DE19856052A1

DE19856052A1 - Conjugate for enrichment in neuronal cells

Info

Publication number: DE19856052A1
Application number: DE19856052A
Authority: DE
Inventors: Achim Loehr; Manfred Schwab
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1998-12-04
Filing date: 1998-12-04
Publication date: 2000-06-08
Also published as: WO2000033880A2; WO2000033880A3

Abstract

The invention relates to a conjugate for introducing active substances into neuronal cells, whereby the conjugate comprises the heavy chain of a toxin of the genus Clostridium and has at least one active substance, whereby the light chain of the toxin is absent. The invention also relates to a method for producing a conjugate of this type, to a kit and to the use of said conjugate.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Konjugat zur Anreicherung in neuronalen Zellen, ein Verfahren zur Herstellung des Konjugats, einen Kit sowie die Verwen dung dieser Gegenstände.The present invention relates to a conjugate for enrichment in neuronal Cells, a process for producing the conjugate, a kit and the use of these items.

Es gibt verschiedenste Krankheiten, die Zellen des zentralen und/oder peripheren Nervensystems betreffen. Beispielsweise seien Morbus Parkinson, Alzheimer Krankheit, Schlaganfall, Hirntumore (z. B. Gliome, Medulloblastome, Astrozyto me) oder Neuroblastome, genannt. Das Neuroblastom macht etwa 8-10% aller Krebserkrankungen bei Kindern aus und stellt den häufigsten extrakraniellen soliden Tumor bei Kindern dar. Das Neuroblastom entsteht aus neuroektoderma len Zellen der Neuralleiste. Diese Zellen wandern während der Embryonalent wicklung aus der Neuralleiste aus und bilden das sympathische Nervensystem und das Nebennierenmark. Gesichert gilt inzwischen, daß es bei etwa 30% der höher-malignen Neuroblastomen zu einer Amplifikation von MYC N kommt, wobei die Menge der Amplifikation von MYC N mit der Agressivität des Tumor wachstums korreliert ist. Insgesamt ist für alle Neuroblastome festzustellen, daß diese durch ein komplexes Krankheitsbild und einen heterogenen Krankheits verlauf charakterisiert sind. Während es bei einigen Patienten zur spontanen Regression des Tumors kommt, schreitet die Krankheit bei ungefähr der Hälfte der Patienten trotz intensiver Therapie fort. Auch bei Hirntumoren ist die Thera pie schwierig. Dies liegt insbesondere daran, daß die meisten Medikamente be stimmte Zellschranken, wie die Blut-Hirn-Schranke, nicht passieren können und überhaupt nicht an den gewünschten Wirkort kommen. Auch radiologische Behandlungen sind lange nicht so erfolgreich wie wünschenswert. Hier wäre eine medikamentöse Vorbehandlung der Tumoren zur Photosensibilisierung sicher dem Erfolg der nachträglichen Strahlenbehandlung zuträglich (photody namische Therapie). Aber auch diese scheitert daran, daß keine Wege bereit stehen, wie die Mittel in die erkrankten Zellen gelangen. Die vorstehend aufge zeigte Problematik bei Neuroblastomen und Hirntumoren besteht generell für alle Erkrankungen des Nervensystems, da auch bei anderen Erkrankungen als Krebs erkrankungen die therapeutischen und diagnostischen Wirkstoffe nicht effizient in Nervenzellen gelangen.There are various diseases, the cells of the central and / or peripheral Affect the nervous system. For example, Parkinson's disease, Alzheimer's Disease, stroke, brain tumors (e.g. gliomas, medulloblastomas, astrocyto me) or neuroblastoma. Neuroblastoma makes up about 8-10% of all Cancer in children and represents the most common extracranial solid tumor in children. The neuroblastoma arises from neuroectoderma len cells of the neural crest. These cells migrate during the embryonic development from the neural crest and form the sympathetic nervous system and the adrenal medulla. It is now certain that around 30% of the higher malignant neuroblastomas there is an amplification of MYC N, the amount of amplification of MYC N with the aggressiveness of the tumor growth is correlated. Overall, it can be stated for all neuroblastomas that this due to a complex clinical picture and a heterogeneous disease are characterized. While it is spontaneous in some patients When the tumor regresses, the disease progresses in about half of patients continued despite intensive therapy. Thera is also used for brain tumors pie difficult. This is particularly because most medications are agreed cell barriers, like the blood-brain barrier, cannot pass and do not come to the desired site of action at all. Also radiological Treatments are far from being as successful as desirable. Here would be drug pretreatment of the tumors for photosensitization certainly beneficial to the success of subsequent radiation treatment (photody Named Therapy). But this also fails because there are no paths ready how the agents get into the diseased cells. The above showed problems with neuroblastomas and brain tumors generally exists for everyone Diseases of the nervous system, as with diseases other than cancer diseases the therapeutic and diagnostic agents are not efficient get into nerve cells.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, ein Mittel bereitzu stellen, mit dem unterschiedlichste Substanzen bzw. Wirkstoffe in neuronale Zellen eingeführt werden können.The object of the present invention is now to provide a means with the most diverse substances or active ingredients in neuronal Cells can be introduced.

Diese Aufgabe wird durch die Gegenstände der Patentansprüche gelöst.This object is solved by the subject matter of the claims.

Von den Erfindern wurde herausgefunden, daß mit einem Konjugat, das die schwere Kette eines Toxins der Gattung Clostridium unterschiedlichste Sub stanzen bzw. Wirkstoffe mit therapeutischer oder diagnostischer Wirkung in neuronale Zellen transportiert werden können. Die schwere Kette eines Toxins der Gattung Clostridium vermittelt den Wirkstoffen die gewünschte Zellpermea bilität für neuronale Zellen. Erfindungsgemäß sollen unter der "schweren Kette eines Toxins der Gattung Clostridium" auch Fragmente oder Modifikationen (z. B. Austausche, Inversionen, Deletionen oder Insertionen) zu verstehen sein, die aber weiterhin Transporteigenschaften in neuronale Zellen aufweisen. Unter einem "Toxin der Gattung Clostridum" sind beispielsweise das Tetanus-Toxin, Botulinus-Toxin sowie seine Serotypen (A-G) dieser zu verstehen. Dabei ist der primäre Wirkort von Tetanus-Toxin das zentrale Nervensystem und von Botuli nus-Toxin das periphere Nervensystem.It has been found by the inventors that with a conjugate which the heavy chain of a toxin of the genus Clostridium different sub punch or active substances with therapeutic or diagnostic effects in neuronal cells can be transported. The heavy chain of a toxin of the genus Clostridium gives the active substances the desired cell permea bilinity for neuronal cells. According to the invention under the "heavy chain a toxin of the genus Clostridium "also fragments or modifications (e.g. Exchanges, inversions, deletions or insertions) must be understood to be the but still have transport properties in neuronal cells. Under a "toxin of the genus Clostridum" are, for example, the tetanus toxin, Botulinum toxin as well as its serotypes (A-G) to understand this. Here is the primary site of action of tetanus toxin the central nervous system and of botuli nus toxin the peripheral nervous system.

Mit Zellpermeabilität wird hier die Eigenschaft von Substanzen bzw. Wirkstoffen bezeichnet, in neuronale Zellen einzudringen. Diese Eigenschaft findet sich natur gegeben allerdings wie bereits oben ausgeführt nur bei wenigen Substanzen. Die meisten Substanzen benötigen Hilfsmittel bzw. Verfahren, um in Zellen ein zudringen. Beispiele hierfür sind Mikroinjektion, Elektroporation, Assoziation mit kationischen Lipiden, Liposomenbildung, Rezeptor-vermittelte Endocytose und Virusinfektion. Diese Hilfsmittel bzw. Verfahren weisen jedoch große Nachteile auf. Insbesondere sind sie teuer, erfordern komplexe Versuchsanordnungen und sind nur begrenzt einsetzbar. Ferner ist ihre Effizienz gering und sie erweisen sich oft als toxisch. Diese Probleme können mit den erfindungsgemäßen Kon jugaten umgangen werden. Dies gilt insbesondere deshalb, da nur die nicht toxische schwere Kette des Toxins verwendet wird und nicht das gesamte Toxin, wie in WO 95/32738, das aus zwei Polypeptidketten (leichte Kette und schwere Kette) aufgebaut ist. Das Toxin der Gattung Clostridium wurde erfin dungsgemäß so modifiert, daß die toxische leichte Kette des Moleküls eliminiert wurde bzw. durch eine Domäne ersetzt wurde, die eine Affinität für die in neuronale Zellen einzubringenden Substanzen verleiht. Von den Erfindern wurde herausgefunden, daß Konjugate, die nur die schwere Kette eines Clostridium- Toxins enthalten, die oben genannte Aufgabe lösen, da die Funktionen der neurospezifischen Bindung und Aufnahme, sowie des Transports und der Frei setzung in das Zytoplasma alle in der Sequenz der schweren Kette kodiert sind. Letzteres ist ein wichtiger Vorteil der schweren Kette gegenüber dem C-Frag ment.With cell permeability, the property of substances or active substances becomes referred to penetrate into neuronal cells. This property is natural however, as already stated above, only for a few substances. The Most substances require tools or procedures to enter cells penetrate. Examples of this are microinjection, electroporation, association with cationic lipids, liposome formation, receptor-mediated endocytosis and Viral infection. However, these tools and methods have major disadvantages on. In particular, they are expensive, require complex experimental setups and can only be used to a limited extent. Furthermore, their efficiency is low and they prove often turns out to be toxic. These problems can be solved with the con jugates are bypassed. This is especially true because only that not toxic heavy chain of the toxin is used and not the whole Toxin, as in WO 95/32738, which consists of two polypeptide chains (light chain and heavy chain) is built. The toxin of the genus Clostridium was invented modified according to the invention so that the toxic light chain of the molecule is eliminated was or was replaced by a domain that has an affinity for the in gives neuronal cells to be introduced substances. From the inventors found that conjugates containing only the heavy chain of a Clostridium Contain toxins that solve the above task because of the functions of neurospecific binding and reception, as well as transport and freedom Placement in the cytoplasm are all encoded in the heavy chain sequence. The latter is an important advantage of the heavy chain over the C-Frag ment.

