DE19859059A1

DE19859059A1 - Fermentative Gewinnung von Bdellovibrionen-Suspensionen mit hoher Überlebensrate

Info

Publication number: DE19859059A1
Application number: DE1998159059
Authority: DE
Inventors: Karl-Heinz Kludas; Monika Krueger; Knut Hagenau; Aliye Edao
Original assignee: Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1998-12-22
Publication date: 2000-06-29

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Bdellovibrionen-Suspensionen. Derartige Suspensionen können angewendet werden zur Bekämpfung gramnegativer Bakterien. Der Stamm Bdellovibrio bacteriovorus wird in einer Lösung gramnegativer Bakterien und Spurenelementen fermentativ gezüchtet. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Zysten sind langzeitlagerstabil.

Description

Die Erfindung betrifft die fermentative Gewinnung von Bdellovibrionen-Suspensionen mit hoher Überlebensrate. Suspensionen von Bdellovibrionen dienen in der Abwasserreini gung zum Herabsetzen des Anteils pathogener gramnegativer Bakterien. Sie sind ferner geeignet als Zusatz in der Herstellung von Futtermitteln für Haustiere und landwirtschaft liche Nutztiere. Bedeutung gewinnen Bdellovibrio-Suspensionen als biologische Desinfek tionsmittel in Einrichtungen der Nahrungsmittelherstellung wie Schlachthöfen, Fleische reien, Bäckereien, Fabriken der Fischverarbeitung und dergleichen.

Die Nutzung der Bakterien der Gattung Bdellovibrio zur Reduzierung pathogener gramne gativer Bakterien in unterschiedlichen Bereichen ist seit vielen Jahren bekannt. Es ist auch bekannt, daß durch die Anwesenheit von Bdellovibrionen im Boden oder Gewässern eine Selbstreinigung von gramnegativen Bakterien erfolgt. Zur Bekämpfung gramnegativer Bakterien ist eine Konzentration der Bdellovibrionen von mindestens 10⁴ pfu/g erforder lich. Eine schnelle und wirksame Bekämpfung von pathogenen gramnegativen Bakterien ist daher nur möglich, wenn es gelingt durch Zugabe von hergestellten Bdellovibrionen- Suspensionen eine hohe Konzentration der Bdellovibrionen am Einsatzort zu gewährlei sten. Die zur Gewinnung von Bdellovibrionen verwendeten Nährmedien enthalten neben Ca⁺⁺- und Mg⁺⁺-Ionen noch einige Bestandteile der Komplex-Nährmedien (wie z. B. Pepton, Casaminoacids und Hefeextrakt) in geringer Konzentration. Durch die komplexe Zusammensetzung dieser Nährmedien-Stoffe wird nicht nur die erforderliche Attraktant- Reaktion unterstützt, sondern gleichzeitig die Kontamination mit Fremdbakterien unter großtechnischen Bedingungen gefördert. Diese Kontaminierung mit Fremdbakterien führt zu Störungen in der kontinuierlichen Fermentation von Bdellovibrionen-Suspensionen, welche die Ursache dafür sind, daß es keine Angaben zur großtechnischen Gewinnung von Bdellovibrionen gibt.

Der Einsatz großtechnisch hergestellter Bdellozysten-Suspensionen in den oben vorge schlagenen Bereichen ist aber prinzipiell möglich, weil die Erreger der Gattung Bdellovi brio gegenüber dem Mensch und Tier völlig apathogen sind. Der Einsatz der vegetativen Lebensform der Bdellovibrio-Bakterien ist in vielen Schriften (CN 1125619, CN 1116932, RU 2069642, JP 06237665, US 5171591, SU 1143424 und FR 2302103) beschrieben.

Der dargestellte Einsatz der vegetativen Form der Bdellovibrio-Bakterien ist auf wenige Stunden bis Tage nach der Herstellung der Bakteriensuspensionen beschränkt, da die Konzentration der Bakterien und damit ihre Aktivität in der Kulturlösung sehr schnell ab nimmt. Methoden zur Verlängerung der biologischen Aktivität der Bdellovibrio- Suspensionen (Lyophilisation bzw. Tieftemperaturkühlung bis -80°C) sind kosteninten siv und müssen bis zum Einsatz eingehalten werden. Konkrete Angaben zur Gewinnung der Ruheform (Zysten) von Bdellovibrio sp. Stamm W (BURGER et al., 1968) machten TUDOR und CONTI (1977). Sie erzeugten Bdellozysten unter Zusatz eines Phosphat- Puffers mit einer Überlebensrate von etwa 2 Monaten.

Aus dieser publizierten Erkenntnis ist jedoch bisher keine industrielle Anwendung erwach sen.

Der nachfolgend beschriebenen Erfindung liegt die Hypothese zugrunde, daß eine zeitliche Verlängerung der Einsatzmöglichkeiten von Bdellovibrio-Präparaten in der Herstellung von Bdellozysten(-blasten)-ähnlichen Suspensionen zu finden ist, da die Bdellozysten eine mögliche Überlebensform (kleiner als 1% der gesamten Bdel lovibrionen) dieser Bakteriengattung unter extremen Bedingungen in der Natur darstellen und sich dadurch ihre dekontaminierenden und detoxifizierenden Eigenschaften ge genüber sauerstoffdismutasebildenden gramnegativen Bakterien erhalten.

