DE102004035606A1 - Carrier for drugs for obtaining oral bioavailability - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Proteinkomplex, bestehend aus mindestens einem Hämagglutinin, aus wenigstens einem der Clostridium botulinum Typen A, B, C, D, E, F oder G und einem Polypeptid-Hc-Konjugat, wobei das Polypeptid-Hc-Konjugat aus einem ausgewählten Polypeptid verbunden mit der schweren Kette oder dessen N-terminalem Fragment von Botulinumtoxin besteht.The present invention relates to a protein complex comprising at least one hemagglutinin, at least one of the Clostridium botulinum types A, B, C, D, E, F or G and a polypeptide-Hc conjugate, wherein the polypeptide-Hc conjugate from a selected polypeptide linked to the heavy chain or its N-terminal fragment of botulinum toxin.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Proteinkomplex bestehend aus mindestens einem Hämagglutinin aus wenigstens einem der Clostridium botulinum Typen A, B, C, D, E, F oder G und einem Polypeptid-Hc-Konjugat, wobei das Polypeptid-Hc-Konjugat aus einem ausgewählten Polypeptid verbunden mit der schweren Kette oder dessen N-terminalem Fragment von Botulinumtoxin besteht.The The present invention relates to a protein complex consisting of at least one hemagglutinin from at least one of the Clostridium botulinum types A, B, C, D, E, F or G and a polypeptide-Hc conjugate, wherein the polypeptide-Hc conjugate from a selected one Polypeptide linked to the heavy chain or its N-terminal fragment of botulinum toxin.
Eine Vielzahl von pharmazeutischen Wirkstoffen ist zwar hochaktiv, ihr therapeutischer Einsatz wird aber erheblich dadurch beeinträchtigt, dass diese Substanzen nicht oral sondern nur parenteral – also per Injektion – verabreicht werden können. Insbesondere die orale Verabreichung von Proteinwirkstoffen scheitert daran, dass diese Substanzen über den oralen Weg nicht an ihren Wirkort gelangen können. Die Proteine stoßen nach oraler Gabe auf zwei schwer überwindbare Hürden: die denaturierenden Bedingungen im Magen-Darm-Trakt führen zu einer Inaktivierung des Proteins, eine Vielzahl von Proteasen sorgt für den Abbau von Polypeptiden und selbst wenn ein Protein resistent gegen diese Bedingungen ist, vermag eine hochmolekulare Substanz nicht, die Barriere der Darmmucosa zu überwinden, um ins Blut überzutreten und an den Wirkort zu gelangen. Proteine werden im Magen bzw. im Dünndarm von Proteasen gespalten und die Spaltprodukte, Aminosäuren und Peptide, resorbiert oder ausgeschieden. Proteinarzneimittel sind somit oral verabreicht wirkungslos.A Variety of pharmaceutical agents is indeed highly active, you but therapeutic use is significantly affected by that these substances are not oral but only parenterally - ie per Injection - administered can be. In particular, the oral administration of protein drugs fails because of these substances over the oral route can not get to their site of action. The proteins follow oral administration to two difficult to overcome hurdles: the denaturing conditions in the gastrointestinal tract lead to Inactivation of the protein ensures a variety of proteases for the Degradation of polypeptides and even if a protein is resistant to these conditions is, a high molecular substance can not to overcome the barrier of the intestinal mucosa, to enter the blood and to get to the site of action. Proteins are in the stomach or in the small intestine cleaved by proteases and the cleavage products, amino acids and Peptides, resorbed or excreted. Protein drugs are thus orally administered ineffective.
Zahlreiche Anstrengungen wurden unternommen, um diesen Nachteil zu beseitigen und um Proteinwirkstoffe oral bioverfügbar zu machen. Einige Ansätze seien hier kurz erwähnt: Es wurde versucht, durch Mischungen von Proteaseinhibitoren den Wirkstoff vor dem proteolytischen Abbau zu schützen. So wurden gleichzeitig mit Proteinwirkstoff Proteaseinhibitoren wie Aprotinin, Bestatin, Puromycin, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor verabreicht, damit sollten der Abbau verhindert und der Proteinwirkstoff unbeschadet resorbierbar sein.numerous Efforts have been made to eliminate this disadvantage and to make protein drugs orally bioavailable. Some approaches are briefly mentioned here: Attempts have been made by mixtures of protease inhibitors the Protect drug from proteolytic degradation. So were at the same time with protein drug protease inhibitors such as aprotinin, bestatin, Puromycin, soybean trypsin inhibitor, should be administered with it the degradation prevented and the protein active ingredient without being absorbed absorbable be.
Es wurde ebenfalls versucht, durch Formulierungen den lokalen pH-Wert im Magen/Darm zu modulieren. Auch am Proteinwirkstoff selbst hat man angesetzt, um durch chemische Modifikation von Aminosäuren deren Stabilität gegen Abbau sowie die Resorbierbarkeit zu erhöhen. Letzteres wollte man durch Erhöhung der Lipophilie erreichen (z. B. durch Palmitoylierung). Als Beispiel sei hier die Kopplung von Insulin mit einem amphiphilen Oligomer genannt (Hexyl-Insulin monoconjugate der Fa. NOBEX Corporation). Ein weiterer Ansatz besteht darin, die Durchlässigkeit der Mukosa zu erhöhen, z. B. durch die Gabe von Chelatoren bzw. oberflächenaktiven Substanzen wie Natriumlaurylsulfat, Natriumdeoxycholat. Zu diesem Konzept gehört auch die gleichzeitige Verabreichung von konzentrierten niedermolekularen Trägermolekülen (z. B. 4-(4-2-hydroxybenzoyl)aminophenyl)Buttersäure). Ein weiterer Ansatz versucht, spezifische Transportmechanismen in der Darmwand auszunutzen. So gibt es für die Resorption von Vitamin B12 einen Transportmechanismus, der für Proteinwirkstoffe genutzt werden soll, indem die Wirkstoffe an Vitamin B12 gekoppelt werden. All diese unterschiedlichen Ansätze haben bisher noch nicht zu einem zugelassenen Proteinarzneimittel geführt, das oral bioverfügbar ist.It was also tried by formulations the local pH in the stomach / intestine to modulate. Also on the protein drug itself has one is set to by chemical modification of amino acids their stability to increase degradation and absorbability. The latter wanted to go through increase lipophilicity (eg, by palmitoylation). As an an example Here is the coupling of insulin with an amphiphilic oligomer called (hexyl insulin monoconjugate Fa. NOBEX Corporation). Another approach is to increase the permeability of the mucosa, eg. B. by the administration of chelators or surface-active substances such as Sodium lauryl sulfate, sodium deoxycholate. Also part of this concept the concurrent administration of concentrated low molecular weight Carrier molecules (e.g. B. 4- (4-2-hydroxybenzoyl) aminophenyl) butyric acid). Another approach tries to exploit specific transport mechanisms in the intestinal wall. So Is available for the absorption of vitamin B12 is a transport mechanism responsible for protein agents should be used by the active ingredients coupled to vitamin B12 become. All these different approaches have not yet led to an approved protein drug that is orally bioavailable.
Ein weiterer Ansatz zur Bereitstellung von oral bioverfügbaren Proteinen ist in WO 03/101484 beschrieben. Entsprechend der Beschreibung wird der C-terminale Rest der schweren Kette von Botulinumtoxin mit einem Polypeptid verbunden. Der C-terminale Rest könne den Transport durch die epithelialen Membranen bewerkstelligen. Für die orale Verabreichung des Hybridproteins kann dieses mit den natürlicherweise das Botulinumtoxin umgebenden Hilfsproteinen gemischt werden.One Another approach to providing orally bioavailable proteins is described in WO 03/101484. According to the description of the C-terminal residue of the botulinum toxin heavy chain with a Polypeptide connected. The C-terminal residue could transport through the accomplish epithelial membranes. For oral administration of the Hybrid protein can do this with the botulinum toxin naturally surrounding auxiliary proteins.
