DE19842527A1 - Verfahren zur Bildung tripelhelixbildender Oligomere und deren Verbindungen - Google Patents

Verfahren zur Bildung tripelhelixbildender Oligomere und deren Verbindungen

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bildung tripelhelixbildender Oligomere und deren Verbindungen, bei dem im vorgesehenen Abschnitt eines DNA-Doppelstranges ein Bereich mit einer geeigneten Sequenz gesucht wird, aus der die Oligomer-Sequenz abgeleitet wird. DOLLAR A Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Bildung solcher Oligomere und deren Verbindungen zu schaffen, die Tripelhelices hoher Stabilität und Selektivität mit doppelsträngiger DNA bilden unter physiologischen Bedingungen und in Bereichen, wo die Duplexsequenzen auch einen anderen als den Homopurin-Homopyrimidin-Aufbau haben. DOLLAR A Erfindungsgemäß werden tripelhelixbildende Oligomere und deren Verbindungen erzeugt, indem aus dem DNA-Doppelstrang ein Bereich eines Nucleinsäurestranges ausgewählt wird, der reich an Cytosinen und/oder reich an Adeninen ist, und es werden Oligomere bzw. deren Verbindung synthetisiert, bei denen die Oligomersequenz mit der Sequenz des ausgewählten Bereiches des Nucleinsäurestranges, einschließlich der Strangorientierung, übereinstimmt. Somit können tripelhelixbildende Oligomere und deren Verbindungen auch für solche Nucleinsäure-Bereiche geschaffen werden, in denen weder eine Homopurin- noch eine Homopyridin-Sequenz vorliegt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bildung tripelhelixbildender Oligomere und deren Verbindungen, bei dem im vorgesehenen Abschnitt eines DNA-Doppelstranges ein Bereich mit einer geeigneten Sequenz gesucht wird, aus der die Oligomer-Sequenz abgeleitet wird.
Tripelhelixbildende Oligonucleotide haben unter anderen folgende Einsatzgebiete gefunden: Megabasenschneiden (Strobel S. A., Dervan P. B., Methods Enzymol 1992, 216, 309-321; Strobel S. A., Doucette-Stamm L. A., Riba L., Housman D. E., Dervan P. B., Science 1991, 254, 1639-1642; Strobel S. A., Dervan P. B., Nature 1991, 350, 172-174; Strobel S. A., Dervan P. B., Science 1990, 249, 73-75), Transkriptionsinhibierung (Hiratou T., Tsukahara S., Takai K., Koyanagi Y., Yamamoto N., Takaku H., Nucleic Acids Symp Ser 1997, 37, 221-222; Kim H. G, Reddoch J. F., Mayfield C., Ebbinghaus S., Vigneswaran N., Thomas S., Jones D. E. Jr, Miller D. M., Biochemistry 1998, 37, 2299-2304; Curcio L. D., Bouffard D. Y., Scanlon K. J., Pharmacol Ther 1997, 74, 317-332; Grigoriev M., Praseuth D., Robin P., Hemar A., Saison-Behmoaras T., Dautry-Varsat A., Thuong N. T., Helene C., Harel-Bellan A., J Biol Chem 1992, 267, 3389-3395; Duval-Valentin G., Thuong N. T., Helene C., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89, 504-508; Helene C., Anticancer Drug Des 1991, 6, 569-584), Mutagenitätserzeugung und -nachweis (Bacolla A., Ulrich M. J., Larson J. E., Ley T. J., Wells R. D., J Biol Chem 1995, 270, 24556-24563; Olivas W. M., Maher L. J., Biotechniques 1994, 16, 128-132; Ulrich M. J., Gray W. J., Ley T. J., J Biol Chem 1992, 267, 18649-18658), Trennverfahren bzw. Reinigung (Seeger C., Batz H. G., Orum H., Biotechniques 1997, 23, 512-517; Kiyama R., Nishikawa N., Oishi M., JMoI Biol 1994, 237, 193-200).
Insgesamt sind bisher folgende Typen von Nucleinsäuretripelhelices beschrieben worden.
