ES2197554T3 - Conjugados de glutationa como moleculas señal. - Google Patents

Abstract

Plantas protectoras contra contaminantes o productos agroquímicos, especialmente herbicidas, por tratamiento con molécula que lleva una señal de conjugados de glutationa para inducir o potenciar enzimas de desintoxicación. Un procedimiento para aumentar la capacidad de las plantas para desintoxicar contaminantes orgánico y/o productos agroquímicos que consiste en poner en contacto las plantas contaminadas con un conjugado de glutationa (I), de manera que (I) se transporta a y se acumula en núcleos celulares de enzimas de desintoxicación de células. La invención se refiere además a la utilización de (I) una molécula que lleva una señal como la anterior.

Description

Conjugados de glutationa como moléculas señal.

La invención se refiere a un procedimiento para aumentar la capacidad de desintoxicación de las plantas frente a sustancias orgánicas perjudiciales y/o productos agroquímicos.

Las plantas están sometidas permanentemente a la acción de sustancias extrañas. Las sustancias perjudiciales están presentes de forma ubicua debido a su impacto general en el medio ambiente y, por lo menos las plantas que han crecido en el campo, no pueden eludir una intrusión de substancias perjudiciales de este tipo. Además, en particular las plantas útiles, están sometidas a la intrusión de productos agroquímicos. Las plantas absorben todas estas substancias perjudiciales y productos agroquímicos, al menos parcialmente, y pueden acumularse en las mismas. En particular en el caso de plantas útiles que se administrarán más tarde como nutriente para el hombre o los animales, tiene gran importancia conseguir la mínima contaminación posible por dichas substancias perjudiciales y productos agroquímicos. Por lo tanto, ya en el pasado se han buscado maneras de descontaminar las plantas útiles de substancias perjudiciales y productos agroquímicos.

Los mecanismos de acción para la descontaminación de plantas tienen lugar a través del conjugado del glutation. Coleman et al. Describen en Plant, Cell and Environment (Planta, Célula y Medio Ambiente) (1997), 20, 449-460, que los xenobióticos presentes en la célula se conjugan con el glutation en el citoplasma y finalmente son transportados en vacuolas.

En particular, en el empleo de herbicidas se intenta aumentar la capacidad de descontaminación de las plantas útiles frente a la de las malas hierbas a través de antídotos (substancias protectoras contra herbicidas) y otros agentes. En la práctica agrícola se emplearon en el pasado antídotos de herbicidas con estructuras análogas a las de los herbicidas más frecuentes, para aumentar la capacidad de descontaminación de las plantas útiles. Sin embargo se desconoce el mecanismo de acción. Por este motivo las aplicaciones de los antídotos son inespecíficas y raramente dosificables.

Por lo tanto la presente invención tiene como objeto preparar moléculas señal que aumenten la capacidad de descontaminación de las plantas frente a las sustancias orgánicas perjudiciales y/o los productos agroquímicos.

Este objeto se resuelve mediante un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que las plantas contaminadas con las sustancias perjudiciales y/o los productos agroquímicos se ponen en contacto con una cantidad activa de un conjugado del glutation, se transportan los conjugados al núcleo celular y se acumulan allí, donde actúan como moléculas señal, para conseguir así una inducción y/o aumento de actividad de las enzimas de desintoxicación vegetal en las células vegetales.

Mediante el procedimiento de acuerdo con la invención pueden sintetizarse inductores específicos que no necesitan ser metabolizados primero en la planta para desplegar su actividad, sino que van dirigidos a inducir y aumentar la capacidad de descontaminación frente a sustancias perjudiciales y productos agroquímicos en las plantas.

Como conjugados se entiende los conjugados de glutation preferidos, a saber, uniones según la invención del glutation o sus análogos con herbicidas, antídotos de herbicidas (substancias protectoras), xenobióticos o sustancias naturales, las cuales deben poderse conjugar con el glutation. Estas clases de substancias se describen más detalladamente a continuación.