Ferner beschreibt die WO 02/05844 die Bereitstellung von oral bioverfügbaren Proteinen und niedermolekularen Pharmaka, die in einen Komplex aus mindestens einem Hämagglutinin und evtl. nicht-toxischem, nicht-hämagglutinierendem Protein (NTNH) der Botulinum-Toxin-Komplexe von Clostridium botulinum eingebaut sind. Der Einbau von Polypeptiden mit einem Molekulargewicht von <50 kDa erwies sich jedoch für eine gewinnbringende Vermarktung als nicht effektiv genug.Further WO 02/05844 describes the provision of orally bioavailable proteins and low molecular weight drugs that are in a complex of at least a hemagglutinin and possibly non-toxic, non-hemagglutinating protein (NTNH) the botulinum toxin complexes of Clostridium botulinum are incorporated. The incorporation of polypeptides with a molecular weight of <50 However, kDa proved for a profitable marketing as not effective enough.
Daher liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem Polypeptide oral bioverfügbar gemacht werden können.Therefore The present invention is based on the object, a means to provide orally bioavailable with the polypeptides can be.
Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.The The object is achieved by the subject matter defined in the claims solved.
Die nachfolgenden Abbildungen erläutern die Erfindung.The the following illustrations explain the Invention.
Der hier verwendete Begriff "Proteinkomplex" bezeichnet ein Vehikel, mit dem andere ausgewählte Polypeptide in das Blutsystem von Mensch und Tier transportiert werden können. Der Proteinkomplex besteht dabei aus wenigstens einem Hämagglutinin und evtl. nichttoxischem, nicht-hämagglutinierendem Protein (NTNH) der Botulinum-Toxin-Komplexe aus wenigstens einem der Clostridium botulinum Typen A, B, C, D, E, F oder G. Die Hämagglutinine und das NTNH stellen die in Clostridien vorkommenden Proteine dar, die natürlicherweise mit Botulinumtoxin den Botulinumtoxin-Komplex bilden. Der Deutlichkeit halber sei hier vermerkt, dass der Proteinkomplex jedoch kein Botulinumtoxin enthält.Of the As used herein, the term "protein complex" refers to a vehicle with the other one selected Polypeptides are transported into the blood system of humans and animals can be. The protein complex consists of at least one hemagglutinin and possibly non-toxic, non-hemagglutinating protein (NTNH) the botulinum toxin complex of at least one of Clostridium botulinum Types A, B, C, D, E, F or G. The hemagglutinins and the NTNH provide the proteins found in clostridia that are naturally occurring form the botulinum toxin complex with botulinum toxin. The clarity however, it should be noted that the protein complex is not a botulinum toxin contains.
Der hier verwendete Begriff "Botulinumtoxin-Komplex" bedeutet ein natürlicherweise vorkommendes Proteinaggregat des Typs A, B, C, D, E, F oder G aus Clostridium botulinum, umfassend das Botulinumtoxin, Hämagglutinine und nicht-toxisches, nicht-hämagglutinierendes Protein (NTNH).Of the As used herein, the term "botulinum toxin complex" means naturally occurring protein aggregate type A, B, C, D, E, F or G from Clostridium botulinum comprising botulinum toxin, hemagglutinins and non-toxic, non-hemagglutinating Protein (NTNH).
Der hier verwendete Begriff "Polypeptid" oder "ausgewähltes Polypeptid" bedeutet ein Peptid aus mindestens 2 Aminosäuren. Das Polypeptid kann linear, zirkulär oder verzweigt sein. Ferner kann das Polypeptid aus mehr als einer Aminosäurekette bestehen, wobei die Ketten z.B. über eine Disulfidbindung miteinander verbunden sein können. Die Polypeptide können ferner modifizierte Aminosäuren und die üblichen posttranslationalen Modifikationen wie Glykosylierung enthalten. Die Polypeptide können pharmakologisch oder immunologisch aktive Polypeptide oder für diagnostische Zwecke verwendete Polypeptide z.B. Antikörper sein.Of the As used herein, "polypeptide" or "selected polypeptide" means a peptide at least 2 amino acids. The polypeptide may be linear, circular or branched. Further For example, the polypeptide may consist of more than one amino acid chain, the Chains e.g. above a disulfide bond may be linked together. The Polypeptides can further modified amino acids and the usual post-translational modifications such as glycosylation. The polypeptides may be pharmacologically or immunologically active polypeptides or polypeptides used for diagnostic purposes e.g. antibody be.
Der hier verwendete Begriff „Carrier" oder „Träger" bezeichnet die gesamte schwere Kette (Hc) oder ein N-terminales Fragment der schweren Kette von Botulinumtoxin ausgewählt aus den Botulinumtoxin-Komplexen der Typen A, B, C, D, E, F oder G.Of the As used herein, "carrier" or "carrier" means the entire heavy chain (Hc) or an N-terminal fragment of the heavy chain of Botulinum toxin selected from botulinum toxin complexes of types A, B, C, D, E, F or G.
Der hier verwendete Begriff „Polypeptid-Hc-Konjugat", „Hc-Konjugat" oder „Konjugat" bezeichnet einen Carrier, der kovalent mit einem ausgewählten Polypeptid verbunden ist. Z.B. bezeichnet Insulin-Hc-Konjugat ein Molekül bestehend aus Insulin verbunden mit der schweren Kette oder dessen N-terminalem Fragment von Botulinumtoxin.Of the As used herein, "polypeptide-Hc conjugate", "Hc conjugate" or "conjugate" refers to one Carrier covalently linked to a selected polypeptide is. For example, Insulin-Hc conjugate is a molecule consisting from insulin linked to the heavy chain or its N-terminal Fragment of botulinum toxin.
Der hier verwendete Begriff "Neokomplex" bezeichnet einen Komplex aus Proteinkomplex in dem ein Hc-Konjugat integriert ist.Of the As used herein, "neocomplex" refers to a Complex of protein complex in which a Hc conjugate is integrated.
Das Bakterium Clostridium botulinum hat einen effizienten Mechanismus entwickelt, um ein Protein über den oralen Weg in einen Organismus zu schleusen, wo dieses Protein dann von seinen Zielzellen aufgenommen wird. Bei diesem Protein handelt es sich um die giftigste Substanz, die man bisher kennt: Clostridium botulinum Toxin, im nachfolgenden auch Botulinumtoxin genannt. Natürlicherweise liegt Botulinumtoxin in einem Botulinumtoxin-Komplex mit einer Reihe von weiteren von Clostridium botulinum exprimierten Proteinen vor. Wird der Botulinumtoxin-Komplex oral verabreicht, wird das hochmolekulare Nervengift Botulinumtoxin im Darm resorbiert und gelangt dann zur Zielzelle, dem Motorneuron an der motorischen Endplatte. An seinem Wirkort verhindert das Neurotoxin die Ausschüttung von Acetylcholin und führt damit zur Paralyse des jeweiligen Muskels.The Clostridium botulinum bacterium has an efficient mechanism designed to be a protein over to channel the oral route into an organism where this protein is then absorbed by its target cells. With this protein it is the most toxic substance known so far: Clostridium botulinum toxin, subsequently also botulinum toxin called. Naturally lies Botulinum toxin in a botulinum toxin complex with a number of others of Clostridium botulinum expressed proteins. Will the botulinum toxin complex administered orally, the high molecular nerve drug botulinum toxin absorbed in the intestine and then reaches the target cell, the motor neuron at the motor end plate. At its site of action prevents the neurotoxin the payout of acetylcholine and leads thus paralysis of the respective muscle.
Clostridium botulinum wird in 7 Serogruppen eingeteilt, die aufgrund ihrer Toxine unterschieden werden: Typ A, B, C, D, E, F, G. Bei den Toxinen handelt es sich um Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 150.000 Dalton (Da). Der Botulinumtoxin-Komplex wird üblicherweise mit kontaminierten Lebensmitteln aufgenommen, enteral resorbiert und gelangt zu seinem Wirkort, der motorischen Endplatte.Clostridium botulinum is divided into 7 serogroups, due to their toxins be distinguished: type A, B, C, D, E, F, G. When the toxins act these are proteins with a molecular weight of about 150,000 Dalton (Da). The botulinum toxin complex is usually contaminated with food absorbed, enterally absorbed and reaches its site of action, the motor end plate.
