DE19849045A1

DE19849045A1 - Gluthathion-Konjugate als Signalmoleküle

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Publication number: DE19849045A1
Application number: DE19849045A
Authority: DE
Inventors: Peter Schroeder; Andreas Stampfl
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 1998-09-17
Filing date: 1998-10-23
Publication date: 2000-03-30
Also published as: DE59904817D1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steigerung der Entgiftungskapazität von Pflanzen für organische Schadstoffe und/oder Agrochemikalien, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die mit den Schadstoffen und/oder Agrochemikalien kontaminierten Pflanzen mit einer wirksamen Menge eines Glutathion-Konjugats in Kontakt gebracht, die Konjugate zum Zellkern transportiert und dort akkumuliert werden, wobei sie als Signalmoleküle wirken, um hierdurch eine Induktion und/oder Steigerung der Aktivität pflanzlicher Entgiftungsenzyme in der Pflanzenzelle zu bewirken.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, um die Entgiftungskapazi tät von Pflanzen für organische Schadstoffe und/oder Agrochemi kalien zu steigern.

Pflanzen sind permanent Einwirkungen von Fremdstoffen ausge setzt. Schadstoffe kommen aufgrund der allgemeinen Umweltbela stung praktisch ubiquitär vor, und zumindest im Freiland aufge zogene Pflanzen können einem derartigen Schadstoffeintrag nicht entkommen. Weiterhin sind insbesondere Nutzpflanzen dem Eintrag von Agrochemikalien ausgesetzt. All diese Schadstoffe und Agro chemikalien werden zumindest teilweise in die Pflanze aufgenom men und können dort akkumulieren. Insbesondere bei Nutzpflan zen, die später als Nahrungsmittel an Menschen oder Tiere ver abreicht werden, ist eine möglichst geringe Belastung mit die sen Schadstoffen und Agrochemikalien von großer Bedeutung. Es wurde deshalb bereits in der Vergangenheit nach Wegen gesucht, um die Nutzpflanzen von Schadstoffen und Agrochemikalien zu entgiften.

Insbesondere beim Herbizid-Einsatz wird daher versucht, die Entgiftungskapazität in Nutzpflanzen durch Antidots (Herbizid- Safener) und andere fördernde Agentien gegenüber der von Un kräutern zu erhöhen. In der landwirtschaftlichen Praxis wurden in der Vergangenheit Herbizid-Antidote mit häufig Herbizid ana logen Strukturen eingesetzt, um die Entgiftungskapazität von Nutzpflanzen zu erhöhen. Der Wirkmechanismus ist jedoch nicht verstanden. Aus diesem Grund sind auch Antidot-Applikationen unspezifisch und kaum dosierbar.

Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Signal moleküle bereitzustellen, die die Entgiftungskapazität von Pflanzen für organische Schadstoffe und/oder Agrochemikalien steigern.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die mit den Schadstoffen und/oder Agrochemikalien kontaminierten Pflan zen mit einer wirksamen Menge eines Glutathion-Konjugats in Kontakt gebracht, die Konjugate zum Zellkern transportiert und dort akkumuliert werden, wobei sie als Signalmoleküle wirken, um hierdurch eine Induktion und/oder Steigerung der Aktivität pflanzlicher Entgiftungsenzyme in der Pflanzenzelle zu bewir ken.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren können spezifische Induk toren synthetisiert werden, die nicht erst in der Pflanze meta bolisiert werden müssen, um ihre Wirksamkeit zu entfalten, son dern die gezielt die Entgiftungskapazität für organische Schad stoffe und Agrochemikalien in Pflanzen induzieren und steigern können.

Unter Konjugate werden erfindungsgemäß Verbindungen von Gluta thion oder seinen Analoga mit Herbiziden, Herbizid-Antidots (Safener), Xenobiotika oder Naturstoffen, die je mit Gluta thion konjugierbar sein müssen, als bevorzugte Gluthathion-Kon jugate verstanden. Diese Substanzklassen werden nachfolgend näher erläutert.

