DE19937230A1

DE19937230A1 - Chimeric proteins

Info

Publication number: DE19937230A1
Application number: DE1999137230
Authority: DE
Inventors: Christian Kilger; Manfred Koegl; Eva Loeser
Original assignee: Lion Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 1999-08-06
Filing date: 1999-08-06
Publication date: 2001-02-08
Also published as: CA2379165A1; DE10082298D2; WO2001011051A3; AU6983000A; WO2001011051A2; JP2003506089A; EP1198571A2

Abstract

The invention relates to a recombinant chimeric protein comprising a) a first domain with a nucleic acid synthesis activity and b) an interaction mediating sequence, whereby said interaction mediating sequence can form a complex through the nucleic acid synthesis activity and a slide bracketing protein. Said complex is different from the complex formed through the nucleic acid synthesis activity and/or the slide tying protein with their natural interaction partner(s).

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines chimären Proteins, das eine Ba sissequenz und eine heterologe Wechselwirkung-bedingende Sequenz umfaßt und infolge der Wechselwirkung-bedingenden Sequenz mit einem Wechselwirkungspartner eine Bindung eingeht oder eine solche Bindung verstärkt wird. Die Erfindung betrifft weiterhin chimäre Proteine, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugt werde. Die Erfindung betrifft weiterhin solche thermostabilen in vitro-Komplexe bei denen erfindungsgemäße chimäre Proteine zum Einsatz kommen. Desweiteren betrifft die Erfindung die Verwendung der erfin dungsgemäßen chimären Proteine in Verfahren zur Template-abhängigen Elongation von Nu kleinsäuren, wie PCR Reaktionen oder der DNA Sequenzierung, bei denen in vitro Template abhängige DNA Strangsynthese erfolgt. Schließlich betrifft die Erfindung noch Kits bzw. Reagenzienkits zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren.The invention relates to a method for producing a chimeric protein which has a Ba sequence and a heterologous interaction-dependent sequence and as a result of the Interaction-related sequence with an interaction partner binding received or such a bond is strengthened. The invention further relates to chimeric Proteins that are produced with the method according to the invention. The invention relates furthermore such thermostable in vitro complexes in which chimeras according to the invention Proteins are used. Furthermore, the invention relates to the use of the inventions chimeric proteins according to the invention in processes for template-dependent elongation of Nu small acids, such as PCR reactions or DNA sequencing, in which templates are used in vitro dependent DNA strand synthesis takes place. Finally, the invention also relates to kits or Reagent kits for carrying out the method according to the invention.

Viele Proteine liegen in der Zelle nicht als Monomere vor, sondern sind Teil eines funktio nellen multimeren Komplexes. Beispiele für solche Komplexe sind in fast allen Bereichen der Zellbiologie beschrieben (z. B. Transkription, Translation, Replikation, Zytoskelett, Signal transduktion, mRNA processing).Many proteins are not present in the cell as monomers, but are part of a function multimer complex. Examples of such complexes are found in almost all areas of the Cell biology described (e.g. transcription, translation, replication, cytoskeleton, signal transduction, mRNA processing).

Die Wechselwirkung oder Bindung eines Proteins mit oder an ein anderes Protein, hierin im folgenden Donorprotein und Akzeptorprotein genannt, erfolgt über bestimmte Aminosäurese quenzen, die im gefalteten Protein meist an der Oberfläche des Proteins liegen und für die spezifische Bindung oder Wechselwirkung an oder mit dem Partner verantwortlich sind. Eine solche Aminossäuresequenz wird im folgenden als "Wechselwirkung-bedingende Sequenz" bezeichnet. Demgemäß sind als Donorproteine solche Proteine zu verstehen, die mit einem weiteren Protein interagieren und gegebenenfalls ein weiteres Protein binden. Gleichermaßen sind als Akzeptorproteine solche Proteine zu verstehen, die mit einem weiteren Protein intera gieren und gegebenenfalls ein weiteres Protein binden.The interaction or binding of a protein with or to another protein, herein in called the following donor protein and acceptor protein, takes place via certain amino acid synthesis sequences that are mostly on the surface of the protein in the folded protein and for which specific bond or interaction with or with the partner. A such an amino acid sequence is hereinafter referred to as the "interaction-causing sequence" designated. Accordingly, donor proteins are to be understood as those proteins which are associated with a interact with another protein and, if necessary, bind another protein. Alike are to be understood as acceptor proteins such proteins that intera with another protein yaw and optionally bind another protein.

Es gibt eine Reihe von Methoden um Wechselwirkung-bedingende Sequenz einer Protein- Protein Interaktionsstelle zu ermitteln. Dazu gehört die (i) Bestimmung der dreidimensionalen Struktur eines Komplexes durch Röntgenstrukturanalyse oder (ii) NMR-Methoden. Eine weitere Methode ist, eine (iii) Komplexbindung in vitro mit rekombinanten Proteinen zu re konstituieren und durch gezielte Veränderung des Donor- oder Akzeptorproteins die Wech selwirkung-bedingende(n) Sequenz(en) zu ermitteln. Solche gezielten Veränderungen bein halten die Mutation von einzelnen Aminosäuren, zum Beispiel zu Alanin (Alanin-scanning) oder die Deletion von Sequenzen im Protein. Führt die Veränderung oder Deletion einer Se quenz zum Verlust der Wechselwirkungs- oder Bindeaktivität so ist sie Teil der Wechselwir kung-bedingende Sequenz, und umgekehrt, führt die Veränderung oder Deletion einer Se quenz nicht zum Verlust der Wechselwirkungs- oder Bindeaktivität so ist sie nicht Teil der Wechselwirkung-bedingende Sequenz. Auf diese Art und Weise läßt sich die Wechselwir kung-bedingende Sequenz definieren.There are a number of methods for the interaction-dependent sequence of a protein Determine protein interaction site. This includes the (i) determination of the three-dimensional Structure of a complex by X-ray structure analysis or (ii) NMR methods. A another method is to re (iii) complex bind in vitro with recombinant proteins constitute and by changing the donor or acceptor protein in a targeted manner the changes to determine the interaction-related sequence (s). Such targeted changes include keep the mutation of single amino acids, for example to alanine (alanine scanning) or the deletion of sequences in the protein. Performs the change or deletion of a SE loss of interaction or binding activity so it is part of the interaction kung-dependent sequence, and vice versa, leads to the change or deletion of a Se not loss of interaction or binding activity so it is not part of the Interaction-related sequence. In this way the interaction can be Define kung-related sequence.

Eine weitere Methode zur Bestimmung der Wechselwirkung-bedingende Sequenz eines Pro teins beruht auf der Verwendung eines Zweihybridsystems, hierin im folgenden auch als "Y2H" abgekürzt. Y2H Systeme beruhen darauf, daß man ein Protein mit einer nachweisba ren Aktivität (wie z. B. das die Enzymaktivität "Dihydrofolatreduktase") in zwei nicht kova lent miteinander verbundenen Teilen exprimiert. Dieses Protein ist inaktiv, wenn die beiden Teile sich nicht in räumlicher Nähe zu einander befinden. Die beiden zu untersuchenden Pro teine, Donorprotein und Akzeptorprotein werden als Fusionsproteine zu jeweils einem der beiden Teile des Proteins mit der nachweisbaren Aktivität (wie z. B. Dihydrofolatreduktase) exprimiert so daß, zwei Fusionsproteine entstehen. Wenn das Donorprotein das Akzeptorpro tein bindet, so kommen die beiden Hälften des zu nachweisbaren Proteins (wie z. B. Dihydro folatreduktase) in räumliche Nähe zu einander. Dadurch wird die Aktivität des Proteins wie derhergestellt, was man nachweisen kann. Als Proteine mit nachweisbarer Aktivität können Enzyme (Dihydrofolatreduktase, beta-Galactsidase) Signaltransduktionsproteine (Cdc25 aus Saccaromyces cerevisiae) oder Transkriptionsaktivatoren (Gal4, LexA-VP16) eingesetzt wer den. Die Ermittlung der Bindungsregion mit Hilfe des Zweihybridsystems beruht auf der glei chen Überlegung wie bei der in-vitro-Rekonstitution der Bindung: Führt die Veränderung oder Deletion einer Sequenz zum Verlust der Bindeaktivität so ist sie Teil der Wechselwir kung-bedingende Sequenz, und umgekehrt, führt die Veränderung oder Deletion einer Se quenz nicht zum Verlust der Bindeaktivität so ist sie nicht Teil der Wechselwirkung bedingende Sequenz.Another method for determining the interaction-dependent sequence of a pro teins is based on the use of a two-hybrid system, hereinafter also as Abbreviated "Y2H". Y2H systems are based on the fact that a protein with a detectable ren activity (such as the enzyme activity "dihydrofolate reductase") in two non-kova lent interconnected parts expressed. This protein is inactive when the two Parts are not in close proximity to each other. The two pros to be examined teine, donor protein and acceptor protein are fusion proteins to each of the two parts of the protein with detectable activity (such as dihydrofolate reductase) expressed so that two fusion proteins are formed. If the donor protein is the acceptor pro tein binds, then come the two halves of the detectable protein (such as dihydro folate reductase) in spatial proximity to each other. This will like the activity of the protein made what can be demonstrated. As proteins with detectable activity can Enzymes (dihydrofolate reductase, beta-galactsidase) signal transduction proteins (Cdc25 from Saccaromyces cerevisiae) or transcription activators (Gal4, LexA-VP16) who used the. The determination of the binding region with the help of the two hybrid system is based on the same Consideration as for the in vitro reconstitution of the binding: Performs the change or deletion of a sequence to lose binding activity so it is part of the interaction kung-dependent sequence, and vice versa, leads to the change or deletion of a Se does not result in loss of binding activity, so it is not part of the interaction conditional sequence.