1. Substancias protectoras

En el pasado se desarrollaron y emplearon numerosas substancias protectoras. El mecanismo de acción se desconoce en todos los casos. Algunos ejemplos de substancias protectoras son: Cloroacetamida, tiocarbamato, cloropropionamida, naftopiranona, diclorometilo, acetal, derivado de oximeter, tiazolcarboxilato, fenilpirimidina, fenilpirazol, quinolinoxicarboxilato, metilbenzilurea.

Ejemplos

Benoxacor, cloquintocet-mexyl, cyometrinil (Concep I), daimuron, dipiperato de dichlormid, dymron, tenchlorazol- etilo, fenclorim, flurazol (Scree), fluxofenim (Concep III) LAB-145138, MG-191, MON-13900, anhídrido naftílico (Protect), oxabetrinil (Concep II).

2. Herbicidas

Algunos herbicidas que pueden conjugarse con el glutation son:

Acetochlor, acifluorfen, alachlor, atrazina, benzo(a)pyren, butachlor, chlorprofam, chlorimuronetilo, chlorsulfuron, diclorometano, dimetachloro, dimethymetryn, dimethenamida, EPTC, fluorodifen, matazachlor, metolachlor, metribuzin, molinat, pebulat, PCNB, pretilachlor, propachlor, terbutryn , tridiphan, trisulfuronmethyl.

TABLA 9.1 Substancias protectoras contra herbicidas basadas en dicloroacetamida y análogos estructurales. Las substancias protectoras de este tipo se emplean en maíz en combinación con herbicidas basados en cloroacetanilida y tiolcarbamato. Solamente MON-13900 se combina con sulfonilurea.

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TABLA 9.2 Substancias protectoras para el tratamiento de semillas de sorgo y maíz, que se utilizan para herbicidas del grupo de las cloroacetanilidas y tiolcarbamatos.

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TABLA 9.3 Substancias protectoras de acción específica, que son apropiadas para la combinación con un solo herbicida. Se alcanzan así mejores tolerancias en arroz y trigo. (P.:H.) indica la relación de mezcla sustancia protectora:herbicida.

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TABLA 9.4 Herbicidas con acción protectora, que impiden daños al arroz en combinación con sulfonilurea bensulfuronmetilo.

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3. Xenobióticos

Numerosos derivados de clorobenzol como dicloronitrobenzol, clorodinitrobenzon, cloruro de nitrobenzoilo, derivados nitroaromáticos y uniones haloalquilo como tricloroeteno, tetracloroeteno, halones, etc. pueden enlazarse con el glutation según la invención.

4. Productos naturales

Pueden utilizarse por ejemplo conjugados con productos naturales del metabolismo secundario vegetal, principalmente de la clase de los fenilpropanoides, por ejemplo los alcoholes cinámicos, los ácidos cumáricos y sus derivados (cumarina y hidroxicumarina) o también de la clase de los flavonoides (por ejemplo saponarina, isovitexina).

Algunos ejemplos de análogos del glutation son:

- \gamma-L-glutamil-L-cisteinil-\beta-alanina

- \gamma-L-glutamil-L-cisteinil-\beta-serina

- hidroximetilglutation

El procedimiento para la preparación de conjugados según la invención es conocido como tal. A continuación se detalla una posibilidad de preparación de los conjugados según la invención. Sin embargo, la invención no se restringe a este procedimiento de preparación particular.

Se introduce el xenobiótico / el producto natural en concentración mM en un disolvente apropiado (hasta un 5% de EtOH, DMSO, DMF, acetona), en un buffer apropiado con un valor de pH de 6,5 y fuerza iónica apropiada (0,1-0,2 M). Se añade un exceso del 10x-20x de glutation en estado reducido disuelto en agua bidestilada. A continuación se lleva a cabo bien una alcalinización mediante un cambio de pH a un valor de pH 8 o una incubación con un extracto total de glutation S-transferasa de maíz, trigo o brotes de soja así como GST comercial de rata o bien hígado de conejo (Sigma-Aldrich).