1. SAFENER

In der Vergangenheit wurden zahlreiche Safener entwickelt und angewendet. Der Wirkungsmechanismus ist in allen Fäl len unbekannt. Beispiele für Safener sind:
Chloroacetamide, Thiocarbamate, Chlorpropionamide, Naph thopyranone, Dichlormethyl, Acetale, Oximether-Derivate, Thiazolcarboxylate, Phenylpyrimidine, Phenylpyrazole, Qui nolinoxycarbonsäureester, Methylbenzylharnstoffe.

Beispiele

Benoxacor, Cloquintocet-mexyl, Cyometrinil (Concep I), Daimuron, Dichlormid Dipiperate, Dymron, Tenchlorazole ethyl, Fenclorim, Flurazole (Scree), Fluxofenim (Concep III) LAB-145138, MG-191, MON-13900, Naphthylsäureanhydrid (Protect), Oxabetrinil (Concep II).

2. HERBIZIDE

Glutathionkonjugierbare Herbizide sind:
Acetochlor, Acifluorfen, Alachlor, Atrazin, Benzo(a)pyren, Butachlor, Chlorpropham, Chlorimuronethyl, Chlorsulfuron, Dichlormethan, Dimetachlor, Dimethymetryn, Dimethenamid, EPTC, Fluorodifen, Metazachlor, Metolachlor, Metribuzin, Molinat, Pebulat, PCNB, Pretilachlor, Propachlor, Terbu tryn, Tridiphan, Trisulfuronmethyl.

Tabelle 9.1

Dichloracetamid- und strukturanaloge Herbizid-Safener. Safener dieses Typs werden in Mais in Kombination mit Chloracetanilid- und Thiolcarbamat-Herbiziden eingesetzt. Nur MON-13900 wird mit einem Sulfonylharnstoff kombiniert.

Tabelle 9.2

Safener für Sorghum- und Mais-Saatgutbehandlungen, die für Herbizide aus den Gruppen der Chloracetanilide und Thiolcarbamate eingesetzt werden.

Tabelle 9.3

Spezifisch wirkende Safener, die zur Kombination mit jeweils nur einem Herbizid geeignet sind. Es werden dadurch bessere Verträglichkeiten in Reis und Weizen erzielt. (S. : H.) gibt das Mischungsverhältnis Safener : Herbizid an.

Tabelle 9.4

Herbizide mit Safener-Wirkung, die in Kombination mit dem Sulfonylharnstoff Bensulfuron methyl Schäden an Reis verhindern.

3. XENOBIOTIKA

Zahlreiche Chlorbenzol-Derivate wie Dichlornitrobenzol, Chlordinitrobenzon, Nitrobenzoyl-Chlorid, Nitroaromate und Haloalkyl-Verbindungen wie Trichlorethen, Tetrachlorethen, Halone usw. können erfindungsgemäß mit Glutathion ver knüpft werden.

4. NATURSTOFFE

Verwendbar sind beispielsweise Konjugate mit Naturstoffen des sekundären Pflanzenstoffwechsels, vor allem aus der Klasse der Phenylpropanoide, beispielsweise der Zimtalko hole, der Cumarsäuren und ihrer Derivate (Cumarine und Hydroxycumarine) oder auch aus der Klasse der Flavonoide (z. B. Saponarin, Isovitexin).

Beispiele für Glutathion-Analoga sind:

- γ-L-Glutamyl-L-cysteinyl-β-alanin
- γ-L-Glutamyl-L-cysteinyl-β-serin
- Hydroxymethylglutathion

Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate ist an sich bekannt. Eine Möglichkeit, um die erfindungsgemäßen Konjugate herzustellen, wird nachfolgend näher dargestellt. Die Erfindung ist jedoch nicht auf dieses spezielle Herstellungs verfahren beschränkt.

In einem geeigneten Puffersystem mit pH-Wert um 6,5 und geeig neter Ionenstärke (0,1-0,2 M) wird das Xenobiotikum / der Na turstoff in mM Konzentration in geeignetem Lösungsmittel (bis 5% EtOH, DMSO, DMF, Aceton) vorgelegt. 10-20-facher Überschuß an H₂O bidest. gelöstem reduziertem Glutathion wird zugegeben.