Das Botulinumtoxin besteht aus zwei Untereinheiten. Die beiden Untereinheiten haben eine unterschiedliche Funktion: die schwere Kette (Molekulargewicht 100 kDa) bindet hochspezifisch an die Nervenzelle und ermöglicht später die Translokation der leichten Kette in das Cytoplasma der Zelle. Die schwere Kette (Hc) ist im nativen Botulinumtoxin über eine Disulfidbrücke mit der leichten Kette (Lc) verknüpft ist. Die leichte Kette dient als Protease, die Proteine (SNARE-Proteine) schneidet, die für die Fusion von sekretorischen Vesikeln mit der Nervenzellmembran verantwortlich sind. Die sekretorischen Vesikel können somit kein Acetylcholin ausschütten: die Aktivierung des Muskels ist blockiert.The Botulinum toxin consists of two subunits. The two subunits have a different function: the heavy chain (molecular weight 100 kDa) binds to the nerve cell in a highly specific manner and later enables the Translocation of the light chain into the cytoplasm of the cell. The heavy one Chain (Hc) is in native botulinum toxin via a disulfide bridge with linked to the light chain (Lc) is. The light chain serves as a protease that cuts proteins (SNARE proteins), the for the fusion of secretory vesicles with the nerve cell membrane are responsible. The secretory vesicles can thus do not dispense acetylcholine: the activation of the muscle is blocked.
Die beiden Ketten entstehen aus dem ursprünglich synthetisierten Polypeptid durch proteolytische Spaltung. Bei einigen Clostridientypen erfolgt die Spaltung bereits durch Clostridien-eigene Proteasen (Typ A, C, teilweise B), während bei anderen Typen die Spaltung erst im Verdauungstrakt (Trypsin) oder Gewebe des Rezipienten abläuft. Die schwere Kette in isolierter Form und ohne Verunreinigung von leichter Kette oder Gesamttoxin ist völlig untoxisch, sie allein vermag in Nervenzellen die Ausschüttung von Acetylcholin nicht zu blockieren.The both chains arise from the originally synthesized polypeptide by proteolytic cleavage. For some types of clostridium, the Cleavage already by clostridia-own proteases (type A, C, partial B) while in other types, the cleavage only in the digestive tract (trypsin) or Tissue of the recipient expires. The heavy chain in insulated form and without contamination of lighter Chain or total toxin is completely Noxious, it alone is able to release the secretion of nerve cells Do not block acetylcholine.
Die Clostridien synthetisieren eine Reihe von weiteren Proteinen, die mit dem Botulinumtoxin einen Komplex (Botulinumtoxin-Komplex) bilden, der im sauren Milieu stabil ist und das Neurotoxin vor Denaturierung und proteolytischem Abbau schützt und außerdem die Aufnahme durch die Darmmukosa ermöglicht.The clostridia synthesize a number of other proteins that interact with the botulinum toxin Complex (botulinum toxin complex), which is stable in an acidic environment and protects the neurotoxin from denaturation and proteolytic degradation and also allows uptake by the intestinal mucosa.
Bei den weiteren Proteinen, die im nachfolgenden Komplexproteine genannt werden, handelt es sich um eine Reihe von Hämagglutininen und einem nicht-toxischen, nicht-hämagglutinierenden Protein (NTNH), das ein Molekulargewicht von etwa 120.000 Da aufweist. Die weiteren Proteine bilden den Proteinkomplex. Bei dem Botulinumtoxin-Komplex des Typ A wurden folgende Hämagglutinine beschrieben: Ha2 mit etwa 16.900 Da, Ha3a mit etwa 21.000 Da, Ha3b mit etwa 52.000 Da und Ha1 mit etwa 35.000 Da.at the other proteins, called in the following complex proteins are a series of hemagglutinins and a non-toxic, non-haemagglutinating Protein (NTNH), which has a molecular weight of about 120,000 Da. The other proteins form the protein complex. In the botulinum toxin complex of type A were the following hemagglutinins described: Ha2 with about 16,900 Da, Ha3a with about 21,000 Da, Ha3b with about 52,000 Da and Ha1 with about 35,000 Da.
Die Botulinumtoxin-Komplexe der Typen B bis G sind nach einem ähnlichem Schema aufgebaut. Als Beispiel seien genannt der Botulinumtoxin-Komlex von Typ B. Neben dem NTNH sind hier HA-70 mit einem Molekulargewicht von etwa 70.000 Da, Ha-17 mit einem Molekulargewicht von etwa 17.000 Da und Ha-33 mit einem Molekulargwicht von etwa 33.000 Da beschrieben (vgl. Bhandari, M. et al. (1997) Current Microbiology 35, pp. 207 – 214).The Botulinum toxin complexes of types B to G are similar Scheme constructed. An example is the botulinum toxin complex of type B. Besides the NTNH here are HA-70 with a molecular weight of about 70,000 Da, Ha-17 with a molecular weight of about 17,000 Da and Ha-33 are described with a molecular weight of about 33,000 Da (Bhandari, M. et al., (1997) Current Microbiology 35, pp. 207-214).
Ferner beschrieben East, A.K.et al. ((1994) System Appl. Microbiol. 17 306-312) die Sequenz von Ha-33 von Typ B im Vergleich mit der Sequenz von Typ A und C. Für die Typ C und Typ D sind neben den Ha 33 (= Ha1) ebenfalls – analog Typ A – ein Ha3b mit einem Molekulargewicht von etwa 33.000 Da auch das Ha3b mit etwa 53.000 Da und Ha3a mit etwa 22-24.000 Da und Ha2 mit etwa 17.000 Da (vgl. Inoue, K. et al. (1999) Microbiology 145, pp. 2533 – 2542).Further described East, A.K. et al. ((1994) System Appl. Microbiol. 17 306-312) compared the sequence of Ha-33 of type B with the sequence of Type A and C. For the type C and type D are in addition to the Ha 33 (= Ha1) also - analog Type A - a Ha3b with a molecular weight of about 33,000 Da also the Ha3b with about 53,000 Da and Ha3a with about 22-24,000 Da and Ha2 with about 17,000 Da (see Inoue, K. et al. (1999) Microbiology 145, pp. 2533-2542).
Überraschenderweise fanden die Erfinder in Rekonstitutionsexperimenten heraus, dass nur die schwere Kette des Botulinumtoxins, also ohne die leichte Kette, alleine oder an ein Polypeptid gekoppelt, quantitativ in den Proteinkomplex eingebaut wird.Surprisingly The inventors found out in reconstitution experiments that only the botulinum toxin heavy chain, so without the light chain Chain, alone or coupled to a polypeptide, quantitatively in the protein complex is incorporated.
Das Polypeptid kann an die schwere Kette eines Botulinumtoxins chemisch gekoppelt und so in einen Proteinkomplex bestehend aus mindestens einem Komplexprotein integriert werden. Zur Kopplung des Proteins an die schwere Kette ist eine Vielzahl von chemischen Methoden verfügbar. Es gibt ein breites Spektrum von bifunktionellen Reagentien, die eine Verknüpfung von zwei verschiedenen Proteinen ermöglichen. Bevorzugt werden Reagentien eingesetzt, die eine Disulfidbrücke mit einem Cystein des Kopplungspartners knüpfen. Im nächsten Schritt kann dann die Bindung mit dem Carrier, der schweren Kette, erfolgen. Geeignet für derartige Kopplung sind zum Beispiel Reagentien wie SPDP (N-Succinimidy 3-[2-Pyridyldithio]propionat) oder DTDP (4,4' Dithiodipyridine), bei dem lediglich eine Disulfidbrücke ohne einen Spacer zwischen den Proteinen geknüpft wird. Diese Verknüpfung hat den Vorteil, dass sie in vivo unter reduzierenden Bedingungen z.B. im Cytoplasma über das Thioredoxinsystem gespalten werden kann. Die Kopplung wird dabei so gewählt, dass der Einbau der schweren Kette in den Proteinkomplex nicht beeinträchtigt wird und die biologische Aktivität des Polypeptids erhalten bleibt. Alternativ kann die Verbindung der schweren Kette mit dem Polypeptid dadurch erreicht werden, dass beide Peptide als rekombinantes Fusionsprotein in einem geeigneten Expressionssystem synthetisiert werden.The Polypeptide can chemically bind to the heavy chain of a botulinum toxin coupled and so in a protein complex consisting of at least integrated into a complex protein. To couple the protein to the heavy chain a variety of chemical methods are available. It There is a wide range of bifunctional reagents that one shortcut of two different proteins. Preference is given to reagents used a disulfide bridge with a cysteine of the tying partner knot. In the next step, then the Binding with the carrier, the heavy chain, done. Suitable for such Coupling are, for example, reagents such as SPDP (N-succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] propionate) or DTDP (4,4'-dithiodipyridine), in which only a disulfide bridge without a spacer between linked to the proteins becomes. This link has the advantage of being in vivo under reducing conditions e.g. in the cytoplasm over the thioredoxin system can be cleaved. The coupling will be there chosen so that the incorporation of the heavy chain into the protein complex is not impaired and the biological activity the polypeptide is retained. Alternatively, the connection the heavy chain with the polypeptide can be achieved by Both peptides as a recombinant fusion protein in a suitable Expression system can be synthesized.
