence of the recombinant plasmid was automated with the dideoxynucleotide Sequencing method determined using an ABI Prism 377 DNA sequencer from Appiied Biosystems Inc. with the ABI Prism Sequencing Analysis Software.

Beispiel 2: Konstruktion eines Expressionsklons ohne die mutmaßliche SignalsequenzExample 2: Construction of an expression clone without the putative signal sequence

Das ribE Gen mit Ausnahme der ersten 216 bp, welche für eine mutmaßliche Signal­ sequenz kodieren wurde durch PCR amplifiziert unter Benutzung von Plasmid pNCOribE(AT)1 (aus dem A. thaliana ribE Expressionsklon) als Matrize. Plasmid pNCOribE(AT)1 wurde isoliert wie beschrieben. Die Aminosäure 73 war von Arginin zu Methionin mutiert und eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym EcoRI wurde vor dem Startkodon am 5'-Ende mit einem modifizierenden Primer eingeführt.The ribE gene except the first 216 bp, which indicates a suspected signal encoding sequence was amplified by PCR using plasmid  pNCOribE (AT) 1 (from the A. thaliana ribE expression clone) as template. plasmid pNCOribE (AT) 1 was isolated as described. The amino acid 73 was from arginine too Methionine mutated and a recognition site for the restriction enzyme EcoRI was present introduced the start codon at the 5 'end with a modifying primer.

Erste PCR:
Die Reaktionsmischung enthielt 10 pmol Primer 5'- GGAGAAATTAACCATGCATGTTACGGGGTCTCTTATC-3', 10 µmol Primer 5'- TCATGTGGATCCATGGAACGAGCCGAG-3', 10 ng cDNA, 1 µl Taq Polymerase (1 E), 10 µl Puffer (Eurogentec), 6 µl MgCl2 (25 mM, Eurogentec) und 20 nmol dNTPs in einem Ge­ samtvolumen von 100 µl. Die Mischung wurde 5 Min. bei 94°C denaturiert. Es wurden 30 PCR-Zyklen (60 Sec. bei 94°C, 45 Sec. bei 50°C, 45 Sec. bei 72°C) ausgeführt. Nach weiteren 7 Min. Inkubation bei 72°C wurde die Mischung auf 4°C gekühlt und die DNA wurde der Trennung auf einem 0,8% Agarosegel unterworfen. Die Bande bei 500 bp wurde mit einem Gelextraktionskit (Qiagen) gereinigt.First PCR:
The reaction mixture contained 10 pmol primer 5'-GGAGAAATTAACCATGCATGTTACGGGGTCTCTTATC-3 ', 10 μmol primer 5'-TCATGTGGATCCATGGAACGAGCCGAG-3', 10 ng cDNA, 1 μl Taq polymerase (1E), 10 μl buffer (Eurogentec), 6 μl MgCl 2 ( 25 mM, Eurogentec) and 20 nmol dNTPs in a total volume of 100 μl. The mixture was denatured at 94 ° C for 5 min. 30 PCR cycles (60 sec at 94 ° C, 45 sec at 50 ° C, 45 sec at 72 ° C) were performed. After a further 7 min. Incubation at 72 ° C, the mixture was cooled to 4 ° C and the DNA was subjected to separation on a 0.8% agarose gel. The band at 500 bp was purified with a gel extraction kit (Qiagen).