Las muestras se incuban durante horas en la oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se para mediante la adición de un 1% de TCA, después se lleva a cabo una extracción por agitación del conjugado mediante la adición del mismo volumen de cloroformo/cloruro de metileno (3:8, v/v). La separación de fases se establece mediante una corta centrifugación; la substancia a extraer permanece en la fase orgánica, el conjugado en la acuosa. La fase acuosa se extrae con una pipeta y se aplica sobre un cartucho C18-(por ejemplo Sep-Pak®, Waters, entre otras) preequilibrado con acetonitrilo. La elución con un 5-35% de acetonitrilo eluye el conjugado de glutation. Los concentrados se sedimentan por centrifugación o se evaporan a sequedad y se almacenan a -20°C hasta su utilización.

Los conjugados preparados pueden utilizarse para la inducción de las enzimas de desintoxicación vegetal después de su disolución en un disolvente apropiado o bien en una formulación corriente de productos agroquímicos. La aplicación sobre las plantas se lleva a cabo según las leyes GLP de la BBA.

Entonces se analiza el éxito de la inducción de cada composición particular. Esto se lleva a cabo determinando espectrofotométricamente el rendimiento de la desintoxicación en sistemas de análisis estándar o analizando la transcripción de los genes correspondientes a través de HPLC o mediante métodos de biología molecular.

De acuerdo con la invención, se induce o se aumenta en particular la actividad de las glutation-S-transferasas como enzimas de desintoxicación vegetal. Sin embargo, también es posible activar otras enzimas de desintoxicación vegetal. A este grupo pertenecen, por ejemplo, las sulfotransferasas, las ATP-sulfurilasas, las glutation-S-transferasas, las O-glucosiltransferasas, las esterasas, las peroxidasas, las P-450 monooxigenasas.

Los conjugados de glutation se emplean en una cantidad activa. Dicha cantidad activa se encuentra por ejemplo en el rango de 1-1000 \muM, por ejemplo en el rango de 10-500 \muM. La aplicación puede llevarse a cabo por ejemplo mediante aspersión o regado, de manera que se ponen en contacto las composiciones con la superficie de las plantas.

La industrialización de enzimas de desintoxicación en plantas y animales es un fenómeno conocido en sí, que se aprovecha ya en la práctica de numerosas maneras. Así se aumenta un poco la resistencia contra herbicidas en las plantas mediante antídotos inespecíficos, cuya acción se debe al aumento de la capacidad de desintoxicación. Los mecanismos que conducen al aumento se conocen extensamente. En el caso de las P-450-monooxigenasas se conocen, en animales, receptores específicos de moléculas extrañas (por ejemplo barbiturato, PCB, PAH) que liberan moléculas señal tras el acoplamiento de la molécula extraña, las cuales se unen específicamente al ADN. Sin embargo, no se han descrito mecanismos análogos para sistemas vegetales. Frecuentemente se toma como agente inductor el estrés oxidativo provocado por la propia molécula extraña o por la acción correspondiente de sus productos metabólicos.

Por lo tanto, la presente invención va más allá de las investigaciones existentes sobre el mecanismo de inducción de las glutation-transferasas en plantas. Así pudo mostrarse por primera vez que los conjugados con glutation actúan como moléculas señal que, por ejemplo, pueden activar e inducir enzimas del metabolismo de desintoxicación vegetal. A través de los resultados existentes se pone a disposición del experto medio en la técnica una solución al problema de la desintoxicación vegetal de los productos agroquímicos y las substancias perjudiciales, en concreto la utilización de un conjugado de glutation que actúa como molécula señal y contribuye a la desintoxicación vegetal de las substancias orgánicas perjudiciales y los productos agroquímicos.

A pesar de largos años de investigación, se desconocía hasta ahora que el propio conjugado de glutation toma el papel de molécula señal. Hasta ahora, la utilización de los conjugados de glutation trataba siempre de evitar los productos de partida tóxicos y sus posibles propiedades inductoras en experimentos de incubación y utilizar en su lugar una clase de substancias que debe transformarse primero en la planta en un agente supuestamente activo. Mediante la presente invención se manifieste primero que los conjugados de glutation, que se producen enzimáticamente bien en la cubierta nuclear o se translocan hacia la misma, participan directamente en la cadena de señales que regulan la activación de los genes de resistencia. Se desconocía hasta ahora en plantas mediadores de este tipo. A través de los resultados experimentales presentados puede a partir de ahora desintoxicarse plantas de productos agroquímicos y substancias perjudiciales.