Darauf folgt entweder eine Alkalisierung durch pH-Shift auf ca. pH 8, oder eine Inkubation mit einem Glutathion S-Transferase Totalextrakt aus Mais, Weizen oder Sojabohne bzw. käuflicher GST aus Ratten- bzw. Kaninchenleber (Sigma-Aldrich).

Die Testansätze werden für Stunden im Dunklen bei Raumtempera tur inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1% TCA ge stoppt, danach erfolgt Ausschütteln des Konjugats durch Zugabe desselben Volumens an Chloroform/Methylenchlorid (3 : 8, v/v). Phasentrennung wird durch kurze Zentrifugation etabliert; die Ausgangssubstanz verbleibt in der organischen Phase, Konjugate im Wässrigen. Die wässrige Phase wird abpipettiert und auf mit Acetonitril vorkonditionierte C18-(z. B. SegPak Millipore- Waters, o. ä.) Kartuschen aufgetragen. Elution mit 5-35% Aceto nitril eluiert die Glutathionkonjugate. Die Konzentrate werden einrotiert oder zur Trockne eingedampft und bis zur Verwendung bei -20°C gelagert.

Die hergestellten Konjugate können zur gezielten Induktion der pflanzlichen Entgiftungsenzyme nach Lösung in einem geeigneten Lösungsmittel bzw. in einer gängigen Agrochemikalien-Formulie rung eingesetzt werden. Der Auftrag auf die Pflanzen erfolgt gemäß den GLP-Richtlinien der BBA.

Die einzelnen Verbindungen werden dann auf den Induktionserfolg getestet. Dies geschieht dadurch, daß die Entgiftungsleistung in Standard-Testsystemen spektralphotometrisch oder durch HPLC bestimmt wird oder mittels molekularbiologischer Methoden die Transkription der entsprechenden Gene analysiert wird.

Erfindungsgemäß werden insbesondere Glutathion-S-Transferasen als pflanzliche Entgiftungsenzyme in ihrer Aktivität induziert bzw. gesteigert. Es ist jedoch auch möglich, daß andere pflanz liche Entgiftungsenzyme aktiviert werden. Hierzu gehören bei spielsweise Sulfotransferasen, ATP-Sulfurylasen, Glutathion-S- Transferasen, O-Glucosyltransferasen, Esterasen, Peroxidasen, P-450-Monooxigenasen.

Die Glutathion-Konjugate werden in einer wirksamen Menge einge setzt. Eine derartige wirksame Menge liegt beispielsweise im Bereich von 1-1000 µM, beispielsweise im Bereich von 10-500 µM. Das Aufbringen kann beispielsweise durch Aufsprühen oder Auf gießen erfolgen, so daß die Verbindungen mit der Pflanzenober fläche in Kontakt gebracht werden.

Die Induzierbarkeit von Entgiftungsenzymen in Pflanzen und Tie ren ist ein an sich bekanntes Phänomen, das bereits auf viel fältige Weise praktisch genutzt wird. So wird in Pflanzen etwa die Resistenz gegenüber Herbiziden durch unspezifische Antidote gesteigert, deren Wirkung auf einer Steigerung der Entgiftungs kapazität beruht. Die Mechanismen, die zur Steigerung führen, sind weitestgehend unbekannt. Im Fall der P-450-Monooxigenasen sind bei Tieren spezifische Rezeptoren für Fremdstoffmoleküle (z. B. Barbiturate, PCB, PAH) bekannt, die nach Ankopplung des Fremdstoffs Signalmoleküle freisetzen, die spezifisch an die DNA binden. Für pflanzliche Systeme wurden jedoch analoge Me chanismen nicht beschrieben. Vielfach wird unspezifisch oxida tiver Streß, verursacht durch den Fremdstoff selbst oder durch entsprechende Wirksamkeit von Abbauprodukten, als induzierendes Agens angenommen.