Zweite PCR (zwei identische PCRs mit jeweils 100 µl wurden ausgeführt um eine höhere Ausbeute zu erhalten):
Die Reaktionsmischung enthielt 10 pmol Primer CAATTTGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATG-3', 10 pmol 5'- TCATGTGGATCCATGGAACGAGCCGAG-3', 1 µl Taq Polymerase (1 E), 10 µl Puffer (Taq-Puffer, Eurogentec), 6 µl MgCl2 (25 mM), 5 µl gereinigtes PCR1-Produkt und 20 nmol dNTPs in einem Gesamtvolumen von 100 µl. Die Mischung wurde 5 Min. bei 94°C denaturiert. Es wurden 30 PCR-Zyklen (60 Sec. bei 94°C, 45 Sec. bei 50°C, 45 Sec. bei 72°C) ausgeführt. Nach weitern 7 Minuten Inkubation bei 72°C wurde die Mischung auf 4 °C gekühlt und die DNA wurde mit einem PCR-Reinigungskit (Qiagen) gereinigt.Second PCR (two identical PCRs of 100 μl each were carried out to obtain a higher yield):
The reaction mixture contained 10 pmol primer CAATTTGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATG-3 ', 10 pmol 5'-TCATGTGGATCCATGGAACGAGCCGAG-3', 1 ul Taq polymerase (1E), 10 ul buffer (Taq buffer, Eurogentec), 6 ul MgCl 2 (25 mM), 5 μl purified PCR1 product and 20 nmol dNTPs in a total volume of 100 μl. The mixture was denatured at 94 ° C for 5 min. 30 PCR cycles (60 sec at 94 ° C, 45 sec at 50 ° C, 45 sec at 72 ° C) were performed. After a further 7 minutes incubation at 72 ° C, the mixture was cooled to 4 ° C and the DNA was purified with a PCR purification kit (Qiagen).

Die weiteren Schritte waren analog zur Konstruktion von pNCOribE(AT) im Referenz­ beispiel 1. Das resultierende Plasmid, welches ein ribE Protein ohne die mutmaßliche Si­ gnalsequenz kodiert wird als pNCOribE(AT)-sig bezeichnet.The further steps were analogous to the construction of pNCOribE (AT) in the reference Example 1. The resulting plasmid containing a ribE protein without the putative Si gnalsequenz encoded is called pNCOribE (AT) -sig.

Beispiel 3: Konstruktion eines malE-ribE Fusionsklons ohne mutmaßliche SignalsequenzExample 3: Construction of a malE-ribE fusion clone with no putative signal sequence

Das ribE Gen mit Ausnahme der ersten 216 bp wurde durch PCR amplifiziert unter Benut­ zung von Plasmid pNCOribE(AT) als Matrize. Das Amplifikat wurde im Leserahmen an das 3'-Ende des malE Gens ligiert.The ribE gene except the first 216 bp was amplified by PCR under Benut  tion of plasmid pNCOribE (AT) as a template. The amplificate was in frame ligated the 3 'end of the malE gene.

Erste PCR:
Die Reaktionsmischung enthielt 10 pmol Primer 5'- ATAATAATAGCGGCCGCTATGCATGTTACGGGGTCTCTTATC-3', 10 pmol Primer 5'- TCATGTGGATCCATGGAACGAGCCGAG-3', 10 ng cDNA, 1 µl Taq-Polymerase (1 E), 10 µl Puffer (Eurogentec), 6 µl MgCl2 (25 mM, Eurogentec) und 20 nmol dNTPs in einem Ge­ samtvolumen von 100 µl. Die Mischung wurde 5 Min. bei 94°C denaturiert. Es wurden 30 PCR-Zyklen (60 Sec. bei 94°C, 45 Sec. bei 50°C, 45 Sec. bei 72°C) ausgeführt. Nach weiteren 7 Min. Inkubation bei 72°C wurde die Mischung auf 4°C gekühlt und die DNA wurde der Elektrophorese auf einem 0,8% Agarosegel unterworfen. Die Bande bei 500 bp wurde mit einem Gelextraktionskit (Qiagen) gereinigt.First PCR:
The reaction mixture contained 10 pmol primer 5'-ATAATAATAGCGGCCGCTATGCATGTTACGGGGTCTCTTATC-3 ', 10 pmol primer 5'-TCATGTGGATCCATGGAACGAGCCGAG-3', 10 ng cDNA, 1 ul Taq polymerase (1E), 10 ul buffer (Eurogentec), 6 ul MgCl 2 (25 mM, Eurogentec) and 20 nmol dNTPs in a total volume of 100 μl. The mixture was denatured at 94 ° C for 5 min. 30 PCR cycles (60 sec at 94 ° C, 45 sec at 50 ° C, 45 sec at 72 ° C) were performed. After a further 7 min. Incubation at 72 ° C, the mixture was cooled to 4 ° C and the DNA was electrophoresed on a 0.8% agarose gel. The band at 500 bp was purified with a gel extraction kit (Qiagen).