La presente invención se ilustra ahora con la ayuda de ejemplos de conjugados de glutation específicos. Sin embargo, el experto medio en la técnica puede sin más, en base a su conocimiento técnico y en base a la presente descripción, sintetizar los diferentes conjugados de glutation y ensayar mediante un procedimiento de screening en tejidos vegetales o cultivos celulares de los mismos, si los conjugados activan la capacidad de desintoxicación según la invención. Así, por ejemplo, puede llevarse a cabo una determinación directa de actividad o una medida del rendimiento de inducción mediante métodos de biología molecular. Los conjugados activos se filtran, re- sintetizan y se continúan investigando en estudios de campo y plantas enteras. Finalmente, se someterán las substancias a los tests habituales para el registro de productos agroquímicos.

Mediante los siguientes experimentos se pudo demostrar, que los conjugados de glutation activan específicamente enzimas de desintoxicación vegetal, por ejemplo glutation-S-transferasas. Para ello se preparó un conjugado fluorescente de glutation y monoclorbiman. Mediante este marcador fluorescente puede seguirse el camino del conjugado a través de la célula. Estudios de tiempos demostraron, que después de la incubación con monoclorbiman aparece una intensa fluorescencia en el núcleo celular, antes de que el citosol emita fluorescencia. La fluorescencia (es decir, el conjugado) abandona a continuación el núcleo y se concentra en estadios posteriores en la zona de las vacuolas. Con el desarrollo de la fluorescencia va unida un aumento transiente de la capacidad de desintoxicación enzimática en las células, que se debe a una síntesis de-novo de proteínas. Por este motivo pueden catalogarse los conjugados de glutation de este tipo como análogos hormonales y utilizarse de manera correspondiente. Por lo tanto, en base a estos resultados de investigación, los conjugados de glutation también son apropiados como moléculas señal en células vegetales, en las cuales pueden introducirse con ayuda de disolventes apropiados y/o adyuvantes de formulación. Los conjugados se acumulan en el núcleo celular y provocan allí un aumento rápido y transiente de la actividad de GST y otras enzimas de 5 desintoxicación vegetales y la capacidad de desintoxicación en plantas. Pueden utilizarse en base a presente invención inductores específicos que no deben metabolizarse primero en la planta para desplegar su actividad.

Los siguientes apócopes significan:

CDNB: 1-cloro-2,4-dinitrobenzol;

DCNB: 1,2-dicloro-4-nitrobenzol;

PPNP: 1,2-epoxi-3(p-nitrofenoxi)-propano;

\gamma-GC: radical \gamma-glutamil-cisteinil-;

GS: radical glutationil-;

GSH: glutation, reducido;

GST: glutation-S-transferasa;

MBB: monobromobiman;

MCB: monoclorobiman;

NBD-Cl: 7-cloro-4-nitrobenzo-2-oxi-1,3-diazol.

El objetivo de los siguientes experimentos era evidenciar la formación del conjugado de forma dependiente de GST y el transporte del conjugado en las células e investigar la influencia de los xenobióticos y sus correspondientes conjugados de glutation sobre su actividad GST en cebollas.

Para diferentes xenobióticos, se encontró una actividad GST en extractos de proteínas de tejidos epidérmicos de cebollas. La actividad pudo demostrarse tanto en el citosol como también en las fracciones microsomales. La conjugación con CDNB- y MBB- tuvo lugar con los mayores valores, pudiéndose constatar en el caso de la conjugación con MBB valores no enzimáticas extremadamente altos. En contraposición a CDNB, pudo demostrarse una conjugación MBB únicamente en el citosol. A diferencia de las condiciones en el citosol, la actividad correspondiente a la conjugación de CDNBN y DCNB era las misma en las fracciones microsomales extraídas de los mismos tejidos. El EPNP se conjugó con los mayores valores bajo las condiciones presentes mediante GST asociado a los microsomas. Las actividades MCB fueron moderadas y exclusivamente presentes en el citosol pero condujeron a la formación de un conjugado ligeramente fluorescente. Bajo las condiciones aplicadas in vitro sólo tuvo lugar una lenta formación de conjugado en sistemas de ensayo sin GST, mientras que a valores de pH sobre 7,6 tuvo lugar una formación no enzimática de un conjugado de glutation en proporción significativa.