Die mit dem Carrier verbundenen Polypeptide sind vorzugsweise pharmakologisch oder immunologisch aktiven Polypeptide, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Proteinkomplexes oral verabreicht werden, die therapeutisch oder präventiv wirksamen sein können. Die ausgewählten Polypeptide können z.B. Hormone, Cytokine, Enzyme, Wachstumsfaktoren, Antigene, Antikörper, Inhibitoren, Rezeptor-Agonisten oder -Antagonisten oder Gerinnungsfaktoren sein. Dabei spielt es keine Rolle, ob die Polypeptide rekombinant hergestellt oder aus ihren natürlichen Quellen isoliert wurden. Bevorzugte Polypeptide sind Insulin, Erythropoetin, Interferone, Interleukine, HIV-Protease-Inhibitoren, GM-CSF(Granulocyte/Makrophage-stimulating factor), NGF (Nerve growth factor), PDGF (Platelet derived growth factor), FGF (fibroblast growth factor), Plasminogen-Aktivatoren, z.B. TPA (Tissue Plasminogen Activator), Renin-Inhibitoren, humaner Wachstumsfaktor, IGF (Insulinlike Growth Factor), Impfstoffe wie z.B. Tetanus-Vaccin, Hepatitis B Vaccin, Diphterie-Vaccin, Antikörper z.B. Herceptin (Antikörper gegen Her2), Antikörper gegen TNF (Tumor Necrose Factor), Antikörper gegen EGF-Receptor, Antikörper gegen VEGF, Antikörper gegen IgE, Antikörper gegen CD 11a, Calcitonin, Urokinase, Streptokinase, Angiogenese-Inhibitoren, Faktor VIII, Factor Xa-Antagonisten, Metalloproteinase-Inhibitoren.The polypeptides associated with the carrier are preferably pharmacological or immunologically active polypeptides obtained by means of the protein complex according to the invention be administered orally, which may be therapeutically or preventively effective can. The selected ones Polypeptides can e.g. Hormones, cytokines, enzymes, growth factors, antigens, antibodies, inhibitors, Receptor agonists or antagonists or coagulation factors. It does not matter whether the polypeptides are recombinantly produced or from their natural sources were isolated. Preferred polypeptides are insulin, erythropoietin, Interferons, interleukins, HIV protease inhibitors, GM-CSF (granulocyte / macrophage-stimulating factor), NGF (Nerve Growth Factor), PDGF (Platelet derived growth factor), FGF (fibroblast growth factor), plasminogen activators, e.g. TPA (tissue plasminogen activator), renin inhibitors, human Growth factor, IGF (insulinlike growth factor), vaccines like e.g. Tetanus vaccine, hepatitis B vaccine, diphtheria vaccine, antibodies e.g. Herceptin (Antibody against Her2), antibodies against TNF (tumor necrosis factor), antibodies against EGF receptor, antibodies against VEGF, antibodies against IgE, antibodies against CD11a, calcitonin, urokinase, streptokinase, angiogenesis inhibitors, factor VIII, Factor Xa antagonists, metalloproteinase inhibitors.
Die für diagnostische Zwecke verwendeten Polypeptide können z.B. Antikörper oder Liganden sein, wobei die Polypeptide mit einer Markierung versehen sein können. Als Markierung kommt jede Markierung in Frage, die im Körper des Menschen oder Tieres nachgewiesen werden kann. Bevorzugte Markierungen sind Isotope, z.B. C13, oder radioaktive Markierungen. Die markierten Antikörper können zum Nachweis von Tumoren, die markierten Liganden zum Nachweis von z.B. pathologischen Rezeptoren verwendet werden.The polypeptides used for diagnostic purposes may be, for example, antibodies or ligands, which polypeptides may be labeled. As a marker is any mark in question, which can be detected in the body of the human or animal. Preferred labels are isotopes, for example C 13 , or radioactive labels. The labeled antibodies can be used for the detection of tumors, the labeled ligands for the detection of eg pathological receptors.
Der mit dem Polypeptid verbundene Carrier wird in den Proteinkomplex eingebaut. Der Proteinkomplex ist aufgebaut aus mindestens einem Hämagglutinin und falls erwünscht mindestens einem NTNH. Die Hämagglutinine und die NTNH sind dabei ausgewählt aus den natürlicherweise vorkommenden Botulinumtoxin-Komplexen der Typen A, B, C, D, E, F oder G von Clostridium botulinum. Der Proteinkomplex kann jedoch auch eine andere als seine natürliche Zusammensetzung enthalten, z.B. kann er nur aus Hämagglutinin ohne die NTNH-Proteine aufgebaut sein. Ferner kann der Proteinkomplex aus weniger Hämagglutininarten als der natürlicherweise vorkommende Botulinumtoxin-Komplex aufgebaut sein, vorzugsweise aus drei verschiedenen Hämagglutininarten, vorzugsweise aus zwei, insbesondere bevorzugt aus einer Hämagglutininart, wobei der Proteinkomplex jeweils das NTNH-Protein enthalten kann oder nicht. Der Proteinkomplex kann ferner aus einem Gemisch eines oder mehrerer Hämagglutininarten und/oder NTNH-Proteinen der verschiedenen Serotypen aufgebaut sein.The carrier linked to the polypeptide is incorporated into the protein complex. The protein complex is composed of at least one hemagglutinin and, if desired, at least one NT NH. The hemagglutinins and the NTNH are selected from the naturally occurring botulinum toxin complexes of types A, B, C, D, E, F or G of Clostridium botulinum. However, the protein complex can also contain other than its natural composition, eg it can only be composed of hemagglutinin without the NTNH proteins. Further, the protein complex may be composed of less hemagglutinin species than the naturally occurring botulinum toxin complex, preferably of three different types of hemagglutinins, preferably two, more preferably one hemagglutinin type, which protein complex may or may not each contain the NTNH protein. The protein complex may also be composed of a mixture of one or more types of hemagglutinin and / or NTNH proteins of the various serotypes.