Zweite PCR (zwei identische PCRs mit je 100 µl wurden ausgeführt um eine höhere Aus­ beute zu erhalten):
10 pmol Primer CAATTTGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATG-3', 10 pmol 5'- TCATGTGGATCCATGGAACGAGCCGAG-3', 1 µl Taq Polymerase (1 E), 10 µl Puffer (Taq-Puffer, Eurogentec), 6 µl MgCl2 (25 mm), 5 µl gereinigtes PCR1-Produkt und 20 nmol dNTPs in einem Gesamtvolumen von 100 µl. Die Mischung wurde 5 Min. bei 94°C denaturiert. Es wurden 30 PCR-Zyklen (60 Sec. bei 94°C, 45 Sec. bei 50°C, 45 Sec. bei 72°C) ausgeführt. Nach weiteren 7 Min. Inkubation bei 72°C wurde die Mischung auf 4 °C gekühlt und die DNA wurde mit einem PCR-Reinigungskit (Qiagen) gereinigt.Second PCR (two identical 100 μl PCRs were performed to obtain a higher yield):
10 pmol primer CAATTTGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATG-3 ', 10 pmol 5'-TCATGTGGATCCATGGAACGAGCCGAG-3', 1 μl Taq polymerase (1E), 10 μl buffer (Taq buffer, Eurogentec), 6 μl MgCl 2 (25 mm), 5 μl purified PCR1 product and 20 nmol dNTPs in a total volume of 100 μl. The mixture was denatured at 94 ° C for 5 min. 30 PCR cycles (60 sec at 94 ° C, 45 sec at 50 ° C, 45 sec at 72 ° C) were performed. After a further 7 min. Incubation at 72 ° C, the mixture was cooled to 4 ° C and the DNA was purified with a PCR purification kit (Qiagen).

Plasmid pNCOmalEribH (Fischer, 1997) wurde aus 20 ml einer Übernachtkultur isoliert wie für das Plasmid pNCO113 beschrieben.Plasmid pNCOmalEribH (Fischer, 1997) was isolated from 20 ml of an overnight culture as described for the plasmid pNCO113.

Das PCR-Produkt und das Plasmid pNCOmalEribH wurden mit den Restriktionsenzymen NotI und BamHI verdaut. Die Reaktionsmischung enthielt 10 µl BamHI Puffer (NEB), 1 µl BSA (100x), 4 µl BamHI (20 E, NEB), 3 µl NotI (60 E, NEB), 2 µg PCR-Produkt bzw. 5 µg pNCOmalEribH in einem Gesamtvolumen von 100 µl. Die Mischungen wurden 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Das PCR-Produkt wurde mit einem PCR-Reinigungskit (Qiagen) ge­ reinigt. Das verdaute Plasmid wurde der Elektrophorese auf einem Agarosegel unter­ worfen. Die Bande bei 3400 bp wurde mit einem Gelextraktionskit (Qiagen) gereinigt. Wei­ tere Schritte waren analog zur Konstruktion von pNCOribE(AT) in Beispiel 1. Das Plasmid, welches ein malE-ribE Fusionsprotein kodiert wurde als pNCOmalE-ribe(AT)-sig bezeich­ net.The PCR product and the plasmid pNCOmalEribH were digested with the restriction enzymes NotI and BamHI digested. The reaction mixture contained 10 μl BamHI buffer (NEB), 1 μl BSA (100x), 4μl BamHI (20E, NEB), 3μl NotI (60E, NEB), 2μg PCR product, and 5μg, respectively pNCOmalEribH in a total volume of 100 μl. The mixtures were 3 hours incubated at 37 ° C. The PCR product was purified with a PCR purification kit (Qiagen) cleans. The digested plasmid was subjected to electrophoresis on an agarose gel worfen. The band at 3400 bp was purified with a gel extraction kit (Qiagen). Wei The next steps were analogous to the construction of pNCOribE (AT) in Example 1. The plasmid,  which encodes a malE-ribE fusion protein was designated pNCOmalE-ribe (AT) -sig net.

