DE19845413A1 - Reflection interference microscope with structure corresponding to top illumination microscope, has ring aperture and illuminates specimen over defined region of aperture - Google Patents

Reflection interference microscope with structure corresponding to top illumination microscope, has ring aperture and illuminates specimen over defined region of aperture

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Abstract

The microscope structure corresponds to the optical structure of a top illumination microscope. The illumination of the specimen takes place not over the full aperture, which is limited by an aperture stop or the numerical aperture of the microscope objective, but over a defined aperture region.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur lateral ortsaufgelösten Dickenmessung und Bestimmung der Mikrotopograhie von optischen Grenzflächen mittels Reflexions-Inter­ ferenz-Mikroskopie.Method and device for laterally spatially resolved thickness measurement and determination the microtopography of optical interfaces using reflection inter reference microscopy.

Reflexions-Interferenz-Mikroskopie ist eine optische Technik zur Untersuchung von planparallelen dünnen Schichten im Dickenbereich von einigen nm und mit einer lateralen Struktur von einigen µm. Zusätzlich kann die Mikrotopographie von beliebig geformten Grenzflächen bestimmt werden, solange die Dicke der Schicht einige µm und die lokale Neigung die Winkelauflösung der Reflexions-Interferenz-Mikroskopie nicht überschreitet.Reflection interference microscopy is an optical technique used to study plane-parallel thin layers in the thickness range of a few nm and with a lateral structure of a few µm. In addition, the microtopography of any shaped interfaces can be determined as long as the thickness of the layer is a few µm and the local tilt does not change the angular resolution of the reflection interference microscopy exceeds.

Nach den ersten Anwendungen von Reflexions-Interferenz-Mikroskopie im Bereich Zell-Adhäsion von Curtis (1964) wurde die Technik von Ploem (1975) grundlegend verbessert. Gingell und Todd (1979) veröffentlichten erste theoretische Ansätze, um die lateral aufgelösten Interferogramme quantitativ auszuwerten. Die theoretischen Modelle wurden von Kühner (Kühner und Sackmann, 1996) weiterentwickelt, um die quantitative Auswertung der Interferogramme zu verbessern. In der Praxis wird zur Kontraststeigerung die Antiflex-Technik nach Pluta (Pluta, 1989) eingesetzt. Dann wird diese Technik als Reflexions-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie bezeichnet.After the first applications of reflection interference microscopy in the field Cell adhesion by Curtis (1964) became the technique of Ploem (1975) fundamental improved. Gingell and Todd (1979) published the first theoretical approaches to the quantitatively evaluate laterally resolved interferograms. The theoretical models were further developed by Kühner (Kühner and Sackmann, 1996) to the quantitative To improve evaluation of the interferograms. In practice it becomes Contrast enhancement used the Antiflex technique according to Pluta (Pluta, 1989). Then it will be this technique is called reflection-interference-contrast microscopy.

In den letzten Jahren wurde Reflexions-Interferenz-Mikroskopie intensiv genutzt, um die lokale Adhäsionsenergie und die elastischen Eigenschaften von Zellen oder Vesikeln zu messen (Verschueren, 1985; Rädler et. al. 1995; Albersdörfer et. al., 1997; Nardi et. al., 1997; Simson und Sackmann, 1998) oder die Dicke von ultradünnen Schichten zu bestimmen (Rädler und Sackmann, 1993). Eine große Bedeutung nimmt diese Technik bereits bei der Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen (Anti­ gen-Antikörper) in biotechnologischen Anwendungen ein (z. B. Gritsch et. al. 1995). Dabei wird ein Rezeptor auf eine Oberfläche gebunden und das Bindungsverhalten verschiedener Liganden an diesen Rezeptor ermittelt. Mittels Reflexions-Interfe­ renz-Mikroskopie wird die Dickenzunahme der Ligandenschicht detektiert. Durch die zusätzliche laterale Auflösung dieser Technik ist es möglich bei entsprechend präparierten Proben mit einer Messung mehrere Reaktionen gleichzeitig zu verfolgen. Dadurch kann eine große Anzahl von Proben in kurzer Zeit untersucht werden. Außerdem ist es mit dieser Technik möglich Be- und Entnetzungsvorgänge zu untersuchen. Dabei wird sowohl die Kontaktlinie als auch der Kontaktwinkel zeitaufgelöst ermittelt (Wiegand et. al., 1998).In recent years, reflection interference microscopy has been used extensively the local adhesion energy and the elastic properties of cells or vesicles to be measured (Verschueren, 1985; Rädler et. al. 1995; Albersdörfer et. al., 1997; Nardi et. al., 1997; Simson and Sackmann, 1998) or the thickness of ultra-thin layers determine (Rädler and Sackmann, 1993). This technique is of great importance already when investigating receptor-ligand interactions (anti gene antibodies) in biotechnological applications (e.g. Gritsch et. al. 1995). Here a receptor is bound to a surface and the binding behavior different ligands to this receptor. By means of reflection interfe renz microscopy, the thickness increase of the ligand layer is detected. Through the additional lateral resolution of this technique is possible with appropriate prepared samples with one measurement to track several reactions simultaneously. This enables a large number of samples to be examined in a short time. Moreover With this technique it is possible to examine wetting and dewetting processes. Here both the contact line and the contact angle are determined in a time-resolved manner (Wiegand et. Al., 1998).