Zusätzlich dazu kann man die Wechselwirkung-bedingende Sequenz darüber definieren, daß man eine Vielzahl von Fragmenten des Proteins bezüglich ihrer Interaktion untersucht, und bestimmt, welche Teile des Proteins in den interagierenden Fragmenten immer vorhanden sind. Dieser stets vorhandene Bereich ist die Wechselwirkung-bedingende Sequenz. Um die in einer Wechselwirkung-bedingende Sequenz für die Wechselwirkung oder Bindung we sentlichen Aminosäuren zu identifizieren, kann man durch gezielte Mutationen einzelne Ami nosäuren verändern. Verlust oder Erhöhung der Bindeaktivität weisen darauf hin, daß diese Positionen direkt an der Wechselwirkung Beteiligt sind.In addition to this, one can define the interaction-dependent sequence by the fact that a variety of fragments of the protein are examined for their interaction, and determines which parts of the protein are always present in the interacting fragments are. This area that is always present is the interaction-dependent sequence. To the in an interaction-dependent sequence for the interaction or binding we To identify significant amino acids, individual ami can be identified by targeted mutations Change nonacids. Loss or increase in binding activity indicate that this Positions directly involved in the interaction.

Unter den für in vitro Anwendungen besonders bevorzugten Komplexen gehören die thermo stabilen Komplexe prokaryontischer und eukaryontischer Replikationsapparate, die als wich tige Enzymaktivität häufig Polymerasen beinhalten.Thermo belongs to the complexes which are particularly preferred for in vitro applications stable complexes of prokaryotic and eukaryotic replication apparatus, which as important term enzyme activity often include polymerases.

DNA-Polymerasen gehören zu einer Gruppe von Enzymen, die einzelsträngige DNA als Template für die Synthese eines komplementären DNA Stranges verwenden. Diese Enzyme spielen eine bedeutende Rolle im Nukleinsäurestoffwechsel, einschließlich der Prozesse DNA-Replikation, Reparatur und Rekombination. DNA-Polymerasen wurden in allen zellulä ren Organismen identifiziert, von bakteriellen bis zu menschlichen Zellen, in vielen Viren sowie in Bakteriophagen (Kornberg, A. & Baker, T.A. (1991) DNA Replikation WH Free man, New York, NY). Man faßt in der Regel die Archaebakterien und die Eubakterien zu sammen zu der Gruppe der Prokaryonten, der Organismen ohne echten Zellkern, und stellt ihnen die Eukaryonten, die Organismen mit echtem Zellkern, gegenüber. Gemeinsam sind vielen Polymerasen aus den verschiedensten Organismen oftmals Ähnlichkeiten in der Ami nosäuresequenz sowie Ähnlichkeiten in der Struktur (Wang, J., Sattar, A.K.M.A.; Wang, C.C., Karam, J.D., Konigsberg, W.H. & Steitz, T.A. (1997) Crystal Structure of pol a familily replication DNA polymerase from bacteriophage RB69. Cell 89, 1087-1099). Organismen wie der Mensch besitzen eine Vielzahl von DNA-abhängigen Polymerasen, von denen jedoch nicht alle für die DNA Replikation zuständig sind, sondern einige auch DNA-Reparatur durchführen. Replikative DNA-Polymerasen bestehen in vivo meist aus Proteinkomplexen mit mehreren Einheiten, welche die Chromosomen der zellulären Organismen und Viren replizie ren. Eine generelle Eigenschaft dieser replizierenden Polymerasen ist im allgemeinen eine hohe Prozessivität, das heißt, deren Fähigkeit, Tausende von Nukleotide zu polymerisieren ohne vom DNA Template abzudissoziieren (Kornberg, A. & Baker, T.A. (1991) DNA Repli kation. WH Freeman, New York, NY). DNA polymerases belong to a group of enzymes that are single-stranded DNA Use template for the synthesis of a complementary DNA strand. These enzymes play an important role in nucleic acid metabolism, including processes DNA replication, repair and recombination. DNA polymerases were found in all cells organisms, from bacterial to human cells, are identified in many viruses and in bacteriophages (Kornberg, A. & Baker, T.A. (1991) DNA Replication WH Free man, New York, NY). As a rule, the archaebacteria and eubacteria are included come together to form the group of prokaryotes, the organisms without a real cell nucleus opposite them are the eukaryotes, the organisms with a real cell nucleus. Are common Many polymerases from a wide variety of organisms often have similarities in the amino acid nucleic acid sequence and structural similarities (Wang, J., Sattar, A.K.M.A .; Wang, C.C., Karam, J.D., Konigsberg, W.H. & Steitz, T.A. (1997) Crystal Structure of pol a familily replication DNA polymerase from bacteriophage RB69. Cell 89, 1087-1099). Organisms like humans have a variety of DNA-dependent polymerases, but of which not all are responsible for DNA replication, but some are also responsible for DNA repair carry out. Replicative DNA polymerases usually consist of protein complexes in vivo several units that replicate the chromosomes of cellular organisms and viruses ren. A general property of these replicating polymerases is generally one high processivity, that is, their ability to polymerize thousands of nucleotides without dissociating from the DNA template (Kornberg, A. & Baker, T.A. (1991) DNA Repli cation. WH Freeman, New York, NY).

Im Stand der Technik sind hochprozessive Replikationsmechanismen bekannt, wobei es sich dabei zum einen um zelluläre Mechanismen und zum anderen um die bei den Bakteriophagen T4 und T7 auftretetenden Repliaktionsmechanismen handelt.In the state of the art, highly processive replication mechanisms are known on the one hand about cellular mechanisms and on the other hand about the bacteriophages T4 and T7 occurring replication mechanisms.

Der Repliaktionsapparat umfaßt eine vielzahl von Komponenten. Dazu gehören, unter ande rem, a) polymeraseaktivität aufweisende Proteine, b) Proteine, die an der Ausbildung einer Klammerstruktur beteiligt sind, wobei der Klammerstruktur unter anderem die Aufgabe zu kommt, eine Polymeraseaktivität an ihr Template zu binden, die Bindung zu stabilisieren und somit die Dissoziationskonstante entsprechend zu ändern, c) Proteine, welche die Klammer auf das template laden, d) Proteine, welche das Template stabilisieren und gegebenenfalls e) Proteine, welche die Polymerase an das Template führen.The replication apparatus includes a variety of components. These include, among others rem, a) proteins having polymerase activity, b) proteins involved in the formation of a Bracket structure are involved, with the bracket structure including the task comes to bind a polymerase activity to their template, stabilize the binding and thus changing the dissociation constant accordingly, c) proteins that hold the bracket load onto the template, d) proteins which stabilize the template and, if necessary, e) Proteins that lead the polymerase to the template.