1. Pyrimidinmotiv
Dieses Motiv ist durch folgenden Aufbau charakterisiert: Der Doppelstrang besteht im tripelhelikalen Teil im wesentlichen aus einem Homopurinstrang und aus einem Homopyrimidinstrang. Der dritte Strang befindet sich in der großen Furche des Doppelstranges und ist ein Homopyrimidinstrang. Dessen Sequenz ist analog, die Orientierung jedoch umgekehrt zu der des Homopyrimidinstrangs im Doppelstrang (Bartley J. P., Brown T., Lane A. N., Biochemistry 1997, 36, 14502-14511; Koshlap K. M., Schultze P., Brunar H., Dervan P. B., Feigon J., Biochemistry 1997, 36, 2659-2668; Wang E., Koshlap K. M., Gillespie P., Dervan P. B., Feigon J., J Mol Biol 1996, 257, 1052-1069; Radhakrishnan L, Patel D. J., J Mol Biol 1994, 241, 600-619; Radhakrishnan L, Patel D. J., Structure 1994, 2, 395-405; Radhakrishnan L, Patel D. J., Structure 1994, 2, 17-32; Radhakrishnan L, Patel D. J., Priestly E. S., Nash H. M., Dervan P. B., Biochemistry 1993, 32, 11228-11234).
2. Purinmotiv
Dieses Motiv ist durch folgenden Aufbau charakterisiert: Der Doppelstrang besteht im tripelhelikalen Teil im wesentlichen aus einem Homopurinstrang und aus einem Homopyrimidinstrang. Der dritte Strang befindet sich in der großen Furche des Doppelstranges und ist ein Homopurinstrang. Dessen Sequenz ist analog, die Orientierung jedoch umgekehrt zu der des Homopurinstrangs im Doppelstrang (Ji J., Hogan M. E., Gao X., Structure 1996, 4, 425-435, Radhakrishnan L, Patel D. J., Structure 1994, 2, 395-405;
Dittrich K., Gu J., Tinder R., Hogan M., Gao X., Biochemistry 1994, 33, 4111-4120; Radhakrishnan L, Patel D. J., Strueture 1993, 1, 135-152).
3. Mischform
Dieses Motiv ist durch folgenden Aufbau charakterisiert: Der Doppelstrang besteht im tripelhelikalen Teil aus einem Strang reich an Purinen und aus einem komplementären Strang. Der dritte Strang befindet sich in der großen Furche des Doppelstranges und ist aus Guaninen und Thyminen aufgebaut (Radhakrishnan L, Patel D. J., Structure 1993, 1, 135-152). Beide Orien­ tierungen des dritten Stranges im Vergleich zum Doppelstrang sind möglich. Bei der erweiterten Mischform, die zusätzlich auch Adenine enthält, ist die Orientierung antiparallel zu dem Duplexhomopurinstrang.
Den Typen 1. bis 3. ist gemeinsam, daß die Basen des dritten Stranges im wesentlichen nur mit den Basen des purinreichen Stranges im Doppelstrang in Wechselwirkung treten.
4. R-Form oder Rekombinationsmotiv
Dieses Motiv ist durch folgenden Aufbau charakterisiert: Der Doppelstrang unterliegt im tripelhelikalen Teil keiner Sequenzbeschränkung. Der dritte Strang befindet sich in der großen Furche des Doppelstranges. Er gleicht einem der Stränge des Doppelstranges in der Orientierung und weitestgehend in der Sequenz. Die Basen des dritten Stranges treten mit den Basenpaaren des Doppelstranges in Wechselwirkung (Kiran M. R., Bansal M., J Biomol Struct Dyn 1997, 15, 333-345; Kim M. G., Zhurkin V. B., Jernigan R. L., Camerini-Otero R. D., J Mol Biol 1995, 247, 874-889; Zhurkin V. B., Raghunathan G., Ulyanov N. B., Camerini-Otero R. D., Jernigan R. L. J Mol Biol 1994, 239, 181-200).
Die spontane Bildung dieses Motivs aus Einzelsträngen ohne Beteiligung von Proteinen (Rekombinasen) oder Peptiden (Teilsequenzen aus den Rekombinasen, Voloshin O., Wang L., Camerini-Otero R. D.; Promotion of homologous DNA pairing by RecA-derived peptides, US 5,731,411) ist bislang nicht beschrieben worden.
