DE19845883A1 - Assembly for automatic bio tests - Google Patents
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- DE19845883A1 DE19845883A1 DE19845883A DE19845883A DE19845883A1 DE 19845883 A1 DE19845883 A1 DE 19845883A1 DE 19845883 A DE19845883 A DE 19845883A DE 19845883 A DE19845883 A DE 19845883A DE 19845883 A1 DE19845883 A1 DE 19845883A1
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Abstract
Description
Biotests sind bekannt. So werden z. B. biologische Kurzzeittests zur Keimung und zum weite ren Wachstum von Pflanzen insbesondere der Wurzel und des Sprosses bis zum Keimblattsta dium durchgeführt.Bioassays are known. So z. B. Short-term biological tests for germination and for wide growth of plants, especially the roots and shoots, up to the cotyledon done.
Derartige Biotests werden je nach Fragestellung zur Bestimmung der Vitalität von Saatgut, besonders aber zum integralen Aufspüren von phyto/pflanzentoxischen Wirkungen von Rein stoffen, Stoffgemischen und Umweltproben (Wasser, Wasserkonzentrate, Boden, Sediment, Boden- und Sedimenteluate und -extrakte, Feststoffe) eingesetzt.Depending on the question, such bioassays are used to determine the vitality of seeds, but especially for the integral detection of phyto / plant-toxic effects of pure substances, mixtures of substances and environmental samples (water, water concentrates, soil, sediment, Soil and sediment eluates and extracts, solids) are used.
Sie ermöglichen die integrale Bewertung von in die Umwelt einzubringenden oder dort vor kommenden Stoffen hinsichtlich möglicher Gefährdungspotentiale z. B. durch Schadstoffein trag aus der Luft und dem Regen in Waldgebieten. Für potentielle Schadstoffgemische mit komplexer, chemisch-analytisch gar nicht umfassend analysierbarer Zusammensetzung - z. B. Abwasser-, Deponiesickerwasserströme, Bodenextrakte besonders aus Altlasten und deren biologische Sanierungsprodukte - Verbrennungsprodukte (Abgase) aus der Chemischen Indu strie, der Energieerzeuger und dem Straßenverkehr sind integrale Wirkungstests zur ökotoxi kologischen Bewertung unverzichtbar.They enable the integral assessment of those to be introduced into the environment or before upcoming substances with regard to possible hazard potentials e.g. B. by pollutants carry out of the air and the rain in forest areas. For potential pollutant mixtures with complex, chemical-analytically not fully analyzable composition - z. B. Wastewater, landfill leachate, soil extracts especially from contaminated sites and their biological remediation products - combustion products (exhaust gases) from chemical ind strie, the energy producer and road traffic are integral effects tests for ecotoxi ecological evaluation indispensable.
Biotests können besonders bei modernen Pflanzenschutzmitteln (hoher Wirksamkeit bei gerin ger Aufwandmenge) in Ergänzung und Konkurrenz zur oft schwierigen chemischen Analytik treten.Biotests can be particularly useful with modern crop protection products (high effectiveness with low low application rate) to complement and compete with the often difficult chemical analysis to step.
Das Wachstum von terrestrischen oder aquatischen Gefäßpflanzen ist die lebenswichtige Grundlage für jegliches tierische und menschliche Leben auf der Erde. Trotzdem wurde die Verwendung von Gefäßpflanzen zum Aufspüren von Schadstoffen bisher stark gegenüber dem Einsatz von einzelligen Algen vernachlässigt. Gefäßpflanzen sind jedoch z. B. gegenüber au xinanalogen Herbiziden viel empfindlicher als einzellige Algen, da letztere nicht über eine auxingesteuerte Wachstumsregulation verfügen. Die Bewertung von Luftschadstoffen ist erst durch die quantitative Erfassung von höheren Pflanzen möglich.The growth of terrestrial or aquatic vascular plants is vital Basis for all animal and human life on earth. Nevertheless, the Up to now, the use of vascular plants for the detection of pollutants has been strong Neglected use of unicellular algae. Vascular plants are, for. B. opposite au xin-analog herbicides much more sensitive than single-celled algae, since the latter do not have a auxin-controlled growth regulation. The assessment of air pollutants is just now possible through the quantitative recording of higher plants.
Der Grund für den selteneren Einsatz von Gefäßpflanzen ist unter anderem die höhere For menvielfalt und Komplexität von Gefäßpflanzen, welche bisher eine manuell optische und damit zeit- und kostenintensive und niemals völlig objektivierbare Auswertung erforderlich macht.The reason for the rarer use of vascular plants is, among other things, the higher For variety and complexity of vascular plants, which previously had a manual optical and This means that time-consuming and cost-intensive evaluation, which is never completely objective, is required makes.
Der Pflanzen-Keimungs-Wurzellängentest z. B. nutzt die hohe Empfindlichkeit von Pflanzen gegenüber toxischen Stoffen während der Keimungsphase bis zur Ausbildung der Keimblätter aus.The plant germination root length test z. B. uses the high sensitivity of plants against toxic substances during the germination phase up to the formation of the cotyledons out.