Die vorliegende Erfindung geht deshalb weit über die bisherigen Untersuchungen zur Mechanistik der Induzierbarkeit von Gluta thion-Transferasen in Pflanzen hinaus. Erfindungsgemäß wurde zum ersten Mal, wie aus den beiliegenden Beispielen ersichtlich ist, der Weg eines Fremdstoff-Modell-Moleküls (Chlorbiman) nach seiner Konjugation mit Glutathion aufgrund der Fluoreszenz in der Zelle verfolgt. Somit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß Konjugate mit Glutathion als Signalmoleküle wirken, die beispielsweise in der Lage sind, Enzyme des pflanzlichen Ent giftungsstoffwechsels zu aktivieren und zu induzieren. Erst durch die vorliegenden Ergebnisse wird dem Fachmann eine ge zielte Lösung für das Problem der Entgiftung von Pflanzen von Agrochemikalien und organischen Schadstoffen bereitgestellt, nämlich die Verwendung eines Glutathion-Konjugats, das als Si gnalmolekül wirkt und zur Entgiftung von Pflanzen von organi schen Schadstoffen und Agrochemikalien beiträgt.

Trotz langjähriger Forschungsarbeiten war bisher unbekannt, daß das Glutathion-Konjugat selbst eine Rolle als Signalmolekül einnimmt. Bisher ging es bei der Verwendung von Glutathion-Kon jugaten in Inkubationsversuchen stets darum, die toxischen Aus gangssubstanzen und ihre möglicherweise induzierenden Eigen schaften zu vermeiden und stattdessen eine Substanzklasse anzu wenden, die in der Pflanze erst zum vermutlich aktiven Agens verwandelt werden muß. Durch die vorliegende Erfindung wird erstmals offenbart, daß die Glutathion-Konjugate, die enzyma tisch entweder an der Kernhülle entstehen oder gezielt dorthin transloziert werden, direkt an der Signalkette beteiligt sind, die die Aktivierung von Resistenzgenen steuert. Bei Pflanzen waren derartige Mediatoren bislang unbekannt. Durch die vorlie genden Versuchsergebnisse können nunmehr gezielt Pflanzen von Agrochemikalien und Schadstoffen entgiftet werden.

Die vorliegende Erfindung wird nunmehr anhand von Beispielen für spezifische Glutathion-Konjugate beschrieben. Der Fachmann kann jedoch aufgrund seines Fachwissens und aufgrund der vor liegenden Beschreibung ohne weiteres die unteschiedlichsten Glutathion-Konjugate synthetisieren und in einem Screening-Ver fahren pflanzliche Gewebe oder Zellkulturen darauf testen, ob die Konjugate die erfindungsgemäße Entgiftungskapazität akti vieren. Beispielsweise kann eine direkte Aktivitätsbestimmung oder eine Messung der Induktionsleistung durch molekularbiolo gische Methoden erfolgen. Aktive Konjugate werden hierdurch herausgefiltert, resynthetisiert und in Feldstudien und bei Ganzpflanzen weiter untersucht. Anschließend werden die Sub stanzen den üblichen Tests zur Registrierung von Agrochemika lien unterworfen.

Durch die nachfolgenden Versuche konnte gezeigt werden, daß Glutathion-Konjugate spezifisch pflanzliche Entgiftungsenzyme, beispielsweise Glutathion-S-Transferasen, aktivieren. Hierzu wurde ein fluoreszierendes Konjugat aus Glutathion und Mono chlorbiman hergestellt. Durch diese Fluoreszenzmarkierung kann der Weg des Konjugats durch die Zelle verfolgt werden. Zeitstu dien ergaben, daß nach Inkubation mit Monochlorbiman eine star ke Fluoreszenz am Zellkern auftritt, bevor das Cytosol fluores ziert. Die Fluoreszenz (d. i. das Konjugat) verläßt in der Folge den Kern und konzentriert sich in späteren Stadien im Bereich der Vakuole. Mit der Fluoreszenzentwicklung ist eine transiente Erhöhung der enzymatischen Entgiftungskapazität in den Zellen verbunden, die offenbar auf einer de-novo-Synthese von Protei nen beruht. Aus diesem Grund können derartige Glutathion-Kon jugate auch als Hormonanaloge bezeichnet und entsprechend ver wendet werden. Aufgrund dieser Untersuchungsergebnisse eignen sich somit Glutathion-Konjugate als Signalmolküle im pflanzli chen Zellen, in die sie mit Hilfe geeigneter Lösungsmittel und /oder Formulierungshilfen einbringbar sind. Die Konjugate akku mulieren am Zellkern und bewirken dort eine rasche und tran siente Erhöhung der Aktivität von GST oder anderer pflanzlicher Entgiftungsenzyme und der Entgiftungskapazität in Pflanzen. Es können durch die vorliegende Erfindung spezifische Induktoren verwendet werden, die nicht erst in der Pflanze metabolisiert werden müssen, um ihre Wirkung zu entfalten.