Bevorzugt sind Proteinkomplexe, die den natürlicherweise vorkommenden Proteinkomplexen (ohne Botulinumtoxin) aus Clostridium botulinum der Typen A, B, C, D, E, F oder G entsprechen, beispielsweise ein Proteinkomplex mit Ha1, Ha2, Ha3a, Ha3b und NTNH von Clostridium botulinum Typ B. Der Proteinkomplex kann außerdem zusammengesetzt sein aus Ha1, Ha2, Ha3a und NTNH, aus Ha1, Ha2, Na3b und NTNH, sowie aus Ha1 und Ha3a, Ha3b und NTNH, des weiteren aus Ha2, Ha3a, Ha3b und NTNH, aus Ha1, Ha2 und NTNH, aus Ha1, Ha3a und NTNH, aus Ha1, Ha3b und NTNH, aus Ha2, Ha3a und NTNH, aus Ha2, Ha3b und NTNH aus Ha3a, Ha3b und NTNH oder aus weiteren beliebigen Kombinationen der aufgeführten Komplexproteine. Der Proteinkomplex kann sich ferner zusammensetzen aus einem der Hämagglutinine und NTNH, außerdem kann sich der Proteinkomplex zusammensetzen aus den aufgeführten Kombinationen der Hämagglutinine ohne NTNH. Entsprechend der beispielhaften Proteinkomplexe des Typs B sind ferner bevorzugt Proteinkomplexe aus den Hämagglutininen und/oder NTNH der Typen A, C, D, E, F oder G.Prefers are protein complexes that are naturally occurring protein complexes (without Botulinum toxin) from Clostridium botulinum types A, B, C, D, E, F or G correspond, for example a protein complex with Ha1, Ha2, Ha3a, Ha3b and NTNH of Clostridium botulinum type B. The protein complex can also be composed of Ha1, Ha2, Ha3a and NTNH, from Ha1, Ha2, Na3b and NTNH, as well as Ha1 and Ha3a, Ha3b and NTNH, further from Ha2, Ha3a, Ha3b and NTNH, from Ha1, Ha2 and NTNH, from Ha1, Ha3a and NTNH, from Ha1, Ha3b and NTNH, from Ha2, Ha3a and NTNH, from Ha2, Ha3b and NTNH from Ha3a, Ha3b and NTNH or from any other Combinations of listed Complex proteins. The protein complex can also be composed from one of the hemagglutinins and NTNH, as well The protein complex may be composed of the listed combinations hemagglutinins without NTNH. According to the exemplary protein complexes of the type B are further preferred protein complexes from the hemagglutinins and / or NTNH types A, C, D, E, F or G.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung des erfindungsgemäßen Proteinkomplexes, umfassend die folgenden Schritte: a) getrennte Isolierung von wenigstens einem Botulinumtoxin-Komplex des Typ A, B, C, D, E, F oder G aus Clostridium botulinum bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 2,0 bis etwa 6,5, b) Erhöhen des pH-Wertes auf einen Wert im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 10,0, c) Abtrennen des jeweiligen Botulinumtoxins von den Komplexproteinen mittels chromatographischer Verfahren, d) Mischen der in Schritt c) erhaltenen Komplexproteine mit einem ausgewählten Polypeptid-Hc-Konjugat, oder e) Auftrennen der in Schritt c) erhaltenen Komplexproteine und Mischen wenigstens eines Komplexproteins mit einem Polypeptid-Hc-Konjugat, f) Dialysieren des Gemisches aus Schritt d) oder e) gegen einen Puffer bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 6,5 bis etwa 2,0, vorzugsweise im Bereich von etwa 4,0 bis etwa 6,0, insbesondere bevorzugt bei 6,0.One Another aspect of the present invention is the provision a method for producing the protein complex according to the invention, comprising the following steps: a) separate isolation of at least a botulinum toxin complex of the type A, B, C, D, E, F or G from Clostridium botulinum at a pH in the range of about 2.0 to about 6.5, b) Increase of the pH to a value in the range of about 7.0 to about 10.0, c) Separating the respective botulinum toxin from the complex proteins by means of chromatographic methods, d) mixing the in step c) complex proteins obtained with a selected polypeptide-Hc conjugate, or e) separating the complex proteins obtained in step c) and mixing at least one complex protein with a polypeptide-Hc conjugate, f) dialyzing the mixture from step d) or e) against a Buffer at a pH in the range of about 6.5 to about 2.0, preferably in the range of about 4.0 to about 6.0, more preferably at 6.0.
Die Komplexproteine können aus den natürlichen Botulinumtoxin-Komplexen isoliert werden. Ein beispielhaftes Verfahren zur Isolierung ist das Folgende: Zunächst wird der Botulinumtoxin-Komplex aus Clostridien bei saurem pH-Wert, vorzugsweise bei einem Wert im Bereich von etwa 2,0 bis etwa 6,5, besonders bevorzugt im Bereich von etwa 4,0 bis etwa 6,5, insbesondere bevorzugt bei pH 6,0, isoliert. Nach Erhöhung des pH-Werts auf einen Wert im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 10,0, vorzugsweise auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 8,0 wird das Botulinumtoxin über in der Proteinchemie übliche chromatographische Verfahren abgetrennt. Dieses Verfahren ist durchführbar, da der Komplex bei einem pH-Wert < 6,5 stabil ist, bei neutralen bzw. bei alkalischem pH-Wert zerfällt und das Toxin freigesetzt wird. Die Toxin-freien Komplexproteine können dann mit einem Polypeptid-Hc-Konjugat versetzt werden und der pH-Wert durch Dialyse gegen einen in der Proteinchemie üblichen Puffer, insbesondere bevorzugt einen Phosphat-, Acetat- oder Citratpuffer auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 2,0 bis etwa 6,5, vorzugsweise im Bereich von etwa 4,0 bis etwa 6,0, insbesondere bevorzugt auf pH 6,0 reduziert werden. Dabei wird ein Proteinkomplex gebildet, der das Polypeptid-Hc-Konjugat enthält und so die orale Bioverfügbarkeit des ausgewählten Polypeptids gewährleistet.The Complex proteins can from the natural Botulinum toxin complexes are isolated. An exemplary process for isolation is the following: First, the botulinum toxin complex of clostridia at acidic pH, preferably at a value in the range of about 2.0 to about 6.5, more preferably in the range of about 4.0 to about 6.5, especially preferably at pH 6.0 isolated. After increasing the pH to a value in the range of about 7.0 to about 10.0, preferably to a pH in the range of about 7.0 to about 8.0 becomes Botulinum toxin over common in protein chemistry separated chromatographic process. This method is feasible since the complex at a pH <6.5 is stable, decays at neutral or at alkaline pH and the toxin is released. The toxin-free complex proteins can then be added with a polypeptide-Hc conjugate and the pH by dialysis against a buffer customary in protein chemistry, especially preferred a phosphate, acetate or citrate buffer to a pH in Range from about 2.0 to about 6.5, preferably in the range of about 4.0 to about 6.0, particularly preferably reduced to pH 6.0. In the process, a protein complex is formed which contains the polypeptide-Hc conjugate contains and so the oral bioavailability of the selected Polypeptide ensures.
Andere in der Proteinchemie übliche chromatographische Verfahren, Konzentrierungsverfahren und Fällungen können für die Isolierung der Komplexproteine ebenfalls verwendet werden.Other common in protein chemistry chromatographic methods, concentration methods and precipitations can for the Isolation of complex proteins can also be used.
Die Komplexproteine können aufgrund ihrer bekannten DNA-Sequenzen auch rekombinant mittels DNA-Rekombinationstechniken in speziellen Wirtsorganismen hergestellt werden. Die so hergestellten Komplexproteine können ferner Modifikationen aufweisen, d.h. sie können Derivate der Komplexproteine sein. Modifikationen bedeuten dabei nicht nur Deletionen, Additionen, Insertionen oder Substitutionen sondern ferner auch chemische Modifikationen von Aminosäuren, z.B. Methylierungen, oder Acethylierungen, sowie posttranslationale Modifikationen, z.B. Glykosylierungen oder Phosphorylierungen. Die Expression von gewünschten Proteinen in verschiedenen Wirten ist Wissen des Durchschnittsfachmanns und muß hier nicht gesondert beschrieben werden. Dabei können die für den Proteinkomplex benötigten Komplexproteine gesondert oder auch gleichzeitig in einem Wirtsorganismus exprimiert werden. Bevorzugt ist die Herstellung der rekombinanten Komplexproteine in Bakterien, z.B. in E. coli, Bacillus subtilis oder Clostridium difficile, oder in eukaryotischen Zellen, z.B. in CHO-Zellen, in Insektenzellen, z.B. unter Verwendung des Baculovirus-Systems, oder in Hefezellen. Die Komplexproteine können isoliert werden und nach dem wie vorstehend beschriebenen Verfahren mit dem ausgewählten Polypeptid-Konjugat versetzt werden. Ferner kann das ausgewählten Polypeptid-HC-Konjugat als Fusionsprotein zusammen mit den Komplexproteinen gleichzeitig in dem Wirtsorganismus exprimiert werden. Besonders bevorzugt ist die gleichzeitige oder getrennte Herstellung der jeweiligen Komplexproteine zusammen mit dem ausgewählten Polypeptid-Hc-Konjugat über ein YAC in Hefe.Due to their known DNA sequences, the complex proteins can also be produced recombinantly by means of recombinant DNA techniques in special host organisms. The complex proteins thus produced may also have modifications, ie they may be derivatives of complex proteins. Modifications here mean not only deletions, additions, insertions or substitutions but also also chemical modifications of amino acids, eg methylations, or acetylations, as well as post-translational modifications, eg glycosylations or phosphorylations. The expression of desired proteins in different hosts is well known to those of ordinary skill in the art and need not be described separately here. In this case, the complex proteins required for the protein complex can be expressed separately or simultaneously in a host organism. Preference is given to the production of the recombinant complex proteins in bacteria, for example in E. coli, Bacillus subtilis or Clostridium difficile, or in eukaryotic cells, eg in CHO cells, in insect cells, eg using the baculovirus system, or in yeast cells. The complex proteins can be isolated and spiked with the selected polypeptide conjugate according to the procedure described above. Furthermore, the selected polypeptide HC conjugate may be expressed as a fusion protein together with the complex proteins in the host organism simultaneously. Particularly preferred is the simultaneous or separate production of the respective complex proteins together with the selected polypeptide-Hc conjugate via a YAC in yeast.