Für die Schaffung von Oligonucleotiden geeigneter Sequenz, die spontan mit doppelsträngiger DNA tripelhelikale Strukturen bilden, wird in dem Zielbereich der DNA eine möglichst lange und möglichst ungestörte Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz gesucht:
  • a) Es wird ein Oligonucleotid synthetisiert, das die gleichen Pyrimidine in der gleichen Sequenz wie der Homopyrimidinstrang aber in umgekehrter Strangorientierung enthält. Cytosine werden unter Umständen ausgetauscht gegen Analoga (5-Methylcytosin, 8-Oxoadenin, Pseudoisocytosin, 2-Amino­ pyridin, 5-Propinylcytosin usw.). An den Stellen, wo die Homopyrimidin­ sequenz durch ein Adenin unterbrochen ist, wird ein Guanin in das Oligonucleotid gesetzt; dort, wo die Homopyrimidinsequenz durch ein Guanin unterbrochen ist, wird ein Thymin oder ein Cytosin in das Oligonucleotid gesetzt oder
  • b) es wird ein Oligonucleotid synthetisiert, das die gleichen Purine in der gleichen Sequenz wie der Homopurinstrang aber in umgekehrter Strangorientierung enthält. An den Stellen, wo die Homopurinsequenz durch ein Cytosin unterbrochen ist, wird ein Thymin gesetzt; dort, wo die Homopurinsequenz durch ein Thymin unterbrochen ist, wird ein Cytosin in das Oligonucleotid gesetzt. Unter Umständen werden einige oder alle Adenine durch Thymine ersetzt.
J. R. Fresco (US 5,693,471 Triple stranded Nucleic acids) beansprucht eine Erweiterung der Vorgehensweise unter b), indem er in einer Purinsequenz im ersten Strang einem auftretenden Adenin nicht nur ein Adenin oder ein Thymin, sondern auch ein Uracil oder ein Hypoxanthin, einem Guanin nicht nur ein Guanin, sondern auch ein Cytosin oder ein Hypoxanthin gegenüberstellt, so daß der dritte Strang in dem Bereich, in dem der erste eine reine Purinsequenz hat, selber weder eine reine Homopurinsequenz noch reine Homopyrimidinsequenz hat.
Nachteile der bislang bekannten Motive:
  • 1. Die Triplextypen 1.-3. sind auf Duplexsequenzen vom Aufbau Homopurin/­ Homopyrimidin beschränkt. Dadurch sind alle die Gensequenzen von einer Beeinflussung durch tripelhelixbildende Oligonucleotide ausgeschlossen, die weder im codierenden noch im regulativen Bereich eine solche Sequenz ausreichender Länge aufweisen.
  • 2. Unter physiologischen Bedingungen ist bei den Typen 1.-4. die Stabilität in der Regel deutlich geringer als die entsprechende Duplexstabilität. Dieses bedeutet hohe Einsatzkonzentrationen von tripelhelixbildenden Oligonucleo­ tiden.
  • 3. Jede Verletzung der Duplexhomosequenz führt zu Tripelhelices der Typen 1.-3., die eine geringere Stabilität haben. Das bedeutet auch, daß es zu dem entsprechenden tripelhelixbildenden Oligonucleotid stärker bindende Duplexsequenzen gibt (Nichteindeutigkeit in der Zielsequenz).
  • 4. Tripelhelices des Typs 1. benötigen in der Regel pH-Werte von 6 oder darunter, existieren also nicht unter physiologischen Bedingungen. Die Ursache dafür sind die Cytosine, die nur in der an N3 protonierten Form entsprechende Wasserstoffbrücken mit dem Guanin im Duplexstrang ausbilden können. Durch die Ladung der protonierten Cytosine sind Sequenzen mit benachbarten Cytosinen weniger geeignet.
  • 5. Tripelhelices des Typs 4. haben eine so geringe Stabilität, daß sie sich nicht spontan bilden. Bislang sind sie nur unter Zuhilfenahme von Proteinen (z. B. RecA aus E. coli) oder intramolekular, das heißt, durch Verknüpfen des dritten Stranges mittels eines Linkers mit dem Duplex erzeugt worden.
  • 6. Tripelhelixbildende Oligonucleotide entsprechend dem Typ zwei mit sehr hohem Anteil an Purinen und neigen zu konkurrierenden Komplexbildungen. Sie bilden untereinander parallelsträngige Duplexe oder bei hohem Anteil von Guanin auch Tetraplexe (Guanintetraden).
Cohen J. S. und Hogan M. E. (Spektrum der Wissenschaft, 1995, 2, 28-34) schätzen, daß nur etwa jeder zweite DNA-Abschnitt die für Tripelhelix­ bildung notwendigen Sequenzabschnitte enthält.
Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Bildung solcher Oligomere und deren Verbindungen zu schaffen, die Tripelhelices hoher Stabilität und Selektivität mit doppelsträngiger DNA bilden unter physiologischen Bedingungen und in Bereichen, wo die Duplexsequenzen auch einen anderen als den Homopurin-Homopyrimidin-Aufbau haben.
Erfindungsgemäß werden tripelhelixbildende Oligomere und deren Verbindungen erzeugt, indem aus dem DNA-Doppelstrang ein Bereich eines Nucleinsäurestranges ausgewählt wird, der reich an Cytosinen und/oder reich an Adeninen ist, und es werden Oligomere bzw. deren Verbindung synthetisiert, bei denen die Oligomersequenz mit der Sequenz des ausgewählten Bereiches des Nucleinsäurestranges, einschließlich der Strang­ orientierung, übereinstimmt. Somit können tripelhelixbildende Oligomere und deren Verbindungen auch für solche Nucleinsäure-Bereiche geschaffen werden, in denen weder eine Homopurin- noch eine Homopyrimidin-Sequenz vorliegt. Im Ergebnis entstehen Oligomere und deren Verbindungen, die reich an Cytosin bzw. dessen Analoga und/oder an Adenin bzw. dessen Analoga sind und die mit einem Haarnadelduplex, dessen einer Strang in Sequenz und 5'-3'-Orientierung mit dem Oligomer übereinstimmt, dreisträngige Strukturen, welche beachtliche Eigenschaften hinsichtlich Strukturstabilität und Sequenzvariabilität aufweisen können.
In den Unteransprüchen 2 bis 11 sind vorteilhafte Verfahrensausgestaltungen genannt.
Die Erfindung soll nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert werden.
Es zeigen:
Fig. 1: Thermische Schmelzkurven in Summen- und Komponenten­ darstellung eines Einzelstrangoligonukleotids 5'-d(A12)-3' (SEQ ID- NO: 1) und eines Haarnadeloligonukleotids (Doppelstrang) 5'- d(A12C4T12)-3' (SEQ ID-NO: 9)
Fig. 2: Job-Plot bei T = 30°C des Systems gemäß Fig. 1
Fig. 3: Konzentrationsabhängigkeit der Schmelztemperatur Tm für System gemäß Fig. 1 und einfacher Sequenzerweiterungen
Fig. 4: Schmelztemperaturen des tripelhelikalen Komplexes aus Einzel- und aus Doppelstrang bei 2 mikromolarer Komplexkonzentration in Abhängigkeit von Basenpaar- (im Doppelstrang) und Basenaustau­ schen (im Einzelstrang) an geeigneten Positionen
Legenden zu den Figuren
Fig. 1:
Durchgezogene Linie: Die Extinktion bei 260 nm ist als Funktion der Celsiustemperatur aufgetragen für eine äquimolare Lösung eines Einzelstrangoligonukleotids 5'-d(A12)-3' (SEQ ID-NO: 1) und eines Haar­ nadeloligonukleotids (Doppelstrang) S'-d(A12C4T12)-3' (SEQ ID-NO: 9), bei dem die beiden komplementären Stränge durch vier Cytosine miteinander verbunden sind, in 10 mmol/l Natriumcacodylat, 200 mmol/l Natriumchlorid und 0,1 mmol/l EDTA. Die Konzentration jedes Oligonukletids beträgt 3 µmol/l.
Gepunktete Linie: Schmelzkurve des Einzelstrangs 5'-d(A12)-3' (SEQ ID- NO: 1) im gleichen Medium und in gleicher Konzentration, jedoch so verschoben, daß sie bei 11°C mit der durchgezogenen Schmelzkurve übereinstimmt.
Eng gestrichelte Linie: Schmelzkurve des Haarnadel-Doppelstranges 5'-d(A12C4T12)-3' (SEQ ID-NO: 9) im gleichen Medium und in gleicher Konzentration, jedoch so verschoben, daß sie bei 11°C mit der durchgezoge­ nen Schmelzkurve übereinstimmt.
Weit gestrichelte Linie: Summe der Schmelzkurven von Einzelstrang 5'-d(A12)-3' (SEQ ID-NO: 1) und Haarnadel-Doppelstrang 5'-d(A12C4T12)-3' (SEQ ID-NO: 9) im gleichen Medium sowie in gleicher Konzentration, jedoch so verschoben, daß sie bei 40°C mit der durchgezogenen Schmelzkurve übereinstimmt.
Die Verschiebung beträgt lediglich 1,4% des Endniveaus.