Die nachfolgenden Abkürzungen bedeuten:
CDNB: 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol;
DCNB: 1,2-Dichlor-4-nitrobenzol;
EPNP: 1,2-Epoxy-3(p-nitrophenoxy)-propan;
γ-GC: γ-Glutamyl-cysteinyl-Rest;
GS: Glutathionyl-Rest;
GSH: Glutathion, reduziert;
GST: Glutathion-S-Transferase;
MBB: Monobromobiman;
MCB: Monochlorobiman;
NBD-Cl: 7-Chlor-4-nitrobenzo-2-oxy-1,3-diazol.

Das Ziel der nachfolgenden Untersuchungen war, die GST-abhängi ge Konjugatbildung und den Transport der Konjugate in den Zel len sichtbar zu machen und den Einfluß von Xenobiotika und ih rer jeweiligen Glutathion-Konjugate auf ihre Aktivität auf GST in Zwiebeln zu untersuchen.

Für verschiedene Xenobiotika wurde in Proteinextrakten aus epi dermalen Gewebe von Zwiebeln eine GST-Aktivität gefunden. Die Aktivitäten waren über den Tag verteilt nicht konstant, sondern folgten einem diurnalen Rhythmus, der mit dem allgemeinen diur nalen Turnover von Protein verbunden war. Die Aktivität war sowohl in den Cytosol- als auch in den Mikrosomen-Fraktionen nachweisbar. CDNB- und MBB-Konjugation fand mit den höchsten Raten statt, wobei bei der MBB-Konjugation extrem hohe nicht enzymatische Raten festgestellt werden konnten. Im Gegensatz zu CDNB war eine MBB-Konjugation nur im Cytosol nachweisbar. An ders als für die Bedingungen im Cytosol war die Aktivität für die Konjugation von CDNB und DCNB in aus dem gleichen Gewebe extrahierten mikrosomalen Fraktionen gleich. EPNP wurde unter den vorliegenden Bedingungen durch die mit den Mikrosomen asso ziierte GST mit den höchsten Raten konjugiert. Die MCB-Aktivi täten waren moderat und ausschließlich im Cytosol vorkommend, führten jedoch zur Bildung eines leuchtend fluoreszierenden Konjugats. Unter den in vitro angewandten Bedingungen fand nur eine langsame Konjugat-Bildung in Testsystemen ohne GST statt, während bei pH-Werten von über 7,6 ein signifikanter Anteil einer nicht-enzymatischen Bildung eines Glutathion-Konjugats stattfand.

Die Entwicklung der Fluoreszenz in epidermalen Zwiebelpräpara tionen in vivo wurde mikroskopisch untersucht. Die Fluoreszenz entwicklung fand innerhalb weniger Minuten nach Inkubation der Epidermisstreifen mit MCB auf, und man fand, daß die Fluores zenz beinahe gleichzeitig im Cytosol nahe an der Zellgrenze und an der Kernhülle der Epidermiszellen beginnt. Bei Beobachtung der Fluoreszenzentwicklung im Kern, in den Vakuolen und im Cy tosol zeigte sich, daß die Fluoreszenz im Cytosol und in den Vakuolen den gleichen Anstieg aufwies, was am wahrscheinlich sten darauf zurückzuführen ist, daß die Cytosol-Fluoreszenz in die Vakuole ausstrahlte. Nach drei Minuten überstieg die Kern fluoreszenz die Cytosol-Fluoreszenz signifikant. Interessanter weise nahm nach 10 Minuten bzw. 15 Minuten die Fluoreszenz im Cytosol und im Kern ab, während in der Vakuole eine leuchtende Fluoreszenz auftrat. Diese ist gekennzeichnet durch eine steile Zunahme der Fluoreszenzkurve. Am Ende der Versuche waren die Epidermiszellen weiterhin am Leben, zeigten eine Plasmazirkula tion und wiesen eine leichte Gesamtfluoreszenz mit leuchtenden Höfen im Kern und in den Vakuolen auf. Die allgemeine Fluores zenz ist wahrscheinlich auf einen Transport und eine bevorzugte Verteilung des Konjugats in die Vakuole der Zellen zurückzufüh ren, was auch durch isolierte Vakuolen gezeigt werden konnte.