Se ensayó microscópicamente el desarrollo de la fluorescencia en preparaciones de cebolla epidérmicas in vivo. El desarrollo de fluorescencia tuvo lugar en pocos minutos tras la incubación de las tiras epidérmicas con MCB, y se descubrió que la fluorescencia empieza casi simultáneamente en el citosol cerca de la barrera celular y en la cubierta nuclear de las células epidérmicas. Observando el desarrollo de la fluorescencia en el núcleo, en las vacuolas y en el citosol, se comprobó que la fluorescencia en el citosol y en las vacuolas mostraba el mismo incremento, de lo cual se puede deducir que lo más probable es que la fluorescencia en el citosol irradie de las vacuolas. Tras tres minutos sobrepasó la fluorescencia nuclear a la fluorescencia citosólica de manera significativa. Curiosamente, disminuyó la fluorescencia en el citosol y en el núcleo después de 10 minutos y 15 minutos, respectivamente, mientras que en las vacuolas apareció una luminosa fluorescencia. Esta se caracteriza por un aumento empinado de la curva de fluorescencia. Al final del experimento las células epidérmicas continuaban vivas, mostraban una circulación plasmática y mostraban una ligera fluorescencia conjunta con cercos luminosos en el núcleo y en las vacuolas. La fluorescencia general debe tener probablemente su origen en un transporte y una distribución preferida del conjugado en las vacuolas de las células, lo cual también pudo comprobarse mediante vacuolas aisladas.

A nivel enzimático, la incubación de células epidérmicas (células de la epidermis) de cebollas con MCB condujo a cambios rápidos y drásticos en la actividad GST. Los mayores efectos se observaron a concentraciones de 10 \muM a 50 \muM de xenobióticos. Después de 45 minutos de incubación con MCB 10 \muM y 50 \muM, la actividad GST para CDNB fue de 1,3x o bien 5,1x veces, respectivamente, la de los tejidos control. De forma similar, aumentó claramente la actividad para la conjugación de NBD-Cl. Sin embargo, desapareció la acción inductora de las dosis de conjugado a concentraciones alrededor de 50 \muM. La conjugación con DCNB estaba influenciada de manera contraria. El transstilbenóxido, añadido en concentraciones de 10 \muM y 50 \muM, provocó una pequeña inducción de los valores de conjugación con CDNB, DCNB y NHBD-Cl. El valor de conjugación con DCNB decayó ya a 50 \muM y se puso de manifiesto una inhibición al 50% de todas las actividades a concentraciones de 100 \muM.

En experimentos de transcurso de tiempo utilizando conjugados con Biman-GS y \gammaGC o cloronitrobenzol-GS y \gammaGC como inductores del GST de cebollas, pudieron analizarse en detalle los efectos descritos. La figura 1 muestra las consecuencias de la administración de conjugados con xenobióticos en capas celulares de epidermis de cebollas peladas. El conjugado de glutation de clorbiman influyó intensamente la actividad GST en el transcurso de una hora y condujo a doblar el valor de conjugación de CDNB y NBD-Cl (figuras 1a, b). Sin embargo, dos horas después de la administración se perdió el efecto. Mediante la administración del conjugado con Biman-GS se inhibió intensamente e irreversiblemente la conjugación con DCNB. Curiosamente, concentraciones más altas del conjugado no provocaron los mismos efectos o efectos más intensos sobre la conjugación con CDNB y NBD-Cl; pero se inhibió la actividad de DCNB al 100% (figura 1b).

El clorodinitrobenzol-GS provocó una inducción casi del 200% de la conjugación con NBD-Cl (figuras 1c, d), mientras que para el mismo tiempo, la conjugación con CDNB permaneció invariable y la conjugación con DCNB se inhibió al 50%. La administración de 20 \muM de conjugado provocó sólo un pequeño efecto (figura 1d). En general, Los conjugados \gammaGC de Biman así como CDNB no condujeron a efectos dramáticos, que se observaran después de la 5 administración de los correspondientes conjugados con glutation, a excepción de una inhibición significativa de la conjugación con DCNB (figuras 1e-h).

