DE19841941A1

DE19841941A1 - A novel metabotropic receptor complex from the central nervous system, related coding sequences and methods of identifying binding substances, ligands and interactions with other proteins

Info

Publication number: DE19841941A1
Application number: DE19841941A
Authority: DE
Inventors: Hans-Christian Kornau; Gisela Eisenhardt; Rohini Kuner; Kirsten Hirschfeld
Original assignee: BASF Lynx Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1998-09-14
Publication date: 2000-03-16

Abstract

A protein heteromer, containing at least a GABA-B receptor protein and at least a protein (A) with a 940 or 941 amino acid sequence (given in the specification) or its derivative which retains the biological activity of the protein heteromer, is new. Independent claims are also included for: (1) (A) as above; (2) nucleic acid (I) encoding (A); (3) a recombinant nucleic acid construct containing (I) and a sequence encoding a GABA-B receptor functionally linked with at least one genetic regulatory element; a host organism transformed with (I) or a construct as in (3), optionally together with a sequence encoding a GABA-B receptor; a transgenic animal containing a functional or non-functional (I) or construct as in (3); (4) a transgenic animal having an altered (I) in the germ and/or the whole or part of the somatic cells by a gene technique method or through interruption by insertion of DNA elements; mono- or polyclonal antibody or antibody mixture, specifically recognizing (A) or the protein heteromer above; (5) a method to identify substances with specific binding affinity to (A) or a protein heteromer as above; (6) methods to qualitatively or quantitatively detect (I), (A) or the protein heteromer in a biological sample; (7) a method to qualitatively or quantitatively characterize (A) through use of specific agonists or antagonists; and (8) a method to quantify the protein activity of (A).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Proteine, die für neue metabotrope GABA-Rezeptoren kodieren und mit GABA_B-Rezeptor proteinen einen neuen metabotroper GABA-Rezeptor-Komplex ( = Pro teinheteromer) bilden, und Nukleinsäuresequenzen oder rekombinan te Nukleinsäurekonstrukte, die für die Proteine kodieren.The present invention relates to isolated proteins which code for new metabotropic GABA receptors and with GABA _B receptor proteins form a new metabotropic GABA receptor complex (= protein heteromer), and nucleic acid sequences or recombinant nucleic acid constructs which code for the proteins.

Die Erfindung betrifft außerdem Wirtsorganismen oder transgene Tiere enthaltend die Nukleinsäuresequenzen oder die rekombinanten Nukleinsäurekonstrukte sowie mono- oder polyklonale Antikörper, die gegen die isolierten Proteine gerichtet sind.The invention also relates to host organisms or transgenic Animals containing the nucleic acid sequences or the recombinant Nucleic acid constructs as well as mono- or polyclonal antibodies, which are directed against the isolated proteins.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Subtanzen mit spezifischer Bindungsaffinität an die erfindungsge mäßen neuen GABA-Rezeptoren bzw. die erfindungsgemäßen GABA-Re zeptor-Komplexe, ein Verfahren zum qualitativen oder quantitati ven Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder der erfindungsgemäßen Proteine sowie einem Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch an einen erfindungsgemäßen GA BA-Rezeptor oder an eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz binden. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der Nuklein säuresequenzen und Proteine.The invention further relates to a method for locating Substances with a specific binding affinity for the invention according to new GABA receptors or the GABA-Re according to the invention zeptor complexes, a process for qualitative or quantitative ven detection of the nucleic acid sequences according to the invention or the proteins according to the invention and a method for detection of substances that are specific to a GA according to the invention BA receptor or to a nucleic acid sequence according to the invention tie. The invention further relates to the use of the nucleus acid sequences and proteins.

Im zentralen Nervensystem von Vertebraten wird vornehmlich γ- Amino-Buttersäure (GABA) als inhibierender Neurotransmitter ver wendet. GABA interagiert mit zwei Rezeptortypen GABA_A und GABA_B. Gut charakterisiert ist die Wirkung von GABA auf ionotrope Rezep toren, die GABA_A-Rezeptoren (Barnard et al.,Trends Neurosci., 10, 1987: 502-509). Diese heteromeren Komplexe bilden Anionenka näle, die auf Ligandenbindung hin geöffnet werden. Die Ausschüt tung von GABA führt über die Aktivierung dieser Kanäle zu einem Chloridioneneinstrom, einem inhibitorischen postsynaptischen Strom, in die Zelle. GABA_A-Rezeptoren sind die Angriffspunkte ei ner Reihe von Medikamenten wie beispielsweise von Benzodiazepi nen, Barbituraten und anderen mehr [North (ed), 1994, Ligand- and Voltage Gated Ion Channels, in: Handbook of receptors and chan nels, vol. 2, CRC Press, Inc. and Smith and Olson, Trends Neuro sci., 16, 1995: 162-168].In the central nervous system of vertebrates, γ-amino-butyric acid (GABA) is mainly used as an inhibiting neurotransmitter. GABA interacts with two receptor types GABA _A and GABA _B. The effect of GABA on ionotropic receptors is well characterized, the GABA _A receptors (Barnard et al., Trends Neurosci., 10, 1987: 502-509). These heteromeric complexes form anion channels, which are opened upon ligand binding. The release of GABA leads to the activation of these channels to a chloride ion influx, an inhibitory post-synaptic current, into the cell. GABA _A receptors are the target of a number of drugs such as benzodiazepines, barbiturates and others [North (ed), 1994, Ligand- and Voltage Gated Ion Channels, in: Handbook of receptors and chan nels, vol. 2, CRC Press, Inc. and Smith and Olson, Trends Neuro sci., 16, 1995: 162-168].