Die unter b) genannten Proteine bilden Strukturen aus, die entweder offen oder geschlossen sind, beispielsweise ringförmige oder halbringförmige Strukturen. Derlei Strukturen können durch eine oder mehrere Spezies von Proteinen ausgebildet werden. Dabei ist es möglich, daß eine der besagten Proteinspezies eine Polymeraseaktivität aufweist.The proteins mentioned under b) form structures that are either open or closed are, for example ring-shaped or semi-ring-shaped structures. Such structures can are formed by one or more species of proteins. It is possible that one of said protein species has polymerase activity.

Die für die Ausbildung dieser Strukturen verantwortlichen Proteine werden, sofern sie keine Polymeraseaktivität aufweisen, hierin im folgenden als "Gleitklammerproteine" oder "Klam merproteine" bezeichnet.The proteins responsible for the formation of these structures, if they are not Have polymerase activity, hereinafter referred to as "slide clamp proteins" or "Klam merproteine ".

Es ist bekannt, daß der Replikationsapparat in Archaea dem des eukaryontischen Replikations apparates ähnlich ist, obwohl die Genomorganisation in Eukaryonten und Archaea gänzlich ver schieden ist und die zelluläre Struktur der Eubakterien dem der Archaea ähnelt. (Edgell, D.R. and Doolittle, W.F. (1997). Archaea and the origin(s) of DNA replication proteins. Cell 89, 995-998).The replication apparatus in Archaea is known to be that of eukaryotic replication apparatus is similar, although the genome organization in eukaryotes and archaea ver is different and the cellular structure of the eubacteria resembles that of the archaea. (Edgell, D.R. and Doolittle, W.F. (1997). Archaea and the origin (s) of DNA replication proteins. Cell 89, 995-998).

Die Gleitklammer ist häufig über ein oder mehrere weitere Proteine an ein Elongationsprotein gebunden, mit anderen Worten an das Elongationsprotein gekoppelt. Ein derartiges koppelndes Protein wird hierin im folgenden als Kopplungsprotein bezeichnet, wobei gegebenenfalls die Kopplung über eine Mehrzahl von Kopplungsproteinen erfolgen kann.The glide clip is often attached to an elongation protein via one or more other proteins bound, in other words coupled to the elongation protein. Such a coupling Protein is referred to hereinafter as the coupling protein, where appropriate the Coupling can take place via a plurality of coupling proteins.

Unter Elongationsprotein soll hierin im übrigen ein Polymeraseaktivität-aufweisendes Protein oder Komplex verstanden werden, das oder der mindestens eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweißt: Verwendung von RNA als Template, Verwendung von DNA als Tem plate, Synthese von RNA, Synthese von DNA, Exonukleaseaktivität in 5'-3'-Richtung und Exo nukleaseaktivität in 3'-5'-Richtung, Strangverdrängungsaktivität (strand-displacement activity) und Prozessivität oder Nicht-Prozessivität.Elongation protein is said to be a protein which has polymerase activity or complex, the at least one or more of the following Features: Use of RNA as a template, use of DNA as a tem plate, synthesis of RNA, synthesis of DNA, exonuclease activity in the 5'-3 'direction and exo nuclease activity in 3'-5 'direction, strand displacement activity and processivity or non-processivity.

Die dreidimensionale Struktur von verschiedenen Gleitklammerproteinen wurde bereits be stimmt. Die Gesamtstruktur dieser Gleitklammern ist sehr ähnlich; die Bilder der ringförmig ausgebildeten Proteingesamtstruktur von PCNA, der β-Untereinheit und gp45 Ringe sind über einandergelegt deckungsgleich (Kelman, Z. & O'Donnell, M. (1995) Structural and functional similarities of prokaryotic and eukaryotic sliding clamps. Nucleid Acids Res. 23, 3613-3620). Jeder Ring hat vergleichbare Dimensionen und eine zentrale Öffnung, die groß genug ist, um Duplex-DNA, also einen DNA-Doppelstrang, bestehend aus den zwei komplementären DNA- Strängen, zu umschließen.The three-dimensional structure of various gliding clip proteins has already been described Right. The overall structure of these slide clamps is very similar; the images of the ring-shaped Total protein structure of PCNA, the β subunit and gp45 rings are over placed congruently (Kelman, Z. & O'Donnell, M. (1995) Structural and functional similarities of prokaryotic and eukaryotic sliding clamps. Nucleid Acids Res. 23, 3613-3620). Each ring has comparable dimensions and a central opening that is large enough to Duplex DNA, i.e. a double strand of DNA, consisting of the two complementary DNA Strands to enclose.

Die Gleitklammer kann sich in vivo nicht selbst um die DNA herum positionieren, sondern muß um die DNA fixiert werden. In Prokaryonten und Eukaryonten besteht ein derartiger Protein komplex aus einer Vielzahl von Untereinheiten. Der Proteinkomplex erkennt das 3'-Ende des Primers des "Primer-Template-Duplexes" und positioniert die Gleitklammer in Anwesenheit von ATP um die DNA.The glide clip cannot position itself around the DNA in vivo, but must to be fixed around the DNA. Such a protein exists in prokaryotes and eukaryotes complex from a multitude of subunits. The protein complex recognizes the 3 'end of the Primer of the "primer template duplex" and positions the glide clip in the presence of ATP around DNA.

Im Falle des Bacteriophagen T7 wird das gleiche Ziel, eine prozessive DNA-Synthese, mittels eines strukturell anderen Proteinkomplexes erreicht. Der Phage exprimiert eine eigene katalyti sche Polymerase, die T7-Polymerase, die das Genprodukt des gene 5, welche mit einem Protein aus dem Wirt Escherichia coli, dem Thioredoxin, eine Bindung eingeht und als Replikase eine hochprozessive DNA-Replikation ermöglicht. Auch hierbei kommt es zur Klammerbildung, jedoch weist diese Klammer nicht die gleiche Struktur auf, wie z. B. im Falle des eukaryonti schen PCNA.In the case of the bacteriophage T7, the same goal, a processive DNA synthesis, is achieved by of a structurally different protein complex. The phage expresses its own catalyti cal polymerase, the T7 polymerase, which is the gene product of gene 5, which is associated with a protein binds from the host Escherichia coli, the thioredoxin, and as a replicase one enables highly processing DNA replication. Brackets also form here, however, this bracket does not have the same structure as e.g. B. in the case of eukaryonti PCNA.

Oft ist es nötig, wie zum Beispiel im Falle der humanen Polymerase δ, daß Proteine (Kopp lungsproteine) die Verbindung zwischen dem katalytisch aktiven Teil der Polymerase und dem Prozessivitätsfaktor (Gleitklammer) schaffen. Beim Menschen ist dies die kleine Untereinheit der δ-Polymerase (Zhang, S.-J., Zeng, X.-R., Zhang, P., Toomey, N.L., Chuang, R.Y., Chang, L.-S., and Lee, M. Y. W. T. (1994). A conserved region in the amino terminus of DNA polymera se δ is involved in proliferating cell nuclear antigen binding. J. Biol. Chem. 270, 7988-7992). Im Falle der T7 Polymerase jedoch bindet der Prozessivitätsfaktor die katalytische Einheit der Po lymerase direkt.It is often necessary, as in the case of human polymerase δ, for proteins (Kopp tion proteins) the connection between the catalytically active part of the polymerase and the Create a processivity factor (glide clip). In humans, this is the small subunit δ polymerase (Zhang, S.-J., Zeng, X.-R., Zhang, P., Toomey, N.L., Chuang, R.Y., Chang, L.-S., and Lee, M.Y.W.T. (1994). A conserved region in the amino terminus of DNA polymera se δ is involved in proliferating cell nuclear antigen binding. J. Biol. Chem. 270, 7988-7992). in the In the case of T7 polymerase, however, the processivity factor binds the catalytic unit of the Po lymerase directly.