Las influencias transientes sobre la actividad GST, que se muestran en la figura 1, se investigaron más a fondo. Cuando se expuso la epidermis de cebolla a 100 \muM de clicloheximida, que se desarrolló originalmente como control de la inhibición de la síntesis de-novo de GST, pudieron observarse en el intervalo de las dos primeras horas del experimento, aumentos significativos y transientes de la conjugación con CDNB y NBD-Cl. Estos aumentos se encontraban cerca del 100% de los valores control, pero se perdieron después de 3,5 horas. Después de este punto se observaron las pérdidas de actividad GST (figura 2a).

Al añadir CDNB a los tejidos de cebolla epidérmicos, se observó el mismo efecto transiente con una alta actividad después de dos horas y una pérdida de actividad después de una hora adicional; pero después de cuatro horas se observó de nuevo un aumento de la actividad GST (figura 2b). La adición de nitrobenzil-glutation, un conjugado de glutation comercial, provocó un fuerte aumento de la actividad GST en el intervalo de los primeros 45 minutos del experimento y una disminución constante de la actividad GST en relación a los valores control durante las siguientes seis horas (figura 2c). En ninguna de las diferentes investigaciones de tiempos varió significativamente la actividad DCNB.

La administración de la cicloheximida junto a CDNB o nitrobenzil-glutation condujo a los mismos cambios en el patrón de actividad GST a lo largo del tiempo. La estimulación transiente observada anteriormente dentro de la primera fase del experimento (de 0 a 2 horas) se perdió; sin embargo puedo observarse una fuerte disminución transiente de las actividades GST para la conjugación con CDNB y NBD-Cl después de cuatro horas.

A partir de estas investigaciones y basándose en el resultado que mostró la aparición de un desarrollo de fluorescencia en el núcleo debido a la acumulación del conjugado de glutation del xenobiótico clorbiman en la cubierta nuclear o en el núcleo, puede deducirse que los conjugados de glutation pueden utilizarse como moléculas señal para la estimulación de la actividad de enzimas de desintoxicación vegetal, en particular de la actividad de GST.

Claims (7)

1. Procedimiento para aumentar la capacidad de desintoxicación de plantas frente a substancias orgánicas perjudiciales y/o productos agroquímicos, caracterizado por el hecho de que las plantas contaminadas con las substancias perjudiciales y/o productos agroquímicos se ponen en contacto con una cantidad activa de un conjugado de glutation, o bien un conjugado análogo a glutation, se transporta el conjugado al núcleo celular y se acumula allí, donde actúa como molécula señal, provocando así una inducción y/o aumento de la actividad de las enzimas de desintoxicación vegetal en la célula vegetal.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que como conjugados se utilizan conjugados de herbicidas, antídotos de herbicidas (substancias protectoras), xenobióticos y productos naturales, que deben ser conjugables con el glutation.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por el hecho de que se utiliza como glutation análogos de glutation.

4. Procedimiento según cualquiera o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que se induce y/o aumenta la actividad de sulfotransferasas, ATP-sulfurilasas, glutation-S-transferasas, O-glucosiltransferasas, esterasas, peroxidasas, P-450-monooxigenasas como enzimas de desintoxicación vegetales.

5. Procedimiento según cualquiera o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que los conjugados de glutation se utilizan en una cantidad de 1 a 1000 \muM, preferentemente 10-500 \muM.

6. Procedimiento según cualquiera o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que los conjugados de glutation se ponen en contacto con superficie de las plantas mediante aspersión o regado.

7. Utilización de conjugados de glutation como moléculas señal para inducir y/o aumentar la actividad de enzimas de desintoxicación vegetales, donde mediante el transporte de los conjugados al núcleo celular y su acumulación en el núcleo celular, aumenta la capacidad de desintoxicación de las plantas contaminadas con substancias orgánicas dañinas y/o productos agroquímicos.