1981 wurden zum ersten Mal Bindungsstellen für GABA nachgewiesen, die unabhängig von Bindungsstellen auf GABA_A-Rezeptoren vorliegen (Hill and Bowery, Nature, 290, 1981: 149-152). Sie befinden si ch auf GABA-Rezeptoren, die intrazellulär an G-Proteine gekoppelt sind. Über diese G-Proteine sind diese Rezeptoren an neuronale Kalium- und Calciumkanäle gekoppelt. Diese neuen GABA-Rezeptoren ( = GABA_B-Rezeptoren) werden auch als metabotrope GABA-Rezeptoren bezeichnet. Diese GABA_B-Rezeptoren sind über das zentrale und pe riphäre Nervensystem verteilt (Ong et al., Life Sciences, Vol. 46, 1990: 1489-1501, Bowery et al., Drug Res., 42 (1), 1992: 215-223). Diese Rezeptoren werden sowohl prä- als auch postsy naptisch gefunden. An der Präsynapse kontrollieren die metabotro pen GABA-Rezeptoren ( = GABA_B-Rezeptoren) die Ausschüttung ver schiedener Neurotransmitter wie GABA, L-Glutamat, Noradrenalin, Dopamin, Serotonin, Substanz P, Cholecystokinin, Somatostatin und anderen. Liganden, Agonisten oder Antagonisten für GABA_B-Rezepto ren, die die Ausschüttung eines spezifischen Neurotransmitters oder Neuropeptides regulieren, können benutzt werden, um Un gleichgewichte zwischen verschiedenen Neurotransmittersystemen, wie sie bei neurodegenerativen Erkrankungen, exzitotoxischen Be gleiterscheinungen von neurologischen Erkrankungen sowie bei psy chiatrischen Krankheiten vorkommen, auszugleichen. An der Postsy napse findet man GABA_B-Rezeptoren, die über Gi-Proteine verschie dene Kalium-Kanäle aktivieren. Null-Mutationen für einen solchen Kanal in transgenen Mäusen führt zum Verlust der durch GABA be wirkten späten Inhibierung und dadurch zu spontanen Krämpfen. GABA_B-Rezeptoren sind an Änderungen der synaptischen Effizienz be teiligt, die Lern- und Gedächtnisvorgängen zugrundeliegen. GABA_B- Rezeptor-Agonisten zeigen positive Wirkung in Tiermodellen für chronische Schmerzen sowie Kokain-Abhängigkeit. Antagonisten wir ken sich positiv in Modellen von "Absence-Epilepsie" aus (Bettler et al., Curr. Opin. Neurolbiol., 8, 1998: 345-350). Aktivierung von GABA_B-Rezeptoren dämpft übererregte neuronale Verknüpfungen. GABA_B-Rezeptoren sind daher geeignete molekulare Targets für die Behandlung von Epilepsie, Schlaganfall, kognitiven Verlusten, chronischen Schmerzen und weiteren neurologischen Erkrankungen sowie für die Behandlung von psychischen Erkrankungen wie Angst, depressiven Erkrankungen, Schizophrenie, Migräne und anderen. Sie sind auch als Targets für die Therapie von Kokain-Abhängigen so wie als Angriffspunkt für neurartige kognitive Enhancer geeignet. Ein GABA_B-Rezeptor-Agonist, Baclofen (Lioresal), wird für die Be handlung von multipler Sklerose und bei den Folgen von Rücken marksverletzungen klinisch eingesetzt (Bowery, Annu. Rev. Pharma col. Toxicol., 33, 1993: 109-147).In 1981, binding sites for GABA were found for the first time, which are independent of binding sites on GABA _A receptors (Hill and Bowery, Nature, 290, 1981: 149-152). They are located on GABA receptors that are intracellularly coupled to G proteins. These receptors are coupled to neuronal potassium and calcium channels via these G proteins. These new GABA receptors (= GABA _B receptors) are also known as metabotropic GABA receptors. These GABA _B receptors are distributed across the central and peripheral nervous system (Ong et al., Life Sciences, Vol. 46, 1990: 1489-1501, Bowery et al., Drug Res., 42 (1), 1992: 215 -223). These receptors are found both pre- and postsy naptically. At the presynapse, the metabotropic GABA receptors (= GABA _B receptors) control the release of various neurotransmitters such as GABA, L-glutamate, noradrenaline, dopamine, serotonin, substance P, cholecystokinin, somatostatin and others. Ligands, agonists or antagonists for GABA _B receptors, which regulate the release of a specific neurotransmitter or neuropeptide, can be used to correct imbalances between different neurotransmitter systems, such as those associated with neurodegenerative diseases, excitotoxic symptoms of neurological diseases, and psychiatric disorders occur to balance. GABA _B receptors can be found on the post-synapse, which activate various potassium channels via Gi proteins. Zero mutations for such a channel in transgenic mice leads to the loss of the late inhibition caused by GABA and thus to spontaneous convulsions. GABA _B receptors are involved in changes in synaptic efficiency that are based on learning and memory processes. GABA _B - receptor agonists show positive effects in animal models for chronic pain and cocaine addiction. Antagonists are positive in models of "absence epilepsy" (Bettler et al., Curr. Opin. Neurolbiol., 8, 1998: 345-350). Activation of GABA _B receptors dampens overexcited neuronal connections. GABA _B receptors are therefore suitable molecular targets for the treatment of epilepsy, stroke, cognitive loss, chronic pain and other neurological disorders as well as for the treatment of mental disorders such as anxiety, depressive disorders, schizophrenia, migraines and others. They are also suitable as targets for the therapy of cocaine addicts and as a target for neurogenic cognitive enhancers. A GABA _B receptor agonist, baclofen (Lioresal), is used clinically for the treatment of multiple sclerosis and the consequences of spinal cord injuries (Bowery, Annu. Rev. Pharma col. Toxicol., 33, 1993: 109-147 ).

Auch im peripheren Nervensystem (PNS) werden positive Effekte von GABA_B-Rezeptor-Agonisten vermutet, beispielsweise bei Entzündungen und Atemwegserkrankungen. Positive effects of GABA _B receptor agonists are also suspected in the peripheral nervous system (PNS), for example in inflammation and respiratory diseases.

Einzelne biochemische und pharmakologische Erkenntnisse können möglicherweise dahingehend interpretiert werden, daß im zentralen Nervensystem mehrere GABA_B-Rezeptor-Subtypen mit verschiedenen Funktionen existieren. Bisher wurde die cDNA für einen GABA_B-Re zeptor gefunden, der in zwei aminoterminalen Spleissformen auf tritt, welche sich pharmakologisch kaum unterscheiden (Kaupmann et al., Nature, 386, 239-246, 1997, WO97/46675). Dieser GABA_B-Re zeptor weist nach Expression in heterologen Systemen ähnlich hohe Affinitäten zu den bekannten GABA_B-Rezeptor-Antagonisten auf, wie sie im Gehirn gefunden werden. Die Affinitäten von GABA_B-Rezeptor- Agonisten zu diesem klonierten GABA_B-Rezeptor liegen dagegen etwa um den Faktor 100 unter den im Gehirn gemessenen Werten (Kaupmann et al., Nature, 386, 239-246, 1997). Verschiedene GABA_B-Rezepto rantagonisten und -agonisten und ihre Wirkung sind Froestl et al., J. Med. Chem. Vol. 38, 1995: 3297-3312 und 3313-3331 zu entnehmen.Individual biochemical and pharmacological findings can possibly be interpreted to mean that several GABA _B receptor subtypes with different functions exist in the central nervous system. So far, the cDNA has been found for a GABA _B receptor which occurs in two amino terminal splice forms which hardly differ pharmacologically (Kaupmann et al., Nature, 386, 239-246, 1997, WO97 / 46675). After expression in heterologous systems, this GABA _B receptor has similarly high affinities for the known GABA _B receptor antagonists as are found in the brain. The affinities of GABA _B receptor agonists for this cloned GABA _B receptor, on the other hand, are approximately 100 times lower than the values measured in the brain (Kaupmann et al., Nature, 386, 239-246, 1997). Various GABA _B receptor antagonists and agonists and their action can be found in Froestl et al., J. Med. Chem. Vol. 38, 1995: 3297-3312 and 3313-3331.

Da GABA_B-Rezeptoren eine zentrale Rolle bei verschiedenen patholo gischen Prozessen des zentralen und peripheren Nervensystems spielen bzw. an derartigen Prozessen beteiligt sind, sind sie ge suchte Targets für die Entwicklung neuer Pharmaka.Since GABA _B receptors play a central role in various pathological processes of the central and peripheral nervous system or are involved in such processes, they are sought targets for the development of new pharmaceuticals.

Es bestand daher die Aufgabe neue GABA_B-Rezeptoren oder Proteine, die mit den GABA_B-Rezeptoren interagieren, zu identifizieren und zu charakterisieren, die möglichst hochaffine Bindungsstellen für GABA_B-Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten besitzen und die damit die Entwicklung molekularer Testsysteme ermöglichen, mit denen man viele Tausend verschiedene Verbindungen nach hochaffinen Sub stanzen in kurzer Zeit durchsuchen kann. Diese so charakterisier ten und spezifisch am GABA_B-Rezeptor angreifenden Substanzen sind potentielle Kandidaten für Wirkstoffe gegen Krankheiten wie Epi lepsie, Schlaganfall, psychische Erkrankungen wie Angst, manisch depressive Erkrankungen, Schizophrenie, Migräne und andere mehr.It was therefore the task of identifying and characterizing new GABA _B receptors or proteins which interact with the GABA _B receptors, which have binding sites for GABA _B receptor agonists and antagonists which are as high as possible affecting the development of molecular test systems enable to search through thousands of different connections for high affinity substances in a short time. These substances, which are so characterized and specifically attack the GABA _B receptor, are potential candidates for active substances against diseases such as epilepsy, stroke, mental illnesses such as anxiety, manic depressive illnesses, schizophrenia, migraines and others.