Fig. 2:
Job-Plot des Systems 5'-d(A12)-3' (SEQ ID-NO: 1) und 5'-d(A12C4T12)-3' (SEQ ID-NO: 9) bei 30°C, Milieubedingungen wie in Fig. 1. Die Extinktions­ messungen wurden doppelt oder dreifach ausgeführt. Die Summe der beiden Oligonukleotidkonzentrationen wurde auf 4 µmol/l festgehalten. Aufgetragen sind die Differenzen der gemittelten Meßwerte gegen eine lineare Funktion (1-x) E(A12) + x E(A12C4T12), wobei E(A12) und E(A12C4T12) die Extinktionen der viermikromolaren Lösungen der einzelnen Oligonukleotide sind und x zwischen 0 und 1 variiert.
Karo, gestrichelte Linie: Messungen bei 280 nm,
Kreis, durchgezogene Linie: Messungen bei 220 nm,
Dreieck, gepunktete Linie: Messungen bei 260 nm.
Die Linien entsprechen den jeweils besten Anpassungen einer einfach geknickten Geraden an die Meßwerte, volle Symbole sind bei der Anpassung unberücksichtigt geblieben.
Fig. 3:
a: Erste Ableitungen der geglätteten Schmelzkurven des Systems 5'-d(A12)-3' (SEQ ID-NO: 1) und 5'-d(A12C4T12)-3' (SEQ ID-NO: 9), jeweils verdünnt um den Faktor 2 in vier Schritten, multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor (n = 1, 2, 4, 8, 16).
b: Triplexschmelztemperaturen von vier unterschiedlichen Doppelstrang- Einzelstrang-Kombinationen aus Verdünnungsreihen als Funktion der Kon­ zentration. Kontinuierliche Linien: Beste Anpassungen der Meßwerte durch die Formel Tm = ΔH / (ΔS + R.ln(c/2)) - 273.16 (Tm ist in Celsiusgraden gegeben, die allgemeine Gaskonstante R in den gleichen Einheiten wie ΔS).
gestrichelte Linien: zugehöriger Vertrauensschlauch (+- Standardabweichun­ gen).
Volle Kreise: 5'-d(A12C4T12)-3' + 5'-d(A12)-3', (SEQ ID-NO: 9, 1)
Quadrate: 5'-d(A4TA7C4T7AT4)-3' + 5'-d(A4TA7)-3', (SEQ ID-NO: 12, 5)
Dreiecke: 5'-d(A4GA7C4T7CT4)-3' + 5'-d(A4GA7)-3', (SEQ ID-NO: 10, 3)
Karos: 5'-d(A4CA7C4T7GT4)-3' + 5'-d(A4CA7)-3', (SEQ ID-NO: 11, 4)
zusätzlich
leere Kreise: 5'-d(T12)-3' + 5'-d(A12)-3' (SEQ ID-NO: 8, 1).
Fig. 4:
a: System Haarnadeldoppelstrang mit der Position XY, die durch jedes Watson-Crick-Basenpaar besetzt werden kann und Einzelstrang mit der Position Z, die durch jede der vier gängigen Basen ersetzt werden kann.
b: Spalten beziehen sich auf das darunterstehende Watson-Crick-Basenpaar (XY), die Symbole beziehen sich auf die Base im Einzelstrang (Z). Auf der Ordinate sind die Tm-Werte für die jeweiligen Kombinationen Basenpaar (XY, Spalte) und Base (Z, Symbol) abzulesen.
Ausführungsbeispiele
In den folgenden Beispielen sind interpolierte Werte für Schmelztemperatu­ ren, die einer Oligonucleotidkonzentration je von zwei mikromolar entsprechen, mit Fehlern angegeben. Diese einfachen Fehler entsprechen den Standardabweichungen der für diese Konzentration berechneten Werte aus den Anpassungen der beobachteten Abhängigkeiten der Tm-Werte von den Konzentrationen gemäß der in der Legende zu Fig. 3 gegebenen Formel. Die Zahl der Freiheitsgrade liegt meist bei 2 bis 3. Für eine statistisch begründete Fehlerangabe müßten die entsprechenden Fraktilen der Studentverteilung berücksichtigt werden. Das Beispiel 12 ist in zwei unabhängigen Durchfüh­ rungen realisiert worden. Der Unterschied zwischen den dort gefundenen Tm- Werten von 0,5 bis 0,6 K kann als ein realistischer Fehler angenommen werden.