Aufgabe der Erfindung ist es, die zwei Formen im Lebenszyklus des Bdellovibrio bacterio vorus, und zwar die obligat wirtsabhängige Form (vegetative Bdellovibrionen) und die fakultativ wirtsabhängige zystierte Form, durch Gestaltung des Anzuchtmediums für Wirtszellen in Fermentoren unter technischen Verfahrensbedingungen zu gewinnen.

Dabei sollten die zystierten Bdellovibrionen unter ökonomisch vertretbaren Kultivierungs bedingungen (Nährbodenkosten, Zeit, Ausbeute) fermentiert und kostengünstig für Langzeitzwecke stabilisiert werden.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß wie folgt gelöst.

Zur fermentativen (batch, dis- oder kontinuierlichen) Kultivierung von Bdellovibrio bacteriovorus wird zur Gewinnung der wirtsabhängigen vegetativen und zystierten Form, ein Suspensionsmedium verwendet das als Hauptnährstoffquelle, auf bekannten Nähr medien bis zum Ende der logarithmischen Wachstumsphase kultivierte und durch Zentri fugation gereinigte (Stoffwechselprodukte < 10^-8 M) gramnegative Bakterien (in der Regel apathogene E. coli-Bakterien, aber auch die am Einsatzort vorhandenen autochthonen Bakterien oder die zu lysierenden Bakterien) enthält.

Die zu lysierenden Bakterien (10⁹-10¹⁰ Wirtszellen/ml) werden in dem nachfolgend beschriebenen anorganischen Grundmedium resuspendiert. Die Suspensionsmedien für die Wirtsbakterien haben für die Herstellung von zystierten FD-Formen (Lösung A) und der vegetativen Formen (Lösung B) folgende Zusammensetzung (mM):

Zur Herstellung des Suspensionsmedium wird entmineralisiertes Wasser oder Aqua dest. verwendet. Die Konzentration an NaCl im Suspensionsmedium soll < 5,0 g/l sein.

Die Kultivierung erfolgt in Fermentoren (oder Schüttlern) bei Temperaturen von +5°C bis +30°C unter mikroaerophilen/aeroben Bedingungen unter ständigem Rühren (z. B. 200 U/min) bei gleichzeitiger Belüftung mit Luftsauerstoff (0,1-1,0 l/h/l Arbeits volumen).

Im folgenden werden die speziellen Bedingungen zur Herstellung der drei Lebensformen beschrieben:

1. Wirtsabhängige vegetative Bdellovibrionen (HD-Formen)
Die fermentative Gewinnung der vegetativen Bdellovibrionen erfolgt bei absoluter Dunkelheit über 24 Stunden. Das Suspensionsmedium wird auf einen pH-Wert von 7-8 (pH-Wert-Regulierung bei 7,5) und mit KCl auf eine Leitfähigkeit von 2000 bis 3000 µS/cm eingestellt. Zur Kultivierung wird ein Bdellovibrio/Wirtsbakterien (B/W)- Index von 10^-9 bis 10^-10 eingestellt.
2. Zystierte Bdellovibrionen (FD-Formen)
Die Herstellung der Bdellozysten erfolgt unter Lichteinfall bei pH-Werten zwischen 6,0 und 8,0 (Regulierung bei pH = 7,5), einer Leitfähigkeit des Suspensionsmediums von 2000-3000 µS/cm und einem (B/W)-Index von 10^-7 bis 10^-8 über 24 Stunden im Fermentor.

Zur Stabilisierung der fermentativ gewonnenen Bdellozysten-Suspension für den Langzeiteinsatz werden der gewaschenen oder ungewaschenen Suspension als Ener giequelle gramnegative kryophile Bakterien und/oder Adenosintriphosphat (ATP) in einer Konzentration von 5-20 mg/l zugegeben. Unabhängig von der Ausgangskon zentration der Bdellozysten-Suspension erreicht die Überlebensrate der Bdellozysten nach etwa 15 Tagen einen stabilen Konzentrationsbereich und es konnte eine 1½- jährige Konstanz der Konzentration bei sachgerechter Lagerung (5°C und dunkel) beobachtet werden. Über die Höhe der Überlebensrate nach 15 Tagen entscheiden nach der fermentativen Gewinnung der Bdellozysten die zugesetzten Stabilisierungs faktoren. Es wird eine Zunahme der Überlebensrate in folgender Reihenfolge beob achtet (Lysat gleich Bdellozysten-Suspension):

Lysat (10² pfu/ml) < Lysat + gramnegative Bakterien (10³ pfu/ml) < Lysat + ATP (10⁴ pfu/ml)

Das Produkt der fermentativen Gewinnung ist eine wässrige Suspension von ruhen den Bdellovibrionen in freier Form (Bdellozysten) und einer Lagerfähigkeit von bis zu 2 Jahren bei 4°C. Die Suspension kann zusätzlich mit energiereichen, repellenten Stoffen stabilisiert werden und weist je nach Konzentration eine Eigentrübung auf.