DNA-Polymerasen werden unter anderem durch zwei Eigenschaften charakterisiert, ihre Elon gationsrate, das heißt die Anzahl der Nukleotide die sie pro Sekunde in einen wachsenden DNA Strang inkorporieren können und ihre Dissoziationskonstante. Wenn die Polymerase nach jedem Inkorporationsschritt eines der Nukleotide in die wachsende Kette wieder vom Strang abdisso ziiert, (d. h. ein Elongationsschritt erfolgt pro Bindungsereignis), dann hat die Prozessivität den Wert 1 und die Polymerase ist nicht prozessiv. Wenn die Polymerase für wiederholte Nuklein säureinkorporationen mit dem Strang verbunden bleibt, dann wird der Replikationsmodus als prozessiv bezeichnet und kann einen Wert von mehreren Tausend erreichen (siehe hierzu auch: Methods in Enzymology Volume 262, DNA Replication, Edited by J.L. Campbell, Academic press 1995, pp. 270-280).DNA polymerases are characterized by two properties, their Elon gation rate, that is, the number of nucleotides they put into a growing DNA per second Can incorporate strand and its dissociation constant. If the polymerase after each Incorporation step of one of the nucleotides into the growing chain again from the strand abdisso quotes, (i.e. one elongation step occurs per binding event), then the processivity has the Value 1 and the polymerase is not processive. If the polymerase for repeated nuclein acid incorporations remains attached to the strand, then the replication mode is considered processively designated and can reach a value of several thousand (see also: Methods in Enzymology Volume 262, DNA Replication, Edited by J.L. Campbell, Academic press 1995, pp. 270-280).

Für die meisten in vitro Anwendungen, wie PCR oder Sequenzierungsprozesse, ist Prozessivität eine wünschenswerte Eigenschaft, die allerdings die bislang in diesen Reaktionen eingesetzten thermostabilen Enzyme nur in geringem Maße besitzen.For most in vitro applications, such as PCR or sequencing processes, processivity is essential a desirable property, however, the ones used so far in these reactions possess thermostable enzymes only to a small extent.

Die U.S. Patente 4,683,195, 4,800,195 und 4,683,202 beschreiben die Anwendung solcher ther mostabiler DNA-Polymerasen in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). In der PCR wird unter Verwendung von Primern, Template (auch Matrize genannt), Nukleotiden, einer DNA- Polymerase eines entsprechenden Puffers und geeigneten Reaktionsbedingungen DNA neu syn thetisiert. In dieser PCR kommt es bevorzugt zur Verwendung einer thermostabilen Polymerase, welche das zyklische, thermische Aufschmelzen der DNA Stränge übersteht. So wird häufig Taq DNA-Polymerase verwendet (U.S. Patent 4,965,188). Die Prozessivität der Taq DNA- Polymerase ist jedoch, wie oben ausgeführt, relativ gering im Vergleich zur T7-Polymerase.The U.S. Patents 4,683,195, 4,800,195 and 4,683,202 describe the use of such ther most stable DNA polymerases in the polymerase chain reaction (PCR). In the PCR is under Use of primers, templates (also called templates), nucleotides, a DNA Polymerase of a corresponding buffer and suitable reaction conditions DNA new syn thetized. This PCR preferably uses a thermostable polymerase, which survives the cyclic, thermal melting of the DNA strands. So often Taq DNA polymerase used (U.S. Patent 4,965,188). The Processivity of Taq DNA However, as stated above, polymerase is relatively low compared to T7 polymerase.

DNA-Polymerasen finden auch bei der DNA Sequenzbestimmung Anwendung (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74: 5463-5467 (1997)). Die hierbei zur Verwendung kommenden Polymerasen können z. B. die oben erwähnte Taq-Polymerase sein (U.S. Patent 5,075, 216) oder die Polymerase von Thermotoga neapolitana (WO 96/10640) oder andere thermostabile Poly merasen sein. Neuere Verfahren koppeln die exponentielle Amplifikation und die Sequenzierung eines DNA Fragmentes in einem Schritt, so daß es möglich ist, genomische DNA direkt zu se quenzieren. Eines der Verfahren, das sogenannte DEXAS-Verfahren (Nucleic Acids Res 1997 May 15; 25 (10): 2032-2034 Direct DNA sequence determination from total genomic DNA. Kil ger C, Pääbo S. Biol. Chem. 1997 Feb; 378 (2) : 99-105 Direct exponential amplification and se quencing (DEXAS) of genomic DNA. Kilger C, Pääbo S und DE 196 53 439.9 sowie DE 196 53 494.1) verwendet eine Polymerase mit verminderter Diskriminierungsfähigkeit gegenüber Dideoxynukleotiden (ddNTPs) im Vergleich zu Deoxynukleotiden (dNTPs) sowie einen Reakti onspuffer, zwei Primer, die bevorzugt nicht äquimolar vorliegen, und die oben genannten Nu kleotide, um dann in mehreren Zyklen eine komplette, sequenzspezifische DNA-Leiter eines Fragmentes zu erhalten, welches von den Primern flankiert ist. Eine Weiterentwicklung dieses Verfahrens besteht in der Verwendung eines Polymerasegemisches, wobei eine der beiden Po lymerase zwischen ddNTPs und dNTPs diskriminiert, während die zweite eine verminderte Dis kriminierungsfähigkeit aufweist (Nucleic Acids Res 1997 May 15; 25 (10): 2032-2034 Direct DNA sequence determination from total genomic DNA. Kilger C, Pääbo S).DNA polymerases are also used in DNA sequence determination (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74: 5463-5467 (1997)). The ones used here Polymerases can e.g. B. the above-mentioned Taq polymerase (U.S. Patent 5,075, 216) or the polymerase from Thermotoga neapolitana (WO 96/10640) or other thermostable poly be merase. Newer methods couple exponential amplification and sequencing of a DNA fragment in one step, so that it is possible to directly search genomic DNA quence. One of the processes, the so-called DEXAS process (Nucleic Acids Res 1997 May 15; 25 (10): 2032-2034 Direct DNA sequence determination from total genomic DNA. Kil ger C, Pääbo S. Biol. Chem. 1997 Feb; 378 (2): 99-105 Direct exponential amplification and se quencing (DEXAS) of genomic DNA. Kilger C, Pääbo S and DE 196 53 439.9 and DE 196 53 494.1) uses a polymerase with reduced discrimination ability Dideoxynucleotides (ddNTPs) compared to deoxynucleotides (dNTPs) as well as a reacti on buffer, two primers, which are preferably not in equimolar amounts, and the above-mentioned nu kleotide, in order to complete a sequence-specific DNA ladder of one in several cycles To receive fragment, which is flanked by the primers. A further development of this The method consists in the use of a polymerase mixture, one of the two Po lymerase discriminated between ddNTPs and dNTPs, while the second a diminished dis ability to criminate (Nucleic Acids Res 1997 May 15; 25 (10): 2032-2034 Direct DNA sequence determination from total genomic DNA. Kilger C, Pääbo S).

DNA-Polymerasen finden auch Anwendung bei der reversen Transkription von RNA in DNA. Hierbei dient RNA als Template und die Polymerase synthetisiert einen komplementären DNA- Strang. Zur Anwendung kommt hier z. B. die thermostabile DNA-Polymerase aus dem Organis mus Thermus thermusphilus (Tth) ((U.S. Patent 5,322,770). DNA polymerases are also used in the reverse transcription of RNA into DNA. Here RNA serves as a template and the polymerase synthesizes a complementary DNA Strand. Applies here z. B. the thermostable DNA polymerase from the organ mus Thermus thermusphilus (Tth) ((U.S. Patent 5,322,770).

Es kann auch vorkommen, daß die Polymerase eine proof-reading' Aktivität besitzt, also eine 3'- 5'-Exonukleaseaktivität aufweist. Diese Eigenschaft ist insbesondere dann wünschenswert, wenn das zu synthetisierende Produkt mit einer niedrigen Fehlerrate bei der Nukleotidinkorporation hergestellt werden soll ein Beispiel stellen Polymerasen aus dem Organismus Pyrococcus wosei dar.It can also happen that the polymerase has proof-reading activity, i.e. a 3'- Has 5'-exonuclease activity. This property is particularly desirable when the product to be synthesized with a low error rate in nucleotide incorporation An example is polymerases from the organism Pyrococcus wosei represents.