Der Ausdruck "Vermittlung von Zellpermeabilität an Substanzen" weist darauf hin, daß die schwere Kette eines Toxins der Gattung Clostridium Zellpermeabili tät an Wirkstoffe jeglicher Art und Abstammung vermitteln kann. Die Wirkstoffe können z. B. (Poly)peptide, Proteine, Nukleinsäuren oder chemische Verbindun gen sein. Beispiele von Polypeptiden sind Struktur-Polypeptide, Tumornekrose faktor, Interferone, Interleukine, Lymphokine, Wachstumsfaktoren, Plasma proteine, z. B. Gerinnungsfaktoren und Stoffwechselenzyme, und Rezeptoren. Insbesondere können die Polypeptide solche sein, welche die Immunogenität von Zellen steigern können. Dies können Polypeptide sein, die Tumorzellen fehlen, z. B. Zytokine, wie IL-2, und GM-CSF, und kostimulatorische Moleküle, wie B7-1, tumorassoziierte Antigene, z. B. MAGE1, Tyrosinasen und virale Polypeptide, z. B. E7 von humanem Papillomvirus und EBNA-3-Polypeptid von Epstein-Barr-Virus. Ferner können die Polypeptide Adapter-Polypeptide, Oligomerisierungsmotive eines Polypeptids, Polypeptidfragmente von Virus-Hüllpolypeptiden, Hormone und Ribozyme sein. Beispiele von Nukleinsäuren sind solche, die für vorstehende Polypeptide kodieren. Ferner können es Antisense-Oligonukleotide (insbesondere zur Inhibierung von MYC N bei der Behandlung von Neuroblastoma-Tumoren), Peptid-Nukleinsäuren und Consenus-Sequenzen für Transkriptionsfaktoren sein. Beispiele von chemischen Verbindungen sind Arzneimittel, die keine Polypeptid- Struktur aufweisen. Solche können Cytostatika, Anästhetika, Antihistaminika, Antibiotika, photoaktive Substanzen, radioaktive Substanzen, zur Fluoreszenz fähige Substanzen oder Substanzen für die Fluor-Kernspinspektroskopie. Bei spiele der Chemotherapeutika sind Virustatika, Antiprotozoenmittel, Zytostatika und Antibiotika. Vertreter dieser sind z. B. Doxorubicin, Daunorubicin, Tetracycli ne, Antimetaboliten, wie Methotrexat, und Derivate davon. Beispiele der photo aktiven Substanzen sind Porphyrine, wie o-, m- und/oder p-Tetracarboxyphenyl porphyrin (TCPP), Chlorine und Bakteriochlorine. Ein Beispiel der radioaktiven Substanz ist ein mit radioaktivem Jod markiertes Tyrosin. Beispiele der zur Fluoreszenz-fähigen Substanzen sind Fluoreszenzfarbstoffe, wie Fluorescein, Aminofluorescein (AFI), sowie Derivate und Analoga davon. Beispiele der Sub stanzen für die Fluor-Kernspinspektroskopie sind Polyfluorcarbonsäuren, wie Trifluoressigsäure.The expression "imparting cell permeability to substances" indicates this indicates that the heavy chain of a toxin of the genus Clostridium cell permeabili act to impart active ingredients of any kind and descent. The active ingredients can e.g. B. (poly) peptides, proteins, nucleic acids or chemical compounds be. Examples of polypeptides are structural polypeptides, tumor necrosis factor, interferons, interleukins, lymphokines, growth factors, plasma proteins, e.g. B. coagulation factors and metabolic enzymes, and receptors. In particular, the polypeptides can be those which demonstrate the immunogenicity of Cells can increase. These can be polypeptides that tumor cells lack, e.g. B. cytokines, such as IL-2, and GM-CSF, and costimulatory molecules, such as B7-1, tumor-associated antigens, e.g. B. MAGE1, tyrosinases and viral polypeptides, e.g. B. E7 from human papilloma virus and EBNA-3 polypeptide from Epstein-Barr virus. Furthermore, the polypeptides can be adapter polypeptides, oligomerization motifs of a polypeptide, polypeptide fragments of virus envelope polypeptides, hormones and be ribozymes. Examples of nucleic acids are those for the above Encode polypeptides. Antisense oligonucleotides (in particular to inhibit MYC N in the treatment of neuroblastoma tumors), Peptide nucleic acids and Consenus sequences for transcription factors. Examples of chemical compounds are drugs that do not contain polypeptides. Have structure. These can include cytostatics, anesthetics, antihistamines, Antibiotics, photoactive substances, radioactive substances, for fluorescence capable substances or substances for fluorine nuclear magnetic resonance spectroscopy. At Games of chemotherapy drugs are antivirals, antiprotozoal drugs, cytostatics and antibiotics. Representatives of these are e.g. B. doxorubicin, daunorubicin, tetracycli ne, antimetabolites such as methotrexate, and derivatives thereof. Examples of photo active substances are porphyrins, such as o-, m- and / or p-tetracarboxyphenyl porphyrin (TCPP), chlorine and bacteriochlorine. An example of radioactive Substance is a tyrosine labeled with radioactive iodine. Examples of the Fluorescence-capable substances are fluorescent dyes, such as fluorescein, Aminofluorescein (AFI), and derivatives and analogues thereof. Examples of sub Punch for fluorine nuclear magnetic resonance spectroscopy are polyfluorocarboxylic acids, such as Trifluoroacetic acid.

Von vorstehenden Wirkstoffen können einer oder mehrere im erfindungsgemä ßen Konjugat vorliegen. Bei mehreren können diese gleich oder verschieden voneinander sein.One or more of the above active ingredients can be used in the invention conjugate are present. If there are several, they can be the same or different be from each other.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die schwere Ketten eines Toxins der Gattung Clostridium über einen Linker mit dem Wirkstoff verbunden. Die Kon jugation mit der schweren Kette kann dabei prinzipiell auf zwei Wegen erreicht werden:
In a preferred embodiment, the heavy chains of a toxin of the genus Clostridium are linked to the active ingredient via a linker. The conjugation with the heavy chain can in principle be achieved in two ways:

a) The active ingredient to be coupled with an amino-reactive, bispecific Crosslinker modified and activated. This then reacts in a modified manner molecule via an activated disulfide bridge, which originates from the linker, with the free SH group of the heavy chain and forms a covalent disulfide bridge. Suitable crosslinkers are SPDP, LC-SPDP or Sulfo-LC-SPDP; SMPT or sulfo-LC-SMPT; SMCC or sulfo-SMCC; MBS or Sulfo-MBS, SIAB or Sulfo-SIAB, SMPB or sulfo-SMPB; GMBS or Sulfo-GMBS, SIAX or SI AXX; SIAC or SIACC, NPIA (all Pierce, Rockford, USA)
b) The heavy chain is activated by a crosslinker, which is then a Binding to an active ingredient guaranteed. For example, the heavy one Chain with NHS-SS-biotin, then binding via biotin to avidin or streptavidin. Other suitable linkers are D-biotin or biocytin; NHS-biotin or sulfo-NHS-biotin, NHS-LC-biotin or sulfo-NHS-LC-biotin; NHS iminobiotin; Sulfo-NHS-SS biotin; Biotin BMCC; Biotin-HPDP; Iodoacetyl LC biotin; Biotin hydrazide or Biotin LC hydrazide, Biocytin hydrazide, 5- (Biotina mido) pentylamine (all from Pierce, Rockford, USA). More to the specialist known linkers can also be used. The linker can Terminus, at the C-terminus, on primary amino groups or SH groups lie, with amino acids in the middle of the molecule also being modified can be. With the adjustment of the pH value during the reaction, the Reaction can be controlled so that modification is preferred at the N-terminus. Lysine residues are also reactive, especially at high pH values. Especially in If the desired binding of a protein, peptide or ribozyme as an active ingredient it has proven to be useful to link the heavy chain of the clostridium To carry out toxins using a chemical crosslinker. The procedure is for example as follows. From a toxin, preferably tetanus toxin (Clo stridium tetani), is the heavy chain by means of isoelectric focusing from the light chain (Weiler et al., Eur. J. Biochem. 182, pp. 649-656 (1989)), and in a solution containing urea (e.g. 2 M urea, 50 mM DTT) is present. To get back to the natural conformation, dialyzed this solution against a physiological buffer. It happens spontaneously to native disulfide bridging in the C-terminal part, and the Cy stone group, which normally forms the link to the light chain exposed at the N-terminus of the heavy chain. To get the one you want To achieve disulfide binding, a bispecific crosslinker such as sulfo-LC SPDP (from Pierce, USA) can be used. In principle, the reaction is such that first the substance to be coupled via a primary amino group with the NHS group of the linker reacts and creates a stable amide bond. in the second step is the resulting construct with the heavy chain of the Toxins implemented. A disulfide exchange takes place between the linker and the SH group of the toxin heavy chain. This creates a stable Disulfide bridge that connects the substance to be coupled with the heavy chain of the Toxins connects.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform liegt die schwere Kette eines Toxins der Gattung Clostridium in Form eines Fusionspolypeptids vor. Der Aus druck "schwere Kette eines Toxins der Gattung Clostridium" umfaßt daher auch ein Fusionspolypeptid bzw. -protein, in dem die schwere Kette des Toxins als durchgängiges Polypeptid oder Protein mit einem anderen Polypeptid oder Protein rekombinant hergestellt worden ist. Dieses andere Peptid oder Protein soll der schweren Kette des Toxins bindende Eigenschaften für obige Substan zen verleihen, wobei die Bindung (z. B. im Falle von Nukleinsäuren) über ionische Wechselwirkungen stattfindet. Diese Peptide oder Proteine, die dem Toxin bindende Eigenschaften verleihen, sind insbesondere basische Proteine, wie z. B. das HMG (High Mobility Group)-1 Protein, Histon-Proteine, Protamin, Spermidin oder Polypeptide mit speziellen DNA-Bindemotive, wie z. B. Helix-turn-Helix, Zink- Finger oder Leucin-Zipper.In another preferred embodiment, the heavy chain is one Toxins of the genus Clostridium in the form of a fusion polypeptide. The end "Heavy chain of a toxin of the genus Clostridium" therefore also includes a fusion polypeptide or protein in which the heavy chain of the toxin as continuous polypeptide or protein with another polypeptide or Protein has been produced recombinantly. This other peptide or protein The heavy chain of the toxin is said to have binding properties for the above substance confer zen, the binding (eg in the case of nucleic acids) via ionic Interactions taking place. These peptides or proteins that make up the toxin confer binding properties, in particular basic proteins, such as. B. the HMG (High Mobility Group) -1 protein, histone proteins, protamine, spermidine or polypeptides with special DNA binding motifs, such as. B. Helix-turn helix, zinc Fingers or leucine zipper.