Auf dem enzymatischen Niveau führte die Inkubation von epider malen Zellen (Epidermiszellen) aus Zwiebeln mit MCB zu schnel len und drastischen Veränderungen in der GST-Aktivität. Die größten Effekte wurden bei Konzentrationen von 10 bis 50 µM an Xenobiotika beobachtet. Nach 45 Minuten Inkubation mit 10 µM und 50 µ MCB betrug die GST-Aktivität für CDNB das 1,3- bzw. 5,1-fache derjenigen von Kontrollgeweben. In ähnlicher Weise nahm die Aktivität für die Konjugation von NBD-C1 deutlich zu. Jedoch verschwand die induktive Wirkung der Konjugatgabe bei Konzentrationen von etwa 50 µM. Die DCNB-Konjugation wurde um gekehrt beeinflußt. Transstilbenoxid, zugegeben in Konzentra tionen von 10 und 50 µM, bewirkte eine geringe Induktion von CDNB-, DCNB- und NHBD-C₁-Konjugationsraten. Die DCNB-Konjuga tionsrate fiel bereits bei 50 µM und eine 50%-ige Inhibierung aller Aktivitäten trat bei Konzentrationen von 100 µM auf.

In Zeitverlaufs-Untersuchungen unter Verwendung der Biman-GS- und der γGC- oder Chlornitrobenzol-GS und -γGC-Konjugate als Induktoren der GST von Zwiebeln konnten die beschriebenen Ef fekte näher analysiert werden. Die Fig. 1 zeigt die Konsequen zen der Verabreichung von Konjugaten mit Xenobiotika an ge schälte Zwiebel-Epidermis-Zellschichten. Das Glutathion-Konju gat von Chlorbiman beeinflußte die GST-Aktivität innerhalb ei ner Stunde stark und führte zu einer Verdoppelung der Konjuga tionsraten von CDNB und NBD-Cl (Fig. 1a, b). Zwei Stunden nach Verabreichung verlor sich jedoch der Effekt. Durch die Verabreichung des Biman-GS-Konjugats wurde die DCNB-Konjugation stark und irreversibel inhibiert. Höhere Konzentrationen des Konjugats bewirken interessanterweise nicht die gleichen oder stärkeren Effekte auf CDNB- und NBD-Cl-Konjugation; jedoch wur de die DCNB-Aktivität um 100% inhibiert (Fig. 1b).

Chlornitrobenzol-GS bewirkte eine Induktion um fast 200% der NBD-Cl-Konjugation (Fig. 1c, d), während zur gleichen Zeit die CDNB-Konjugation unverändert blieb und die DCNB-Konjugation um 50% inhibiert wurde. Die Verabreichung von 20 µM Konjugat bewirkte nur geringere Effekte (Fig. 1d). Im allgemeinen führ ten γGC-Konjugate von Himan als auch von CDNB nicht zu den dra matischen Effekten, die nach Verabreichung der jeweiligen Glu tathion-Konjugate beobachtet wurden, mit der Ausnahme einer signifikanten Inhibierung der DCNB-Konjugation (Fig. 1E-H).

Die transienten Einflüsse auf die GST-Aktivität, die in der Fig. 1 gezeigt sind, wurden weiter untersucht. Wenn Zwiebel epidermis 100 µM Cycloheximid ausgesetzt wurde, das ursprüng lich als Kontrolle zur Inhibierung der de-novo-Synthese von GST entwickelt worden war, konnten innerhalb der ersten zwei Stun den des Versuchs signifikante und transiente Steigerungen der CDNB- und NBD-Cl-Konjugation beobachtet werden. Diese Steige rungen betrugen beinahe 100% der Kontrollwerte, verloren sich jedoch nach 3,5 Stunden. Nach diesem Punkt wurden GST-Aktivi tätsverluste beobachtet (Fig. 2A).