Weiterhin kann die Technik zur Oberflächen- und Werkstoffprüfung beliebiger Objekte eingesetzt werden. Voraussetzung hierfür sind, daß die Struktur der zu visualisierenden Grenzfläche innerhalb der Auflösungsgrenzen der Reflexions-Interferenz-Mikroskopie liegen, daß die Probe und die Referenzgrenzfläche ausreichend angenähert werden können und die Reflektivität der Referenzgrenzfläche an die der Probe ausreichend angepaßt werden kann.Furthermore, the technology for surface and material testing of any objects be used. The prerequisite for this is that the structure of the to be visualized Interface within the resolution limits of reflection interference microscopy  lie that the sample and the reference interface are sufficiently approximated and the reflectivity of the reference interface to that of the sample is sufficient can be adjusted.

Die Bildentstehung beruht auf der Reflexion von Licht an unterschiedlichen optischen Grenzflächen der untersuchten Probe, das in der Bildebene interferiert. Durch Unterschiede in der optischen Weglänge entstehen die lateral aufgelösten Interferogramme. Die lokale Intensität bei monochromatischer Beleuchtung bzw. die Farbverteilung bei polychromatischer Beleuchtung enthält die Höheninformation der Interferogramme.Image formation is based on the reflection of light from different optical systems Interfaces of the examined sample that interferes in the image plane. By Differences in the optical path length result in the laterally resolved Interferograms. The local intensity with monochromatic lighting or the Color distribution with polychromatic lighting contains the height information of the Interferograms.

Sowohl die bisher verwendeten Mikroskop-Aufbauten, als auch die theoretischen Modelle basieren auf einer Beleuchtung der Probe mit einer Apertur, die kleiner oder gleich der Apertur des Mikroskopobjektivs ist. Dabei entsteht das Problem, daß das reflektierte Licht unter allen in der Beobachtungsapertur enthaltenen Winkel detektiert wird. Dadurch kommt es zur Überlagerung von interferierenden Strahlen, die unterschiedliche optische Weglängen aufweisen. Zusätzlich werden diese Strahlen wegen der unterschiedlichen Einfallswinkel mit unterschiedlichem Reflexionskoeffizienten reflektiert. Dies wirkt sich nachteilig in einer Reduktion der interferometrischen Information durch Mittelungseffekte aus. Hinzu kommt, daß die theoretischen Modelle, die die auftretenden Effekte korrekt berücksichtigen, sehr rechenintensiv sind. Beides limitiert den Einsatzbereich der Reflexions-In­ terferenz-Mikroskopie.Both the microscope structures used so far and the theoretical ones Models are based on illuminating the sample with an aperture that is smaller or smaller is equal to the aperture of the microscope objective. The problem arises that the reflected light is detected at all angles contained in the observation aperture becomes. This results in the interference of interfering rays have different optical path lengths. In addition, these rays because of the different angles of incidence with different Reflection coefficient reflected. This has an adverse effect in reducing the interferometric information by averaging effects. In addition, the theoretical models that correctly take into account the effects that occur, very much are computationally intensive. Both limit the area of application of the reflection-in interference microscopy.