Beispiel 1
Ein Einzelstrangoligonucleotid 5'-d(A4GA7)-3' (SEQ ID-NO: 3) und ein Haarnadelduplex 5'-d(A4GA7C4T7CT4)-3' (SEQ ID-NO: 10) werden äquimolar in einem Puffer gelöst, der 10 mmol/l Natriumcacodylat und 200 mmol/l Natriumchlorid sowie 0,1 mmol/l EDTA enthält. Die Absorption dieser Lösung bei 260 nm wird als Funktion der Temperatur registriert. Die so entstehende Kurve wird numerisch geglättet und abgeleitet nach der Temperatur. Das erste Maximum dieser ersten Ableitung wird als die Schmelztemperatur Tm des Komplexes aus Einzelstrang und Haarnadel­ duplex interpretiert. In einer 1 : 1 Verdünnungsreihe variieren die äquimolaren Konzentrationen zwischen 3,1 und 0,19 mikromolar. Für eine zweimikro­ molare Lösung wird ein Tm-Wert von 30,22+-0,02°C ermittelt.
Beispiel 2
Wie Beispiel 1, nur mit folgenden Unterschieden:
Der Einzelstrang ist 5'-d(A7GA4)-3' (SEQ ID-NO: 2). Die äquimolaren Lösungen mit dem gleichen Haarnadelduplex variieren in der Konzentration zwischen 3,15 und 0,20 mikromolar. Für eine zweimikromolare Lösung wird ein Tm-Wert von 20,11+-0,05°C ermittelt.
Beispiel 3
Wie Beispiel 1, nur mit folgenden Unterschieden:
Der Einzelstrang ist 5'-d(A12)-3' (SEQ ID-NO: 1), der Haarnadelduplex 5'- d(A12C4T12)-3' (SEQ ID-NO: 9). Die äquimolaren Lösungen variieren in der Konzentration zwischen 3,0 und 0,19 mikromolar. Für eine zweimikromolare Lösung wird ein Tm-Wert von 31,78+-0,24°C ermittelt.
Beispiel 4
Wie Beispiel 1, nur mit folgenden Unterschieden:
Der Einzelstrang ist 5'-d(A4CA7)-3' (SEQ ID-NO: 4), der Haarnadelduplex 5'- d(A4CA7C4T7GT4)-3'(SEQ ID-NO: 11). Die äquimolaren Lösungen variieren in der Konzentration zwischen 3,0 und 0,19 mikromolar. Für eine zweimikro­ molare Lösung wird ein Tm-Wert von 33,46+-0,07°C ermittelt.
Beispiel 5
Wie Beispiel 1, nur mit folgenden Unterschieden:
Der Einzelstrang ist 5'-d(A4TA7)-3' (SEQ ID-NO: 5), der Haarnadelduplex 5'- d(A4TA7C4T7AT4)-3' (SEQ ID-NO: 12). Die äquimolaren Lösungen variieren in der Konzentration zwischen 3,5 und 0,22 mikromolar. Für eine zweimikro­ molare Lösung wird ein Tm-Wert von 28,78+-0,20°C ermittelt.
Beispiel 6
Wie Beispiel 5, nur mit folgenden Unterschieden:
Der Haarnadelduplex ist 5'-d(A4CA7C4T7GT4)-3' (SEQ ID-N0 : 11). Die äquimolaren Lösungen mit dem gleichen Einzelstrang variieren in der Konzentration zwischen 3,0 und 0,19 mikromolar. Für eine zweimikromolare Lösung wird ein Tm-Wert von 21,92+-0,36°C ermittelt.
Beispiel 7
Wie Beispiel 5, nur mit folgenden Unterschieden:
Der Haarnadelduplex ist 5'-d(A4GA7C4T7CT4)-3' (SEQ ID-NO: 10). Die äquimolaren Lösungen mit dem gleichen Einzelstrang variieren in der Konzentration zwischen 3,0 und 0,19 mikromolar. Für eine zweimikromolare Lösung wird ein Tm-Wert von 16,98+-0,61°C ermittelt.
Beispiel 8
Wie Beispiel 4, nur mit folgenden Unterschieden:
Der Haarnadelduplex ist 5'-d(A12C4T12)-3' (SEQ ID-NO: 9). Die äquimolaren Lösungen mit dem gleichen Einzelstrang variieren in der Konzentration zwischen 3,3 und 0,21 mikromolar. Für eine zweimikromolare Lösung wird ein Tm-Wert von 18,47+-0,46°C ermittelt.