Eine weitere Möglichkeit, insbesondere zur Anknüpfung von Nukleinsäuren an die schwere Kette, ist die Kopplung eines Oligonukloetids (z. B. über Crosslinker), wobei dieses Oligonukleotid in der Lage ist, mit speziellen Nukleinsäure-Sequen zen, z. B. auf einem Plasmid, eine sog. Triplehelix zu bilden. Damit werden die Nukleinsäuren über Wasserstoffbrücken mit dem Oligonukleotid an die schwere Kette gebunden. Der Vorteil ist, daß diese Bindung unter physiologischen Bedin gungen stabiler ist als ionische Wechselwirkungen.Another possibility, in particular for attaching nucleic acids the heavy chain, is the coupling of an oligonucleotide (e.g. via crosslinker), this oligonucleotide is able to use special nucleic acid sequences zen, z. B. on a plasmid to form a so-called Triplehelix. With that, the Nucleic acids via hydrogen bonds with the oligonucleotide to the heavy one Chain tied. The advantage is that this binding under physiological conditions is more stable than ionic interactions.

Die Vermittlung von Zellpermeabilität an Wirkstoffe kann durch übliche Ver fahren nachgewiesen werden. Günstig ist es, Zellen mit den Toxin-verbundenen Substanzen zu inkubieren und das Eindringen bzw. Vorliegen der schweren Kette eines Clostridium-Toxins und/oder den Substanzen in den Zellen nachzuweisen. Dies kann z. B. durch spezifische Antikörper (z. B. im Rahmen der Immunfluo reszenz-Methode) oder Reagentien erfolgen, die direkt oder indirekt mit der schweren Kette eines Clostridum-Toxins bzw. den Substanzen reagieren.The mediation of cell permeability to active substances can be done by conventional Ver driving can be demonstrated. It is beneficial to have cells associated with the toxin Incubate substances and penetration or presence of the heavy chain of a Clostridium toxin and / or the substances in the cells. This can e.g. B. by specific antibodies (z. B. in the context of Immunfluo resence method) or reagents that are directly or indirectly with the heavy chain of a Clostridum toxin or the substances react.

Die schwere Kette des Clostridium-Toxins muß vor ihrer Konjugation an die therapeutischen oder diagnostischen Wirkstoffe von der leichten Kette abge trennt werden. Die Herstellung der schweren Kette erfolgt bevorzugt rekom binant, kann aber auch auf anderen dem Fachmann bekannten Wegen erfolgen.The heavy chain of the Clostridium toxin must be attached to the therapeutic or diagnostic agents from the light chain be separated. The heavy chain is preferably produced recom binant, but can also be done in other ways known to those skilled in the art.

Ein Weg, den die Verwendung der schweren Kette bietet, ist die native Kom position des Toxins möglichst identisch nachzuahmen, um ein Konstrukt herzu stellen, das alle Funktionen des Toxin-Proteins mit Ausnahme der toxischen Eigenschaften besitzt. Dazu wird die leichte Kette des Toxins bevorzugt durch andere Proteine oder Substanzen ersetzt, die wie im nativen Toxin über eine Disulfidbrücke an die schwere Kette gebunden werden.One way that heavy chain use is native com Imitating the position of the toxin as identically as possible to create a construct make all the functions of the toxin protein except the toxic Possesses properties. The light chain of the toxin is preferred by other proteins or substances replaced, as in the native toxin via a Disulfide bridge to be bound to the heavy chain.

Nukleinsäuren, wie anti-sense Oligonkleotide, werden bevorzugt an ein Fusions protein der schweren Kette eines Clostridium-Toxins gekoppelt. Dies ist ausführ lich einem der nachfolgenden Beispiele beschrieben. Solche Konstrukte eignen sich bestens für gentherapeutische Zwecke, z. B. zur Behandlung von Neurobla stoma-Tumoren, wenn das anti-sense Oligonukleotid z. B. die Expression von MYC N hemmt.Nucleic acids such as anti-sense oligonucleotides are preferred on a fusion protein of the heavy chain of a Clostridium toxin coupled. This is detailed Lich described in one of the examples below. Such constructs are suitable ideal for gene therapy purposes, e.g. B. for the treatment of Neurobla stoma tumors when the anti-sense oligonucleotide e.g. B. the expression of MYC N inhibits.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit. Ein solcher umfaßt eine oder mehrere der folgenden Komponenten:
Another object of the present invention is a kit. Such comprises one or more of the following components:

a) the heavy chain of a toxin of the genus Clostridium
b) usual auxiliaries, such as carriers, buffers, solvents, controls, etc.

Von den einzelnen Komponenten können jeweils ein oder mehrere Vertreter vor liegen. Hinsichtlich der einzelnen Ausdrücke wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen. One or more representatives of the individual components can be present lie. With regard to the individual terms, reference is made to the above explanations referred.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es Zellpermeabilität für neuronale Zellen an Substanzen jeglicher Art und Abstammung zu vermitteln. Auch können die Zellen ex vivo bzw. in vivo vorliegen. Desweiteren löst die Zellpermeabilität keine toxischen Effekte aus.The present invention enables cell permeability to neuronal cells To convey substances of all kinds and origins. They can also Cells exist ex vivo or in vivo. Furthermore, cell permeability solves no toxic effects.

Die vorliegende Erfindung eignet sich somit bestens für Diagnose und Therapie. Letzteres umfaßt das Eingreifen in die Expression von Genen und in Stoffwech selprozesse. Besonders eignet sich die vorliegende Erfindung für die Diagnose und Therapie schwerster Erkrankungen, z. B. von Tumoren. Ganz besonders zeichnet sich die vorliegende Erfindung dadurch aus, daß sie sowohl für kon servative als auch gentherapeutische Behandlungsmaßnahmen eingesetzt wer den kann.The present invention is therefore ideal for diagnosis and therapy. The latter includes intervening in the expression of genes and in metabolism sel processes. The present invention is particularly suitable for diagnosis and therapy of severe diseases, e.g. B. of tumors. Most notably The present invention is characterized in that it is suitable both for con servative as well as gene therapy treatment measures are used that can.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Figuren beschrieben.The invention is described below with reference to the figures.

Fig. 1 Aufnahme von Konjugaten in Neuroblastom-Zellen
A1 Dapi-Zellkernfärbung der HDN-16 Zellen von Bild A2
A2 Avidin-Signale von HDN-16 Zellen, die mit einem Kon jugat aus der schweren Kette des Tetanus-Toxin und Avidin inkubiert wurden. Der Avidin-Nachweis erfolgte durch einen FITC-markierten Sekundärantikörper, der einen spezifischen Avidin-Antikörper erkennt.
B1 Propidiumjodid-Zellkernfärbung der Kelly-Zellen von Bild B2.
B2 FITC-Signal von Oligonukleotiden, die mit einem Kon jugat aus der schweren Kette des Tetanus-Toxin, Avidin und biotinylierten Oligonukleotiden (FITC-mar kiert) inkubiert wurden. Fig. 1 Recording of conjugates in neuroblastoma cells
A1 Dapi nuclear staining of the HDN-16 cells from image A2
A2 Avidin signals from HDN-16 cells which were incubated with a conjugate from the heavy chain of the tetanus toxin and avidin. Avidin was detected using a FITC-labeled secondary antibody that recognizes a specific avidin antibody.
B1 Propidium iodide nuclear staining of the Kelly cells from image B2.
B2 FITC signal from oligonucleotides that were incubated with a conjugate from the heavy chain of tetanus toxin, avidin and biotinylated oligonucleotides (FITC-labeled).