Bei einem zur Zeit üblichen Aufbau für Reflexions-Interferenz-Mikroskopie werden die Einfallswinkel des eingestrahlten Lichts von der numerischen Apertur des Objektivs oder einer Aperturblende bestimmt und umfassen einen Bereich von 0°-50° zur Normalen der Probenoberfläche. Wird eine gute laterale Auflösung gewünscht, muß mit möglichst großen numerischen Aperturen gearbeitet werden.With a structure currently used for reflection interference microscopy, the Angle of incidence of the incident light from the numerical aperture of the lens or an aperture stop determined and cover a range of 0 ° -50 ° to the normal of the Sample surface. If a good lateral resolution is desired, it should be possible with large numerical apertures.

Beim Einsatz einer Ringblende als Aperturblende wird eine Einschränkung des Einfallswinkels auf einen kleinen Bereich (z. B. 45°-50°) erreicht. Dadurch werden verschiedene Vorteile erzielt:
When using a ring diaphragm as an aperture diaphragm, the angle of incidence is restricted to a small area (e.g. 45 ° -50 °). This has several advantages:

  • - Die Dickenauflösung verbessert sich mit kleiner werdendem Bereich des Einfallswinkel. Besonders wichtig für die Untersuchung von Rezep­ tor-Ligand-Wechselwirkungen.- The thickness resolution improves as the area of the Angle of incidence. Particularly important for examining recipes Tor-ligand interactions.
  • - Durch die Verwendung von großen Einfallswinkeln (zur Normalen) steigt die laterale Auflösung der Abbildung.- The use of large angles of incidence (to the normal) increases the lateral Resolution of the figure.
  • - Bei der Detektion von geneigten (gekrümmten) Oberflächen wird der Winkelbereich der Neigung zur Oberfläche erweitert. Besonders wichtig für die Messung der lokalen Adhäsionsenergie und der elastischen Eigenschaften von Zellen oder Vesikeln. - When detecting inclined (curved) surfaces, the angular range the inclination to the surface expanded. Particularly important for the measurement of the local Adhesion energy and the elastic properties of cells or vesicles.  
  • - Durch den kleinen Bereich der Einfallswinkel kann die rechenintensive Integration entfallen oder deutlich eingeschränkt werden.- Due to the small area of the angle of incidence, the computationally intensive integration omitted or significantly restricted.
  • - Durch die Variation des Bereichs der Einfallswinkel kann der Bereich senkrecht zur Oberfläche variiert werden, der noch aufgelöst werden soll.- By varying the range of the angles of incidence, the range can be perpendicular to Surface to be varied, which is still to be resolved.
Literaturverzeichnisbibliography

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Claims (11)