Die oben genannten Elongationsproteine, die in den oben genannten Anwendungen zum Einsatz kommen, gehören in vivo größtenteils nicht zu den eigentlichen Replikationsenzymen, sondern es sind zumeist Enzyme, von denen man annimmt, daß sie bei der DNA-Reparatur beteiligt sind, weshalb deren Prozessivität relativ gering ist. Zudem besitzt jeder Organismus eine Vielzahl von Polymerasen die eine Vielzahl von Eigenschaften besitzen.The above elongation proteins are used in the above applications come in vivo mostly do not belong to the actual replication enzymes, but it's mostly enzymes that are thought to be involved in DNA repair, which is why their processivity is relatively low. In addition, every organism has a variety of Polymerases that have a variety of properties.

Solche Elongationsproteine weisen wie oben ausgeführt z. B. die Eigenschaften: Verwendung von RNA als Template, Verwendung von DNA als Template, Synthese von RNA, Synthese von DNA, Exonukleaseaktivität in 5'-3'-Richtung und Exonukleaseaktivität in 3'-5'-Richtung, Strangverdrängungsaktivität (strand-displacement activity), Prozessivität oder Nicht- Prozessivität oder Thermostabilität oder Thermosensitivität auf. In vivo ist es jedoch häufig so, daß ein Proteinkomplex eine oder mehrere dieser Eigenschaften vereint. Insbesondere, liegen oftmals Replikationskomplexe vor deren Prozessivität wie oben ausgeführt, durch das Vorhan densein eines Gleitklammerproteins gesteigert wird.Such elongation proteins have z. B. the characteristics: use of RNA as a template, use of DNA as a template, synthesis of RNA, synthesis of DNA, exonuclease activity in the 5'-3 'direction and exonuclease activity in the 3'-5' direction, Strand displacement activity, processivity or non- Processivity or thermostability or thermosensitivity. In vivo, however, it is often the case that a protein complex combines one or more of these properties. In particular, lie often replication complexes before their processivity as stated above by the curtain which is increased by a slide clamp protein.

Für in vitro-Anwendungen war die Bereitstellung und Verwendung solcher, mehrere Eigen schaften vereinende, Replikationskomplexe dadurch eingeschränkt, daß die Einzelkomponenten nicht alle bekannt waren.The provision and use of such were in-house for in vitro applications unifying replication complexes limited by the fact that the individual components not all were known.

Auch war, für in vitro-Anwendungen die Bereitstellung und Verwendung solcher prozessiver Replikationskomplexe dadurch eingeschränkt, daß die Einzelkomponenten nicht alle bekannt waren. Also, the provision and use of such was more processive for in vitro applications Replication complexes limited by the fact that the individual components are not all known were.

Neben den oben genannten Bestandteilen von Replikationsapparaten, findet man in vivo auch andere DNA modifizierende Proteine häufig in größeren Komplexen mit weiteren Proteinen. In solchen Komplexen kommt es oftmals dazu, daß von einem ersten Protein "eine DNA modifizie rende Aktivität" wie beispielsweise Terminale-Transkriptase-Aktivtät, zusammen kommt mit einer oder mehreren, durch ein weiteres Protein in den Komplex eingebrachten Aktivität, wie beispielsweise Exonukleaseaktivität. Unter DNA-modifizerender Aktivität ist hierin jede enzy matische Aktivität, die zu einer chemischen, physikalischen oder strukturellen Veränderung einer Ausgangs-Nukleinsäure führt, zu verstehen. Es kommt auch vor, daß eine DNA modifizierende Aktivität erst durch die Interaktion mit mindestens einem weiteren Protein zustande kommt, weiter ist es möglich, daß eine DNA modifizierende Aktivität verringert oder gesteigert wird, durch die Interaktion mit mindestes einem weiteren Protein. Somit entsteht in vivo oftmals ein Proteinkomplex der z. B. die Summe der Einzelaktivitäten trägt oder dessen Aktivität gegenüber der Einzelaktivität verbessert ist.In addition to the components of replication apparatus mentioned above, one also finds in vivo other DNA-modifying proteins often in larger complexes with other proteins. In Such complexes often result in the modification of a DNA from a first protein activity "such as terminal transcriptase activity comes along with one or more activities introduced into the complex by another protein, such as for example exonuclease activity. DNA-modifying activity includes any enzy Matic activity that leads to a chemical, physical or structural change in a Starting nucleic acid leads to understand. It also happens that a DNA modifier Activity only comes about through interaction with at least one other protein, furthermore it is possible that a DNA-modifying activity is reduced or increased, by interacting with at least one other protein. Thus, a often arises in vivo Protein complex of the z. B. carries the sum of the individual activities or its activity individual activity is improved.

In vivo können derlei Komplexe wie oben ausgeführt andere, oftmals wesentlich verbesserte Eigenschaften aufweisen als jedes Donor oder Akzeptorprotein für sich alleine genommen. In vitro war leider die Verwendung solcher Enzymkomplexe dadurch erschwert, daß Donorprotein und Akzeptorprotein häufig nicht aus dem selben Organismus erhältlich waren oder wenn dies der Fall war, dann eine Eigenschaft entweder des Donorproteins oder des Akzeptorproteins nicht bevorzugt war. Im Falle der Verwendung heterologer System, hierin im folgenden als Systeme bezeichnet bei denen Donorprotein und Akzeptorprotein nicht den selben Ursprung haben, war es häufig der Fall, daß die Wechselwirkungspartner nicht oder nur schlecht miteinander intera gierten bzw. aneinander banden.In vivo, such complexes, as set forth above, can often be other, often significantly improved Have properties as each donor or acceptor protein taken on its own. In Unfortunately, the use of such enzyme complexes was complicated in vitro by the fact that donor protein and acceptor protein were often not available from the same organism or if so was the case, then a property of either the donor protein or the acceptor protein was not was preferred. In the case of using heterologous systems, hereinafter referred to as systems where donor protein and acceptor protein do not have the same origin it is often the case that the interaction partners do not or only poorly intera gated or bound together.

Für in vitro-Anwendungen war die Bereitstellung und Verwendung solcher, verbesserter Pro teinkomplexe, die z. B. mehrere DNA modifizierende Aktivitäten tragenden oder eine verbesserte Aktivität gegenüber ihres Einzelkomponenten hat, dadurch eingeschränkt, daß die Einzelkompo nenten nicht alle bekannt waren. The provision and use of such improved pro was for in vitro applications complexes that z. B. carrying several DNA-modifying activities or an improved Activity towards their individual components has been limited by the fact that the individual comp not all were known.

Somit war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, mehrere der vorgenannten Eigenschaften von Polymerasen, insbesondere hohe Prozessivität und Thermostabilität, für die Verwendung in in vitro Reaktionen zu vereinen.It was therefore an object of the present invention to achieve several of the aforementioned properties of Polymerases, especially high processivity and thermostability, for use in to combine vitro reactions.

Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch das Verfahren und Anspruch 1, das clii märe Protein nach Anspruch 8 und den in vitro-Komplex und Anspruch 10.This object was achieved by the method and claim 1, the clii The protein of claim 8 and the in vitro complex and claim 10.