Diese Aufgabe wurde mit dem erfindungsgemäßen Proteinheteromer, enthaltend mindestens ein GABA_B-Rezeptorprotein und mindestens ein Protein mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz, wobei wenigstens noch eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften des in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Proteins oder des Proteinheteromer erhalten bleibt bzw. mit dem isolierten Protein, enthaltend die in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz, wobei wenig stens noch eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften des in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Proteins erhalten bleibt, gelöst.This object was achieved with the protein heteromer according to the invention, comprising at least one GABA _B receptor protein and at least one protein with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or one of them by substitution, inversion, insertion or deletion of one or more Sequence obtainable amino acid residues, wherein at least one of the essential biological properties of the protein shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or the protein heteromer is retained or with the isolated protein containing those in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 amino acid sequence shown or a sequence obtainable therefrom by substitution, inversion, insertion or deletion of one or more amino acid residues, with at least one of the essential biological properties of the protein shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 being retained , solved.

Unter den erfindungsgemäßen Proteinheteromeren sind GABA-Rezep tor-Komplexe vorteilhaft metabotrope GABA-Rezeptor-Komplexe ent haltend mindestens einen GABA_B-Rezeptorprotein und mindestens ein Protein mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz zu verstehen. In WO97/46675 werden geeignete GABA_B-Rezeptorproteine, die vorteilhaft in den Proteinheteromeren enthalten sein können, beschrieben. Diese GABAB-Rezeptorproteine tragen in WO97/46675 die Sequenzbezeichnungen bzw. Klonnamen "SEQ ID NO: 1" bzw. "GABABR1a rat" (kloniert aus Rattus norvegi cus), "SEQ ID NO: 3" bzw. "GABABR1a/b human" (kloniert aus Homo sapiens), "SEQ ID NO: 5" bzw. "GABABR1b rat" (kloniert aus Rattus norvegicus) und "SEQ ID NO: 7" bzw. "GABABR1b human" (kloniert aus Homo sapiens). Auf diese Rezeptoren und die Schrift WO97/46675 wird an dieser Stelle ausdrücklich bezug genommen.The protein heteromers according to the invention are to be understood as meaning GABA receptor complexes which advantageously contain metabotropic GABA receptor complexes containing at least one GABA _B receptor protein and at least one protein with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. WO97 / 46675 describes suitable GABA _B receptor proteins which can advantageously be contained in the protein heteromers. In WO97 / 46675, these GABAB receptor proteins have the sequence names or clone names "SEQ ID NO: 1" or "GABABR1a rat" (cloned from Rattus norvegi cus), "SEQ ID NO: 3" or "GABABR1a / b human" (cloned from Homo sapiens), "SEQ ID NO: 5" or "GABABR1b rat" (cloned from Rattus norvegicus) and "SEQ ID NO: 7" or "GABABR1b human" (cloned from Homo sapiens). These receptors and the document WO97 / 46675 are expressly referred to here.

Unter den erfindungsgemäßen isolierten Proteinen sind Proteine zu verstehen, die eine in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 darge stellte Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Amino säureresten erhältliche Sequenz enthalten, wobei wenigstens noch eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften des in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Proteins erhalten bleibt. Dabei können beispielsweise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Ba sizität, Hydrophobizität etc.) ersetzt werden. Beispielsweise werden Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucin reste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausge tauscht. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ih rer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden. Die solchermaßen gegenüber der SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 veränderten Proteine besitzen wenigstens 60%, bevorzugt we nigstens 70% und besonders bevorzugt wenigstens 90% Sequenziden tität zu den Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 berechnet nach dem Algorithmus von "Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990".Proteins are among the isolated proteins according to the invention understand the one in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 put amino acid sequence or a substitution thereof, Inversion, insertion or deletion of one or more amino contain acid residues available sequence, at least still one of the essential biological properties of the in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 protein is retained. For example, certain amino acids can be replaced by such with similar physicochemical properties (space filling, Ba sicity, hydrophobicity etc.) are replaced. For example become arginine residues against lysine residues, valine residues against isoleucine residues or aspartic acid residues against glutamic acid residues swaps. However, one or more amino acids can also be present in it the order is reversed, added or removed, or several of these measures can be combined become. The so compared to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 modified proteins have at least 60%, preferably we at least 70% and particularly preferably at least 90% sequence ides to the sequences SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 according to the algorithm of "Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990 ".

Unter der wesentlichen biologischen Eigenschaft der erfindungsge mäßen Proteine bzw. Proteinheteromere sind der oder die transmem branen Bereiche, der aminoterminale Bereich und wesentlich der carboxyterminale Bereich des Proteins allein oder im Proteinhete romer zu verstehen (siehe Fig. 2). Diese Proteinbereiche ermög lichen die spezielle biologische Wirkung der Proteine bzw. Pro teinheteromere. Diese wesentlichen biologischen Eigenschaften beinhalten außerdem die hochaffine Bindung (Kd<10nM) spezifischer synthetischer oder natürlicher Agonisten und Antagonisten an die erfindungsgemäßen Proteine mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenz, die Signalweiterleitung an ein intrazelluläres G-Protein sowie die Interaktion mit den oben genannten, bekannten GABA_B-Rezeptoren.The essential biological property of the proteins or protein heteromers according to the invention is to be understood as the transmembrane region or regions, the amino-terminal region and essentially the carboxy-terminal region of the protein alone or in the protein heteromer (see FIG. 2). These protein areas enable the special biological effect of the proteins or protein heteromers. These essential biological properties also include the high-affinity binding (Kd <10nM) of specific synthetic or natural agonists and antagonists to the proteins according to the invention with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, the signal transmission to an intracellular G protein as well as the interaction with the known GABA _B receptors mentioned above.

Das isolierte Protein und seine funktionellen Varianten lassen sich vorteilhafterweise aus dem Gehirn von Mammalia wie Homo sa piens oder Rattus norvegicus isolieren. Auch Homologe aus anderen Mammalia sind unter funktionellen Varianten zu verstehen.The isolated protein and its functional variants leave advantageously from the brain of Mammalia like Homo sa Isolate piens or Rattus norvegicus. Even homologues from others Mammalia are to be understood as functional variants.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Nukleinsäuresequenzen, die für die oben beschriebenen Proteine kodieren, insbesondere für solche mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestell ten Primärstruktur. Die Nukleinsäuresequenz aus Rattus norvegicus oder Homo sapiens ist in SEQ ID NO: 1 bzw. in SEQ ID NO: 3 darge stellt.The invention further relates to nucleic acid sequences, which code for the proteins described above, in particular for those shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 th primary structure. The nucleic acid sequence from Rattus norvegicus or Homo sapiens is shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 poses.

Nach Isolierung und Sequenzierung sind die erfindungsgemäßen Nu kleotidsequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 oder deren funk tionelle Äquivalente wie z. B. Allelvarianten erhältlich. Unter Allelvarianten sind SEQ ID NO: 1- oder SEQ ID NO: 3-Varianten zu verstehen, die 60 bis 100% Homologie auf Aminosäureebene, bevor zugt 70 bis 100%, ganz besonders bevorzugt 90 bis 100% aufwei sen. Allelvarianten umfassen insbesondere solche funktionellen Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 dargestell ten Sequenz erhältlich sind, wobei wenigstens noch eine der we sentlichen biologischen Eigenschaften erhalten bleibt. Homologe oder sequenzverwandte Nukleinsäuresequenzen können aus allen Säu gerspezies einschließlich Mensch nach gängigen Verfahren durch Homologiescreening durch Hybridisierung mit einer Probe der er findungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon isoliert werden.After isolation and sequencing, the nu Kleotide sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 or their radio tional equivalents such as B. Allele variants available. Under Allelic variants are SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 variants understand the 60 to 100% homology at the amino acid level before prefers 70 to 100%, very particularly preferably 90 to 100% sen. Allelic variants include functional ones in particular Variants created by deletion, insertion or substitution of Nucleotides from the shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 th sequence are available, with at least one of the we significant biological properties are preserved. Homologue or sequence-related nucleic acid sequences can be from all acids species including human beings by common methods Homology screening by hybridization with a sample of the nucleic acid sequences according to the invention or parts thereof isolated become.