Die Erfindung soll nachstehend an mehreren Beispielen erläutert werden.

Beispiel 1

Fermentative Gewinnung von vegetativen, wirtsabhängigen Bdellovibrionen unter den o. g. Bedingungen mit E.coli N1917

Beispiel 2 Fermentative Gewinnung von Bdellozysten

Die Anzucht der Bdellozysten erfolgte durch Zusatz des apathoge nen E. coli-Stammes K12 zur oben beschriebenen Lösung mit definierter Ionenkonzentration:

Beispiel 3

Fermentative Gewinnung von vegetativen, fakultativ abhängigen (FD) Bdellovibrionen mit E. coli K12 mit den Bedingungen von Beispiel 1 unter Zusatz von weiteren Ionen (Mg⁺⁺: 0,1 mM; Zn⁺⁺: 2 × 10^-3 mM; K⁺: 4,85 mM)

Beispiel 4

Langzeitlagerung von Bdellozysten in Anwesenheit kryophiler gramnega tiver Bakterien bei 4°C

Beispiel 5

Langzeitlagerung von Bdellozysten in Anwesenheit gramnegativer Bakterien bei 4°C

Beispiel 6

Langzeitlagerung von Bdellozysten nach Zusatz von ATP bei 4°C

Literaturhinweise

BURGER, A., DREWS, G., LADWIG, R. (1968): Wirtskreis und Infektionszyklus ei nes neu isolierten Bdellovibrio bacteriovorus-Stammes Arch. Mikrobiol. 61, 261-279
TUDOR, J. J., CONTI, S. F. (1977): Characterization of bdellocysts of Bdellovi brio sp. J. Bacteriol 131, 314-322
Nomenklatur:
pfu plaque forming unit
cfu colony forming unit

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Bdellovibrionen-Suspensionen durch fermentative Kultivierung von Bdellovibrio bacteriovorus, dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige Lösung als einzige Nährstoffquelle
auf an sich bekannten Komplexmedien mit 5 mS bis zum Ende der logarithmi schen Wachstumsphase kultivierte und durch Zentrifugation gereinigte gramnega tive Bakterien mit vom Komplexmedium abhängiger Konzentration an Zn⁺⁺-, Mn⁺⁺- und P^3--Ionen enthält,
diese Suspensionslösungen enthalten für die Herstellung von zystierten Bdellovibrionen (Lösung A) und für vegetative Bdellovibrionen (Lösung B) die folgenden Ionen [in mM]:
weitestgehend bei Vermeidung von Na⁺-Ionen in dieser Lösung Bdellovibrio bacteriovorus kultiviert wird,
wobei die Kultivierung in Fermentatoren oder Schüttlern erfolgt
bei Temperaturen von +5 bis +30 Grad C
unter mikroaerophilen/aeroben Bedingungen
unter ständigem Rühren bei vorzugsweise 200 U/min
und Belüften mit Luftsauerstoff im Umfang von 0,1 bis 1,0 l/h/l Arbeitsvolumen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als gramnegative Bakterien Escherichia coli eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als gramnegative Bakterien autochtone Bakterien eingesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß
Bdellovibrio bacteriovorus in absoluter Dunkelheit mit Zn- und Mn-haltigen Wirtsbak terien über 24 h kultiviert wird
bei einem pH der Lösung von 7 bis 8
und einer mit KCl auf ca. 2700 µS/cm eingestellten Leitfähigkeit
bei einem Bdellovibrio/Wirtsbakterien-Index von 10^-9 bis 10^-10 und vegetative Bdellovibrionen erhalten werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß
Bdellovibrio bacteriovorus
unter Lichteinfall
bei einem pH-Wert der Lösung von 6,0 bis 7,5 und einer Leitfähigkeit von 2700 µS/cm mit Bakterien mit geringem Gehalt an Zn-, Mn- und PO₄ ^3--Ionen bei einem B/W-Index von 10^-8 bis 10^-9
über 48 Stunden im Fermentor kultiviert werden,
der entstehenden Suspension gramnegative Bakterien und/oder Adenosintriphosphat in einer Konzentration von 5 bis 20 mg/l zugegeben werden
und die Suspension der Bdellozysten, Bdelloplasten und der vegetativen Bdellovibrio nen bei 5 Grad C im Dunkeln aufbewahrt wird.

6. Suspension von ruhenden Bdellovibrionen in freier Form (Bdellozysten), enthaltend 2 × 10⁵ [pfu/ml] Bdellozysten.

7. Suspension nach Anspruch 6, neben den Bdellozysten gramnegative Bakterien und/oder ATP enthaltend.

8. Suspension nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß
die Suspension 2 × 10⁵ [pfu/ml] Bdellozysten, 5 × 10³ (cfu/ml) gramnegative Bakterien und 2 × 10⁵ [pfu/ml] ATP enthält.