Weitere Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.Further embodiments result from the subclaims.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und Figuren weiter erläutert, aus denen sich weitere Vorteile und Ausführungsformen ergebenThe invention is further illustrated by the following examples and figures, from which: there are further advantages and embodiments

example 1

Zur Bestimmung der Binderegion von Gleitklammerproteinen (von nun an GKP) und Replikationsfaktoren (von nun an: RF) wird das Hefe-Zweihybridsystem (Fields S, Song O, Nature 1989 Jul 20; 340 (6230): 245-6) verwendet. Die Gene für GKPs und RFs werden in den Vektoren pGBT9 und pGAD424 exprimiert, sodaß Fusionsproteine mit der DNA- Bindedomäne bzw. der Aktivierungsdomäne von GAL4 entstehen. Dabei werden die offenen Leserastrer der Gene mittels PCR aus genomischer DNA von Archaeoglobus fulgidus amplifiziert. Die DNA wird mittels der bekannten Verfahren aus dem Organismus Archaeoglobus fulgidus (DSM No. 4304) gereinigt. Organismen Aufzucht geschieht hierbei durch die DSM (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen). Andere Vektoren, die im Zweihybridsystem verwendet werden eignen sich auch für das im Folgenden beschriebenen Verfahren (darunter sind zum Besispiel pAD-GAL4-2.1, pBD-GAL4, pBD-GAL4 Cam, pCMV-AD, pCMV-BD, pMyr, pSos, pACT2, pAS2-1, pHISi, pLexA, pM, pHISi-1, pB42AD, pVP16, pGADIO, pGBKT7, pLacZi, pBop-lacZ, pGAD GH, pGilda, pAD GL, pGADT7, pGBDU, pDBLeu, pPC86, pDBTrp). Zusätzlich werden veränderte Klone in die gleichen Vektoren kloniert. Bei den veränderten Klonen handelt es sich um Deletionsmutationen und um Mutationen die einzelne oder mehrere Aminosäuren des GKP und/oder des RF verändern. Anschließend wird die Fähigkeit der veränderten Klone, im Zweihybridsystem miteinander zu interagieren, gemessen.To determine the binding region of slide clamp proteins (from now on GKP) and Replication factors (from now on: RF) will be the yeast two hybrid system (Fields S, Song O, Nature 1989 Jul 20; 340 (6230): 245-6) used. The genes for GKPs and RFs are in the Vectors pGBT9 and pGAD424 expressed so that fusion proteins with the DNA Binding domain or the activation domain of GAL4 arise. The open ones Reading frames of the genes by means of PCR from Archaeoglobus fulgidus genomic DNA amplified. The DNA is extracted from the organism using known methods Archaeoglobus fulgidus (DSM No. 4304) cleaned. Organisms are raised here by the DSM (German Collection for Microorganisms). Other vectors that are in the Dual hybrid systems are also suitable for the one described below Procedures (including, for example, pAD-GAL4-2.1, pBD-GAL4, pBD-GAL4 Cam, pCMV-AD, pCMV-BD, pMyr, pSos, pACT2, pAS2-1, pHISi, pLexA, pM, pHISi-1, pB42AD, pVP16, pGADIO, pGBKT7, pLacZi, pBop-lacZ, pGAD GH, pGilda, pAD GL, pGADT7, pGBDU, pDBLeu, pPC86, pDBTrp). In addition, modified clones will be the same Cloned vectors. The modified clones are deletion mutations and for mutations that change the single or more amino acids of the GKP and / or the RF. Then the ability of the modified clones to interact with each other in the dual hybrid system interact, measured.

Es gibt eine Reihe von Methoden, Deletionen in ein Gen einzuführen. Eine Methode zur Herstellung der Deletionen ist es DNA-Fragmente herzustellen, die die Gene für das GKP oder den RF enthalten. Diese Fragmente werden entweder durch PCR oder durch Restriktionsverdau aus einem geeignetem Vektor gewonnen. Weiters wird genomische DNA des Organismus verwendet, aus dem die beiden Proteine stammen. Diese verschiedenen DNA-Fragmente und die genomische DNA werden nun durch Ultraschallbehandlung zerkleinert, und Fragmente, die zwischen der Gesamtlänge der Gene und etwa 100 Basen liegen, werden durch präparative Agarosegelelektrophrese gereinigt. Die Enden der Fragmente werden durch Behandlung mit einem geeignetem Enzym (Klenow, Pwo-Polymerase, oder andere) aufgefüllt bzw. abverdaut, sodass beide Stränge die gleiche Länge haben ("blunt" sind). Diese Fragmente werden nun durch Ligation in einen mit SmaI geschnittenen (oder anders linerisierten und blunt gemachten) pGAD424 und pGBT9 Vektor, oder andere geeignete Vektoren, eingebaut. So entstehen Banken von einer Vielzahl von Subfragmenten der Gene für die GKP und die RF, jeweils in beiden Vektoren des Zweihybridsystems. Die DNA dieser Banken wird nach Transformation in Escherichia coli vermehrt und gereingt. Im nächsten Schritt werden die beiden Banken in einen für das Zweihybridsystem geeigneten haploiden Hefestamm transformiert, sodass die Fusionen mit der DNA-Bindedomäne in einem Stamm mit einem anderen Paarungstyp vorliegen als die Fusionen mit der Aktivierungsdomäne. Durch Paarung der beiden Stämme werden nun diploide Zellen erzeugt, in denen die Plasmide aus beiden Banken in derselben Zelle vorliegen. Als Stamm eignet sich PJ69-4 (James P, Halladay J, Craig EA, Genetics 1996 Dec; 144 (4): 1425-36) oder jeder andere Stamm mit einem für das Zweihybridsystem geeigneten Genotyp. Zellen, in denen die Reportergene aktiviert werden, werden isoliert, und die Plasmid DNA daraus durch Preparation gewonnen, oder die Inserts durch PCR spezifisch vermehrt. Die Sequenzen werden durch DNA-Sequenzanalyse ermittelt. Die Bindungsregion (oder die Bindungsregionen) wird (werden) durch Bestimmung jener Bereiche ermittelt, die in allen interagierenden Klonen gefunden werden (oder die in bestimmten Gruppen von interagierenden Klonen immer gefunden werden). Diese Bestimmung wird für jedes der Gene viermal durchgeführt: einmal mit der Bank im Vektor mit der Aktivierungsdomäne (präferentiell: pGAD424) und einmal mit der Bank im Vektor mit der DNA-Bindedomäne (präferentiell: pGTB9), jeweils einmal mit dem Gesamtlängenklon des Bindepartners und einmal mit der Genbank der Fragmente.There are a number of ways to insert deletions into a gene. A method for Production of the deletions is to produce DNA fragments that contain the genes for the GKP or contain the RF. These fragments are either by PCR or by Restriction digestion obtained from a suitable vector. Furthermore, genomic DNA of the organism from which the two proteins come. These different DNA fragments and the genomic DNA are now sonicated crushed, and fragments between the total length of the genes and about 100 bases are cleaned by preparative agarose gel electrophresis. The ends of the fragments are treated with a suitable enzyme (Klenow, Pwo polymerase, or others) filled or digested so that both strands have the same length ("blunt" are). These fragments are now ligated into a SmaI cut (or differently linearized and blunted) pGAD424 and pGBT9 vector, or others suitable vectors, built-in. This is how banks are created from a multitude of subfragments the genes for the GKP and the RF, each in both vectors of the two-hybrid system. The After transformation in Escherichia coli, DNA from these banks is increased and purified. in the The next step will be the two banks in one suitable for the two-hybrid system haploid yeast strain transformed so that the fusions with the DNA binding domain in one Strain with a different mating type than the mergers with the Activation domain. By pairing the two strains, diploid cells are now generated, in which the plasmids from both banks are in the same cell. Suitable as a trunk PJ69-4 (James P, Halladay J, Craig EA, Genetics 1996 Dec; 144 (4): 1425-36) or any other Strain with a genotype suitable for the two hybrid system. Cells in which the Reporter genes are activated, and the plasmid DNA extracted from them Preparation obtained, or the inserts specifically amplified by PCR. The sequences are determined by DNA sequence analysis. The binding region (or regions) becomes (are) determined by determining those areas in all interacting clones can be found (or always in certain groups of interacting clones being found). This determination is carried out four times for each of the genes: once with the bank in the vector with the activation domain (preferential: pGAD424) and once with the bank in the vector with the DNA binding domain (preferential: pGTB9), once each with the total length clone of the binding partner and once with the gene bank of the fragments.

Durch die beschriebenen Versuche ist es möglich, minimale Binderegionen zu definieren, die man für die Konstruktion von chimären Proteinen mit Affinität für GKP nutzen kann. Zur genaueren Charakterisierung der Binderegion werden wir Mutationen von Aminosäuren einführen, und den Effekt auf die Bindeeigenschaft testen. Dadurch werden wir den Bereich weiter einengen und die an der Bindung beteiligten Positionen im Protein bestimmen. In einem parallelen Ansatz werden wir durch das Einführen zufälliger Mutationen in die Binderegion und die Analyse der Effekte auf die Bindung ebenfalls die an der Bindung beteiligten Positionen bestimmen. In beiden Fällen werden wir bestimmen, ob die Mutationen das Protein instabil machen und also einen indirekten Effekt haben, oder ob sie keine Auswirkungen auf die Stabilität des Proteins haben und so einen direkten Effekt haben.Through the experiments described, it is possible to define minimal binding regions that can be used for the construction of chimeric proteins with affinity for GKP. For more precise characterization of the binding region we will mutations of amino acids and test the binding effect. This will make us the area further narrow and determine the positions in the protein involved in binding. In one We will take a parallel approach by introducing random mutations into the binding region and analysis of the effects on binding also involved in binding Determine positions. In both cases we will determine if the mutations are the protein make unstable and therefore have an indirect effect or whether they have no effect on have the stability of the protein and thus have a direct effect.