Fig. 2 Nachweis der Aufnahme des full length-Fusionsproteins aus dem verkürzten HMG-1-Protein und der schweren Kette des Tetanus-Toxin in die Neuroblastom-Zellinie IMR-32
A Dapi-Zellkernfärbung der Zellen von Bild B
B Nachweis des Fusionsproteins über einen polyklonalen AK gegen das C-Fragment der schweren Kette des Tetanus-Toxin und einen CY-2 markierten Sekundä rantikörper Fig. 2 Evidence of the uptake of the full-length fusion protein from the truncated HMG-1 protein and the heavy chain of the tetanus toxin in the neuroblastoma cell line IMR-32
A Dapi nuclear staining of the cells of image B
B Detection of the fusion protein via a polyclonal AK against the C fragment of the heavy chain of tetanus toxin and a CY-2 labeled secondary antibody

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Beispiele beschrieben. Die Arbeits methoden basieren auf Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Habor, und Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1994-1998.The invention is described below using the examples. The working methods are based on Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Habor, and Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1994-1998.

example Isolation and cloning of the tetanus heavy chain gene Clostridium tetani toxins

Als Ausgangsmaterial wurde ein lyophilisiertes Bakteriensediment von Clostridi um tetani (Massachusetts-Stamm), das von ATCC unter der Nummer ATCC 10709 bezogen wurde, verwendet. Nach der DNA-Extraktion war es das Ziel, mittels der Pfu-Polymerase und nachfolgenden Primern, welche die Restrik tionsstellen für die Klonierung einführten, das etwa 2,5 kb große Gen der schw eren Kette ohne Mutationen zu amplifizieren. Dazu wurden folgende Parameter gewählt: große Menge von Ausgangs-DNA (0,5 µg), große Menge Polymerase (10 U), lange Extensionszeiten für die "proof- reading" Funktion der Polymerase (7 min für das 2,5 kb-Gen), geringe Anzahl von Zyklen (5 Zyklen bei 54°C, da in den ersten Zyklen die Restriktionsstellen nicht komplementär sind, dann 15 Zyklen bei 60°C):
PCR-Ansatz: 0,5 pg DNA
25 µmol Klonierungsprimer 1
25 µmol Klonierungsprimer 2
5 µl 10 × Pfu-Puffer (200 mM Tris-HCl, pH 8,8
20 mM MgSO₄
100 mM KCl
100 mM (NH₄)₂SO₄
1% Triton
1 mg/ml BSA)
10 µl dNTP-Mix
10 U Pfu-Polymerase
ad 50 µl H₂OA lyophilized bacterial sediment from Clostridi um tetani (Massachusetts strain), which was obtained from ATCC under the number ATCC 10709, was used as starting material. After DNA extraction, the aim was to amplify the approximately 2.5 kb gene of the heavy chain without mutations using the Pfu polymerase and subsequent primers, which introduced the restriction sites for the cloning. The following parameters were selected: large amount of starting DNA (0.5 µg), large amount of polymerase (10 U), long extension times for the "proof-reading" function of the polymerase (7 min for the 2.5 kb gene ), small number of cycles (5 cycles at 54 ° C, since the restriction sites are not complementary in the first cycles, then 15 cycles at 60 ° C):
PCR approach: 0.5 pg DNA
25 µmol cloning primer 1
25 µmol cloning primer 2
5 ul 10 × Pfu buffer (200 mM Tris-HCl, pH 8.8
20 mM MgSO ₄
100 mM KCl
100 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄
1% triton
1 mg / ml BSA)
10 µl dNTP mix
10 U Pfu polymerase
ad 50 µl H ₂ O

Klonierungsprimer 1: HCH. FOR Cloning Primer 1: HCH. FOR

Klonierungsprimer 2: HCH. REV Cloning primer 2: HCH. REV

Unter den oben genannten PCR-Bedingungen war es möglich, das erwartete 2,5- kb-Fragment ohne Nebenprodukte zu bilden. Nach einer präparativen Agarosegel elektrophorese mit nachfolgender Gelextraktion wurde das DNA-Fragment mit Ncol und Smal geschnitten und in den gemäß Herstellerangaben vorbereiteten Expressionsvektor pCYB4 (IMPACT-System, New England Biolabs, Beverly, USA) kloniert. Der erhaltene Vektor wurde pCYB4-HCH genannt. Die Klonierung wurde durch Sequenzierung verifiziert.Under the above PCR conditions, it was possible to achieve the expected 2.5- kb fragment to form without by-products. After a preparative agarose gel The DNA fragment was electrophoresed with subsequent gel extraction Cut Ncol and Smal and prepare them according to the manufacturer's instructions Expression vector pCYB4 (IMPACT system, New England Biolabs, Beverly, USA) cloned. The vector obtained was named pCYB4-HCH. The cloning was verified by sequencing.

Klonierungstechnisch bedingt hatte das rekombinante Protein am C-Terminus zusätzlich die Aminosäuren Glycin und Prolin vor der Intein-Spaltstelle. Am Amino-Terminus war es um drei Aminosäuren im Vergleich zum Wildtyp-Protein verkürzt. Somit war die erste Aminosäure des rekombinanten Proteins nach dem Formyl-Methionin ein Aspartat. Diese Aminosäure kann in eukaryotischen Zellen für eine Destabilisierung des Proteins sorgen, indem es einen raschen Abbau induziert. Um sicherzustellen, daß die rekombinante schwere Kette nach der Aufnahme von humanen Zellen stabil ist, wurde der Amino-Terminus komplet tiert. Dazu wurde über eine Ncol und BseRI Schnittstelle ein Oligoadapter in pCYB4-HCH eingeführt, der für die drei fehlenden aminoterminalen Aminosäuren codiert. Somit bestand die erste Aminosäure nun in einem Serin, die stabilisie rend für das Protein ist. Die Klonierung wurde durch Sequenzierung verifiziert.
For reasons of cloning, the recombinant protein at the C-terminus also had the amino acids glycine and proline before the intein cleavage site. At the amino terminus it was shortened by three amino acids compared to the wild-type protein. Thus, the first amino acid of the recombinant protein after the formyl methionine was an aspartate. This amino acid can destabilize the protein in eukaryotic cells by inducing rapid degradation. To ensure that the recombinant heavy chain is stable after the uptake of human cells, the amino terminus was completed. For this purpose, an oligo adapter was introduced into pCYB4-HCH via an Ncol and BseRI interface, which codes for the three missing amino-terminal amino acids. The first amino acid was now a serine, which is stabilizing for the protein. The cloning was verified by sequencing.

Das neue Konstrukt wurde pCYB4-Ad-A + B-HCH genannt.The new construct was named pCYB4-Ad-A + B-HCH.

Als weiteres Expressionssystem wurde das IMPACT T7 System (New England Biolabs, Beverley, USA) eingesetzt. Dieses nutzt im Unterschied zum ursprüng lichen System die T7-Polymerase zur Transkription der Expressions-Plasmid. Da auch mit diesem System eine zusätzliche Reinigung über eine N-Terminale His tag ermöglicht werden sollte, wurde ein entsprechender Adapter in das Ex pressions-Plasmid pTYB1 kloniert. Der Vektor wurde mit Ndel und Xhol verdaut und der Adapter I + II ligiert.
The IMPACT T7 system (New England Biolabs, Beverley, USA) was used as a further expression system. In contrast to the original system, this uses T7 polymerase to transcribe the expression plasmid. Since this system should also enable additional cleaning via an N-terminal His tag, an appropriate adapter was cloned into the expression plasmid pTYB1. The vector was digested with Ndel and Xhol and the adapter I + II ligated.

Die Klonierung wurde durch Sequenzierung verifiziert. Das Konstrukt wurde pTYB1-Ad-I + II genannt.The cloning was verified by sequencing. The construct was called pTYB1-Ad-I + II.

Das Plasmid pTYB1-Ad-I + II wurde mit Sapl verdaut, die überhängenden Basen mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt und der Vektor nochmals mit Xhol verdaut.The plasmid pTYB1-Ad-I + II was digested with Sapl, the overhanging bases filled in with the Klenow fragment and the vector digested again with Xhol.

Ausgehend von dem Plasmid pCYB4-Ad-A + B-HCH mit dem kompletten Gen der schweren Kette, wurde für die Klonierung eine PCR mit der Pfu-Polymerase durchgeführt. Damit wurde das Gen der schweren Kette amplifiziert, das am 5'- Ende eine Xhol-Schnittstelle hatte und am 3'-Ende das Codon für Aspartat (letzte Aminosäure wt schwere Kette) mit dem Codon für Serin ausgetauscht hatte. Dieser Aminosäureaustausch war nötig geworden, da Aspartat eine totale in vivo-Spaltung des HCH-Intein-Fusionsprotein bewirkt hätte (Manual IMPACT- System). Das PCR-Produkt wurde, nach Xhol-Verdau in den vorbereiteten Vektor pTYB1-Ad-I + II sticky/blunt ligiert. Durch diese Strategie wurde das Gen für die schwere Kette ohne zusätzliche Aminosäure am C-Terminus direkt vor die erste Aminosäure des Inteins kloniert.Starting from the plasmid pCYB4-Ad-A + B-HCH with the complete gene of heavy chain, a PCR with the Pfu polymerase was used for the cloning carried out. This amplified the heavy chain gene that was found on the 5'- Had an Xhol interface at the end and the codon for aspartate at the 3 'end (last amino acid wt heavy chain) with the codon for serine would have. This amino acid exchange had become necessary since aspartate was a total in vivo cleavage of the HCH-intein fusion protein (manual IMPACT- System). The PCR product was, after Xhol digestion, in the prepared vector pTYB1-Ad-I + II sticky / blunt ligated. Through this strategy, the gene for heavy chain without additional amino acid at the C-terminus directly in front of the first Amino acid cloned.