Beispiel 4: Herstellung und Reinigung des ribE-Proteins mit und ohne SignalsequenzExample 4: Preparation and purification of the ribE protein with and without signal sequence

1 l Luria Bertani (LB) Medium mit einem Gehalt von 160 mg Ampicillin pro Liter wurde beimpft mit 40 ml einer Übernachtkultur von E. coli Stamm XL-1, welcher das Plasmid pNCOribE(AT) bzw. pNCOribE(AT)-sig enthält. Die Kultur wurde unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Bei einer optischen Dichte (600 nm) von 0,6 wurde die Kultur mit 2 mM IPTG induziert. Die Kultur wurde für weitere 5 Stunden inkubiert. Die Suspension wurde 20 Min. bei 5000 UpM und 4°C zentrifugiert. Die Zellen wurden mit 0,9% NaCl-Lösung ge­ waschen, erneut zentrifugiert und bei -20°C zur Lagerung eingeforen. Die Zellen wurden in 20 ml einer Lösung mit einem Gehalt von 50 mM Kaliumphosphat, pH 7,0, 1 mM EDTA und 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid aufgetaut. Die Mischung wurde 6 × 15 Sek. mit Ultraschall behandelt (Branson Sonifier Stufe 4). Die Suspension wurde bei 4°C und 15.000 UpM 20 Min. zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine Sepharose Q Säule (20 ml, Pharmacia) aufgetragen, welche vorher mit 50 mM Kaliumphosphat, pH 7,0 (Puffer A) äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit 60 ml Puffer A gewaschen und mit einem linearen Gradienten von 0-1 M NaCl in Puffer A (Gesamtvolumen 200 ml) entwickelt. RibE-Pro­ tein enthaltende Fraktionen wurden durch SDS-Elektrophorese identifziert und mit einer Amicon-Zelle (Ausschlussgrenze 30 kDa) konzentriert. Aliquote mit einem Gehalt von 5 mg Protein wurden der Chromatographie auf einer Superdex 200 Säule (1,6 × 60 cm, Pharmacia) unterworfen. Die Säule wurde entwickelt mit Puffer A unter Zusatz von 100 mM NaCl. Es wurden 38 mg ribE(AT) bzw. 2 mg ribE(AT)-sig erhalten.1 L of Luria Bertani (LB) medium containing 160 mg of ampicillin per liter inoculated with 40 ml of an overnight culture of E. coli strain XL-1 containing the plasmid pNCOribE (AT) or pNCOribE (AT) -sig. The culture was shaken at 37 ° C incubated. At an optical density (600 nm) of 0.6, the culture was incubated with 2 mM IPTG induced. The culture was incubated for a further 5 hours. The suspension was allowed to stand for 20 min. centrifuged at 5000 rpm and 4 ° C. The cells were filled with 0.9% NaCl solution wash, recentrifuged and frozen at -20 ° C for storage. The cells were in 20 ml of a solution containing 50 mM potassium phosphate, pH 7.0, 1 mM EDTA and 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride thawed. The mixture was 6x15 sec. With Ultrasound treatment (Branson Sonifier Level 4). The suspension was at 4 ° C and Centrifuged at 15,000 rpm for 20 min. The supernatant was applied to a Sepharose Q column (20 ml, Pharmacia) previously diluted with 50 mM potassium phosphate, pH 7.0 (buffer A). was equilibrated. The column was washed with 60 ml of buffer A and with a linear Gradients of 0-1 M NaCl in buffer A (total volume 200 ml) developed. RibE-Pro tein containing fractions were identified by SDS electrophoresis and with a Amicon cell (exclusion limit 30 kDa) concentrated. Aliquots containing 5 mg of protein were chromatographed on a Superdex 200 column (1.6 x 60 cm, Pharmacia). The column was developed with buffer A with addition of 100 mM NaCl. There were obtained 38 mg of ribE (AT) and 2 mg of ribE (AT) -sig, respectively.

Beispiel 5: Herstellung und Reinigung des MBP-ribE FusionsproteinsExample 5: Preparation and purification of the MBP-ribE fusion protein