1. Reflexions-Interferenz-Mikroskopie, dadurch gekennzeichnet, daß der Aufbau des Reflexions-Interferenz-Mikroskops dem optischen Aufbau eines Auflichtmikroskops entspricht, wobei jedoch die Beleuchtung der Probe nicht über die volle Apertur (die durch eine Aperturblende oder der numerischen Apertur des Mikroskopobjektivs begrenzt wird) erfolgt, sondern in einem definierten Aperturbereich.1. reflection interference microscopy, characterized in that the structure of the reflection interference microscope corresponds to the optical structure of an incident light microscope, but the illumination of the sample is not over the full aperture (which is limited by an aperture diaphragm or the numerical aperture of the microscope objective is carried out), but in a defined aperture area. 2. Reflexions-Interferenz-Mikroskopie nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der definierte Aperturbereich durch die Verwendung einer ringförmigen Aperturblende erreicht wird.2. reflection interference microscopy according to claim 1, characterized in that the defined aperture area through the use of an annular aperture diaphragm is achieved. 3. Reflexions-Interferenz-Mikroskopie nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der definierte Aperturbereich durch die Verwendung von auf einem Ring oder Ringsegment angebrachten Lichtquellen erreicht wird, die sich anstatt einer Aperturblende in der Ebene befinden, in der normalerweise eine Aperturblende angebracht wird.3. reflection interference microscopy according to claim 1, characterized in that the defined aperture range by using on a ring or ring segment attached light sources is achieved, which is instead of an aperture diaphragm in the plane in which an aperture diaphragm is normally attached. 4. Reflexions-Interferenz-Mikroskopie nach Patentanspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der definierte Aperturbereich durch die Veränderung des Außen- und Innendurchmessers der Ringblende verändert werden kann.4. reflection interference microscopy according to claim 1 and 2, characterized in that the defined aperture range by changing the outer and inner diameter of the Ring aperture can be changed. 5. Reflexions-Interferenz-Mikroskopie nach Patentanspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß der definierte Aperturbereich durch die Veränderung des Abstandes der Lichtquellen zur optischen Achse verändert werden kann.5. reflection interference microscopy according to claim 1 and 3, characterized in that the defined aperture range by changing the distance of the light sources to optical axis can be changed. 6. Reflexions-Interferenz-Mikroskopie nach Patentanspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich die Antiflextechnik eingesetzt werden kann.6. reflection interference microscopy according to claim 1 to 5, characterized in that the anti-flex technology can also be used. 7. Reflexions-Interferenz-Mikroskopie nach Patentanspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Mikroskop bei verschiedenen Wellenlängen und/oder Einfallswinkeln betrieben werden kann.7. reflection interference microscopy according to claim 1 to 6, characterized in that the microscope can be operated at different wavelengths and / or angles of incidence can. 8. Reflexions-Interferenz-Mikroskopie nach Patentanspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion des Meßsignals entweder über ein ortsauflösendes Detektionssystem (z. B. CCD-Kamera, SIT-Kamera, Restlicht-Kamera, o. ä.) in einem bildgebenden Modus erfolgt oder über einen Punktsensor (z. B. Photodiode, Photomultiplier, etc.), der über das gesamte Gesichtsfeld einen integralen Meßwert liefert.8. reflection interference microscopy according to claim 1 to 7, characterized in that the detection of the measurement signal either via a spatially resolving detection system (e.g. CCD camera, SIT camera, low light camera, or the like) takes place in an imaging mode or  via a point sensor (e.g. photodiode, photomultiplier, etc.) that covers the entire Field of view provides an integral measured value. 9. Reflexions-Interferenz-Mikroskopie nach Patentanspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Mikroskopie mit zusätzlichen Komponenten zur Probeninspektion durch herkömmliche und konfokale Verfahren der Lichtmikroskopie (z. B. Hellfeld-, Dunkelfeld-, Polarisations-, DIC-, Phasenkontrast-, Fluoreszenz- und Brewster-Winkel-Mikroskopie), IR-Spektroskopie, IR-Mikroskopie, Interferometrie, Ramanspektroskopie, mikroskopische IR- oder Ramanspektroskopie, zeitaufgelöste Fluoreszenzlebensdauermessung ausgerüstet ist, oder diese Komponenten in das Mikroskop integriert werden können.9. reflection interference microscopy according to claim 1 to 8, characterized in that microscopy with additional components for sample inspection by conventional and confocal methods of light microscopy (e.g. brightfield, darkfield, polarization, DIC, Phase contrast, fluorescence and Brewster angle microscopy), IR spectroscopy, IR microscopy, interferometry, Raman spectroscopy, microscopic IR or Raman spectroscopy, time-resolved fluorescence lifetime measurement is equipped, or this Components can be integrated into the microscope. 10. Reflexions-Interferenz-Mikroskopie nach Patentanspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Mikroskop mit mechanischen, optischen und elektronischen Komponenten ausgestattet ist, die ein automatisiertes Handling und Alignment der Proben im Mikroskop gestatten.10. reflection interference microscopy according to claim 1 to 9, characterized in that the microscope is equipped with mechanical, optical and electronic components which allow automated handling and alignment of the samples in the microscope. 11. Reflexions-Interferenz-Mikroskopie nach Patentanspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß Steuerung, Überwachung, Verarbeitung, Auswertung und Darstellung der Messungen und Ergebnisse des Mikroskops über einen oder mehrere geeignete Computer mit entsprechend geeigneter Bildaufnahme- und Bildverarbeitungs-Hard- und Software und entsprechenden, geeigneten visuellen und/oder druckenden Ausgabegeräten erfolgt.11. reflection interference microscopy according to claim 1 to 9, characterized in that control, monitoring, processing, evaluation and presentation of the measurements and Results of the microscope using one or more suitable computers with corresponding suitable image acquisition and image processing hardware and software and corresponding suitable visual and / or printing output devices.
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