Das Konstrukt wurde pTYB1-HCH genannt.The construct was named pTYB1-HCH.

1. Primer 1. Primer

2. Primer 2. Primer

PCR parameters

5 min 95°C
25 Zyklen 1 min 95°C
1 min 55°C
7,5 min 72°C
10 min 72°C, dann 4°C
5 min 95 ° C
25 cycles 1 min 95 ° C
1 min 55 ° C
7.5 min 72 ° C
10 min 72 ° C, then 4 ° C

Example 2: Expression and purification of the tetanus toxin heavy chain in E.coli

Aus einer E.coli K12 Bakterienkultur vom pTYB1-HCH wurde eine 200 ml LB- Amp-Übernachtkultur angeimpft. Diese wurde am nächsten Tag zu 800 ml LB- Amp gegeben und bei 37°C bis zu einer OD₆₀₀ von 1,0 bis 1,5 geschüttelt. Von diesen Bakterien wurden 50 ml als uninduzierte Probe entnommen und sedimen tiert. Zu dem restlichen Ansatz wurde IPTG mit einer Endkonzentration von 1 mM gegeben und die Bakterien bei Raumtemperatur für 4-5 Stunden geschüttelt. Nach der Induktionszeit wurden die Bakterien sedimentiert und konnten bei -20°C gelagert werden. Alle nachfolgenden Schritte wurden auf Eis oder im Kühlraum durchgeführt.A 200 ml LB amp culture was inoculated from an E. coli K12 bacterial culture from pTYB1-HCH. The next day, this was added to 800 ml of LB amp and shaken at 37 ° C. to an OD ₆₀₀ of 1.0 to 1.5. 50 ml of these bacteria were taken as an uninduced sample and sedimented. IPTG was added to the remaining batch at a final concentration of 1 mM and the bacteria were shaken at room temperature for 4-5 hours. After the induction period, the bacteria were sedimented and could be stored at -20 ° C. All subsequent steps were carried out on ice or in the cold room.

Die Sedimente, die einer Bakteriensuspension von ca. 250 ml entsprachen, wurden mit 6,25 ml Lysepuffer (20 mM HEPES, PH8,0 ggf. 2M Harnstoff 500 uM EDTA 0,1% Triton X-100) resuspendiert. Zur Verhinderung von proteolyti schem Abbau wurde COMPLETE-Proteinase Inhibitor (Fa. Boehringer Mannheim) nach Angaben des Herstellers zugegeben. Der Zellaufschluß erfolgte mittels Ultraschall (Branson-Sonifier 250; 5 × 1 min. 20% Leistung, mit jeweils 30 sec Pause). Nach der anschließenden Zentrifugation für 30 min bei 12 000 g wurde der Überstand auf eine mit Lysepuffer äquilibrierte Chitin-Säule gegeben. Der Durchfluß wurde aufgefangen und nochmals über die Säule gegeben. Der erste Waschschritt mit dem 4-fach Säulenvolumen erfolgte mit dem Lysepuffer. Es schlossen sich ein Waschschritt mit dem Waschpuffer 1 (20 mM HEPES, pH 8,0; 500 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 0,1% Triton X-100) (8-faches Säulenvolu men) und Waschpuffer 2 (50 mM BICINE, pH 8,5; 150 mM NaCl; 1 mm EDTA) (4-faches Säulenvolumen) an. Zur Induktion der Proteinspaltung wurden 3 Säulenvolumen Cleavage Puffer (50 mM BICINE, pH 8,5; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, 30 mM β-Mercaptoethanol) über die Säule gegeben und diese dann über Nacht verschlossen. Die Elution erfolgte mit dem Waschpuffer 2 und die Protein konzentration wurde mittels des BioRad Detektionssystems bestimmt.The sediments, which corresponded to a bacterial suspension of approx. 250 ml, were treated with 6.25 ml of lysis buffer (20 mM HEPES, PH8.0, optionally 2M urea 500 uM EDTA 0.1% Triton X-100) resuspended. To prevent proteolyti chemical degradation became COMPLETE proteinase inhibitor (Boehringer Mannheim) added according to the manufacturer. The cell disruption took place by means of Ultrasound (Branson-Sonifier 250; 5 × 1 min. 20% power, each with a 30 sec pause). After the subsequent centrifugation for 30 min at 12,000 g the supernatant was placed on a chitin column equilibrated with lysis buffer. The Flow was collected and passed over the column again. The first Washing step with the 4-fold column volume was carried out with the lysis buffer. It followed by a wash step with wash buffer 1 (20 mM HEPES, pH 8.0; 500 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 0.1% Triton X-100) (8-fold column volume men) and washing buffer 2 (50 mM BICINE, pH 8.5; 150 mM NaCl; 1 mm EDTA) (4 times the column volume). To induce protein cleavage, 3 Column volume of cleavage buffer (50 mM BICINE, pH 8.5; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, 30 mM β-mercaptoethanol) over the column and then over Closed at night. The elution was carried out with washing buffer 2 and the protein concentration was determined using the BioRad detection system.

Nach der oben beschriebenen C-terminalen Reinigung der rekombinanten Protei ne eluierten Produkte mit heterogener Größe. Als weiteren Reinigungsschritt sollte deshalb das full length Protein, das 6 Histidine am N-Terminus besaß, über eine Ni-Agarose Affinitätsmatrix homogen isoliert werden.After the C-terminal purification of the recombinant protein described above ne eluted products of heterogeneous size. As a further cleaning step should therefore over the full length protein, which had 6 histidines at the N-terminus a Ni-agarose affinity matrix can be homogeneously isolated.

Die Ni-Agarose-Suspension wurde mit dem Waschpuffer 2 (4 M Harnstoff, 100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-HCl, pH 6,3) äquilibriert. Die Proteinlösung wurde durch das Zugeben des gleichen Volumens von Waschpuffer 1 (8 M Harnstoff, 100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-HCl, pH 6,3) auf eine Harnstoffkonzentration von 4 M eingestellt. Nach Zugabe der Ni-Beads wurde die Suspension in einem Reaktionsgefäß auf einem Taumelrollenmischer bei 4°C für 30-60 min inkubiert. Anschließend wurde das Gemisch in eine leere Säule gefüllt, die durch eine Fritte die Beads zurückhielt. Ungebundene Proteine wurden mit dem 10-fachen Säulen bettvolumen an Waschpuffer 2 entfernt. Vor der Elution wurde der Harnstoff durch den Waschpuffer 3 (50 mM NaH₂PO₄, pH 8,0, 150 mM NaCl) entfernt und der pH auf 8,0 eingestellt. Die gebundenen Proteine wurden durch den Elutionspuffer freigesetzt und aufgefangen.The Ni agarose suspension was equilibrated with washing buffer 2 (4 M urea, 100 mM NaH ₂ PO ₄ , 10 mM Tris-HCl, pH 6.3). The protein solution was adjusted to a urea concentration of 4 M by adding the same volume of wash buffer 1 (8 M urea, 100 mM NaH ₂ PO ₄ , 10 mM Tris-HCl, pH 6.3). After the addition of the Ni beads, the suspension was incubated in a reaction vessel on a tumble roller mixer at 4 ° C. for 30-60 min. The mixture was then poured into an empty column, which retained the beads by means of a frit. Unbound proteins were removed with 10 times the bed volume of wash buffer 2. Before the elution, the urea was removed by washing buffer 3 (50 mM NaH ₂ PO ₄ , pH 8.0, 150 mM NaCl) and the pH was adjusted to 8.0. The bound proteins were released through the elution buffer and collected.

Example 3 Expression and Purification of a Fusion Protein from HMG-1 And the tetanus toxin heavy chain gene

Ein weiteres Ziel war es, das Gen der schweren Kette des Tetanus-Toxins mit einem anderen Gen zu kombinieren, um ein Fusionsprotein mit neuen Eigen schaften zu erhalten. Die Funktionen der schweren Kette, die die zelltypspezifi sche Bindung, Aufnahme und Freisetzung des Toxins umfassen, sollten durch eine DNA-Bindedomäne ergänzt werden. Zu diesem Zweck wurde das humane Chromatinprotein HMG-1 kloniert.Another goal was to use the heavy chain gene of the tetanus toxin with combine another gene to make a fusion protein with new eigen to maintain. The functions of the heavy chain that the cell type-specific binding, uptake and release of the toxin should include: a DNA binding domain can be added. For this purpose, the human Chromatin protein HMG-1 cloned.