0,5 l Luria-Bertani (LB) Medium mit einem Gehalt von 75 mg Ampicillin wurden beimpft mit 40 ml einer Übernachtkultur von E. 2011 Stamm XL-1, welcher das Plasmid pNCOmalEribE(AT) enthielt. Die Kultur wurde in Schüttelkolben bei 37°C inkubiert. Bei einer optischen Dichte (600 nm) von 0,5 wurde die Kultur mit 1 mM IPTG induziert und anschließend unter Schütteln für weitere 3 Skunden inkubiert. Die Zellen wurden durch 20- minütige Zentrifugation bei 5.000 UpM und 4°C geerntet. Sie wurden dann mit 0,9% NaCl-Lösung gewaschen, erneut zentrifugiert wie beschrieben und bei -20°C gelagert. Die Zellen wurden aufgetaut in 10 ml einer Lösung mit einem Gehalt von 50 mM Kalium­ phosphat, pH 7,0, 1 mM EDTA und 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid. Die Mischung wurde mit 6 × 15 Sek. mit Ultraschall behandelt (Branson Sonifiere Stufe 4). Die Suspen­ sion wurde bei 15.000 UpM und 4°C 20 Min. zentrifugiert. Der Überstand wurde 1 : 5 mit Puffer A (Beispiel 4) verdünnt und auf eine 2 ml Säule von Amyloseharz (New England Biolabs) aufgetragen, welches vorher äquilibriert wurde mit 15 ml Puffer A. Die Säule wurde mit 30 ml Puffer A gewaschen. Das Fusionsprotein wurde mit 6 ml Puffer A unter Zusatz von 10 mM Maltose eluiert. Dabei wurden 5 mg malE-ribE Protein erhalten. Die Reinigung des Proteins (56 kDa) wurde überprüft durch SDS-Elektrophorese.0.5 l of Luria-Bertani (LB) medium containing 75 mg of ampicillin was inoculated with 40 ml of an overnight culture of E. 2011 strain XL-1 containing the plasmid pNCOmalEribE (AT). The culture was incubated in shake flasks at 37 ° C. at an optical density (600 nm) of 0.5, the culture was induced with 1 mM IPTG and then incubate with shaking for a further 3 scans. The cells were replaced by 20- centrifugation at 5,000 rpm and 4 ° C. They were then 0.9%  NaCl solution, centrifuged again as described and stored at -20 ° C. The cells were thawed in 10 ml of a solution containing 50 mM potassium phosphate, pH 7.0, 1 mM EDTA and 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. The mixture was sonicated at 6x15 sec. (Branson Sonifiere Level 4). The Suspen The reaction was centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C for 20 min. The supernatant was 1: 5 with Buffer A (Example 4) and applied to a 2 ml column of amylose resin (New England Biolabs) previously equilibrated with 15 ml of buffer A. The column was washed with 30 ml of buffer A. The fusion protein was submerged with 6 ml of buffer A. Addition of 10 mM maltose eluted. 5 mg of malE-ribE protein were obtained. The Purification of the protein (56 kDa) was checked by SDS electrophoresis.

Beispiel 6: Screening nach LumazinsynthaseaktivitätExample 6: Screening for lumazine synthase activity Herstellung von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatPreparation of 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate

Eine Reaktionsmischung enthielt 100 mM Kaliumphosphat, pH 7,5, 20 mM MgCl2, 10 mM Ribose-5-phosphat (Sigma), 0,1 E Pentosephosphatisomerase (Sigma) und 2000 E 3,4- Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthase in einem Gesamtvolumen von 100 µl. Die Mi­ schung wurde bei 37°C 20 Min. inkubiert.One reaction mixture contained 100 mM potassium phosphate, pH 7.5, 20 mM MgCl 2 , 10 mM ribose-5-phosphate (Sigma), 0.1 E pentose phosphate isomerase (Sigma) and 2000 E 3,4-dihydroxy-2-butanone-4 phosphate synthase in a total volume of 100 μl. The mixture was incubated at 37 ° C for 20 min.

Bestimmung von LumazinsynthaseaktivitätDetermination of lumazine synthase activity