Unter funktionellen Äquivalenten sind auch Homologe von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 beispielsweise ihre Homologen aus anderen Mammalia, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz zu verstehen.Homologs of are also among functional equivalents SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, for example, from their homologs other mammals, truncated sequences, single-stranded DNA or RNA to understand the coding and non-coding DNA sequence.

Solche funktionellen Äquivalente lassen sich ausgehend von den in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 beschriebenen DNA-Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisie rungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Vertebraten wie Mammalia isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Stan dardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybri sierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservier ten Bereiche beispielsweise aus den Transmembranbereichen oder aus dem aminoterminalen Bereich, die über Vergleiche mit anderen Transmembranproteinen speziell anderen GABA-Rezeptoren in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nuklein säuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure Oligonu kleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisie rung verwendet werden, varieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA : DNA-Hybride ca 10°C niedriger als die von DNA : RNA-Hybriden gleicher Länge.Such functional equivalents can be derived from the in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 described DNA sequences or Share these sequences, for example with conventional hybridization method or the PCR technique from other vertebrates such as Isolate mammalia. These DNA sequences hybridize under Stan dardbedingungen with the sequences of the invention. To the hybri short oligonucleotides are the preservation advantageous areas from the transmembrane areas or from the amino terminal area, which compares with others Transmembrane proteins specifically other GABA receptors in the Those skilled in the art can be determined used. It but can also be longer fragments of the nucleus according to the invention acids or the complete sequences for hybridization be used. Depending on the nucleic acid used Oligonu kleotide, longer fragment or complete sequence or each after what kind of nucleic acid DNA or RNA for hybridization These standard conditions vary. So are the melting temperatures for DNA: DNA hybrids, for example approx. 10 ° C lower than that of DNA: RNA hybrids of the same length.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäu re Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlö sung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Ge genwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisie rungsbedingungen für DNA : DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperatu ren zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA : RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingun gen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angege benen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kal kulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Ge halt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridiza tion: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practi cal Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.Under standard conditions, for example, depending on the nucleic acid re temperatures between 42 and 58 ° C in an aqueous buffer solution solution with a concentration between 0.1 to 5 × SSC (1 × SSC = 0.15 M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.2) or additionally in Ge presence of 50% formamide such as 42 ° C in 5 × SSC, 50% To understand formamide. The hybridisies are advantageously located conditions for DNA: DNA hybrids at 0.1 × SSC and temperature ren between about 20 ° C to 45 ° C, preferably between about 30 ° C. up to 45 ° C. The hybridization conditions are for DNA: RNA hybrids gene advantageous at 0.1 × SSC and temperatures between about 30 ° C. to 55 ° C, preferably between about 45 ° C to 55 ° C. This specified The temperatures for hybridization are exemplary cal culinary melting temperature values for a nucleic acid with a Length of approximately 100 nucleotides and a G + C content of 50% in Absence of formamide. The experimental conditions for the DNA hybridization are found in relevant textbooks on genetics such as Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, and are described below formulas known to the person skilled in the art, for example depending on the Length of the nucleic acids, the type of hybrid or the G + C-Ge stop calculating. Further information on hybridization can be obtained from the The following textbooks can be obtained from a specialist: Ausubel et al. (eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridiza tion: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practi cal Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Außerdem sind unter Homologe der Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 Derivate wie beispielsweise Promotorvarianten zu verste hen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen ge meinsam oder einzeln vorgeschaltet sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Dele tion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren kön nen die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirk samkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.In addition, homologs of the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 derivatives such as promoter variants to understand hen. The promoters that correspond to the specified nucleotide sequences upstream together or individually, can be set by a or multiple nucleotide changes, by insertion (s) and / or dele tion (s) may be changed without the functionality or Effectiveness of the promoters are impaired. Furthermore, the promoters by changing their sequence in their action increased or completely through more effective promoters too foreign organisms are exchanged.

Unter Derivaten sind auch vorteilhaft Varianten zu verstehen, de ren Nukleotidsequenz im Bereich -1 bis -1000 vor dem Startkodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Protei nexpression verändert, bevorzugt erhöht wird. Weiterhin sind un ter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die am 3'-Ende verän dert wurden.Derivatives are also advantageously to be understood as variants, de Ren nucleotide sequence in the range -1 to -1000 before the start codon were modified so that gene expression and / or the protein nexpression changed, preferably increased. Furthermore, un ter derivatives to understand variants that change at the 3 'end were changed.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Or ganismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.For optimal expression of heterologous genes in organisms it advantageously the nucleic acid sequences according to the in Or used to change specific "codon usage". The "Codon usage" can be determined on the basis of computer evaluations by other easily identify known genes of the organism in question.

Weiterhin ist es von Vorteil die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 allein oder die Nukleinsäuren SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 und eine Sequenz, die für einen GABA_B- Rezeptorprotein kodiert, funktionell mit mindestens einem geneti schen Regulationselement zu den erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäurekonstrukten zu verknüpfen.Furthermore, it is advantageous to use the nucleic acids SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 according to the invention alone or the nucleic acids SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 and a sequence which codes for a GABA _B receptor protein with at least one function to link a genetic regulatory element to the recombinant nucleic acid constructs according to the invention.

Dazu werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen üblicher weise mit genetischen Regulationselementen wie Transkriptions- und Translationssignalen funktionell verknüpft. Diese Verknüpfung kann je nach gewünschter Anwendung zu einer Erhöhung oder Ernied rigung der Genexpression führen. Mit den solchermaßen hergestell ten rekombinanten Nukleinsäurekonstrukten werden anschließend Wirtsorganismen transformiert. Zusätzlich zu diesen neuen Regula tionssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gege benenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenzen inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regu lation wird nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Re gulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Auch am 3'-Ende der Nu kleinsäure-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte regulatori sche Elemente inseriert werden. Die Nukleinsäuresequenzen für die Sequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 und/oder für die GABA_B-Rezeptorproteine können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein, oder auf getrennten Genkonstrukten lokalisiert sein.For this purpose, the nucleic acid sequences according to the invention are usually functionally linked to genetic regulatory elements such as transcription and translation signals. Depending on the desired application, this linkage can lead to an increase or decrease in gene expression. With the recombinant nucleic acid constructs thus produced, host organisms are subsequently transformed. In addition to these new regulatory sequences, the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically modified so that the natural regulation has been switched off and the expression of the genes increased. However, the gene construct can also have a simpler structure, ie no additional regulatory signals are inserted in front of the sequences and the natural promoter with its regulation is not removed. Instead, the natural regulatory sequence is mutated so that regulation no longer takes place and gene expression is increased. Additional advantageous regulatory elements can also be inserted at the 3 'end of the nucleic acid sequences. The nucleic acid sequences for the sequences SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 and / or for the GABA _B receptor proteins can be contained in one or more copies in the gene construct, or can be localized on separate gene constructs.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Ver fahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, 1-PR- oder im 1-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung fin den. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispiels weise in den gram-positiven Promotoren wie amy und SPO2, in den Hefepromotoren wie ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder in Mam maliapromotoren wie CaM-KinaseII, CMV, Nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, β-Globin, GFAP, GAP43, Tyrosin Hydroxylase, Kainat-Rezeptor- Untereinheit 1, Glutamat-Rezeptor-Untereinheit B enthalten.Advantageous regulatory sequences for the Ver driving are in promoters such as cos, tac, trp, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, contain gal, trc, ara, SP6, 1-PR or in the 1-PL promoter, which fin advantageously in gram-negative bacteria application the. Further advantageous regulation sequences are examples in the gram-positive promoters such as amy and SPO2, in the Yeast promoters such as ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH or in Mam malia promoters such as CaM-KinaseII, CMV, Nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, β-globin, GFAP, GAP43, tyrosine hydroxylase, kainate receptor Subunit 1, glutamate receptor subunit B included.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regula tionssequenzen wie die oben genannten verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.In principle, all natural promoters can use their regulations tion sequences such as those mentioned above. About it In addition, synthetic promoters can also be used advantageously become.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.These regulatory sequences are designed to target expression enable nucleic acid sequences and protein expression. Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is immediately expressed and / or overexpressed.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs weise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafter weise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Trans kriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.The regulatory sequences or factors can be preferred wise influence the expression positively and thereby increase. So can strengthen the regulatory elements more advantageous done at the transcriptional level by using strong trans Kriptionssignale such as promoters and / or "enhancers" used become. But there is also an increase in translation possible, for example, by improving the stability of the mRNA becomes.