Die Bezeichnung HMG steht für High Mobility Group und bezieht sich auf das Laufverhalten der Proteine bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Die Proteine gehören zum nicht-Histon-Anteil des Chromatins und werden in drei Familien eingeteilt: 1. HMG-1/2; 2. HMG-14/17; 3. HMG-I(Y). HMG-1 /2-Proteine werden in allen Zellen exprimiert, ihre genaue Funktion ist allerdings nicht bekannt. Das Molekulargewicht beträgt etwa 25 kDa. Es handelt sich, ähnlich wie bei den Histonen, um Proteine mit stark konservierter Sequenz. So beträgt die Homolo gie zwischen dem HMG-T der Forelle und dem humanen HMG-1 noch 70%. Charakteristisch für das HMG-1-Protein sind die zwei sogenannten HMG-Boxen A und B, die homolog zu anderen HMG-Proteinen sind. Diese Boxen liegen im N- terminalen Bereich, haben eine Nettoladung von + 20 und bewirken eine un spezifische DNA-Bindung. Die Bindung umfaßt ca. 14 bp, wobei die DNA gebo gen wird. Im Gegensatz zu den HMG-Boxen ist der C-Terminus negativ geladen, so daß die Gesamtladung bei -5 liegt.The term HMG stands for High Mobility Group and refers to that Running behavior of the proteins in polyacrylamide gel electrophoresis. The proteins belong to the non-histone portion of chromatin and are in three families classified: 1. HMG-1/2; 2. HMG-14/17; 3. HMG-I (Y). HMG-1/2 proteins expressed in all cells, but their exact function is not known. The Molecular weight is about 25 kDa. It is similar to the Histones to proteins with highly conserved sequence. So the homolo is still between 70% of the trout HMG-T and the human HMG-1. The two so-called HMG boxes are characteristic of the HMG-1 protein A and B that are homologous to other HMG proteins. These boxes are in the N- terminal area, have a net charge of + 20 and cause an un specific DNA binding. The binding comprises approx. 14 bp, the DNA gebo will. In contrast to the HMG boxes, the C-terminus is negatively charged, so that the total charge is -5.

Mittels Datenbankrecherche wurde ein IMAGE-Klon identifiziert, der das gewünschte Gen enthielt. Von dem Ressourcenzentrum Berlin (MPI für Molekula re Genetik) wurde der Klon p998B091570 (clone ID 645032) geliefert.An IMAGE clone was identified by database research contained the desired gene. From the Berlin Resource Center (MPI for Molecules genetics) the clone p998B091570 (clone ID 645032) was delivered.

Mit Hilfe von sequenzspezifischen Primern, die am 5'-Ende eine Ncol- bzw. Smal-Schnittstelle besaßen, wurde das Gen mit der Pfu-Polymerase amplifiziert.With the help of sequence-specific primers that have an Ncol or Smal cleaved, the gene was amplified with the Pfu polymerase.

Ansatz: s. Beispiel 1Approach: s. example 1

Klonierungsprimer 1: HMG-1.FOR Cloning Primer 1: HMG-1.FOR

Klonierungsprimer 2: HMG-1a.REV Cloning primer 2: HMG-1a.REV

PCR-Parameter 5 min 95°C
5 Zyklen 1 min 95°C
1 min 56°C
7 min 72°C
15 Zyklen 1 min 95°C
1 min 62°C
7 min 72°C
10 min 72°C, dann 4°CPCR parameters 5 min 95 ° C
5 cycles 1 min 95 ° C
1 min 56 ° C
7 min 72 ° C
15 cycles 1 min 95 ° C
1 min 62 ° C
7 min 72 ° C
10 min 72 ° C, then 4 ° C

Das Plasmid pCYB4-HCH (s. Bsp. 1) wurde mit Ncol und BseRl verdaut und der Adapter Ad X + Y eingefügt. Dieser Adapter ermöglichte es, das mit Ncol und Smal verdaute HMG-1 PCR-Fragment über Ncol und Snaßl (ebenso wie Smal blunt) in frame vor das Gen der schweren Kette zu ligieren. Ebenso wurde durch den Adapter das 5'-Ende der schweren Kette komplettiert und ein Peptidlinker zwischen den beiden Proteinen eingefügt. Der Peptidlinker hatte folgende Se quenz: Val-Lys-Ser-Ala-Pro-Ser-Gly. The plasmid pCYB4-HCH (see Example 1) was digested with Ncol and BseRI and the Ad X + Y adapter inserted. This adapter made it possible to work with Ncol and Smal digested HMG-1 PCR fragment via Ncol and Snassl (as well as Smal blunt) in frame before ligating the heavy chain gene. Likewise, through the adapter completes the 5 'end of the heavy chain and a peptide linker inserted between the two proteins. The peptide linker had the following Se quenz: Val-Lys-Ser-Ala-Pro-Ser-Gly.

Ad-X Ad-X

Ad-Y Ad-Y

Alle Klonierungen wurden durch Sequenzierung verifiziert. Der Vektor mit dem inserierten Adapter wurde pCYB4-Ad-X + Y-HCH und der Vektor mit dem inse rierten HMG-1-Gen pCYB4-HMG-1-HCH genannt. Da das HMG-1 PCR-Fragment vor der Ligation auch mit Smal verdaut und blunt an den Adapter ligiert wurde, hatte das HMG-1-Protein am C-Terminus zusätzlich noch die Aminosäure Glycin (Codon: GGG). Somit besaß das Fusionsprotein die folgende schematische Sequenz: ATG-wt HMG 1-Gly-Val-Lys-Ser-Ala-Pro-Ser-Gly-wt schwere Kette Tetanustoxin-Gly-Pro-Intein-Chitin-Bindeprotein.All clonings were verified by sequencing. The vector with the The adapter inserted was pCYB4-Ad-X + Y-HCH and the vector with the inse HMG-1 gene called pCYB4-HMG-1-HCH. Because the HMG-1 PCR fragment was digested with smal and ligated to the adapter in blunt before the ligation, the HMG-1 protein also had the amino acid glycine at the C-terminus (Codon: GGG). Thus the fusion protein had the following schematic Sequence: ATG-wt HMG 1-Gly-Val-Lys-Ser-Ala-Pro-Ser-Gly-wt heavy chain Tetanus Toxin Gly Pro Intein Chitin Binding Protein.

Da bei allen Isolaten neben dem Produkt mit der korrekten Größe auch kleinere Fragmente eluiert wurden, sollte der Expressionsvektor derart verändert werden, daß die rekombinanten Proteine zusätzlich über den N-Terminus gereinigt werden konnten. Dazu wurde, ausgehend von dem Vektor pCYB4-Ad-X + Y-HCH, ein Adapter einligiert, der nach dem Startcodon für sechs Histidine codiert und somit eine Reinigung über Metall-Affinitäts-Säulen ermöglichte. Nach den His- Codons befand sich eine Xhol-Schnittstelle. Nach Verdau mit Xhol und SnaBl konnten somit weitere Gene in frame integriert werden. Der Vektor wurde mit Ncol und SnaBl verdaut und der Adapter sticky/blunt unter Rekonstitution der SnaBl (blunt)-Schnittstelle ligiert.Because with all isolates not only the product with the correct size but also smaller ones Fragments were eluted, the expression vector should be changed such that the recombinant proteins are additionally purified via the N-terminus could. For this purpose, starting from the vector pCYB4-Ad-X + Y-HCH Adapter ligated in, which codes for six histidines after the start codon and thus enabled purification via metal affinity columns. After the His- Codons was an Xhol interface. After digestion with Xhol and SnaBl additional genes could be integrated into the frame. The vector was made with Ncol and SnaBl digested and the adapter sticky / blunt under reconstitution of the SnaBl (blunt) interface ligated.

Ad-HIS-A Ad-HIS-A

Ad-HIS-B Ad-HIS-B

Die Klonierung wurde durch Sequenzierung verifiziert. Dieses Konstrukt wurde pCYB4-HIS-HCH genannt. Auch eine Reinigung der rekombinanten schweren Kette über die His-Tag war mit diesem Plasmid möglich. Dieses Protein hatte zusätzlich zur Wildtyp-Sequenz 18 Aminosäuren am N-Terminus (6 × His-Leu-Glu- Gly-Gly-Tyr-Val-Lys-Ser-Ala-Pro-Ser-Gly).The cloning was verified by sequencing. This construct was called pCYB4-HIS-HCH. Also cleaning the recombinant heavy Chain across the His tag was possible with this plasmid. Had this protein in addition to the wild-type sequence, 18 amino acids at the N-terminus (6 × His-Leu-Glu- Gly-Gly-Tyr-Val-Lys-Ser-Ala-Pro-Ser-Gly).

Zur Konstruktion von HMG-1/schwere Kette-Fusionsproteinen, die zusätzlich über eine aminoterminale His-Tag gereinigt werden können, wurden das HMG-1 Gen mit sequenzspezifischen Primern amplifiziert, die am 5'-Ende eine Xhol- Schnittstelle einführten. Die Prüfer am 3'-Ende des Gens waren komplett kom plementär, so daß eine sticky/blunt-Ligation durchgeführt werden konnte. Als weitere Variation wurde ein am 3'-Ende verkürztes Fragment des HMG-1-Gens kloniert, welches nur die DNA-bindenden Domänen (HMG-Box A + B) enthielt. Die PCR wurde mit der Pfu-Polymerase und dem Klon pCYB4-HMG-1-HCH als Matrize durchgeführt.To construct HMG-1 / heavy chain fusion proteins, the additional The HMG-1 was purified via an amino-terminal His-Tag Gene amplified with sequence-specific primers which have an Xhol at the 5 'end. Interface introduced. The testers at the 3 'end of the gene were completely com complementary so that a sticky / blunt ligation could be performed. As another variation was a fragment of the HMG-1 gene truncated at the 3 'end cloned, which contained only the DNA-binding domains (HMG box A + B). The PCR was carried out with the Pfu polymerase and the clone pCYB4-HMG-1-HCH as Die performed.