Richtlinien für die Testdurchführung finden sich z. B. in:
Guidelines for performing the test can be found e.g. B. in:
- - DIN Entwurf 38412 "Bestimmung der Wirkung von Abwasser auf das Wurzellängen wachstum der Gartenkresse". Dieser sieht ein dreitägiges beleuchtetes Wachstum von Kressesamen auf Edelstahlnetzen in eine Verdünnungsreihe von Abwasser vor. Als Meß größen dient die manuell gemessene Wurzellänge. Außerdem sollen Erscheinungen wie die Ausbildung der Wurzelhaarzone und Entwicklungszustand von Hypokotyl und Blättern protokolliert werden.- DIN Draft 38412 "Determination of the effect of wastewater on the root length growth of garden cress ". This sees a three-day illuminated growth of Cress seeds on stainless steel nets in a dilution series of wastewater. As a measurement The manually measured root length is used for sizes. In addition, apparitions such as the formation of the root hair zone and the state of development of the hypocotyl and leaves be logged.
- - Der Entwurf DIN 350 11 269 Teil 1 beschreibt die Prüfung des Wachstums vorgekeimter Gerstesamen in Bodenproben. Auch hier sollen nach 5 bis 7 Tagen und Entfernung der Er de die Länge der längsten Wurzel, gegebenenfalls auch die des Triebes gemessen werden.- The draft DIN 350 11 269 part 1 describes the test of the growth of pre-germinated Barley seeds in soil samples. Again, after 5 to 7 days and removal of the Er de the length of the longest root, if necessary also that of the shoot.
- - Die EPA-Richtlinie 600-3-88-029 sieht ein fünftägiges "Protocols for short term toxicity screening of hazardous waste sites" Wachstum z. B. von Salatsamen im hell-/dunkel-Zyklus in Petrischalen in Gegenwart der Testlösung vor. Mögliche Meßgrößen sind Keimung, Wurzellänge und Trockengewicht.- EPA Guideline 600-3-88-029 provides a five-day "Protocols for short term toxicity screening of hazardous waste sites "Growth of, for example, lettuce seeds in the light / dark cycle in petri dishes in the presence of the test solution. Possible measurands are germination, Root length and dry weight.
Allen Richtlinien ist gemeinsam, daß neben der zerstörenden Trockenmassebestimmung nur die einfachste Meßgröße des Wachstums - die Länge der Wurzel- bestimmt wird, da nur diese Längenmessung dem menschlichen Auge problemlos möglich ist.All guidelines have in common that apart from the destructive determination of dry matter only the simplest measure of growth - the length of the root is determined because only this Length measurement is easily possible for the human eye.
Weiter bekannt sind biologische Kurzzeittests zur Wachstumshemmung/-förderung von Was serlinsen (Lemnaceae): Biological short-term tests to inhibit / promote growth of What are also known serlin lenses (Lemnaceae):
Wurzelnde oder freischwimmende Gefäßpflanzen sind neben Algen ein wesentlicher Be standteil vieler aquatischer Ökosysteme. Wasserlinsen sind eine Nährungsquelle für Wasser vögel und viele Kleintiere. Sie dienen Fischen als Futter, Deckung und Schatten. Kleine wir bellose Tiere nutzen sie als Träger. Bei zu schnellem Wachstum können sie jedoch Licht- und Sauerstoffzufuhr soweit unterbinden, daß es zu Fischsterben kommt.In addition to algae, rooting or free-floating vascular plants are an important factor part of many aquatic ecosystems. Duckweed is a source of nutrition for water birds and many small animals. They serve fish as food, cover and shade. Small we bellose animals use them as carriers. If they grow too quickly, however, they can light and Cut off oxygen supply to the extent that fish die.
Ein Test ist z. B. in der ASTM Guideline E 1415-91 "Standard Guide for Conducting Static Toxicity Tests With Lemna gibba G3" dargestellt. Eine vergleichbare europäische Richtlinie gibt es noch nicht. Der Test nutzt die Tatsache aus, daß sich die Schwimmblätter von Wasser linsen bei ausreichender Temperierung, Beleuchtung und Nährstoffversorgung sehr schnell teilen. Unter toxischer Belastung kommt es jedoch zu einer Gelbfärbung vorhandener Schwimmblätter und zu einer Verringerung der Teilungsgeschwindigkeit.A test is e.g. B. in ASTM Guideline E 1415-91 "Standard Guide for Conducting Static Toxicity Tests With Lemna gibba G3 ". A comparable European guideline does not exist yet. The test takes advantage of the fact that the floating leaves are separated from water lentils with adequate temperature control, lighting and nutrient supply very quickly divide. Under toxic loads, however, there is a yellowing Floating leaves and a reduction in the rate of division.