Die hierfür nötigen experimentellen Verfahren finden sich in Maniatis et al. (Molecular Cloning (2^nd edition, 3 Volume set): A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)) oder in Ausubel et al (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1988)), oder in Abelson, J.N., and Simon, M.I. (Editoren) 1991 (Methods in Enzymology, Volume 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press,) oder in Adams, A. Gottschling, D.E. Kaiser, CA, and Stearns, T., 1997, (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbour Laboratory Press). Die Handhabung des two-hybrid systems erfolgte gemäß der Anleitung der Firma Clontech (yeast protocols handbook, PT3024-1.The experimental procedures required for this can be found in Maniatis et al. (Molecular Cloning (2 ^nd edition, 3 Volume set): A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989)) or in Ausubel et al (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1988)), or in Abelson, JN, and Simon, MI (editors) 1991 (Methods in Enzymology, Volume 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press,) or in Adams, A. Gottschling, DE Kaiser, CA, and Stearns, T ., 1997, (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press). The two-hybrid system was handled in accordance with the instructions of Clontech (yeast protocols handbook, PT3024-1.

Example 2

Es wurde GKP und den RF als rekombinante Proteine gewonnen. Jeweils eines der beiden Proteine wurde an einem Träger immobilisiert. Dann wurde das andere Protein in ungebun dener Form zugeben, um die Bindung an den immobilisierten Partner erlauben. Freies Materi al wurde ausgewaschen, und das gebundene Protein z. B. durch Denaturierung eluiert. Die Menge des gebundenen Proteins ist ein Mass für die Bindung (z. B. angewandt in Anderson D, Koch CA, Grey L, Ellis C, Moran MF, Pawson T, Science 1990 Nov 16; 250 (4983): 979-82). Die Analyse von Deletionsmutanten des Proteins und von Mutanten mit veränderter Ami nosäuresequenz erlaubte die Kartierung der Bindungsregion. Deletionen können durch pro teolytischen Verdau oder mittels der rekombinanten Expression von deletierten Genen erzeugt werden. In gleicher Weise kann man durch Ko-immunpräzipitation aus Zellextrakten, die de letierte Formen der Proteine enthalten, die Binderegion bestimmen. Die Kompetition der Bin dung durch Peptide kann Aufschluß auf die Sequenz der Binderegion geben.GKP and RF were obtained as recombinant proteins. One of the two Proteins were immobilized on a support. Then the other protein was unbound add their form to allow attachment to the immobilized partner. Free matter al was washed out and the bound protein e.g. B. eluted by denaturation. The Amount of protein bound is a measure of binding (e.g. used in Anderson D, Koch CA, Gray L, Ellis C, Moran MF, Pawson T, Science 1990 Nov 16; 250 (4983): 979-82). Analysis of deletion mutants of the protein and mutants with modified Ami nucleic acid sequence allowed mapping of the binding region. Deletions can be made by pro Teolytic digestion or by means of recombinant expression of deleted genes become. In the same way, one can by co-immunoprecipitation from cell extracts that de contain lethal forms of the proteins that determine the binding region. The competition of the bin Peptide can provide information about the sequence of the binding region.

Ein weiter Weg ist es, Peptide herzustellen und die Bindung der Peptide an das jeweils andere Protein zu messen. Die Sequenz der Peptide kann zufällig (Songyang Z, Prog Biophys Mol Biol 1999; 71 (3-4): 359-72) oder auf der Aminosäuresequenz des Proteins beruhen, dessen Binderegion identifiziert werden soll (petide scans, Brix J, Rudiger S, Bukau B, Schneider- Mergener J, Pfanner N,J Biol Chem 1999 Jun 4; 274 (23): 16522-30). Solche Peptide können durch chemische Synthese oder durch andere Methen wie phage display hergestellt und zur Bindung angeboten werden. Ein Beispiel ist in Fig. 1 gezeigt.A long way is to produce peptides and to measure the binding of the peptides to the other protein. The sequence of the peptides can be random (Songyang Z, Prog Biophys Mol Biol 1999; 71 (3-4): 359-72) or based on the amino acid sequence of the protein whose binding region is to be identified (petide scans, Brix J, Rudiger S, Bukau B, Schneider-Mergener J, Pfanner N, J Biol Chem 1999 Jun 4; 274 (23): 16522-30). Such peptides can be prepared by chemical synthesis or by other methods such as phage display and offered for binding. An example is shown in FIG. 1.

Eine weitere Methode ist es, Antikörper herzustellen gegen Epitope des Proteins dessen Bin deregion identifiziert werden soll. Wenn der Antikörper die Bindung inhibiert, so überschnei det sich das Epitop es Antikörpers mit der Binderegion (z. B. Fumagalli S. Totty NF, Hsuan JJ, Courtneidge SA, Nature 1994 Apr 28; 368 (6474): 871-4).Another method is to produce antibodies against epitopes of the protein whose bin deregion to be identified. If the antibody inhibits binding, overlap the epitope of the antibody with the binding region (e.g. Fumagalli S. Totty NF, Hsuan JJ, Courtneidge SA, Nature 1994 Apr 28; 368 (6474): 871-4).

Eine weitere Methode ist es, die Feinstruktur des Komplexes aufzuklären, mit den Methoden der Röntgenstrukturanalyse, der Nuclear Magnetic Resonance oder der Elektronenmikrosko pie.Another method is to elucidate the fine structure of the complex using the methods X-ray structure analysis, nuclear magnetic resonance or electron microscopy pie.

Example 3

Interaktionen von Proteinen aus Archaeoglobus fulgidus wurden mit dem Y2H System ge zeigt. Die kodierenden Bereiche von Genen aus Archaeoglobus fulgidus, deren Genprodukte in vitro verwendeten werden können, wurden mittels PCR amplifiziert, in die Vektoren pGBT9 (vertikale Spalten der Fig. 27) und pGAD424 (horizontale Reihen der Fig. 27) klo niert und durch gap-repair in Hefe PJ69-4a (für pGAD424) und PJ69-4alpha (für pGBT9) als Hybridproteine zur Expression gebracht. Ebenso wurde eine positive Kontrolle mittels PCR amplifiziert, in die Vektoren pGBT9 (siehe auch vertikale Spalten der Fig. 2) und pGAD424 (siehe auch horizontale Reihen der Fig. 27) kloniert und durch gap-repair in den Hefestamm PJ69-4a (für pGAD424) und PJ69-4alpha (für pGBT9) als Hybridproteine zur Expression gebracht. Diploide Zellen, die beide Vektoren enthalten, wurden durch Paarung entsprechend dem gezeigten Raster in Fig. 2 erzeugt. Die Expression von drei unabhängigen Reportern (HIS3, ADE2 und MEL1) wurde gemessen. Gezeigt ist in Fig. 2 das Wachstum auf Medium ohne Histidin und Adenin. In diesem Experiment wachsen jene Zellen, die beide Vektoren tragen und zudem die Expressionsprodukte dieser beiden Vektoren einander binden. Was da durch bedingt wird, daß in Folge der Bindung der Expressionsprodukte Transkription initiiert wird, die dazu führt, daß die Histidin und Adenin Auxotrophie aufgehoben wird.Interactions of proteins from Archaeoglobus fulgidus were shown with the Y2H system. The coding regions of genes from Archaeoglobus fulgidus, whose gene products can be used in vitro, were amplified by PCR, cloned into the vectors pGBT9 (vertical columns of FIG. 27) and pGAD424 (horizontal rows of FIG. 27) and cloned by gap- repair in yeast PJ69-4a (for pGAD424) and PJ69-4alpha (for pGBT9) expressed as hybrid proteins. Likewise, a positive control was amplified by PCR, cloned into the vectors pGBT9 (see also vertical columns of FIG. 2) and pGAD424 (see also horizontal rows of FIG. 27) and by gap repair in the yeast strain PJ69-4a (for pGAD424 ) and PJ69-4alpha (for pGBT9) as hybrid proteins for expression. Diploid cells containing both vectors were generated by pairing according to the grid shown in Fig. 2. The expression of three independent reporters (HIS3, ADE2 and MEL1) was measured. The growth on medium without histidine and adenine is shown in FIG . In this experiment, the cells that carry both vectors and also bind the expression products of these two vectors grow together. This is due to the fact that, as a result of the binding of the expression products, transcription is initiated, which leads to the histidine and adenine auxotrophy being abolished.