Beispiel 9
Wie Beispiel 3, nur mit folgenden Unterschieden:
Der Haarnadelduplex ist 5'-d(A4TA7C4T7A4)-3' (SEQ ID-NO: 12). Die äquimolaren Lösungen mit dem gleichen Einzelstrang variieren in der Konzentration zwischen 3,3 und 0,21 mikromolar. Für eine zweimikromolare Lösung wird ein Tm-Wert von 16,85+-0,06°C ermittelt.
Beispiel 10
Wie Beispiel 1, nur mit folgenden Unterschieden:
Der Haarnadelduplex ist 5'-d(A4TA7C4T7A4)-3' (SEQ ID-NO: 12). Die äquimolaren Lösungen mit dem gleichen Einzelstrang variieren in der Konzentration zwischen 3,87 und 0,24 mikromolar. Für eine zweimikro­ molare Lösung wird ein Tm-Wert von 18,48+-0,25°C ermittelt.
Beispiel 11
Wie Beispiel 1, nur mit folgenden Unterschieden:
Der Haarnadelduplex ist 5'-d(A4CA7C4G7A4)-3' (SEQ ID-NO: 11). Die äquimolaren Lösungen mit dem gleichen Einzelstrang variieren in der Konzentration zwischen 3,2 und 0,2 mikromolar. Für eine zweimikromolare Lösung wird ein Tm-Wert von 19,11+-0,11°C ermittelt.
Beispiel 12
Wie Beispiel 1, nur mit folgenden Unterschieden:
Der Einzelstrang ist 5'-d([CA]5A2)-3' (SEQ ID-NO: 6), der Haarnadelduplex 5'-d([CA]5A2C4T2[TG]5)-3' (SEQ ID-NO: 13). Die äquimolaren Lösungen variieren in der Konzentration zwischen 3,55 und 0,22 mikromolar. Für eine zweimikromolare Lösung wird ein Tm-Wert von 49,46+-0,16°C ermittelt. In einer unabhängigen Wiederholungsmessung mit neuer Probe wurde ein Tm- Wert von 50,02+-0,29°C ermittelt.
Beispiel 13
Wie Beispiel 1, nur mit folgenden Unterschieden:
Der Einzelstrang ist 5'-d(C5A7)-3'(SEQ ID-NO: 7), der Haarnadelduplex 5'-d(C5A7C4T7G5)-3' (SEQ ID-NO: 14). Die äquimolaren Lösungen variieren in der Konzentration zwischen 2,93 und 0,37 mikromolar. Für eine zwei­ mikromolare Lösung wird ein Tm-Wert von 45,50+-0,33°C ermittelt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (11)

1. Verfahren zur Bildung tripelhelixbildender Oligomere und deren Verbindungen, bei dem aus einem Nucleinsäurestrang, vorzugsweise eines DNA-Doppelstranges, ein Bereich mit einer geeigneten Sequenz gesucht wird, aus der die Oligomer-Sequenz abgeleitet wird, dadurch gekennzeichnet, daß ein Bereich des Nucleinsäurestranges ausgewählt wird, der reich an Cytosinen und/oder reich an Adeninen ist, und daß ein Oligomer bzw. dessen Verbindung synthetisiert wird, bei dem bzw. der die Oligomersequenz mit der Sequenz des ausgewählten Bereiches des Nucleinsäurestranges, einschließlich der Strangorientierung, übereinstimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Bereich des Nucleinsäurestranges ausgewählt wird, in dem von den Basen mindestens 17% Cytosine, mindestens 17% Adenine und in der Summe mindestens 67% Adenine oder Cytosine sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Oligomer bzw. dessen Verbindung synthetisiert wird, bei dem bzw. der die Basen vollständig oder teilweise durch Basenanaloga ersetzt sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Oligomer bzw. dessen Verbindung synthetisiert wird, bei dem bzw. der die Base Cytosin durch Cytosinanaloga ersetzt ist, wobei zu den Cytosinanaloga zumindest Pseudoisocytosin, 5-Methylcytosin, 5-Propinylcytosin, 6-Oxocyto­ sin, 2-Aminopyridin, 8-Oxoadenin und alle Sechsringsysteme zu zählen sind, die bezüglich der mit dem Rückgrat verbundenen Ringposition exozyklisch in 2-Stellung einen Sauerstoff oder in 4-Stellung eine Aminogruppe tragen.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Oligomer bzw. dessen Verbindung synthetisiert wird, bei dem bzw. der die Base Adenin durch Adeninanaloga ersetzt ist, wobei zu den Adeninanaloga zumindest 2-Aminopurin, 2,6-Diaminopurin und sämtliche Verbindungen zu zählen sind, die an einem Puringrundkörper außer Substitutionen an anderen Positionen noch in 2- oder in 6-Position exozyklisch eine Aminogruppe tragen.