Dazu müssen vor Testbeginn nach Augenmaß in alle Versuchsansätze "gleichwertige" Was serlinsenpflanzen aus der Vorzucht aussortiert und in Gefäße mit Nährlösung eingesetzt wer den. Dies ist grundlegend, da sich Startunterschiede im Verlauf des Tests weiter vergrößern und damit Schadstoffeffekte verdecken können. Gleichzeitig ist die optisch manuelle Auswahl von Pflanzen mit "gleichwertiger" Blattanzahl und Größe auch in Hinblick auf die Erforder nisse der Qualitätssicherung und Dokumentation mit einem hohen subjektiven Faktor belastet. Nach Ende der normalerweise siebentägigen Wachstumsphase im Phytotron, einer sehr gleichmäßig ausgeleuchteten Klimakammer, muß anhand einer geeigneten Meßgröße die För derung oder Hemmung des Wachstums behandelter Versuchsansätze gegenüber unbehandelten Kontrollansätzen ermittelt werden. Die häufigste und einfachste Methode ist die Zählung der einzelnen Schwimmblätter unabhängig von deren Größe. Weitere Meßgrößen sind die Anzahl der gebildeten Wurzeln, das Trockengewicht und die Gesamtlänge aller Wurzeln. Das Troc kengewicht ist der objektivste und reproduzierbarste Endpunkt, ist aber nur einmal unter Zer störung der Wasserlinsen möglich. Der Chlorophyllgehalt ist sehr aussagekräftig für die Vita lität der Pflanzen, aber ebenfalls nur unter Zerstörung direkt meßbar.For this purpose, "equivalent" what must be done in all test approaches before the start of the test Serlin lens plants are sorted out from the pre-breeding and placed in vessels with nutrient solution the. This is fundamental as start differences widen further as the test progresses and can thus hide pollutant effects. At the same time is the optically manual selection of plants with "equivalent" number of leaves and size also with regard to the requirements quality assurance and documentation are subject to a high subjective factor. After the normally seven-day growth phase in the phytotron, one very evenly illuminated climate chamber, the För change or inhibit the growth of treated experimental approaches compared to untreated Control approaches are determined. The most common and easiest method is to count the number individual floating leaves regardless of their size. The number is another measure the roots formed, the dry weight and the total length of all roots. The Troc Weight is the most objective and reproducible endpoint, but is only once under Zer Dysfunction of duckweed possible. The chlorophyll content is very meaningful for the vita plants, but also only directly measurable with destruction.
Nachteilig bei den genannten Testverfahren ist der hohe Arbeitsaufwand, die schlecht doku mentierbaren, da subjektiven Einflußfaktoren und/oder die objektzerstörenden Maßnahmen.A disadvantage of the test methods mentioned is the high workload, which is poorly documented mentable, since subjective influencing factors and / or the object-destroying measures.
Es ist demzufolge Aufgabe der vorliegenden Erfindung, unter Vermeidung der aus dem Stand der Technik bekannten Merkmale eine einfach durchzuführende, objektivierbare und objekter haltende Möglichkeit zur Durchführung und Auswertung von Biotests zu schaffen. It is therefore an object of the present invention, while avoiding the prior art the features known in the art are simple to carry out, objectifiable and objective create lasting opportunity to conduct and evaluate bioassays.
Diese Aufgabe wird gelöst mit einer Vorrichtung zur Durchführung von Biotests, die Mittel zur automatischen bildanalytischen Auswertung von in Probenschalen angeordneten biologi schen Proben mit und ohne Einfluß potentiell phytotoxischer Substanzen in verschiedenen Matrices und eine optische Aufnahmeeinrichtung aufweist, die die Probenschale mit Auf- oder Durchlicht beleuchtet, die Proben gegebenenfalls mit einer Glasscheibe oder einer hoch pola ren Matrix planarisiert, mit einer digitalen (CCD) Kamera aufnimmt und die Daten zur Re duktion und Auswertung an ein Bildanalysesystem weitergibt.This object is achieved with a device for carrying out bioassays, which means for the automatic image analysis evaluation of biologi arranged in sample dishes specimens with and without influence of potentially phytotoxic substances in different Has matrices and an optical recording device that the sample dish with or Illuminated by transmitted light, the samples, if necessary, with a glass pane or a highly pola planarized, recorded with a digital (CCD) camera and the data for re production and evaluation to an image analysis system.
Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche.Advantageous refinements are the subject of the dependent claims.
So ist es bevorzugt, wenn die Vorrichtung Mittel zur automatischen Diskriminierung von Pro benbestandteilen wie z. B. Samenhülle, Sproß, Wurzel, Wurzelhaare oder von Wurzelhaaren überdeckter Fläche, und zur darauffolgenden quantitativen Vermessung der Bestandteile auf z. B. Länge, Breite und Schattenfläche aufgrund der erhobenen Daten mittels Bildanalyse auf weist.So it is preferred if the device means for automatic discrimination of Pro ben ingredients such. B. seed coat, sprout, root, root hair or of root hair covered area, and for the subsequent quantitative measurement of the components e.g. B. length, width and shadow area based on the data collected using image analysis points.
Weiter vorteilhaft sind Mittel zur Wiederauffindung individueller Proben, Probenbestandteile oder Probengruppen bei periodischen Vermessungen der gleichen Probe anhand von spezifi schen Formmerkmalen und Informationen über die räumlichen Veränderungsmöglichkeiten zwischen den Messungen.Means for retrieving individual samples, sample components, are also advantageous or sample groups for periodic measurements of the same sample based on speci shape features and information about the spatial change options between measurements.
Wenn an/in den Versuchseinheiten im Sichtfeld der Kamera Barcodes angeordnet sind, die zur sicheren Zuordnung der einzelnen Messungen jeweils bildanalytisch mit ausgewertet werden und neben Informationen zum Testansatz auch Angaben über die computergenerierte Plazie rung der Schale bei randomisierten Versuchen enthalten, liegt eine weitere bevorzugte Ausfüh rungsform vor.If barcodes are arranged on / in the test units in the field of view of the camera, which are used for reliable assignment of the individual measurements can be evaluated with image analysis and in addition to information about the test approach, information about the computer-generated plazie shell in randomized trials is another preferred embodiment form.