Complete HMG-1 gene primer

XhoHMG-1.FOR XhoHMG-1.FOR

XhoHMG-1.REV XhoHMG-REV 1

Truncated HMG-1 gene primer

XhoHMG-1.FOR XhoHMG-1.FOR

DeltaHMG-1.REV DeltaHMG-REV 1

PCR-Parameter
5 min 95°C
25 Zyklen 1 min 95°C
1 min 55°C
1,5 min 72°C
10 min 72°C, dann 4°CPCR parameters
5 min 95 ° C
25 cycles 1 min 95 ° C
1 min 55 ° C
1.5 min 72 ° C
10 min 72 ° C, then 4 ° C

Das Plasmid pCYB4-HIS-HCH wurde mit Xhol und SnaBl verdaut und die PCR- Fragmente nach Xhol-Verdau einligiert. Die Konstrukte wurden pCYB4-His-HMG- 1-HCH bzw. pCYB4-His-ΔHMG-1-HCH genannt. Die Klonierungen wurden durch Sequenzierung verifiziert.The plasmid pCYB4-HIS-HCH was digested with Xhol and SnaBl and the PCR Fragments inserted after Xhol digestion. The constructs were pCYB4-His-HMG- Called 1-HCH or pCYB4-His-ΔHMG-1-HCH. The cloning was done by Sequencing verified.

Die Herstellung des Fusionsproteins erfolgte mit pCYB4-His-HMG-1-HCH bzw. pCYB4-His-ΔHMG-1-HCH analog Beispiel 2 rekombinant in E. coli.The fusion protein was produced with pCYB4-His-HMG-1-HCH or pCYB4-His-ΔHMG-1-HCH analogously to Example 2 recombinantly in E. coli.

Example 4: Uptake of protein conjugates in neuroblastoma cells

Der bispezifische Crosslinker Sulfo-LC-SPDP (Fa. Pierce, Rockford, USA) besitzt eine Amino- und eine SH-reaktive Gruppe.The bispecific crosslinker Sulfo-LC-SPDP (from Pierce, Rockford, USA) has an amino and an SH reactive group.

Das Protein neutrAvidin (Fa. Pierce, USA) lag in einer Konzentration von 5 mg/ml in 50 mM BICINE (Fa. Sigma), pH 8,5; 80 mM NaCl vor. Es handelte sich hierbei im Gegensatz zum Wildtyp um ein Protein ohne Zuckerseitenketten und damit mit neutralem pl-Wert. Dies verhindert die unspezifischen Wechselwirkungen z. B. mit Zellen, die bei dem basischen Wildtyp-Protein vorkommen. Der Cross linker war in einer Konzentration von 15 mM in DMSO gelöst (Lagerung bei -80°C). 2,5 mg Avidin wurden mit einem dreifachen molaren Überschuß des Crosslinkers für zwei Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Tris-Puffer pH 8,0 gestoppt. Der Reaktionsansatz wurde durch eine Gelfiltration über eine G-25 Entsalzungssäule (FPLC) in 50 mM MOPS pH 7,4; 80 mM NaCl überführt und dabei die überschüssigen Crosslinker entfernt. Nach Angaben des Herstellers wurde mit dem Bio-Rad Protein Assay Kit I (Bio-Rad, München) die Proteinkonzentration der Säulenfraktionen bestimmt und anschließend durch Reduktion eines Teils des modifizierten Proteins die Anzahl der gekoppelten Linker pro Molekül gemäß Standardmethoden photome trisch bestimmt. Es ergab sich eine Anzahl von 1,9 Linkern pro Avidin-Molekül.The protein neutrAvidin (from Pierce, USA) was in a concentration of 5 mg / ml in 50 mM BICINE (Sigma), pH 8.5; 80 mM NaCl before. It was this in contrast to the wild type around a protein without sugar side chains and with it with a neutral pl value. This prevents the non-specific interactions e.g. B. with cells that occur in the basic wild-type protein. The cross left was dissolved in a concentration of 15 mM in DMSO (storage at -80 ° C). 2.5 mg of avidin was mixed with a three-fold molar excess of Crosslinkers implemented for two hours at room temperature. The reaction was stopped by adding Tris buffer pH 8.0. The reaction approach was by gel filtration over a G-25 desalination column (FPLC) in 50 mM MOPS pH 7.4; 80 mM NaCl transferred and the excess crosslinker away. According to the manufacturer, the Bio-Rad protein assay Kit I (Bio-Rad, Munich) determines the protein concentration of the column fractions and then by reducing a portion of the modified protein Number of coupled linkers per molecule according to standard photome methods determined. There was a number of 1.9 linkers per avidin molecule.

Zunächst wurden die beiden Proteine gekoppelt, um eine Einschleusung von Avidin in Neuroblastom-Zellen über die schwere Kette nachzuweisen. Dazu wurde 1 nmol ( = 60 µg) des modifizierten Avidins mit 192 pmol ( = 19,2 µg) der schweren Kette von Tetanustoxin in 50 mM MOPS-Puffer, pH 7,4 und 80 mM NaCl bei 4°C für 3 Tage inkubiert. Der Reaktionsansatz wurde über eine Superdex-200-Gelfiltrationssäule, die mit 50 mM CHES pH 9,5 und 1,5 M NaCl äquilibriert war, aufgetrennt. 100 µl Proben aus den ersten Peakfraktionen wurden für Immunfluoreszenz-Experimente verwendet.First, the two proteins were coupled in order to inject Evidence of avidin in neuroblastoma cells via the heavy chain. To 1 nmol (= 60 µg) of the modified avidine with 192 pmol (= 19.2 µg) the heavy chain of tetanus toxin in 50 mM MOPS buffer, pH 7.4 and 80 mM Incubated NaCl at 4 ° C for 3 days. The reaction was carried out over a Superdex-200 gel filtration column, which was filled with 50 mM CHES pH 9.5 and 1.5 M NaCl was equilibrated, separated. 100 µl samples from the first peak fractions were used for immunofluorescence experiments.

Für diesen Versuch wurde die Neuroblastom-Zellinie HDN-16 vorbereitet. Die Zellen waren am Vortag des Experiments auf unbeschichtete Glas-Deckgläschen (∅ = 1 cm) ausgesät und in 6-Loch-Gefäße (∅ je Loch = 3,5 cm) mit je 4 ml Medium überschichtet worden. Vor Beginn des Experiments wurden die Zellen mit Medium gewaschen, um abgestorbene Zellen zu entfernen. Nachfolgend wurden die Zellen zu 100 µl Elutionsfraktion in 1 ml RPMI-Medium (+ 10% FCS) gegeben und für 5 h ohne Bewegung inkubiert. Alle Schritte der Immunfluo reszenz wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Ende der Inkubations zeit wurden die Zellen ausgiebig mit Medium gewaschen und direkt danach fixiert.The neuroblastoma cell line HDN-16 was prepared for this experiment. The Cells were on uncoated glass coverslips the day before the experiment (∅ = 1 cm) and sown in 6-hole vessels (∅ per hole = 3.5 cm) with 4 ml each Medium has been overlaid. Before the experiment started, the cells washed with medium to remove dead cells. Below the cells were 100 µl elution fraction in 1 ml RPMI medium (+ 10% FCS) given and incubated for 5 h without movement. All steps of immunofluo Resections were performed at room temperature. At the end of the incubation the cells were washed extensively with medium and immediately thereafter fixed.

Sowohl die Erst- (anti-Avidin, Kaninchen, 2 µg/ml; Rockland, Gilbertsville, USA) als auch die Zweitantikörper (Ziege-anti-Kaninchen-CY-2; 3,3 µg/ml; Rockland, Gilbertsville, USA) wurden mit der Verdünnungslösung (PBS, 0,1% BSA) ange setzt.Both the first- (anti-avidin, rabbit, 2 µg / ml; Rockland, Gilbertsville, USA) as well as the secondary antibodies (goat anti-rabbit CY-2; 3.3 µg / ml; Rockland, Gilbertsville, USA) were diluted with the diluent (PBS, 0.1% BSA) puts.

Das Volumen betrug 50 µl. Diese Lösung wurde in einem 6-Loch-Gefäß vor gelegt und die Deckgläschen mit der Zellseite darauf gelegt. Die Inkubationszeit betrug mindestens 30 min. anschließend wurden die Zellen mit PBS ausgiebig gewaschen.The volume was 50 µl. This solution was placed in a 6-hole vessel placed and the cover slip with the cell side placed on it. The incubation period was at least 30 min. then the cells became extensive with PBS washed.

Zur Färbung des Zellkerns wurden die Zellen für 10 min mit einer Dapi-Lösung (5 ng/ml in 2 × SSC) inkubiert und anschließend mit PBS gewaschen.The cells were stained with a Dapi solution for 10 min (5 ng / ml in 2 × SSC) and then washed with PBS.

Auf einen Objektträger wurden 15 µl des Mounting-Mediums (2,4 g Mowiol in 6 ml Glycerin, 1 h Rühren, + 6 ml H₂O, 2 h Rühren + 12 ml 0,2 M Tris-HCl, pH 8,5, 50°C mit gelegentlichem Rühren, Zentrifugation: 5000 g für 15 min. Zugabe von 23 mg/ml DABCO; Lagerung von 1 ml Portionen bei -20°C) vor gelegt und die Deckgläschen mit der Zellseite unter Vermeidung von Luftblasen langsam aufgelegt. Die Objektträger wurden waagerecht und abgedunkelt über Nacht zum Auspolymerisieren gelagert. Das erstarrte Einbett-Medium konserviert das Präparat und das beinhaltete Dabco soll das Ausbleichen der Farbstoffe bei der Fluoreszenz-Mikroskopie verhindern. Die Präparate konnten bei 4°C über mehrere Wochen gelagert werden.15 μl of the mounting medium (2.4 g of Mowiol in 6 ml of glycerol, stirring for 1 hour, + 6 ml of H ₂ O, stirring for 2 hours + 12 ml of 0.2 M Tris-HCl, pH 8.5) were placed on a slide , 50 ° C with occasional stirring, centrifugation: 5000 g for 15 min.Addition of 23 mg / ml DABCO; storage of 1 ml portions at -20 ° C) and the cover glass with the cell side is slowly placed on, avoiding air bubbles. The slides were stored horizontally and darkened overnight to polymerize. The solidified embedding medium preserves the preparation and the contained Dabco is intended to prevent the dyes from fading in fluorescence microscopy. The preparations could be stored at 4 ° C for several weeks.