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Oligomer bzw. dessen Verbindung synthetisiert wird, bei dem bzw. der die Base Thymin durch Thyminanaloga ersetzt ist, wobei unter den Thyminanaloga zumindest 5-Propinyluracil, Uracil und diejenigen Verbindungen zu verstehen sind, bei denen ein oder beide Sauerstoffe der natürlichen Basen Thymin oder Uracil durch Schwefel ersetzt sind.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Oligomer bzw. dessen Verbindung synthetisiert wird, bei dem bzw. der die Base Guanin durch Guaninanaloga ersetzt ist, wobei unter Guaninanaloga zumindest 6-Thioguanin zu verstehen ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Oligomer der Längen 7 bis 40 synthetisiert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Oligomerverbindung synthetisiert wird, dessen Oligomeranteil eine Länge 5 bis 40 besitzt.
10. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligomer bzw. dessen Verbindung in überwiegend unverzweigter Anordnung Nucleinsäurebasen und/oder Basenanaloga mit unterschiedlichen Rückgraten verbindet, einschließend DNA, RNA, in 2'-Position oder auch am Phosphor modifizierte Rückgrate, peptidische Rückgrate (PNA) sowie Rückgrate mit Morpholino- oder Guanidinostruktur.
11. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Oligomerverbindung synthetisiert wird, die vorzugsweise die Verbindung eines Oligomers mit einer oder mehreren chemischen Substanzen, die besondere Affinität zu Nucleinsäurestrukturen zeigen, und/oder die Verbindung zwischen Oligomeren darstellt.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006027099A2 (de) * 2004-09-03 2006-03-16 Justus-Liebig-Universität Giessen Hochspezifisch mit dna interagierende enzym-konjugate mit programmierbarer spezifität

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993010820A1 (en) * 1991-11-26 1993-06-10 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
WO1994013326A1 (en) * 1992-12-08 1994-06-23 Genta Incorporated Formation of triple helix complexes using a novel motif
WO1994024144A2 (en) * 1993-04-19 1994-10-27 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5399676A (en) * 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5399676A (en) * 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
WO1993010820A1 (en) * 1991-11-26 1993-06-10 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5645985A (en) * 1991-11-26 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
WO1994013326A1 (en) * 1992-12-08 1994-06-23 Genta Incorporated Formation of triple helix complexes using a novel motif
WO1994024144A2 (en) * 1993-04-19 1994-10-27 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BALATSKAYA,Svetlana V.,et.al.: Alternate-Strand Triplex Formation: Modulation of Binding to Matched and Mismatched Duplexes by Sequence Choisein the Pu-Pu-Py Block. In: Biochemistry, 1996, 35,S.13328-13337 *
MILLS,Martin,et.al.: Triple Helical Structures Involving Inosine: There Is a Penalty for Promiscuity. In: Biochemistry, 1996, 35, S.13338- S.13344 *
PHIPPS,Kathryn A.,et.al.: Solution Structure of an Intramolecular DNA Triplex Containing 5-(1-Propynyl)-2'-deoxyuridine Residues in the Third Strand. In: Biochemistry, 1998, 37, S.5820- S.5830 *
SARKAR,Munna,et.al.: A Synthetic Model for Triple-Helical Domains in Self-Splicing Group I Introns *
VÖLKER,Jens,et.al.: Thermodynamic Properties of a Conformationally Constrained Intramolecular DNA Triple Helix. In: Biochemistry, 1997, 36, S.756- S.767 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006027099A2 (de) * 2004-09-03 2006-03-16 Justus-Liebig-Universität Giessen Hochspezifisch mit dna interagierende enzym-konjugate mit programmierbarer spezifität
WO2006027099A3 (de) * 2004-09-03 2006-08-10 Univ Giessen Justus Liebig Hochspezifisch mit dna interagierende enzym-konjugate mit programmierbarer spezifität

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