Die erfindungsgemäßen Proteinkomplexe können ferner aus einer Mischung von rekombinant hergestellten und aus natürlichen Botulinumtoxin-Komplexen isolierten Komplexproteinen zusammengesetzt sein.The Protein complexes according to the invention can furthermore from a mixture of recombinantly produced and from natural Botulinum toxin complexes composed of isolated complex proteins be.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sind nicht als einschränkend aufzufassen.The explain the following examples the invention and are not to be construed as limiting.
Beispiel 1: Isolierung der schweren Kette von Clostridium botulinum Toxin Typ AExample 1: Isolation the heavy chain of Clostridium botulinum toxin type A.
Clostridium botulinum Toxin Typ A (strain ATCC 3502) wurde nach publizierten Verfahren mit den nachfolgend aufgeführten Abänderungen kultiviert (vgl. Das Gupta & Sathyamoorthy, 1984, Toxicon 22, pp. 415 – 424). Nach 72 h Wachstum wurde das Toxin durch Zugabe von 3 N Schwefelsäure gefällt. Nach Extraktion des Präzipitats und Abtrennung von Nukleinsäuren wurde das Toxin mittels Ammoniumsulfat gefällt. Nach Solubilisation und Dialyse erfolgte eine DEAE-Sepharose-Chromatographie (2,6×15 cm) bei pH 6.0. Das gebundene Toxin wurde mit 150 mM NaCl eluiert, gegen 50 mM Tris/HCl dialysiert und einer weiteren Ionaustauscher-Chromatographie über eine Sepharose Q-Säule (2.6×10.0 cm) unterzogen. Das Neurotoxin wurde mit einem NaCl-Gradienten (0-300 mM NaCl) eluiert. Die Neurotoxin-haltigen Fraktionen wurden vereinigt und gegen 10 mM NaPhosphat pH 7.0 dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Sepharose S-Säule (1,6×11 cm) aufgetragen und mit deinem NaCl-Gradienten (0-300 mM NaCl) eluiert. Die Chromatographie lieferte das hochreine Neurotoxin.Clostridium botulinum toxin type A (strain ATCC 3502) was published after Process with the modifications listed below cultivated (see. The Gupta & Sathyamoorthy, 1984, Toxicon 22, pp. 415 - 424). After 72 hours of growth, the toxin was precipitated by adding 3N sulfuric acid. To Extraction of the precipitate and separation of nucleic acids the toxin was precipitated by ammonium sulfate. After solubilization and Dialysis was carried out by DEAE-Sepharose chromatography (2.6 × 15 cm). at pH 6.0. The bound toxin was eluted with 150 mM NaCl, against Dialyzed 50 mM Tris / HCl and another ion exchange chromatography on a Sepharose Q-pillar (2.6 × 10.0 cm). The neurotoxin was incubated with a NaCl gradient (0-300 mM NaCl) eluted. The neurotoxin-containing fractions were pooled and dialysed against 10 mM NaPhosphate pH 7.0. The dialysate was on a Sepharose S-pillar (1.6 x 11 cm) and eluted with your NaCl gradient (0-300 mM NaCl). Chromatography yielded the high purity neurotoxin.
Die Isolierung der schweren Kette aus dem Neurotoxin erfolgte analog der publizierten Literatur mit den nachfolgend aufgeführten Abänderungen (vgl. Kozaki et al., 1981, J. Med Sci Biol 34, pp. 61 – 68). Dazu wurde das hochreine Neurotoxin Typ A gegen Borat/Phosphatpuffer pH 8.5 dialysiert und auf einer Säule (1 × 5 cm) gefüllt mit QAE-Sephadex gebunden. Nach dem Waschen mit dem Borat/Phosphatpuffer, der zusätzlich 10 mM DTE enthielt, wurde die Säule über Nacht mit 3 mL Borat/Phosphatpuffer inkubiert, der zusätzlich 150 mM DTE und 2 M Harnstoff enthielt. Nach der darauffolgenden Elution der leichten Kette mit dem Borat/Phosphatpuffer + 10 mM DTE + 2 N Harnstoff wurde die schwere Kette mit demselben Puffer versetzt mit 200 mM NaCl eluiert. Zur Abtrennung von Resten vom unvollständig abgetrennten aktiven Neurotoxin wurden die gepoolten Fraktionen viermal über eine Affinitätssäule gepumpt. Die Affinitätssäule war gefüllt mit Sepharose, an die ein Antikörper gegen die leichte Kette von Clostridium botulinum Toxin Typ A gekoppelt war. Nach dieser Chromatographie war eine schwere Kette verfügbar, die keine Verunreinigungen von leichter Kette oder nativem Toxin enthielt. Selbst in hohen Konzentrationen zeigte sich im Aktivitätstest (Maus-Zwerchfell-Assay) keine Aktivität.The Isolation of the heavy chain from the neurotoxin was analogous the published literature with the following amendments (cf. Kozaki et al., 1981, J. Med. Sci Biol. 34, pp. 61-68). This was the high purity Neurotoxin type A dialyzed against borate / phosphate buffer pH 8.5 and on a pillar (1 × 5 cm) filled bound with QAE-Sephadex. After washing with the borate / phosphate buffer, the additional 10 mM DTE, the column became overnight incubated with 3 mL borate / phosphate buffer containing 150 mM DTE and 2 M urea contained. After the subsequent elution of the light chain with the borate / phosphate buffer + 10mM DTE + 2N urea became the heavy Chain eluted with the same buffer and 200 mM NaCl. to Separation of residues from incompletely separated active neurotoxin The pooled fractions were pumped four times over an affinity column. The Affinity column was filled with Sepharose, to which an antibody coupled to the light chain of Clostridium botulinum toxin type A. was. After this chromatography, a heavy chain was available which contained no contaminants from light chain or native toxin. Even in high concentrations the activity test (mouse diaphragmatic assay) showed no activity.
Beispiel 2: Präparation der Komplexproteine von Clostridium botulinum Typ BExample 2: Preparation the complex proteins of Clostridium botulinum type B
Die Komplexproteine von Clostridium botulinum Typ B werden nach Fermentation von Clostridium botulinum Typ B (Stamm-Okra) nach publiziertem Verfahren isoliert (vgl. Evans et al., 1986; European Journal of Bioch. 154, 409-416), wobei einige Schritte modifiziert wurden: Wie in Beispiel 1 wurden nach Extraktion der säuregefällten Biomasse die Nukleinsäuren aus dem Extrakt gefällt und der toxische Botulinumtoxin-Komplex aus dem Überstand mit Ammoniumsulfat präzipitiert. Der Niederschlag wurde in 0.05 M Natriumcitrat + 1 mM EDTA pH 5.5 aufgenommen und nach Dialyse über eine DEAE-Sephadex-Chromatographie gereinigt, wobei der hochmolekulare Komplex auf der Säule (5×12 cm) nicht gebunden wurde und quantitativ durch die Säule lief. Das komplexhaltige Eluat wurde nach einer Dialyse gegen 50 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA pH 7.9 über eine Sepharose Q-Säule chromatographiert, wobei die Komplexproteine auf der Säule nicht gebunden wurden während das Neurotoxin auf der Säule gebunden blieb und erst mit einem Salzgradienten eluiert wurde. Eine weitere Reinigung der Komplexproteine erfolgte auf einer Q Hyper D-Säule (2,6×13 cm), die mit dem gleichen Puffer (50 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA) equilibriert war. Der toxinfreie Proteinkomplex wurde mit einem Natriumchlorid-Gradienten (0 – 300 mM NaCl) eluiert.The Complex proteins of Clostridium botulinum type B are obtained after fermentation of Clostridium botulinum type B (strain okra) according to published method isolated (see Evans et al., 1986, European Journal of Bioch. 409-416), with some steps modified: as in example 1 were after extraction of the acid precipitated biomass the nucleic acids from the extract like and the toxic botulinum toxin complex from the supernatant with ammonium sulfate precipitated. The precipitate was dissolved in 0.05 M sodium citrate + 1 mM EDTA pH 5.5 taken up and after dialysis over a DEAE Sephadex chromatography, the high molecular weight Complex on the pillar (5 x 12 cm) was not bound and passed quantitatively through the column. The complex-containing eluate was after dialysis against 50 mM Tris / HCl, 1 mM EDTA pH 7.9 a Sepharose Q-pillar chromatographed, with the complex proteins not on the column were tied during the neurotoxin on the column remained bound and eluted first with a salt gradient. Further purification of the complex proteins took place on a Q Hyper D-pillar (2.6 x 13 cm) equilibrated with the same buffer (50 mM Tris / HCl, 1 mM EDTA) was. The toxin-free protein complex was treated with a sodium chloride gradient (0 - 300 mM NaCl) eluted.