Es ist weiter vorteilhaft, wenn eine Einrichtung zur automatischen Kalibrierung mit einem Einheitskörper bekannter Körpergeometrie und Farbe durch automatisches Vermessen von der Bildverarbeitung vorgesehen ist. Hierdurch können in einfacher Weise die Probendaten in ab solute Werte umgerechnet werden.It is further advantageous if a device for automatic calibration with a Unit body of known body geometry and color by automatic measurement of the Image processing is provided. This allows the sample data in a simple manner solute values are converted.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn der oder die Barcodes auf dem Einheitskörper zur Kalibrie rung angeordnet sind, da so der apparative Aufwand reduziert wird. It is particularly advantageous if the bar code or codes on the unit body for calibration tion are arranged, since this reduces the expenditure on equipment.
Wenn dies erforderlich sein sollte, die Bildanalyse auch ohne sichtbares Licht durchzuführen, kann eine Beleuchtungseinrichtung zum Auswerten in dunkler Testumgebung mit einem Wellenlängenbereich, der die Pflanzen in ihrem Verhalten nicht beeinflußt und bei der die CCD-Kamera arbeitet, vorgesehen werden.If this is necessary to carry out the image analysis without visible light, can a lighting device for evaluation in a dark test environment with a Wavelength range that does not affect the behavior of the plants and at which the CCD camera works to be provided.
Insbesondere kann dies eine Infrarotbeleuchtungseinrichtung sein.In particular, this can be an infrared lighting device.
Die in manchen Testreihen erforderliche, nach Farben getrennte Erfassung und Auswertung der Proben wird durch eine Farbkamera oder eine optische Filtereinrichtung realisiert.The recording and evaluation separated by color in some test series the samples are realized by a color camera or an optical filter device.
Vorteilhaft ist weiter, wenn Mittel zum Vergleichen der gewonnenen Daten mit abgespeicher ten Vergleichsdaten vorgesehen sind. Hierdurch kann auf im Laufe der Zeit angesammeltes Referenzdatenmaterial zurückgegriffen werden.It is also advantageous if means for comparing the data obtained with stored th comparison data are provided. This can lead to accumulation over time Reference data material can be used.
Wenn die Aufnahmeeinrichtungen (CCD Kamera) und die Auswerteeinrichtungen (Bildanaly sesystem) räumlich getrennt sind, kann die Auswertung in vorteilhafter Weise zentral durchge führt wird. Hierdurch muß nicht an jedem Test-/Arbeitsplatz die volle Rechenleistung vorge halten werden.If the recording devices (CCD camera) and the evaluation devices (image analysis system) are spatially separated, the evaluation can advantageously be carried out centrally leads. As a result, the full computing power does not have to be provided at every test / work station will hold.
Die CCD Kamera und die Probenschalen sollte relativ zueinander beweglich angeordnet sein, damit die CCD Kamera unterschiedliche Probenbereiche anfahren, fokussieren und aufnehmen kann.The CCD camera and the sample dishes should be arranged to be movable relative to each other, so that the CCD camera moves to different sample areas, focuses and records can.
Bevorzugt ist weiter, wenn die Auswerteeinrichtungen (Bildanalysesystem) anhand von Farb- und Strukturmustern der Testpflanzen Rückschlüsse auf die Xenobiotika (Umweltchemikali en) ziehen kann. Xenobiotika (Umweltchemikalien) verursachen bei den genannten Pflanzen verschiedene Strukturwandlungen. Die Pflanzen können sich z. B. in Farbe, Form, Größe, Teilungsrate, Infrarotmuster oder Chlorophyllgehalt verändern. Es kann vollständiger und partieller Pigmentverlust auftreten. Es kommt zu Kolonieenaufbruch, zur Buckelbildung, zum Verlust oder zur extremen Bildung von Wurzelhaaren. Wasserlinsen können Antozyane auf der Unterseite bilden, oder sie bilden Turione. All diese Merkmale können Rückschlüsse auf vorhandene Xenobiotika zu lassen. Die meisten Merkmale sind jedoch nach heutigem Stand der Technik nur durch Zerstörung des Organismus zu bestimmen. Dadurch können immer nur einzelne Merkmale untersucht werden, und die spezifische Aussagekraft der Mes sung ist nicht gegeben. Durch die Integrale Erfassung aller Merkmale, kann die Auswerte einrichtung Rückschlüsse auf die vorliegenden Xenobiotika machen. Dabei werden zwei ver schiedene Strategien verfolgt. Zum einen erkennt die Auswerteeinrichtung vorgegebene Merkmalsmuster, zum anderen werden durch eine Vielzahl von Tests neue Merkmalsver knüpfungen von der Auswerteeinrichtung selbständig gefunden.It is further preferred if the evaluation devices (image analysis system) are based on Color and structure patterns of the test plants, conclusions on the xenobiotics (environmental chemicals en) can pull. Xenobiotics (environmental chemicals) cause the above-mentioned plants different structural changes. The plants can z. B. in color, shape, size, Change division rate, infrared pattern or chlorophyll content. It can be more complete and partial pigment loss occur. There are colony breaks, humps, for the loss or extreme formation of root hairs. Duckweed can Antozyane form on the bottom, or they form Turione. All of these characteristics can draw conclusions on existing xenobiotics. However, most of the features are as of today State of the art can only be determined by destroying the organism. This allows only individual characteristics are examined and the specific significance of the measurement solution is not given. The evaluation can be carried out by the integral recording of all characteristics institution draw conclusions about the xenobiotics available. Two ver pursued different strategies. On the one hand, the evaluation device recognizes predefined ones Feature patterns, on the other hand, a variety of tests are used to convert new features links found independently by the evaluation device.