Reaktionsmischungen enthielten 100 mM Kaliumphosphat, pH 7,0, 20 mM EDTA, 1 mM 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat und 5 µl der Enzymprobe in einem Gesamtvolumen von 50 µl. Nach einer Vorinkubationszeit von 2 Min. bei 37°C wurde die Reaktion gestar­ tet durch Hinzufügen von 1 µl 5 mM 5-Amino-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion und die Proben wurden bei 37°C 5 Min. inkubiert. Die Reaktion wurde beendet durch Zugabe von 50 µl Trichloressigsäure (15%). 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin wurde durch Reverse- Phasen-HPLC unter Benutzung einer Nucleosil RP18-Säule bestimmt. Der Eluent enthielt 30 mM Ameisensäure und 20% Methanol. Gas Eluat wurde fluorometriert (Excitation, 408 nm; Emission, 487 nm). Eine Enzymeinheit katalysiert die Bildung von 1 nmol 6,7-Di­ methyl-8-ribityllumazin pro Stunde bei 37°C.
Reaction mixtures contained 100 mM potassium phosphate, pH 7.0, 20 mM EDTA, 1 mM 3,4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate and 5 μl of the enzyme sample in a total volume of 50 μl. After a preincubation time of 2 min. At 37 ° C, the reaction was started by adding 1 μl of 5 mM 5-amino-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H) -pyrimidinedione and the samples were washed at 37 ° C Min. Incubated. The reaction was stopped by adding 50 μl of trichloroacetic acid (15%). 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazine was determined by reverse phase HPLC using a Nucleosil RP18 column. The eluent contained 30 mM formic acid and 20% methanol. Gas eluate was fluorometred (excitation, 408 nm, emission, 487 nm). One enzyme unit catalyzes the formation of 1 nmol of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine per hour at 37 ° C.

Screening nach Hemmung von LumazinsynthaseaktivitätScreening for inhibition of lumazine synthase activity

Das Screening nach Hemmung von Lumazinsynthase wurde durchgeführt mit dem ribE Genprodukt ohne die mutmaßliche Signalsequenz. Die Tests wurden durchgeführt mit verschiedenen Inhibitorkonzentrationen bei konstanten Konzentrationen von 5-Amino-6- ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion und 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat. Die Menge an biomimetisch gebildetem Lumazin wurde von der Gesamtmenge des Lumazins abgezogen.The screening for inhibition of lumazine synthase was performed with the ribE Gene product without the putative signal sequence. The tests were done with different inhibitor concentrations at constant concentrations of 5-amino-6- ribitylamino-2,4 (1H, 3H) -pyrimidinedione and 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate. The Amount of biomimetic lumazine was calculated from the total amount of lumazine deducted.

Screening nach Lumazinsynthaseaktivität in Anwesenheit von 5-Nitroso-6-ribitylamino- 2,4(1H,3H)-pyrimidindion (Winestock & Plaut, 1961) oder 5-Nitro-6-ribitylamino- 2,4(1H,3H)-pyrimidindion (Cresswell & Wood" 1960)
Screening for lumazine synthase activity in the presence of 5-nitroso-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H) -pyrimidinedione (Winestock & Plaut, 1961) or 5-nitro-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H) -pyrimidinedione (Cresswell & Wood, 1960)

Verbindungconnection IC50[µM]IC 50 [μM] 5-Nitro-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindon5-nitro-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H) -pyrimidindon 310310 5-Nitroso-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion5-nitroso-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H) -pyrimidinedione 560560

500 µl Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH 7,5), 1 mM EDTA, 10 µg Enzym, 100 µl Inhibi­ tor (Endkonzentration 0-10 mM) und 10 µl 5-Amino-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidin­ dion (9 mM) wurden in eine 1 ml Küvette gegeben. Nach einer Vorinkubationszeit von 10 Min, bei 37°C wurde die Reaktion gestartet durch Hinzufügen von 20 µl 3,4-Dihydroxy-2- butanon-4-phosphat. Die Mischung wurde weitere 5 Min. bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde photometrisch verfolgt (410 nm).500 μl potassium phosphate buffer (100 mM, pH 7.5), 1 mM EDTA, 10 μg enzyme, 100 μl Inhibi tor (final concentration 0-10 mM) and 10 μl of 5-amino-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H) -pyrimidine dione (9 mM) was added to a 1 ml cuvette. After a pre-incubation period of 10 Min, at 37 ° C, the reaction was started by adding 20 μl of 3,4-dihydroxy-2- butanone-4-phosphate. The mixture was incubated at 37 ° C for a further 5 min. The reaction was photometrically monitored (410 nm).