Letzte Spuren von Neurotoxin wurden mittels Affinitätschromatographie entfernt. Dazu wurde die komplexhaltige Lösung viermal über eine Säule gepumpt, die als Affinitätsmatrix eine mit einem Antikörper (IgG-Fraktion) gegen Botulinum Neurotoxin Typ B gekoppelte Sepharose enthielt. Im Aktivitätstest (Maus-Hämidiaphragma-Assay) war anschließend keine biologische Aktivität (Toxizität) mehr nachweisbar.Latest Traces of neurotoxin were removed by affinity chromatography. This was the complex solution four times over a column pumped that as an affinity matrix one with an antibody (IgG fraction) against botulinum neurotoxin type B coupled Sepharose contained. In the activity test (mouse hemodiaphragm analysis) was then no biological activity (Toxicity) more detectable.
Beispiel 3: Integration der schweren Kette von Botulinumtoxin Typ A in einen Proteinkomplex von C. botulinum Typ BExample 3: Integration the heavy chain of botulinum toxin type A into a protein complex of C. botulinum type B
100 μg (34μl) der hochgereinigten Komplexproteine von Typ B aus Beispiel 2 wurden vermischt mit 200 μg (690μl) der isolierten schweren Kette von Typ A aus Beispiel 1. Das Gemisch wurde 3 Tage bei 2-8°C gegen 1 L 50 mM NaPhosphat-Puffer pH 6.0 mit 150 mM NaCl dialysiert. Anschließend wurden 450 μL durch Zugabe von 150 μl 4 M Ammoniumsulphat gefällt. Unter diesen Fällungsbedingungen bleibt die nicht in den Proteinkomplex eingebaute schwere Kette in Lösung wärend der Proteinkomplex (mit oder ohne eingebaute schwere Kette) quantitativ ausfällt. Nach erneuter Inkubation über Nacht wurde das Pellet abzentrifugiert und in 120 μL NaPhosphat, mm NaCl, 2mM EDTA pH 6,0 resuspendiert. Die Bildung des Proteinkomplexes wurde durch "Gelfiltration" über eine BioSep-S-3000 geprüft. Das Chromatogramm zeigte nur einen einzigen Peak (bei einem Molekulargewicht von ca. 500 000 Dalton). Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ergab, dass die Peakfraktionen sowohl die Komplexproteine von Typ B als auch die schwere Kette von Botulinumtoxin Typ A enthielten.100 μg (34 μl) of the highly purified Complex proteins of type B from example 2 were mixed with 200 μg (690 μl) of the isolated ones heavy chain of type A from example 1. The mixture was 3 days at 2-8 ° C dialyzed against 1 L of 50 mM NaPhosphate buffer pH 6.0 with 150 mM NaCl. Subsequently were 450 μL by adding 150 μl 4 M ammonium sulphate precipitated. Under these conditions of precipitation remains the heavy chain not incorporated into the protein complex in solution during Protein complex (with or without incorporated heavy chain) quantitatively fails. To re-incubation over At night, the pellet was spun down and placed in 120 μL NaPhosphate, mm NaCl, 2mM EDTA pH 6.0 resuspended. The formation of the protein complex was tested by "gel filtration" on a BioSep-S-3000. The Chromatogram showed only a single peak (at a molecular weight of about 500,000 daltons). SDS polyacrylamide gel electrophoresis revealed that the peak fractions contained both the complex proteins of type B as well as the botulinum toxin heavy chain type A.
Beispiel 4: Kopplung von Insulin an die schwere Kette von Botulinumtoxin Typ A Synthese von SPDP-InsulinExample 4: Coupling of Insulin to the heavy chain of botulinum toxin type A synthesis of SPDP insulin
12.5 mg Insulin (Roche, rekombinant) wurden in 6.3 mL Puffer (10 mM Natriumcarbonat pH = 6.9) gelöst. Dazu wurden zum Blocken von α-Aminogruppen 3 μL Citaconanhydrid (Fluka) pipettiert und die Mischung bei Raumtemperatur inkubiert, wobei der pH-Wert verfolgt wurde. Durch Zugabe von 1 M NaOH wurde der pH-Wert bei 6.8 – 7.0 gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend über Nacht bei 4°C gegen 50 mM Natrium-phosphat, 100 mM Natriumchlorid pH = 7.3 dialysiert.12.5 mg insulin (Roche, recombinant) was added to 6.3 mL buffer (10 mM sodium carbonate pH = 6.9). These were used to block α-amino groups 3 μL citaconic anhydride (Fluka) pipetted and the mixture incubated at room temperature, wherein the pH was followed. By addition of 1 M NaOH was the pH at 6.8 - 7.0 held. The reaction mixture was then heated at 4 ° C overnight against 50 mM sodium phosphate, dialyzed 100 mM sodium chloride pH = 7.3.
6.2 mg SPDP (N-Succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]propionat, Pierce) wurden in 500 μL DMF gelöst. 274 μL dieser Lösung wurden zu 6.3 mL Insulinderivat (auf pH 8.3 eingestellt) hinzugefügt und das Gemisch 1 ½ h bei Raumtemperatur auf einem Mixer inkubiert. Noch vorhandenes SPDP wurde mittels Dialyse gegen 50 mM Natriumphosphat, 100 mM NaCl pH = 7.3 entfernt. Zur Entfernung der Schutzgruppen wurde gegen Wasser dialysiert (2 h bei Raumtemperatur) und dann gegen 10 mM HCl für 5 ½ h bei Raumtemperatur. Schließlich wurde über Nacht gegen 50 mM Natriumphosphat, 100 mM Natriumchlorid, 4 mM EDTA pH = 7.3 dialysiert (Endvolumen der SPDP-Lösung: 7 mL).6.2 mg SPDP (N-succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] propionate, Pierce) in 500 μL DMF solved. 274 μL of this solution were added to 6.3 mL of insulin derivative (adjusted to pH 8.3) and the mixture 1 ½ h incubated at room temperature on a blender. Still available SPDP was dialyzed against 50 mM sodium phosphate, 100 mM NaCl pH = 7.3 removed. To remove the protecting groups was added water dialyzed (2 h at room temperature) and then against 10 mM HCl for 5½ h at room temperature. After all was over Night against 50 mM sodium phosphate, 100 mM sodium chloride, 4 mM EDTA pH = 7.3 dialyzed (final volume of the SPDP solution: 7 mL).
Herstellung des Insulin-Hc-KonjugatsPreparation of insulin-Hc conjugate
25 mg der schweren Kette von Botulinumtoxin Typ A, die ensprechend Beispiel 1 isoliert wurde, wurden mit 8 mg Insulin-SPDP versetzt (Endvolumen: 41.5 mg) und 4 Tage bei 4°C inkubiert (end-over-end Mixer). Zur Abtrennung von nicht gekoppeltem Insulin-SPDP wurde gegen 50 mM Tris/HCl, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA dialysiert, wobei der Dialyseschlauch eine Ausschlussgrenze von 50 kD besaß.25 mg of the botulinum toxin heavy chain type A corresponding to Example 1 was isolated, were added to 8 mg of insulin SPDP (Final volume: 41.5 mg) and incubated for 4 days at 4 ° C (end-over-end mixer). To separate uncoupled insulin SPDP was compared to 50 dialysed mM Tris / HCl, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, the dialysis tubing had an exclusion limit of 50 kD.
Das Produkt wurde im Western Blot analysiert. Mit Antikörpern gegen Insulin wurde ein Protein mit dem Molekulargewicht von ~ 100 kD identifiziert. Es handelte sich also um das Konjugat aus schwerer Kette und Insulin (= Insulin-Hc-Konjugat). An 3T3-Zellen wurde in vitro die Aktivität des Insulins nachgewiesen.The Product was analyzed in the Western blot. With antibodies against Insulin became a protein with molecular weight of ~ 100 kD identified. So it was the heavy chain conjugate and insulin (= insulin-Hc conjugate). At 3T3 cells was in vitro the activity of insulin.