Alle hier positiven Klone waren auch positiv bezüglich der Expression des MEL1 Gens. Die Handhabung des two-hybrid systems erfolgte gemäß der Anleitung der Firma Clonetech (yeast protocols handbook, PT3024-1). Fig. 2 zeigt eine Bindung zwischen den Proteinen der Positivkontrolle, dem Elongationsprotein und dem Gleitklammerprotein, dem Gleitklammer protein und dem Gleitklammerprotein und dem Kopplungsprotein und dem Gleitklammer protein. In weiteren Versuchen wurde diese Wechselwirkungsbedingende-Sequenz durch Verkleinerung der Inserts der Vektoren eingeengt (Siehe Fig. 1).All clones positive here were also positive for the expression of the MEL1 gene. The two-hybrid system was handled in accordance with the instructions from Clonetech (yeast protocols handbook, PT3024-1). Fig. 2 is a bond between the proteins of the positive control, the Elongationsprotein and the Gleitklammerprotein, the slide clamp protein and protein-the Gleitklammerprotein and the coupling protein and the slide bracket. In further experiments, this interaction-dependent sequence was narrowed down by reducing the inserts of the vectors (see FIG. 1).

Fig. 1

Zeigt das Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens. Aus den in der Figur dargestellten Sequenzen lassen sich die erfindungsgemäßen Chimären Proteine herstellen.Shows the result of the method according to the invention. From those shown in the figure The chimeric proteins according to the invention can be produced in sequences.

Fig. 2 (example 2)

Die Fig. 2 zeigt die Ergebnisse eines Y2H Experimentes, wobei die Reihe A mit Zellen be stückt ist, die den leeren pGAD424 Vektor (Clontech, Palo Alto, USA) tragen, sodaß die Transkriptions-Aktivierungsdomäne exprimiert wird, die Reihe B mit Zellen bestückt ist, die den pGAD424 Vektor tragen, von dem das Sacharomyces cerevesiae Gen CDC48 als Fusi onsprotein mit der Transkriptions-Aktivierungsdomäne exprimiert wird, die Reihe C mit Zel len bestückt ist, die den pGAD424 Vektor tragen, von dem das Gleitklammergen aus Ar chaeoglobus fulgidus als Fusionsprotein mit der Transkriptions-Aktivierungsdomäne expri miert wird, die Reihe D nicht mit Zellen bestückt ist und die Reihe E mit Zellen bestückt ist, die den pGAD424 Vektor tragen, von dem das Elongationsproteingen aus Archaeoglobus fulgidus als Fusionsprotein mit der Transkriptions-Aktivierungsdomäne exprimiert wird. Fig. 2 shows the results of a Y2H experiment, where row A is populated with cells carrying the empty pGAD424 vector (Clontech, Palo Alto, USA) so that the transcription activation domain is expressed, row B populated with cells which carry the pGAD424 vector, of which the Sacharomyces cerevesiae gene CDC48 is expressed as a fusion protein with the transcription activation domain, the row C is populated with cells which carry the pGAD424 vector, of which the sliding clamp gene from Ar chaeoglobus fulgidus as Fusion protein is expressed with the transcription activation domain, row D is not populated with cells and row E is populated with cells that carry the pGAD424 vector from which the elongation protein gene from Archaeoglobus fulgidus is expressed as a fusion protein with the transcription activation domain.

Die Spalte 1 ist mit Zellen bestückt, die den leeren pGBT9 Vektor (Clontech, Palo Alto, USA) tragen, sodaß die DNA-Bindedomäne exprimiert wird, die Spalte 2 ist bestückt mit Zellen, die den pGBT9 Vektor tragen, von dem das Saccharomyces cerevisiae Gen UFD3 als Fusionsprotein mit der DNA-Bindedomäne exprimiert wird, die Spalte 3 ist bestückt mit Zel len, die den pGBT9 Vektor tragen, von dem das Gleitklammerprotein aus Archaeoglobus ful gidus als Fusionsprotein mit der DNA-Bindedomäne exprimiert wird, die Spalte 4 ist bestückt mit Zellen, die den pGBT9 Vektor tragen, von dem das Kopplungsprotein aus Archaeoglobus fulgidus als Fusionsprotein mit der DNA-Bindedomäne exprimiert wird und die Spalte 5 ist bestückt mit Zellen, die den pGBT9 Vektor tragen, von dem das Elongationsprotein aus Ar chaeoglobus fulgidus als Fusionsprotein mit der DNA-Bindedomäne exprimiert wird.Column 1 is populated with cells that carry the empty pGBT9 vector (Clontech, Palo Alto, USA) so that the DNA binding domain is expressed, column 2 is populated with cells that carry the pGBT9 vector, of which the Saccharomyces cerevisiae Gen UFD3 is expressed as a fusion protein with the DNA binding domain, column 3 is populated with cells that carry the pGBT9 vector, from which the glide clip protein from Archaeoglobus ful gidus is expressed as a fusion protein with the DNA binding domain, column 4 is populated with cells that carry the pGBT9 vector, from which the coupling protein from Archaeoglobus fulgidus is expressed as a fusion protein with the DNA binding domain and column 5 is populated with cells that carry the pGBT9 vector, from which the elongation protein from Ar chaeoglobus fulgidus as a fusion protein is expressed with the DNA binding domain.

Die in der vorliegenden Beschreibung sowie in den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein. The features of the disclosed in the present description and in the claims Invention can be implemented individually as well as in any combination of the invention in its various embodiments.

SEQUENCE LOG

Claims

1. A method for producing a chimeric protein which comprises a base sequence and a heterologous interaction-dependent sequence and, as a result of the interaction-dependent sequence, forms a bond with an interaction partner or such a bond is strengthened, characterized in that

a) from an interaction system comprising a protein called a donor protein and an acceptor protein, that sequence of the donor protein or acceptor protein is determined which causes the interaction between the two interaction partners; and
b) the interaction-causing sequence in a different from the donor protein and acceptor protein receiving protein, which comprises the base sequence, is introduced.

2. The method according to claim 1, characterized in that the donor protein and the Ak Zeptorprotein form a complex that binds nucleic acid.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the donor protein and the Form acceptor protein a complex that has an activity selected from Group, polymerase activity, DNA binding activity, RNA binding activity, 5'-3'- Has exonuclease activity, 3'-5'-exonuclease activity and ligase activity.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the donor pro tein is selected from the group, the elongation proteins; Glide clip proteins, glide includes stapling proteins and coupling proteins.

5. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the acceptor protein is selected from the group consisting of elongation proteins, glide clip proteins, glide includes stapling proteins and coupling proteins.

6. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the recording protein is selected from the group consisting of elongation proteins, slide clamp proteins, Sliding clip loader proteins and coupling proteins.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that step a) more is repeated several times and from the interaction-determined in this way determined Sequences a consensus sequence is determined that an interaction-dependent Se represents sequence, and in step b) as an interaction-dependent sequence in a Do norprotein and acceptor protein different uptake protein, which is a basic sequence includes, is introduced.

8. Chimeric protein obtainable according to one of claims 1 to 7.

9. Chimeric protein according to claim 8, characterized in that the base sequence is a part is the amino acid sequence of a protein selected from the group called elongati onproteins, glide clip proteins, glide clip loader proteins and coupling proteins sums up.

10. Comprehensive in vitro complex for template-dependent elongation of nucleic acid Slide clip protein and an elongation protein, wherein at least one of the proteins chimeric protein according to any one of the preceding claims.

11. Complex according to claim 10, characterized in that the complex is thermostable.