Ein weiteres vorteilhaftes Merkmal der Erfindung ist es, daß die Auswerteeinrichtungen (Bild analysesystem) die Keimlinge aufgrund von Bewegungsmustern, Farb- und Formenklassen auch nach deren Aufwachsen wiederfinden kann. In Keimungs- und Aufwuchstest werden eine Vielzahl gleicher Pflanzen in einem Versuchsgefäß beobachtet. Durch die enorme Ähn lichkeit ist es bisher nicht möglich, einzelne Organismen wieder aufzufinden und sie eindeu tig über längere Zeit zu identifizieren. Die Aufnahmeeinheit kann z. B. bis zu 100 Keimlinge gleichzeitig beobachten, und sie aufgrund der beschriebenen Merkmalsmuster einwandfrei zuordnen. Hinzu kommt die Möglichkeit der Wiedererkennung aufgrund von vorgegebenen Bewegungsmustern.Another advantageous feature of the invention is that the evaluation devices (Fig analysis system) the seedlings based on movement patterns, color and shape classes even after growing up. Be in germination and growth test a large number of identical plants were observed in one test vessel. Because of the enormous resemblance So far it has not been possible to find individual organisms again and to see them again identifiable over a long period of time. The recording unit can e.g. B. up to 100 seedlings observe at the same time, and they work perfectly due to the described pattern of features assign. In addition, there is the possibility of recognition based on predetermined Movement patterns.
Objekte, die unter der Grenze der Auflösungsgröße der CCD-Kamera liegen (kleiner 1 mm), sollten bevorzugt originalgetreu wiedergegeben werden. Die normale Auflösungsgrenze von CCD Kameras mit einer Auflösung von 520.520 Pixeln liegt bei einem untersuchten Feld von 100×100 mm bei ca. 3 mm2 (520 Pixel a 3 Farben entsprechen 174 Pixel pro Farbe. Um ein Objekt klar darzustellen braucht man jedoch mindestens 3.3 Pixel). Da die Objekte bekannt sind, kann die Auswerteeinheit gefundene Objekte an bekannte Muster anfitten, und so die Auflösung erhöhen. Die Objekte werden dann nicht mehr als Pixel Matrix dargestellt, sondern als mathematische Funktion. Dadurch ist es möglich, die eigentlich beschränkte Auflösung der Kamera zu steigern und auch Objekte, die kleiner als 3 mm2 sind, maßstabs getreu darzustellen.Objects that are below the resolution size of the CCD camera (less than 1 mm) should preferably be reproduced true to the original. The normal resolution limit of CCD cameras with a resolution of 520,520 pixels in an examined field of 100 × 100 mm is approx. 3 mm 2 (520 pixels a 3 colors correspond to 174 pixels per color. However, in order to display an object clearly one needs at least 3.3 Pixel). Since the objects are known, the evaluation unit can begin to find objects found on known patterns and thus increase the resolution. The objects are then no longer displayed as a pixel matrix, but as a mathematical function. This makes it possible to increase the actually limited resolution of the camera and also to display objects that are smaller than 3 mm 2 true to scale.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform liegt vor, wenn die Aufnahmeeinrichtung (CCD-Kamera) und die Auswerteeinrichtung durch Filtersysteme die Stoffwechselrate der Pflanze anhand von Infrarotmustern bestimmen kann. Ein wichtiges Merkmal für die Fitneß von Pflanzen ist deren Stoffwechselrate. Sowohl die Photosyntheseleistung, als auch die Oxidati on von Stärke und Fetten verändern das Infrarotmuster durch Reflexion und eigener Emissi on von Pflanzen. Diese Veränderungen können mittels IR-Filtern durch die CCD Kamera sichtbar gemacht werden. Die Auswerteeinheit paßt die Filtersysteme selbständig an, und kann somit zwischen Photosynthesestoffwechsel und Atmung unterscheiden. Diese Merk malsmuster konnten bisher nicht zerstörungsfrei und über längere Zeit erfaßt werden, da die IR-Spektren nicht von dem normalen Grundrauschen zu unterscheiden waren. Durch spezi elle Beleuchtung und Kühlung lassen sich nun auch feinste Unterschiede feststellen.Another preferred embodiment is when the receiving device (CCD camera) and the evaluation device through filter systems the metabolic rate of the plant can determine using infrared patterns. An important characteristic for the fitness of Plants is their metabolic rate. Both the photosynthetic performance and the oxidati Starch and fats change the infrared pattern through reflection and own emissi on of plants. These changes can be done using IR filters through the CCD camera be made visible. The evaluation unit adjusts the filter systems independently, and can therefore differentiate between photosynthetic metabolism and breathing. This note Painting patterns have so far not been able to be recorded non-destructively and over a long period of time since the IR spectra were indistinguishable from the normal noise floor. By spec All lighting and cooling can now be determined even the finest differences.