Beispiel 5: Einbau des Insulin-Hc-Koniugats in den Proteinkomplex aus Clostridium botulinum Typ BExample 5: Installation of the Insulin-Hc conjugates into the protein complex from Clostridium botulinum Type B
In 52 mL wurden 7.4 mg Insulin-Hc-Konjugat (aus Beispiel 4) mit 21 mg Proteinkomplex (gereinigt entsprechend Beispiel 2) und gegen 50 mM Natriumphosphat, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 6.0 4 Tage bei 4°C dialysiert. Eine Probe von 500 μL wurde in einer Gelfiltration über eine BioSep-S-3000-Säule (Phenomenex) analysiert. Es zeigte sich nur ein hochmolekularer Peak bei einem Molekulargewicht von ~ 600 kD. Eine Probe der Peakfraktion wurde im Western Blot analysiert. Mit Antikörpern gegen Insulin ergab sich, dass Insulin (als Insulin-Hc-Konjugat) in den Proteinkomplex (aus Komplexproteinen von C. botulinum) integriert war.In 52 mL were 7.4 mg insulin-Hc conjugate (from Example 4) with 21 mg protein complex (purified according to Example 2) and against 50 mM sodium phosphate, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 6.0 for 4 days Dialyzed at 4 ° C. A sample of 500 μL was in a gel filtration over a BioSep S-3000 column (Phenomenex) analyzed. It showed only a high molecular weight peak at one Molecular weight of ~ 600 kD. A sample of the peak fraction was analyzed in the Western blot. With antibodies to insulin, that insulin (as insulin-Hc conjugate) into the protein complex (out Complex proteins of C. botulinum) was integrated.
Beispiel 6: Prüfung eines Insulin-Neokomplexes an Ratten im Glucose-ToleranztestExample 6: Testing a Insulin neocomplex in rats in the glucose tolerance test
Die Wirksamkeit eines in einen Proteinkomplex eingebauten Insulin-Hc-Konjugats (im nachfolgenden als Insulin-Neokomplex bezeichnet) nach oraler Verabreichung wurde im Tierversuch an Ratten überprüft.The Effectiveness of an insulin-Hc conjugate incorporated into a protein complex (hereinafter referred to as insulin neo complex) after oral Administration was tested in animals in rats.
Gruppen
aus 4 Ratten wurden entweder mit Insulin-Neokomplex oder mit freiem
Insulin-Hc-Konjugat
(ohne Komplexproteine) behandelt. Als Kontrolle dienten unbehandelte
Tiere. Die Dosis an Insulin war in beiden Gruppen gleich und betrug
2 U/Tier. Die Lösungen
wurden per Schlundsonde verabreicht. Als weitere Kontrollen wurden
0.1 U, 0.6 U und 2.0 U Insulin i.p. verabreicht. 1 h nach Applikation
von Insulin-Neokomplex und freiem Insulin-Hc-Konjugat wurden die
Tiere mit Glucose (2 g/kg per oral) belastet. Zu diesem Zeitpunkt
erfolgte auch die Injektion der Positivkontrolle (0.1 U, 0.6 U und
2.0 Units Insulin). Nach 30, 60, 120 und 180 min wurde Blut entnommen
und der Glucosespiegel bestimmt. Nach 60 min wurde bei den Kontrolltieren
eine Höchstkonzentration
an Glucose mit ca. 140 mg/mL erreicht, während bei den mit Insulin-Neokomplex
behandelten Tieren die Konzentration nur wenig anstieg (s.
Die Glucosekonzentration bei den Tieren, die nur mit Insulin-Hc-Konjugat behandelt wurden, verhielt sich genauso wie bei der Kontrolle: die Konzentration stieg bis zum Zeitpunkt 60 min stark an. Es läßt sich daraus schließen, dass ein Insulin-Hc-Konjugat allein keine Wirkung auf den Insulinspiegel hat, die Verabreichung von Insulin-Hc-Konjugat ohne den Einbau in den Proteinkomplex ist also nicht geeignet, Insulin oral bioverfügbar zu machen.The Glucose concentration in animals using only insulin-Hc conjugate treated as well as in the case of control: the Concentration increased strongly until the time of 60 minutes. It can be conclude, that an insulin-Hc conjugate alone has no effect on insulin levels has, the administration of insulin-Hc conjugate without incorporation in The protein complex is thus not suitable for making insulin orally bioavailable do.
Beispiel 7: Vergleich der Integration von Insulin-Hc-Konjugat mit Insulin gebunden an den C-Terminus der schweren Kette von BotulinumtoxinExample 7: Comparison the integration of insulin-Hc conjugate bound with insulin the C-terminus of heavy chain of botulinum toxin
Das c-terminale Fragment der schweren Kette (Mr≈50 kD) von Botulinumtoxin Typ A wurde recombinant in E. coli exprimiert. Dazu wurde die DNA-Sequenz für das c-terminale Fragment von Botulinumtoxin Typ A As 871- 1296 (NIINT ......ERPL) verknüpft mit einem His-Tag in den Vektor pBN29 4772 kloniert, damit E. coli N15 [pREP4] (Quiagen) transformiert und das exprimierte Fragment über eine Ni-NTA-Sepharose-Säule mittels Affinitätschromatographie gereinigt.The c-terminal fragment of the heavy chain (M r ≈50 kD) of botulinum toxin type A was recombinantly expressed in E. coli. For this purpose, the DNA sequence for the c-terminal fragment of botulinum toxin type A As 871-1296 (NIINT... ERPL) linked to a His tag was cloned into the vector pBN29 4772 in order to allow E. coli N15 [pREP4 ] (Quiagen) and the expressed fragment purified on a Ni-NTA Sepharose column by affinity chromatography.
100 μg der toxinfreien Komplexproteine von C. botulinum Typ B wurden mit 200μg (340 μL) des recombinanten c-terminalen -Fragments gemischt und drei Tage bei 2-8°C gegen 50 mM NaPhosphat pH 6,0 mit 150 mM NaCl dialsysiert. Anschließend wurde mit H2O auf 450 μL aufgefüllt und durch Zugabe von 150 μl 4 M Ammoniumsulphat gefällt. Unter diesen Fällungsbedingungen bleibt das nicht in den Proteinkomplex eingebaute c-terminale Fragment in Lösung, während der Proteinkomplex (mit oder ohne eingebautes c-terminales Fragment) quantitativ ausfällt. Nach erneuter Inkubation über Nacht wurde das Pellet abzentrifugiert und in 150 μL 50 mM NaPhosphat, 150 mM NaCl, 2mM EDTA pH 6,0 resuspendiert. 100μL wurden auf einer Biosep S-3000 Gelfiltrationssäule in den Komplex und eventuell als Verunreinugung vorhandenes, nicht gebundenes c-terminal Fragment aufgetrennt. Es wurden 2 Peaks eluiert: der erste Peak (12,2 min) repräsentiert den Proteinkomplex. Ein sehr kleiner Peak repräsentiert das freie c-terminale Fragment-Fragment. Der erste Peak wurde in der SDS-PAGE untersucht, es waren nur die Komplexproteine vorhanden, das c-terminale Fragment war also nicht in den Komplex integriert sondern blieb in der Ammoniumsulfatfällung ungebunden in Lösung. Das c-terminale Fragment von Botulinutoxin läßt sich also nicht in den Komplex integrieren.100 μg of the toxin-free complex proteins of C. botulinum type B were mixed with 200 μg (340 μL) of the recombinant c-terminal fragment and dialysed for 3 days at 2-8 ° C. against 50 mM Na phosphate pH 6.0 with 150 mM NaCl. It was then made up to 450 μL with H 2 O and precipitated by the addition of 150 μl of 4 M ammonium sulphate. Under these precipitation conditions, the c-terminal fragment which is not incorporated into the protein complex remains in solution, while the protein complex (with or without incorporated c-terminal fragment) precipitates quantitatively. After re-incubation overnight, the pellet was spun down and resuspended in 150 μL 50 mM NaPhosphate, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 6.0. 100μL were separated on a Biosep S-3000 gel filtration column into the complex and possibly as a contaminant, unbound c-terminal fragment. Two peaks were eluted: the first peak (12.2 min) represents the protein complex. A very small peak represents the free c-terminal fragment fragment. The first peak was examined in the SDS-PAGE, only the complex proteins were present, so the c-terminal fragment was not integrated into the complex but remained in the ammonium sulfate precipitate unbound in solution. The c-terminal fragment of botulinutoxin can therefore not be integrated into the complex.
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