Unter "Enhancer" sind beispielsweise DNA-Sequenzen zu verstehen, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-POlymerase und DNA eine erhöhte Expression bewirken. Als weitere Regulati onssequenzen seien beispielhaft die locus control regions, silen cer oder jeweilige Teilsequenzen davon genannt. Diese Sequenzen können vorteilhaft für eine gewebespezifische Expression verwen det werden.“Enhancers” are understood to mean, for example, DNA sequences which have an improved interaction between RNA polymerase and DNA cause increased expression. As another regulati The locus control regions, silenes, are exemplary cer or called partial sequences thereof. These sequences can be used advantageously for tissue-specific expression be det.

Eine bevorzugte Ausführungsform ist die Verknüpfung der erfin dungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit einem Promotor, wobei der Promotor 5' up stream zu liegen kommt. Weitere Regulationssignale wie 3' gelegene Terminatoren oder Polyadenylierungssignale oder Enhancer können funktionell in dem Nukleinsäurekonstrukt Anwen dung finden.A preferred embodiment is the linking of the inventions nucleic acid sequence according to the invention with a promoter, wherein the Promoter 5 'up stream comes to rest. Further regulation signals such as 3 'terminators or polyadenylation signals or Enhancers can be functional in the nucleic acid construct find.

Unter dem Begriff des erfindungsgemäßen "rekombinanten Nuklein säurekonstrukts bzw. Genkonstrukts" sind auch komplette Vektor konstrukte zu verstehen. Diese Vektorkonstrukte oder Vektoren werden zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus verwen det. Vorteilhafterweise werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäu ren und/oder die Gene für die GABA_B-Rezeptoren in einen wirtsspe zifischen Vektor inseriert, der eine optimale Expression der Gene im ausgesuchten Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Ade novirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Für die Integration in Mammalia wird vorteilhaft lineare DNA verwendet.The term “recombinant nucleic acid construct or gene construct” according to the invention also means complete vector constructs. These vector constructs or vectors are used for expression in a suitable host organism. The nucleic acids according to the invention and / or the genes for the GABA _B receptors are advantageously inserted into a host-specific vector which enables optimal expression of the genes in the selected host. Vectors are well known to those skilled in the art and can be found, for example, in the book Cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). In addition to plasmids, vectors are also understood to mean all other vectors known to the person skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, baculovirus, ade novirus, transposons, IS elements, phasmids, phagemids, cosmids, linear or circular DNA. These vectors can be replicated autonomously in the host organism or can be replicated chromosomally. Linear DNA is advantageously used for the integration into Mammalia.

Die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen bzw. des rekombinanten Nukleinsäurekonstrukts kann vorteilhaft durch Erhöhen der Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatori scher Faktoren, die die Genexpression positiv beeinflussen, er höht werden. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem stärkere Transkriptionssignale wie Promotoren und Enhancer verwendet wer den. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation mög lich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert, oder die Ableseeffizienz dieser mRNA an den Ribosomen erhöht wird.The expression of the nucleic acid sequences according to the invention or of the recombinant nucleic acid construct can advantageously by Increasing the number of gene copies and / or by increasing regulatoryi factors that positively influence gene expression be raised. This can strengthen regulatory elements preferably done at the transcriptional level by using stronger ones Transcription signals such as promoters and enhancers are used the. In addition, an increase in translation is also possible Lich, for example by improving the stability of the mRNA, or increases the reading efficiency of this mRNA on the ribosomes becomes.

Zur Erhöhung der Genkopienzahl können die Nukleinsäuresequenzen oder homologe Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält. Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Genexpression verstärken.The nucleic acid sequences can be used to increase the number of gene copies or homologous genes, for example in a nucleic acid fragment or be built into a vector, which preferably the regulatory gene sequences assigned to respective genes or contains analogously acting promoter activity. In particular, be such regulatory sequences used that gene expression reinforce.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können zusammen mit den für die GABA_B-Rezeptoren kodierenden Sequenzen in einen ein zelnen Vektor kloniert werden und anschließend in dem gewünschten Organismus exprimiert werden. Alternativ kann auch jede der be schriebenen Nukleinsäuresequenzen und die für die GABA_B-Rezeptoren kodierenden Sequenzen in je einen einzelnen Vektor gebracht und diese getrennt in den jeweiligen Organismus über übliche Methoden wie Transformation, Transfektion, Transduktion, Elektrophoration oder Partikel-Gun verbracht werden.The nucleic acid sequences according to the invention can be cloned together with the sequences coding for the GABA _B receptors into an individual vector and then expressed in the desired organism. Alternatively, each of the nucleic acid sequences described and the sequences coding for the GABA _B receptors can also be brought into a single vector and these can be brought into the respective organism separately using customary methods such as transformation, transfection, transduction, electrophoration or particle gun.

Darüberhinaus kann das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfinungsgemäßen Nukleinsäuren auch in Form therapeu tisch oder diagnostisch geeigneter Fragmente exprimiert werden. Zur Generierung des rekombinanten Proteins können Vektorsysteme oder Oligonukleotide verwendet werden, die die Nukleinsäuren oder das Nukleinsäurekonstrukt um bestimmte Nukleotidsequenzen verlän gern und damit für veränderte Polypeptide kodieren, die einer einfacheren Reinigung dienen. Als solche "Tags" sind in der Lite ratur z. B. Hexa-Histidin-Anker bekannt oder Epitope, die als Antigene verschiedener Antikörper erkannt werden können (Studier et al., Meth. Enzymol., 185, 1990: 60-89 und Ausubel et al. [eds.]m 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York).In addition, the nucleic acid construct according to the invention can or the nucleic acids according to the invention also in the form of therapy table or diagnostically suitable fragments are expressed. Vector systems can be used to generate the recombinant protein or oligonucleotides can be used which are the nucleic acids or extend the nucleic acid construct by certain nucleotide sequences like to code for modified polypeptides that one serve easier cleaning. As such "tags" are in the Lite ratur z. B. Hexa-histidine anchor known or epitopes that as Antigens of different antibodies can be recognized (Studier et al., Meth. Enzymol., 185, 1990: 60-89 and Ausubel et al. [eds.] m 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York).

Als Wirtsorganismen sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrer funktionellen Äquivalente oder Derivate oder des rekombinanten Nukleinsäurekonstrukt allein oder zusammen mit einer Sequenz, die für GABA_B-Rezeptorproteine kodiert, ermög lichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Be vorzugte Organismen sind Bakterien wie Escherichia coli, Strepto myces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Mensch oder Tier, beispielsweise COS-, Hela-, HEK293-, Sf9- oder CHO-Zellen.In principle, all organisms are suitable as host organisms which enable expression of the nucleic acids according to the invention, their allele variants, their functional equivalents or derivatives or the recombinant nucleic acid construct alone or together with a sequence which codes for GABA _B receptor proteins. Host organisms are, for example, bacteria, fungi, yeasts, plant or animal cells. Preferred organisms are bacteria such as Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus or Pseudomonas, eukaryotic microorganisms such as Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, higher eukaryotic cells from humans or animals, for example COS, Hela, HEK293, Sf9 or CHO cells.