Literaturliterature

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Anhang A Appendix A

Nukleotid- und Aminosäuresequenz der Lumazinsynthase von Arabidopsis thaliana Nucleotide and amino acid sequence of the lumazine synthase of Arabidopsis thaliana

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING

Claims (14)

1. Eine Methode zum Screening nach Anwesenheit oder Abwesenheit von Hemmung von 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthageaktivität, welche aus den folgenden Schrit­ ten besteht:
  • a) Herstellung einer ersten wässrigen Mischung, welche ein Protein mit einer pflan­ zentypische 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthasesequenz und 5-Amino-6-ribityl­ amino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion und 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat enthält;
  • b) Umsetzung der besagten ersten Mischung während einer vorbestimmten Zeit­ dauer bei einer vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Konzentration von 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin;
  • c) Herstellung einer zweiten wässrigen Mischung, wobei in die besagte erste Mi­ schung eine vorbestimmt Menge einer chemischen Testsubstanz eingeschlossen wird;
  • d) Umsetzung der besagten zweiten Mischung während der vorbestimmten Zeit­ dauer bei der vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Konzentration von 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin;
  • e) Ermittlung der Anwesenheit einer Hemmung von 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin­ synthase durch die Feststellung, ob die in Schritt d) festgestellte Konzentration niedriger ist als die in Schritt b) festgestellte Konzentration.
1. A method of screening for the presence or absence of inhibition of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase activity, which consists of the following steps:
  • a) Preparation of a first aqueous mixture containing a protein with a plant-typical 6,7-dimethyl-8-ribityllumazazin synthase and 5-amino-6-ribityl amino-2,4 (1H, 3H) -pyrimidinedione and 3,4-dihydroxy Contains -2-butanone 4-phosphate;
  • b) reacting said first mixture for a predetermined time at a predetermined temperature and then determining the concentration of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine;
  • c) preparing a second aqueous mixture, wherein a predetermined amount of a chemical test substance is included in said first mixture;
  • d) reacting said second mixture for the predetermined time at the predetermined temperature and then determining the concentration of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine;
  • e) determining the presence of an inhibition of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase by determining whether the concentration detected in step d) is lower than the concentration determined in step b).
2. Eine Methode zum Screening nach Anwesenheit oder Abwesenheit von Resistenz gegen Hemmung von 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase, welche die folgenden Schritt umfasst:
  • a) Herstellung einer ersten wässrigen Mischung, welche ein Protein mit einer mutier­ ten pflanzentypischen 6,7-Dimetflyl-8-ribityllumazinsynthasesequenz sowie 5- Amino-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion und 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4- phosphat enthält;
  • b) Umsetzung der besagten ersten Mischung während einer vorbestimmten Zeit­ dauer bei einer vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Konzentration von 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin;
  • c) Herstellung einer zweiten wässrigen Mischung, wobei in die besagte erste Mi­ schung eine vorbestimmte Menge eines spezifischen Inhibitors für 6,7-Dimethyl-8- ribityllumazinsynthase eingeschlossen wird;
  • d) Umsetzung der besagten zweiten Mischung während der vorbestimmten Zeit­ dauer bei der vorbestimmten Temperatur und anschließende Bestimmung der Konzentration von 6,7-Dimethyl-8-riblityllumazin;
  • e) Bestimmung der Anwesenheit von Resistenz gegen Hemmung von 6,7-Dimethyl- 8-ribityllumazinsynthase indem festgestellt wird, ob die in Schritt d) bestimmte Konzentration ähnlich zur in Schritt b) bestimmten Konzentration ist.
2. A method of screening for the presence or absence of resistance to inhibition of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase comprising the following steps:
  • a) Preparation of a first aqueous mixture containing a protein with a mutated th plant-typical 6,7-Dimetflyl-8-ribityllumazazinynthasesequenz and 5-amino-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H) -pyrimidinedione and 3,4-dihydroxy Contains -2-butanone-4-phosphate;
  • b) reacting said first mixture for a predetermined time at a predetermined temperature and then determining the concentration of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine;
  • c) preparing a second aqueous mixture, including in said first mixture a predetermined amount of a specific inhibitor of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase;
  • d) reacting said second mixture for the predetermined time at the predetermined temperature and then determining the concentration of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine;
  • e) Determining the presence of resistance to inhibition of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase by determining whether the concentration determined in step d) is similar to the concentration determined in step b).