Die Präparate wurden mit einem Zeiss Axiophot Epifluoreszenz-Mikroskop ausge wertet. Die Aufnahmen wurden mit einer CCD-Kamera CH250 der Firma Photo metrics (München) gemacht und mit der Bildverarbeitungs-Software IPLab- Spectrum 10 (Vers. 3.0) dokumentiert.The preparations were taken out with a Zeiss Axiophot epifluorescence microscope evaluates. The recordings were made with a CCD camera CH250 from Photo metrics (Munich) and with the image processing software IPLab- Spectrum 10 (Vers. 3.0) documented.

In Fig. 1 sind die deutlichen Avidin-Signale zu sehen. Kontrollansätze mit a) Avidin, b) der schweren Kette und c) einem Ansatz mit unmodifizierten Avidin und der schweren Kette in der Konzentration der Elutionsfraktion, erbrachten keine Signale (Daten nicht gezeigt).The clear avidin signals can be seen in FIG . Control batches with a) avidin, b) the heavy chain and c) a batch with unmodified avidin and the heavy chain in the concentration of the elution fraction gave no signals (data not shown).

Durch dieses Experimentieren wurde der Nachweis erbracht, daß es mit der schweren Kette des Tetanus-Toxins möglich ist, andere Proteine in Neublastrom- Zellen zu transportieren.Through this experimentation, evidence was provided that the heavy chain of the tetanus toxin is possible, other proteins in neoplasm To transport cells.

Example 5: Binding of Biotin Oligonucleotides to Heavy Chain Avidin Conjugate

In weiteren Ansätzen sollte die schwere Kette mit dem modifizierten Avidin gekoppelt werden, um dann an diese Konjugate DNA-Oligonukleotide (15-mer mit zufälliger Sequenz, Fa. MWG Biotech, München) zu binden. Dazu wurde 1 nmol ( = 100 µg) der schweren Kette von Tetanustoxin mit 500 µmol ( = 30 µg) des modifizierten Avidins (neutrAvidin, Fa. Pierce, Rockford, USA) in 50 mM Hepes pH 8,5 und 150 mM NaCl für 6 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurden 50 µmol eines 15mer DNA-Oligonukleotids zugegeben und der Ansatz ohne Bewegung über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Oligonukleotide besaßen an ihrem 3'-Ende eine Biotin-Gruppe, die eine Bindung an Avidin er möglicht. Am 5'-Ende waren die Oligonukleotide mit einer FITC-Gruppe modifi ziert, um so eine eventuelle Aufnahme in Zellen nachweisen zu können. Die Modifikationen der Oligonukleotide waren vom Hersteller bei der Synthese einge führt worden (Fa. MWG Biotech, München).In further approaches, the heavy chain with the modified avidin coupled to DNA oligonucleotides (15-mer with a random sequence, MWG Biotech, Munich). For this, 1 nmol (= 100 µg) of the heavy chain of tetanus toxin with 500 µmol (= 30 µg) of the modified avidine (neutrAvidin, from Pierce, Rockford, USA) in 50 mM Hepes pH 8.5 and 150 mM NaCl shaken for 6 h at room temperature. Then 50 µmol of a 15mer DNA oligonucleotide were added and the mixture is incubated at 4 ° C. overnight without movement. The oligonucleotides had at their 3 'end a biotin group that binds to avidin possible. At the 5 'end, the oligonucleotides were modified with a FITC group adorned in order to be able to detect possible uptake in cells. The Modifications of the oligonucleotides were included in the synthesis by the manufacturer (MWG Biotech, Munich).

Obwohl in den Ansätzen Avidin in einem 10fachen molaren Überschuß vorlag und theoretisch pro Avidin vier Biotin-Bindestellen zur Verfügung standen, sollten noch eventuell vorhandene freie Oligonukleotide aus den Ansätzen entfernt werden, um Versuchsartefakte zu minimieren. Dazu wurden die Ansätze entweder mit magnetischen Beads, die mit Streptavidin gekoppelt waren, inkubiert, oder über eine NickSpin Column (Pharmacia) aufgetrennt. Im ersten Fall wurden die Streptavidin-Beads mit 50 mM Hepes pH 7,4; 150 mM NaCl äquilibriert, die Ansätze zugegeben und für 15 min geschüttelt. Nach der magne tischen Separierung der Beads wurde der Ansatz entnommen. Die NickSpin Columns, die eine Sephadex G-50 Matrix besaßen, wurden mit dem gleichen Puffer äquilibriert und die Ansätze nach den Angaben des Herstellers aufge trennt. Beide Proben wurden bei den Immunfluoreszenz-Versuchen (analog Beispiel 4) eingesetzt, zeigten aber keinen signifikanten Unterschied in dem Signalmuster (vgl. Fig. 1).Although avidin was in a 10-fold molar excess in the batches and theoretically four biotin binding sites were available per avidin, any free oligonucleotides still present should be removed from the batches in order to minimize experimental artifacts. For this purpose, the batches were either incubated with magnetic beads which were coupled with streptavidin, or separated using a NickSpin Column (Pharmacia). In the first case, the streptavidin beads with 50 mM Hepes pH 7.4; 150 mM NaCl equilibrated, the batches added and shaken for 15 min. After the magnetic separation of the beads, the batch was removed. The NickSpin Columns, which had a Sephadex G-50 matrix, were equilibrated with the same buffer and the batches were separated according to the manufacturer's instructions. Both samples were used in the immunofluorescence experiments (analogously to Example 4), but showed no significant difference in the signal pattern (cf. FIG. 1).

EXAMPLE 6: Uptake of HisΔMG-1-HCH fusion protein in neuro blastom cells

Das homogen isolierte Fusionsprotein aus einem verkürzten HMG-1-Protein und der schweren Kette des Tetanus Toxin wurde mit der Neuroblastom-Zellinie IMR- 32 inkubiert, um durch Immunfluoreszenz-Analysen die Aufnahme des Proteins zu testen. Nach einer vierstündigen Inkubation von etwa 0,5 µg des Fusions proteins in 1,5 ml RPMI-Medium (+ 10% FCS) wurden die Zellen ausgiebig mit Medium gewaschen, fixiert, mittels Antikörper gegen das C-Fragment des Tetanus-Toxins (1 : 100-1 : 300; Fa. Charles River, Southbridge, USA) und einem CY-2 markierten Sekundärantikörper (Ziege-anti-Kaninchen-CY-2; Fa Rockland, Gilbertsville, USA) das Fusionsprotein detektiert. In Fig. 2 ist das Resultat des Experiments zu sehen. Es sind sehr starke Signale in fast allen Zellen zu erkennen.The homogeneously isolated fusion protein consisting of a truncated HMG-1 protein and the heavy chain of the tetanus toxin was incubated with the neuroblastoma cell line IMR-32 in order to test the uptake of the protein by immunofluorescence analyzes. After a four-hour incubation of about 0.5 µg of the fusion protein in 1.5 ml RPMI medium (+ 10% FCS), the cells were washed extensively with medium, fixed, using antibodies against the C fragment of the tetanus toxin (1st : 100-1: 300; Charles River, Southbridge, USA) and a CY-2-labeled secondary antibody (goat anti-rabbit CY-2; Rockland, Gilbertsville, USA) detected the fusion protein. The result of the experiment can be seen in FIG . Very strong signals can be seen in almost all cells.

Claims

1. Conjugate for the introduction of active substances into neuronal cells, the The heavy chain of a toxin of the genus Clostridium and comprises at least one active ingredient, the light chain of the toxin is absent.

2. The conjugate of claim 1, wherein the toxin of the genus Clostridium Is tetanus toxin or botulinum toxin.

3. Conjugate according to claim 1 or 2, wherein the active ingredient is selected from (Poly) peptides, proteins, nucleic acids or chemical compounds.

4. Conjugate according to one of claims 1 to 3, wherein the active ingredient and the heavy chain of the toxin are linked by a linker.

5. The conjugate of claim 4, wherein the linker NHS-SS-biotin, NHS-imino is biotin or sulfo-LC-SPDP.

6. Conjugate according to one of claims 1 to 5, wherein the heavy chain of Toxins is a fusion protein.

7. The conjugate according to claim 6, wherein the fusion portion is a basic protein, preferably human HMG-1 protein.

8. A method for producing a conjugate according to any one of claims 1-7, the active ingredient, the heavy chain of a toxin of the genus Clostri um and possibly a linker can be implemented with each other.

9. Kit comprising one or more of the following components:

(a) the heavy chain of a toxin of the genus Clostridium
(b) usual auxiliaries, such as carriers, buffers, solvents, controls, etc.

10. Use of the conjugate according to one of claims 1-7 for enrichment tion in neuronal cells.

11. Use of the conjugate according to claim 10 for the treatment and / or Therapy of neuronal diseases.

12. Use of the conjugate according to claim 10 or 11 for gene therapy treatment of neuroblastoma tumors.