Gewünschtenfalls kann das Genprodukt auch in transgenen Organis men wie transgenen Tieren z. B. Mäusen, Ratten, Schafen, Rindern oder Schweinen zur Expression gebracht werden. Auch transgene Pflanzen sind im Prinzip denkbar. Bei den transgenen Organismen kann es sich auch um sogenannte Knock-Out Tiere handeln.If desired, the gene product can also be found in transgenic organisms men like transgenic animals e.g. B. mice, rats, sheep, cattle or pigs for expression. Even transgenic In principle, plants are conceivable. In the case of the transgenic organisms it can also be a so-called knock-out animal.

Dabei können die transgenen Tiere eine funktionelle oder nicht funktionelle erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder ein funk tionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt allein oder in Kombination mit einer funktionellen oder nicht funktio nellen Sequenz, die für GABA_B-Rezeptorproteine kodiert, enthalten.The transgenic animals can contain a functional or non-functional nucleic acid sequence according to the invention or a functional or non-functional nucleic acid construct alone or in combination with a functional or non-functional sequence which codes for GABA _B receptor proteins.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausgestaltung der oben beschriebe nen transgenen Tiere sind transgene Tiere, in dessen Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen; oder in dessen Keimzellen und der Gesamtheit oder einem Teil der soma tischen Zellen die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz durch gen technische Verfahren verändert oder durch Einfügen von DNA-Ele menten unterbrochen wurden.Another embodiment of the invention described above A transgenic animal is a transgenic animal in its germ cells or all or part of the somatic cells; or in its germ cells and all or part of the soma tables cells the nucleotide sequence according to the invention by gene technical processes changed or by inserting DNA-Ele elements were interrupted.

Die Kombination aus dem Wirtsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren wie Plasmide, Viren oder Phagen wie beispiels weise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter System, die Phagen 1, Mu oder andere temperänte Phagen oder Transposons und/oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen bilden ein Ex pressionssystem. Bevorzugt sind unter dem Begriff Expressionssy steme beispielsweise die Kombination aus Säugetierzellen wie CHO- Zellen und vektoren wie pcDNA3neo-Vektor oder HEK293-Zellen und CMV-Vektor, die für Säugetierzellen geeignet sind, zu verstehen.The combination of the host organism and that of the organism matching vectors such as plasmids, viruses or phages such as wise plasmids with the RNA polymerase / promoter system, the phages 1, Mu or other temperate phages or transposons and / or further advantageous regulatory sequences form an Ex pression system. Preferred under the term Expressionssy systems, for example, the combination of mammalian cells such as CHO Cells and vectors such as pcDNA3neo vector or HEK293 cells and Understand CMV vector suitable for mammalian cells.

Die In-situ Hybridisierung mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder Tei len davon ergab eine starke Expression in Hippokampus, Cortex, Cerebellum sowie in thalamischen Kernen (siehe Fig. 1 und Bei spiele). Fig. 1a und 1b geben die Expressionsanalyse der zu SEQ ID NO: 1 korrespondierenden mRNA wieder. 1a zeigt den Northern blot, 1b die in situ-Hybridisierung (siehe Beispiel 3 und 4). Das Expressionsmuster überlappt mit dem des GABAB-Rezeptors und deutet auf eine wichtige zentralnervöse Funktion des in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Proteins hin. Der Hippokampus ist die entscheidende Hirnstruktur für die Speicherung neuer Gedächt nisinhalte. Ein Protein mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 ist damit ein interessantes Target für das Verständnis in Bezug auf Lernen und Gedächtnis und für die Entwicklung neuer kognitiver Enhancer. Als Teil des limbischen Systems beeinflußt der Hippocampus auch Stimmungen und Gefühle. Gegen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 und ihre funktionellen Äquivalente, Homologe oder Derivate gerichtete Pharmaka stellen damit potentielle Antidepressiva oder Anxioly tika dar und können bei cognitiven Erkrankungen verwendet werden. Schließlich ist der Hippokampus stark in Temporallappenepilepsien involviert, was ein Protein mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 zu einem attraktiven Target für neue Medikamente gegen diese häufige Erkrankung macht. Im Cortex befinden sich Regionen, die sensori sche Informationen integrieren, verarbeiten und in geeignete Re aktionen umwandeln. Diese sensorischen und motorischen Zentren sind oft auch Ausgangspunkte für epileptische Anfälle. Eine ge zielte Beeinflussung der erfindungsgemäßen Proteine oder des er findungsgemäßen Proteinheteromer könnte die Krampfwahrscheinlich keit bei Epilepsipatienten senken. Die thalamischen Kerne sind dem Cortex vorgeschaltet, integrieren die über die Sinnesorgane aufgenommenen Wahrnehmungen und leiten sie an corticale Struktu ren weiter. Sie sind häufig der Ausgangspunkt für generalisierte Krampfanfälle. Die starke Expression der erfindungsgemäßen Pro teine oder des Proteinheteromers in den thalamischen Kernen deu tet darauf hin, daß seine Aktivierung oder seine Inhibition zur Linderung von Krampfanfällen in Epilepsipatienten beitragen kann. Die cerebellären Verknüpfungen sind maßgeblich für die Feinkoor dination der Bewegungen verantwortlich. Ataxien und andere moto rische Erkrankungen könnten auf einer Deregulation eines Proteins mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz beruhen. Die erfin dungsgemäßen Proteinheteromere oder Proteine stellen damit inter essante Targets für die Entwicklung neuer Substanzen dar, die zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten wie neurologische Erkrankungen wie Epilepsie, Schlaganfall, psychi sche Erkrankungen wie Angst, manisch-depressive Erkrankungen, Mi gräne, kognitive Verluste und weiteren neurologischen Erkrankun gen.The in situ hybridization with the sequence SEQ ID NO: 2 or parts thereof gave a strong expression in the hippocampus, cortex, cerebellum and in thalamic nuclei (see FIG. 1 and examples). Figs. 1a and 1b enter the expression analysis of the SEQ ID NO: 1 corresponding mRNA again. 1a shows the Northern blot, 1b the in situ hybridization (see Examples 3 and 4). The expression pattern overlaps that of the GABAB receptor and indicates an important central nervous function of the protein shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. The hippocampus is the crucial brain structure for storing new memory content. A protein with the sequence SEQ ID NO: 2 is therefore an interesting target for understanding with regard to learning and memory and for the development of new cognitive enhancers. As part of the limbic system, the hippocampus also affects moods and feelings. Pharmaceuticals directed against SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and their functional equivalents, homologs or derivatives thus represent potential antidepressants or anxiolytics and can be used in cognitive disorders. Finally, the hippocampus is heavily involved in temporal lobe epilepsy, which makes a protein with SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 an attractive target for new drugs against this common disease. Regions are located in the cortex that integrate, process and convert sensory information into suitable reactions. These sensory and motor centers are often the starting points for epileptic seizures. A targeted influencing of the proteins according to the invention or of the protein heteromer according to the invention could reduce the likelihood of convulsions in epilepsy patients. The thalamic nuclei precede the cortex, integrate the senses received through the sensory organs and pass them on to cortical structures. They are often the starting point for generalized seizures. The strong expression of the proteins according to the invention or of the protein heteromer in the thalamic nuclei suggests that its activation or inhibition can contribute to the relief of seizures in epilepsy patients. The cerebellar connections are largely responsible for the fine coordination of the movements. Ataxias and other motor disorders could be based on deregulation of a protein with the nucleic acid sequence according to the invention. The protein heteromers or proteins according to the invention thus represent interesting targets for the development of new substances which are used in the manufacture of medicaments for the treatment of diseases such as neurological disorders such as epilepsy, stroke, psychological disorders such as anxiety, manic-depressive disorders, migraine and cognitive disorders Losses and other neurological diseases.