Schließlich ist es vorteilhaft, wenn spezifische optische Filter für Beleuchtung und Kamera zur Messung und Quantifizierung der Fluoreszenz von Pflanzen vorgesehen sind. Bisher werden derartige Fluoreszenzsignale integral über die gesamte Bildfläche ausgewertet. Neu artig ist, daß derartige Fluoreszenzsignale mit morphologischen Filtern bearbeitet werden. Weiterhin werden die Bilddaten mit den Daten und Formen der Bildobjekte im sichtbaren und IR-Bereich überlagert und gemeinsam ausgewertet. Diese Anwendung eignet sich be sonders für Kurzzeittests im Stundenbereich.Finally, it is advantageous if specific optical filters for lighting and camera for measuring and quantifying the fluorescence of plants are provided. So far such fluorescence signals are evaluated integrally over the entire image area. New is like that such fluorescence signals are processed with morphological filters. Furthermore, the image data with the data and shapes of the image objects are visible and IR area overlaid and evaluated together. This application is suitable especially for short-term tests in the hour range.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung (vgl. Fig. 1) zeichnet sich bei vollständiger Kompatibili tät mit den vorhandenen Testrichtlinien durch eine Vermeidung der oben genannten Probleme bei gleichzeitiger Schaffung neuer, empfindlicherer Meßgrößen aus. Durch die automatische Bildanalyse werden subjektive Faktoren ausgeschlossen, der notwendige Personalaufwand drastisch reduziert. Damit werden Mehrfachmessungen problemlos möglich und eine valide, kontinuierliche Dokumentierbarkeit geschaffen.The device according to the invention (cf. FIG. 1) is characterized by complete compatibility with the existing test guidelines by avoiding the above-mentioned problems while simultaneously creating new, more sensitive measured variables. The automatic image analysis eliminates subjective factors and drastically reduces the personnel costs. This makes multiple measurements possible without any problems and creates a valid, continuous documentability.
Die eigentliche Auswertung wird nur durch die verwendete Software eingeschränkt. So ist es
z. B. möglich, mit den gewonnenen Daten folgende Untersuchungen durchzuführen:
The actual evaluation is only restricted by the software used. So it is z. For example, it is possible to carry out the following tests with the data obtained:
- - Erkennung von Nekrosen, Chlorosen und Blattmißbildungen;- detection of necrosis, chlorosis and leaf malformations;
- - Unterscheidung von toten und lebenden Blättern;- Differentiation between dead and living leaves;
- - Bestimmung der Wachstumsgeschwindigkeit und Keimungsrate und andere kontinuierli che oder engmaschige Bestimmungen von Parametern (z. B. Teilungsrate, Flächenzunah me, Chlorophyllentwicklung, Wachstumsdynamik, Absterbedynamik), die von Hand we gen des hohen Zeitaufwands kaum (wirtschaftlich) möglich sind;- Determination of growth rate and germination rate and other continuous Good or close-knit determinations of parameters (e.g. division rate, increase in area me, chlorophyll development, growth dynamics, death dynamics), which we do by hand are hardly (economically) possible due to the high expenditure of time;
- - Bestimmung der Blattanzahl;- determination of the number of sheets;
- - Bestimmung der Frondzahl;- determination of the frond number;
- - Bestimmung von Gesamt- und Einzelfrondfläche;- Determination of total and single front area;
- - Bestimmung von Gesamt- und Einzelgrünheit;- Determination of total and individual greenness;
- - Bestimmung des Chlorophyllgehaltes über die Grünheit der Blätter- Determination of the chlorophyll content via the greenness of the leaves
- - Bestimmung des Trockengewichts über Volumenanalyse und Flächenanalyse;- Determination of dry weight using volume analysis and area analysis;
- - Bestimmung von Effektkonzentrationen (ECx);- determination of effect concentrations (EC x );
- - Bestimmung von Blattgrößen, Blattgrößenverteilungen und Blattformen; - Determination of sheet sizes, sheet size distributions and sheet shapes;
- - Gesamterfassung einer höheren Pflanze;- overall registration of a higher plant;
- - automatischer Vergleich zu unbelasteten sogenannten Nullkontrollen, sowohl aus paralle len Versuchsansätzen als auch aus gespeicherten Datensätzen;- automatic comparison to unloaded so-called zero controls, both from parallel len experimental approaches as well as from stored data sets;
- - Erfassung von IR-Mustern und Überlagerung mit sichtbaren morphologischen Strukturen;- Acquisition of IR patterns and overlay with visible morphological structures;
- - Archivierung der bildanalytischen Daten z. B. für eventuelle spätere Zweitgutachten.- Archiving of image analytical data e.g. B. for possible subsequent second reports.
Dabei ist es insbesondere möglich, die gewonnenen Daten mittels Datenfernübertragung an eine zentrale Analyseeinrichtung zu übermitteln, dort z. B. durch Vergleich mit großen Bestän den an Standarddaten auswerten zu lassen und die Auswertung zurückzuübermitteln.It is in particular possible to transmit the data obtained by means of remote data transmission to transmit a central analysis device, there z. B. by comparison with large stocks to have the data evaluated on standard data and to send the evaluation back.
Die in den beiden Fig. 1 und 2 dargestellten Vorrichtungen sind lediglich Ausführungsbei spiele der Erfindung.The devices shown in the two Figs. 1 and 2 are only Ausführungsbei games of the invention.
In Fig. 1 ist eine Ausführungsform dargestellt, bei der die in einer Probenschale od. dgl. be findliche Probe auf einem Objekttisch angeordnet wird. Je nach Fragestellung erfolgt entweder keine Beleuchtung oder eine Beleuchtung von den neben der Kamera angeordneten Beleuch tungseinrichtungen als Auflicht oder von der unterhalb des Objekttisches angeordneten Be leuchtungseinrichtung als Durchlicht. Die Kamera, z. B. eine CCD Kamera nimmt die Bilder auf, die dann mittels einer Auswerteeinheit, vorzugsweise in Form eines PCs bildanalytisch verarbeitet werden. Die Daten werden auf einem Monitor dargestellt.In Fig. 1, an embodiment is shown in which the sample in a sample pan or the like. Be sensitive sample is arranged on an object table. Depending on the question, there is either no lighting or lighting from the lighting devices arranged next to the camera as incident light or from the lighting device arranged below the object table as transmitted light. The camera, e.g. B. a CCD camera records the images, which are then processed by image analysis using an evaluation unit, preferably in the form of a PC. The data is displayed on a monitor.