Bei Zugabe von CDNB zum epidermalen Zwiebelgewebe wurde der gleiche transiente Effekt mit einer hohen Aktivität nach zwei Stunden und ein Aktivitätsverlust nach einer zusätzlichen Stun de beobachtet; nach vier Stunden jedoch konnte eine erneute Zunahme der GST-Aktivität beobachtet werden (Fig. 2B). Die Zugabe von Nitrobenzyl-Glutathion, einem kommerziell erhältli chen Glutathion-Konjugat, bewirkte starke Zunahmen der GST-Ak tivität innerhalb der ersten 45 Minuten des Experiments und eine konstante Abnahme der GST-Aktivität in Bezug auf die Kon trollwerte während der nachfolgenden sechs Stunden (Fig. 2C). Bei keiner der unterschiedlichen Zeituntersuchungen änderte sich die DCNB-Aktivität signifikant.

Die Verabreichung von Cycloheximid zusammen mit entweder CDNB oder Nitrobenzyl-Glutathion führte zu den gleichen Veränderun gen in den GST-Aktivitätsmustern über die Zeit. Die vorher be obachtete transiente Stimulation innerhalb der ersten Phase des Versuchs (0 bis 2 Stunden) ging verloren; es konnte jedoch eine starke transiente Zunahme der GST-Aktivitäten für CDNB- und NBD-Cl-Konjugation nach vier Stunden beobachtet werden.

Aus diesen Untersuchungen und aufgrund des Ergebnisses, das zeigte, daß aufgrund der Glutathion-Konjugat-Akkumulation des Xenobiotikums Chlorbiman in der Kernhülle oder im Kern eine Fluoreszenzentwicklung auftrat, kann geschlossen werden, daß Glutathion-Konjugate als Signalmoleküle zur Stimulation der Aktivität pflanzlicher Entgiftungsenzyme, insbesondere der Ak tivität vond GST, einsetzbar sind.

Claims

1. Verfahren zur Steigerung der Entgiftungskapazität von Pflanzen für organische Schadstoffe und/oder Agrochemika lien, dadurch gekennzeichnet, daß die mit den Schadstoffen und/oder Agrochemikalien kon taminierten Pflanzen mit einer wirksamen Menge eines Glu tathion-Konjugats in Kontakt gebracht, die Konjugate zum Zellkern transportiert und dort akkumuliert werden, wobei sie als Signalmoleküle wirken, um hierdurch eine Induktion und/oder Steigerung der Aktivität pflanzlicher Entgif tungsenzyme in der Pflanzenzelle zu bewirken.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Konjugate Konjugate von Herbiziden, Herbizid-Anti dots (Safener), Xeno-biotika und Naturstoffen, die je mit Gluthathion konjugierbar sein müssen, mit Glutathion ein gesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Glutathion Glutathion-Analoga eingesetzt werden.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität von Sulfotransferasen, ATP-Sulfurylasen, Glutathion-S-Transferasen, O-Glucosyltransferasen, Estera sen, Peroxidasen, P-450-Monooxigenasen als pflanzliche Entgiftungsenzyme induziert und/oder gesteigert wird.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Glutathion-Konjugate in einer Menge von 1 bis 1000 µM, bevorzugt 10-500 µM, eingesetzt werden.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Glutathion-Konjugate durch Aufsprühen oder Aufgie ßen mit der Oberfläche der Pflanze in Kontakt gebracht werden.

7. Verwendung von Glutathion-Konjugaten als Signalmoleküle zur Induktion und/oder zur Steigerung der Aktivität von pflanzlichen Entgiftungsenzymen, wobei durch den Transport der Konjugate zum Zellkern und ihre Akkumulation im Zellkern die Entgiftungskapazität von mit organischen Schadstoffen und/oder Agrochemikalien kontaminierten Pflanzen gesteigert wird.