Substanzen die eine Wirkung gegenüber GABA_B-Rezeptoren aufweisen sind beispielsweise als Agonist Baclofen und seine Derivate und als Antagonist Phaclofen, Saclofen und Derivate. Diese Substanzen sowie weitere wirksame Substanzen sind J. Med. Chem., 38, 1995: 3313-3331, J. Med. Chem., 38, 1995: 3297-3312 und WO97/46675 zu entnehmen. Diese Substanzen wirken mit hoher Wahrscheinlich keit auch gegenüber dem erfindungsgemäßen Proteinheteromer oder dem erfindungsgemäßen Protein. Vermutlich lassen sich mit Hilfe der erfindungsgemäßen Proteine ( = Proteinheteromer + isoliertes Protein) leichter agonistisch stärker wirkende Substanzen entwic keln. Mit Hilfe der neuen Proteine können selektivere Substanzen entwickelt werden.Substances which have an effect on GABA _B receptors are, for example, as agonist baclofen and its derivatives and as antagonist phaclofen, saclofen and derivatives. These substances and other active substances can be found in J. Med. Chem., 38, 1995: 3313-3331, J. Med. Chem., 38, 1995: 3297-3312 and WO97 / 46675. These substances are also highly likely to act against the protein heteromer or protein of the invention. Presumably, with the help of the proteins according to the invention (= protein heteromer + isolated protein) substances with a more agonistic effect can be developed. With the help of the new proteins, more selective substances can be developed.

Das Gen für den bereits bekannten GABA_B-Rezeptor befindet sich in der Nähe des chromosomalen Locus, der mit der juvenilen, myoclo nischen Epilepsie assoziiert ist. Diese Korrelation könnte außer dem ein neues Diagnoseverfahren für diese verbreitete Epilepsie form ermöglichen. Gleiches gilt für die erfindungsgemäßen Pro teine. Die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 kann dazu verwendet werden, Gene für mENAs, die für diese Nukleinsäu ren oder deren funktionellen Äquivalente, Homologe oder Derivate kodieren, im murinen und im menschlichen Genom mit gängigen Me thoden durch Homologiescreening zu isolieren und zu kartieren und mit Markern für humane Erbkrankheiten zu korrelieren. Dies ermög licht die Identifizierung des Gens als Ursache für bestimmte Erb krankheiten, was ihre Diagnose erheblich vereinfacht und neue Therapieansätze ermöglicht. Mit Hilfe der Nukleinsäuren als Mar ker lassen sich damit Erbkrankheiten diagnostizieren. The gene for the already known GABA _B receptor is located near the chromosomal locus, which is associated with juvenile, myoclonic epilepsy. This correlation could also enable a new diagnostic method for this common form of epilepsy. The same applies to the proteins according to the invention. The nucleotide sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 can be used to identify genes for mENAs which code for these nucleic acids or their functional equivalents, homologs or derivatives, in the murine and in the human genome using common methods by homology screening isolate and map and correlate with markers for human hereditary diseases. This enables the gene to be identified as the cause of certain inherited diseases, which simplifies their diagnosis considerably and enables new therapeutic approaches. With the help of nucleic acids as markers, hereditary diseases can be diagnosed.

Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der erfindungsge mäßen Nukleinsäuren oder Teilen davon zur Gentherapie. Auch zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder Teilen davon komplemen täre Sequenzen können zur Gentherapie verwendet werden.The invention also relates to the use of the fiction appropriate nucleic acids or parts thereof for gene therapy. Also to Complement the nucleic acid according to the invention or parts thereof tary sequences can be used for gene therapy.

Eine weitere Möglichkeit des Einsatzes der Nukleotidsequenz oder Teilen davon ist die Erzeugung transgener oder knock-out- oder konditioneller oder regionenspezifischer knock-out Tiere oder spezifischer Mutationen in gentechnisch veränderten Tieren (Aus ubel et al. [eds]. 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York und Torres et al., [eds.]m 1997, La boratory protocols for conditional gene targeting, Oxford Univer sity Press, Oxford). Über transgene überexpression oder geneti sche Mutation (Nullmutation oder spezifische Deletionen, Inser tionen oder Veränderungen) durch homologe Rekombination in em bryonalen Stammzellen kann man Tiermodelle erzeugen, die wert volle weitere Informationen über die (Patho-)Physiologie der er findungsgemäßen Sequenzen allein oder in Komplex mit dem GABA_B-Re zeptor liefern. Solchermaßen hergestellte Tiermodelle können es sentielle Testsysteme zur Evaluierung neuartiger Therapeutika darstellen, die die Signaltransduktion von GABA_B-Rezeptoren be einflussen.A further possibility of using the nucleotide sequence or parts thereof is the generation of transgenic or knock-out or conditional or region-specific knock-out animals or specific mutations in genetically modified animals (From ubel et al. [Eds]. 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York and Torres et al., [Eds.] M 1997, La boratory protocols for conditional gene targeting, Oxford University Press, Oxford). Via transgenic overexpression or genetic mutation (zero mutation or specific deletions, insertions or changes) by homologous recombination in embryonic stem cells, animal models can be generated which contain valuable further information about the (patho-) physiology of the sequences according to the invention, alone or in complex deliver with the GABA _B -receptor. Animal models produced in this way can represent significant test systems for evaluating novel therapeutic agents that influence the signal transduction of GABA _B receptors.

Die Interaktion des bekannten GABA_B-Rezeptors mit dem neuen erfin dungsgemäßen, beschriebenen 7-Transmembranregionen-Protein, das mit dem two-hybrid System entdeckt wurde, spielt eine wichtige physiologische Rolle. Dieser überraschende Befund ermöglicht neue außerordentliche Behandlungsmöglichkeiten im Hinblick auf die o. g. neurologischen und psychischen Erkrankungen, die mit dem GABA_B-Rezeptor im Zusammenhang stehen. Niedermolekulare Effekto ren oder Peptide, die diese Interaktion positiv oder negativ be einflussen, sind Wirkstoffe, die in die GABAerge Signaltransduk tion eingreifen und damit als neue Klasse von Pharmaka zum Ein satz kommen können. Die direkte molekulare Interaktion zwischen zwei unterschiedlichen metabotropen Rezeptoren war bislang nicht bekannt. Ebenso sind bislang keine Substanzen beschrieben, die die Interaktion zwischen zwei unterschiedlichen metabotropen Rezepto ren beeinflussen und dadurch die Signaltransduktion über diese Rezeptoren modulieren. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Pro teinheteromer ermöglicht damit die Entwicklung neuer Wirkstoffe bzw. Wirkstoffklassen.The interaction of the known GABA _B receptor with the new 7-transmembrane region protein described according to the invention, which was discovered with the two-hybrid system, plays an important physiological role. This surprising finding enables new and extraordinary treatment options with regard to the above-mentioned neurological and psychological disorders that are related to the GABA _B receptor. Low molecular weight effectors or peptides that influence this interaction positively or negatively are active substances that intervene in the GABAergic signal transduction and can therefore be used as a new class of pharmaceuticals. The direct molecular interaction between two different metabotropic receptors was previously unknown. Likewise, no substances have so far been described which influence the interaction between two different metabotropic receptors and thereby modulate signal transduction via these receptors. The use of the protein heteromer according to the invention thus enables the development of new active substances or classes of active substances.