In Fig. 2 ist eine alternative Ausführungsform gezeigt, bei der die Kamera oberhalb einer Klimakammer mit mehreren Proben verfahrbar angeordnet ist. Die Kamera kann so in vorge gebenen zeitlichen Abständen die einzelnen Proben anfahren und entsprechende Aufnahmen wie vorbeschrieben machen.An alternative embodiment is shown in FIG. 2, in which the camera is arranged such that it can be moved with a plurality of samples above a climatic chamber. In this way, the camera can approach the individual samples at predetermined time intervals and take appropriate pictures as described above.
Nachstehend werden noch zwei Anwendungsbeispiele für die erfindungsgemäße Vorrichtung erläutert.Below are two more application examples for the device according to the invention explained.
Die erfindungsgemäße computergestützte Bildanalyse erfaßt jeden Keimling einzeln. Mit bildanalytischen Methoden werden dann Samenhülle, Sproß und Wurzel, gegebenenfalls auch Wurzelhaare separiert und dann getrennt quantifiziert. Mögliche Meßgrößen sind z. B. Samenquellung, Keimung (Wurzel nach bestimmter Inkubationszeit länger als 1-4 mm), Wurzellänge, Wurzelschattenfläche, mittlerer Wurzeldurchmesser, Verhältnis der Wurzel länge zum Durchmesser, von den Wurzelhaaren bedeckte Fläche, Sproßlänge, Sproßfläche und Blattfläche.The computer-assisted image analysis according to the invention detects each seedling individually. With Image analytical methods are then seed coat, shoot and root, if necessary also root hairs separated and then quantified separately. Possible measurands are e.g. B. Seed swelling, germination (root longer than 1-4 mm after a certain incubation period), Root length, root shadow area, average root diameter, ratio of the root length to diameter, area covered by root hairs, shoot length, shoot area and leaf area.
Dies erlaubt es, ohne zusätzlichen Arbeitsaufwand auch bisher nur schlecht feststellbare Ef fekte wie eine Veränderung der Wurzeldicke oder Blattfläche unter Schadstoffeinfluß zu erkennen.This allows Ef, which has so far been difficult to ascertain without additional work effects such as a change in the root thickness or leaf area under the influence of pollutants detect.
Die erst durch die Automatisierung praktikable periodische Vermessung aller Proben bei Petrischalentests während der Keim- und Wachstumsphase ermöglicht die Bestimmung zeitlicher Wachstumsparameter wie Keimungszeitpunkt und individuelle Wachstumskur ven. Dies ermöglicht auch eine automatische Separierung von ungekeimten Samen und sol chen, die in der Keimungs- oder ersten Wachstumsphase abgestorben sind. Zur individuel len Wiederauffindung der sich auf dem Untergrund bewegenden Keimlinge werden bei je der Messung die räumliche Lage spezifischer Keimlingsmerkmale der einzelnen Keimlinge bildanalytisch ermittelt und mit abgespeichert. Diese Merkmale ermöglichen bei der näch sten Messung die individuelle Zuordnung von Keimlingen.The periodic measurement of all samples, which is only feasible through automation Petri dish tests during the germination and growth phase enable the determination temporal growth parameters such as the time of germination and individual growth course ven. This also enables automatic separation of non-germinated seeds and sol those who died in the germination or first growth phase. For individual The recovery of the seedlings moving on the ground is the measurement of the spatial position of specific seedling characteristics of the individual seedlings determined by image analysis and saved with. These features enable the next most measurement the individual assignment of seedlings.
Die Auswertung des Versuchs erfolgt beim Test in Petrischalen entweder durch Heraus nehmen der Schalen aus dem Inkubationsraum (gegebenenfalls Phytotron) in die Meßvor richtung oder durch Einbau der Kamera in einen horizontal beweglichen Schlitten im Inku bationsraum. Dies gestattet vollautomatische Mehrfachmessungen und die Messung und Versuchsauswertung an arbeitsfreien Tagen.The test is evaluated in the test in Petri dishes either by pulling it out take the dishes from the incubation room (possibly phytotron) into the measuring device direction or by installing the camera in a horizontally movable carriage in the Inku nursery. This allows fully automatic multiple measurements and the measurement and Trial evaluation on non-working days.
Bei anderen Testvorschriften werden die Pflanzen von der Aufwuchsmatrix manuell befreit und anschließend bildanalytisch vermessen.In other test regulations, the plants are manually freed from the growth matrix and then measure it analytically.
Zur Planarisierung kann eine Glasscheibe auf die Keimlinge/Pflanzen gelegt werden.A glass pane can be placed on the seedlings / plants for planarization.
Alle Rohdaten können direkt statistisch ausgewertet werden.All raw data can be statistically evaluated directly.