3. Die Methode entsprechend Ansprüchen 1 oder 2, wobei die besagte wässrige Mi­ schung einen pH im Bereich von 5,5 bis 9 hat.3. The method according to claims 1 or 2, wherein said aqueous Mi has a pH in the range of 5.5 to 9. 4. Die Methode entsprechend Ansprüchen 1 oder 2, wobei eine Vormischung her­ gestellt wird, in der eine essentielle Zutat fehlt, wobei die Reaktion durch Hinzufügen der besagten Zutat gestartet wird.4. The method according to claims 1 or 2, wherein a premix ago is missing, in which an essential ingredient is missing, whereby the reaction by adding the said ingredient is started. 5. Die Methode entsprechend Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, dass die Reaktion beendet wird durch Hinzugabe einer Säure oder eines Lösungsmittels oder eines Detergenz, vorzugsweise Trichloressigsäure oder Aceton oder Natrium­ dodecylsulfat.5. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the Reaction is terminated by adding an acid or a solvent or a detergent, preferably trichloroacetic acid or acetone or sodium dodecyl sulfate. 6. Die Methode entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, dass die Konzentration von 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin photometrisch oder fluoro­ metrisch bestimmt wird.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized by that the concentration of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine photometric or fluoro metric is determined. 7. Die Methode entsprechend Anspruch 6, wobei die Bestimmung in einer HPLC-Frak­ tion erfolgt.7. The method according to claim 6, wherein the determination in an HPLC Frak tion takes place. 8. Die Methode entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, dass die Detektion durchgeführt wird durch Inkubation mit Riboflavinsynthase und Bestimmung von Riboflavin.8. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized by that the detection is carried out by incubation with riboflavin synthase and Determination of riboflavin. 9. Die Methode entsprechend Ansprüchen 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, dass eine Mischung mit einem Gehalt an 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat hergestellt wird durch Inkubation einer wässrigen Mischung, welche Ribulose-5-phosphat mit 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsyrthase enthält.9. The method according to claims 1 or 2, characterized in that prepared a mixture containing 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate is by incubation of an aqueous mixture containing ribulose-5-phosphate  Contains 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate myrthase. 10. Die Methode entsprechend einem der Ansprüche 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, dass eine Mischung mit einem Gehalt von 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat her­ gestellt wird durch Inkubation einer wässrigen Mischung, welche Ribose-5-phosphat mit Pentosephosphatisomerase und 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthase enthält.10. The method according to one of claims 1 or 2, characterized by that is a mixture containing 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate is made by incubation of an aqueous mixture containing ribose-5-phosphate with pentose phosphate isomerase and 3,4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate synthase contains. 11. Ein isoliertes Protein, welches eine pflanzentypische 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin­ synthasesequenz hat und in einer Form mit enzymatischer 6,7-Dimethyl-8-ribityl­ lumazinsynthaseaktivität vorliegt.11. An isolated protein containing a plant-typical 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine has synthase sequence and in a form with enzymatic 6,7-dimethyl-8-ribityl lumazine synthase activity. 12. Eine isolierte DNA, welche ausschließlich kodiert für
  • a) ein Protein, welches eine pflanzentypische 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase­ sequenz umfasst; und
  • b) wahlweise mindestens ein zusätzliches Enzym des Flavinbiosyntheseweges.
12. An isolated DNA encoding exclusively for
  • a) a protein which comprises a plant-typical 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase sequence; and
  • b) optionally at least one additional enzyme of the flavin biosynthetic pathway.
13. Eine Methode zum Hemmen eines Enzyms mit 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin­ synthaseaktivität aus oder in einer Pflanze durch Behandlung mit einer Verbindung, welche ausgewählt wird aus der Gruppe der chemischen Verbindungen, welche Hemmung in der Screeningmethode entsprechend Anspruch 1 zeigt.13. A method of inhibiting an enzyme with 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase activity from or in a plant by treatment with a compound, which is selected from the group of chemical compounds which Inhibition in the screening method according to claim 1 shows. 14. Eine chemische Verbindung, welche in der Methode nach Anspruch 1 Hemmung zeigt gegen eine pflanzliche 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthaseaktivität.14. A chemical compound which in the method of claim 1 inhibition shows against a plant 6,7-dimethyl-8-ribityllumazin synthase activity.
DE1999142175 1999-09-03 1999-09-03 Method for finding inhibitors of riboflavin biosynthesis Withdrawn DE19942175A1 (en)

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