Um Verwechslungen auszuschließen, kann an/in jedem Gefäß/Versuchsansatz im Sichtfeld der Kamera ein Barcode angebracht werden, der bei der Bildanalyse jeweils mit eingelesen wird. Er enthält neben Informationen zum Testansatz auch Angaben über die computerge nerierte Plazierung der Schale bei randomisierten Versuchen. To avoid confusion, on / in each vessel / test approach in the field of vision a barcode is attached to the camera, which is also read in during the image analysis becomes. In addition to information on the test approach, it also contains information about the computer nerated placement of the shell in randomized experiments.
Die Beleuchtung wird in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Pflanze als Durchlicht oder Auflicht ausgeführt. Ein spezieller Fall stellt die Infrarotbeleuchtung dar. Mit Infrarot beleuchtung können die Keimlinge kontrolliert werden, ohne ihr Wachstum zu beeinflus sen, da Infrarotlicht keine Auswirkungen auf die Photosynthese der Pflanzen hat. Ander seits ist die CCD Kamera dagegen empfindlich für Infrarotlicht.The lighting is used as transmitted light depending on the plant to be examined or reflected light. Infrared lighting is a special case. With infrared lighting, the seedlings can be controlled without affecting their growth because infrared light has no effect on the photosynthesis of plants. Other on the other hand, the CCD camera is sensitive to infrared light.
Für eine automatische Kalibrierung der Meßgröße kann ein definierter Körper in die Schale eingebracht werden. Die Pixelwerte und deren Farbwerte, die von der Bildverarbeitung auf genommen werden, können so in absolute Meßgrößen umgewandelt werden. Dies ermög licht einen Vergleich mit manuellen Auswertungen.A defined body can be placed in the shell for an automatic calibration of the measured variable be introduced. The pixel values and their color values based on the image processing can be converted into absolute parameters. This enables makes a comparison with manual evaluations.
Die computergestützte Bildanalyse erfaßt jedes Blatt der Wasserlinsen im Testgefäß ein zeln, stellt die Fläche fest und ermöglicht damit über die Anzahl hinaus Größenverteilungen und Gesamtfläche darzustellen. Dies erlaubt auch bisher nur schlecht feststellbare Effekte, wie eine Verkleinerung der Schwimmblätter unter Schadstoffeinfluß, zu erkennen.The computer-assisted image analysis records each leaf of the duckweed in the test vessel zeln, determines the area and enables size distributions beyond the number and total area. This also allows effects that have so far been difficult to determine, how to see a reduction in the size of the floating leaves under the influence of pollutants.
Die Auswertung des Versuchs erfolgt entweder durch Herausnehmen der Schalen aus dem Phytotron und Plazierung in die Meßvorrichtung oder auch durch Einbau der Kamera auf einem beweglichen Schlitten im Phytotron selbst bzw. der Probe. Dies gestattet vollauto matische Mehrfachmessungen und die Messung und die Versuchsauswertung an arbeits freien Tagen.The test is evaluated either by removing the shells from the Phytotron and placement in the measuring device or by installing the camera on a movable sled in the phytotron itself or the sample. This allows fully auto Matic multiple measurements and the measurement and test evaluation on work days off.
Die Beleuchtung für die Messung erfolgt von oben mit einer zusätzlichen Beleuchtung rund um die Kamera, wobei ggf. das Licht des Phytotrons abgeschirmt wird. Zur besseren Unter scheidung von grünen, gelben und "weißen" Blättchen wird eine Farbkamera oder eine Graustufen-Kamera mit beweglichen Filtern verwendet und gegebenenfalls auch mit Durchlicht gearbeitet. Die Bestimmung der Summe aller Schwimmblätter erfolgt nach Ab schaltung der Zusatzbeleuchtung ohne Filter. Bei direkten Messungen im Phytotron wird die Zusatzbeleuchtung abgeschaltet, so daß eine quasi indirekte Beleuchtung/Durchlicht vorliegt.The lighting for the measurement is from above with an additional round lighting around the camera, possibly shielding the phytotron light. For better sub The separation of green, yellow and "white" papers becomes a color camera or a Grayscale camera with movable filters used and possibly also with Transmitted light worked. The sum of all floating leaves is determined according to Ab switching of additional lighting without filter. With direct measurements in the phytotron the additional lighting switched off, so that a quasi indirect lighting / transmitted light is present.
Zur Dokumentation der jeweiligen Startbedingungen in jedem Versuchsgefäß werden vor Versuchsbeginn alle einzusetzenden Wasserlinsengruppen mit der Bildanalyse vermessen und Gruppen, die enge Qualitätsanforderungen an die Homogenität nicht einhalten, aussor tiert. Dies verringert mögliche Standardabweichungen erheblich und schafft eine Testho mogenität, die mit dem menschlichen Auge alleine nicht erreichbar wäre.To document the respective starting conditions in each test vessel, Start the experiment by measuring all duckweed groups to be used with the image analysis and groups that do not meet strict quality requirements for homogeneity animals. This significantly reduces possible standard deviations and creates a test ho homogeneity that would not be achievable with the human eye alone.
Während des laufenden Versuches können gegebenenfalls in definierten Abständen ohne großen Aufwand Messungen durchgeführt und zeitliche Verschiebungen in der Wachs tumsdynamik dokumentiert werden.During the ongoing test, if necessary, at defined intervals without big effort measurements performed and temporal shifts in the wax dynamics are documented.
Für die Endauswertung, die statistischer Auswertung der Rohdaten und die Kennzeichnung mittels Barcodes gelten die vorstehenden Ausführungen analog.For the final evaluation, the statistical evaluation of the raw data and the labeling The above explanations apply analogously by means of barcodes.
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