Durch Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, des Nukleinsäurekonstrukts, eines erfindungsgemäßen Proteinheterome ren oder des Proteins können Proteine identifiziert werden, die zum Proteinheteromeren oder zum Protein spezifische Bindungsaffi nitäten aufweisen, oder zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für Proteine kodieren, die zum Proteinheteromeren oder zum Protein spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen. Vorteilhafter weise werden hierzu das two-hybrid System oder andere biochemi sche Verfahren allein oder in Kombination verwendet. Es lassen sich so Interaktionsdomänen von metabotropen Rezeptoren und damit pharmakotherapeutische Interventionspunkte bestimmen.By using the nucleic acid sequence according to the invention, the Nucleic acid construct, a protein heterome according to the invention or the protein, proteins can be identified which binding affinity specific to the protein heteromer or to the protein units or to identify nucleic acids, which code for proteins, for the protein heteromer or for Have protein-specific binding affinities. More advantageous The two-hybrid system or other biochemicals are becoming wise for this cal methods used alone or in combination. Leave it interaction domains of metabotropic receptors and thus Determine pharmacotherapeutic intervention points.

Daher ist ein Gegenstand der Erfindung die Verwendung des two-hy brid Systems oder biochemischer Verfahren zur Identifizierung der Interaktionsdomänen von metabotropen Rezeptoren und die Verwen dung zur pharmakotherapeutischen Intervention.Therefore, an object of the invention is the use of the two-hy brid systems or biochemical methods to identify the Interaction domains of metabotropic receptors and their use for pharmacotherapeutic intervention.

Über Strukturanalysen des Proteinheteromer oder des erfindungsge mäßen Proteins lassen sich gezielt Substanzen finden, die eine spezifische Bindungsaffinität aufweisen.About structural analyzes of the protein heteromer or of the invention According to the protein, substances can be found which have specific binding affinity.

Die beschriebenen Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 ermög lichen, mit Hilfe des two-hybrid Systems oder anderen Assays, die für die Interaktion verantwortlichen Aminosäuren einzugrenzen und Substanzen zu finden, mit denen die Interaktion zwischen den bei den metabotropen Rezeptoren beeinflusst werden kann. Die Verwen dung von Substanzen, die die physikalische Interaktion von zwei metabotropen Rezeptoren beeinflussen, für die Behandlung von Krankheiten, stellt unabhängig von dem speziellen hier für den GABA_B-Rezeptor beschriebenen Fall ein neues pharmakologisches Prinzip dar.The sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 described enable the amino acids responsible for the interaction to be narrowed down with the aid of the two-hybrid system or other assays and to find substances with which the interaction between those in the metabotropic receptors can be influenced. The use of substances that influence the physical interaction of two metabotropic receptors for the treatment of diseases is a new pharmacological principle, regardless of the specific case described here for the GABA _B receptor.

Dies ermöglicht ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen mit spezifischer Bindungsaffinität zum erfindungsgemäßen Proteinhete romer bzw. Protein, das folgende Schritte umfaßt.
This enables a method for finding substances with specific binding affinity for the protein heteromer or protein according to the invention, which comprises the following steps.

a) Incubation of the protein or proteins with the sub to be tested punch.
b) detection of the binding of the substance to be tested to the pro complexion.

Die Detektion der Bindung erfolgt durch Messen der Antagonisie rung oder Agonisierung der GABA_B-Rezeptor-Aktivität oder durch Messen einer physiologischen Wirkung, wie z. B. einer Änderung der Calcium-, cAMP-, IP3-Konzentration oder des Membranpotentials.Binding is detected by measuring the antagonization or agonization of the GABA _B receptor activity or by measuring a physiological effect, such as. B. a change in calcium, cAMP, IP3 concentration or membrane potential.

Weitere Ausgestaltungsformen der Erfingung sind ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Interaktion von Proteinen mit Aminosäuresequenzen, wie sie in SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 4 dargestellt werden, mit anderen metabotropen Rezeptoren hemmen oder verstärken; ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Interaktion von Liganden mit dem erfindungsgemäßen Proteinhe teromer oder dem erfindungsgemäßen Proteinen mit Aminosäurese quenzen wie SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 4 hemmen oder verstärken oder ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Interak tion von Proteinen mit Aminosäuresequenzen wie SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 4 mit G-Proteinen oder anderen Signaltransduktionsmo lekülen hemmen oder verstärken. Die Interaktion von Proteinen mit den erfindungsgemäßen Aminosäuren läßt sich mit Hilfe des Two-hy brid Systems detektieren. Weiter lassen sich die Verfahren durch Expression der Proteine in eukaryotischen Zellen und Verknüpfung mit einem Reporter-Assay für die Aktivierung des GABA_B-Rezeptors durchführen. Dabei wird beispielsweise die Änderung des cAMP- Spiegels oder des Membranpotentials detektiert.Further embodiments of the invention are a method for finding substances which inhibit or intensify the interaction of proteins with amino acid sequences, as shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, with other metabotropic receptors; a method for finding substances which inhibit or intensify the interaction of ligands with the protein heteromer according to the invention or the proteins according to the invention with amino acid sequences such as SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or a method for finding substances which Inhibit or enhance interaction of proteins with amino acid sequences such as SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 with G proteins or other signal transduction molecules. The interaction of proteins with the amino acids according to the invention can be detected using the two-hybrid system. The methods can also be carried out by expressing the proteins in eukaryotic cells and linking them to a reporter assay for the activation of the GABA _B receptor. For example, the change in the cAMP level or the membrane potential is detected.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Proteinen mit Aminosäuresequen zen wie SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 unter Benutzung von spezi fischen Agonisten oder Antagonisten. Dabei wird die GABAB-Rezep tor-Ligandenbindung zur Detektion ausgenutzt.The invention further relates to a method for qualitative and quantitative determination of proteins with amino acid sequences Zen like SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 using spec fish agonists or antagonists. The GABAB recipe Tor ligand binding used for detection.

Über Antikörper kann die Proteinaktivität der Proteine mit den Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 bestimmt werden. Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Quan tifizierung der Proteinaktivität eines Proteins mit den Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4.The protein activity of the proteins can be linked to the Sequences SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 can be determined. Therefore Another object of the invention is a method for quan tification of the protein activity of a protein with the sequences SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.

Die regulatorischen Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäu ren, insbesondere der Promotor, die Enhancer, locus control re gions und silencer oder jeweilige Teilsequenzen davon können für die gewebespezifische Expression von diesem und weiteren Genen verwendet werden. Damit ergibt sich die Möglichkeit, gehirnspezi fische Genexpression von Nukleinsäurekonstrukten durchzuführen.The regulatory sequences of the nucleic acid according to the invention ren, in particular the promoter, the enhancer, locus control re gions and silencers or respective partial sequences thereof can be used for the tissue-specific expression of this and other genes be used. This results in the possibility of brain-specific fish expression of nucleic acid constructs.

Um ein DNA-Fragment zu isolieren, das die Bereiche enthält, die die Transkription der Sequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 re gulieren, wird zunächst eine genomische Bank mit einer möglichst weit 5'-positionierten cDNA-Probe durchsucht. Dazu wird eine dem Fachmann geläufige Homologiesuche durchgeführt (Ausubel et al. [eds.], 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). Auf dem isolierten DNA-Fragment wird dann der Transkriptionsstart identifiziert. Der Bereich vor dem Transkrip tionsstart wird anschließend mit einem Reportergen wie β-Galacto sidase oder GFP ( = green fluorescent protein) verknüpft und in Zellen oder in transgenen Tieren wie Mäusen daraufhin getestet, ob er zu dem für SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 spezifischen Ex pressionsmuster führt (Ausubel et al. siehe oben). Das Reporter gen kann anschließend mit anderen cDNAs verknüpft werden, um Tiermodelle zu erstellen, in denen die jeweilige cDNA regionspe zifisch exprimiert wird (siehe beispielsweise Oberdick et al., Science, 248, 1990: 223-226).To isolate a DNA fragment that contains the areas that the transcription of the sequences SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 re gulate, first a genomic bank with one if possible searched far 5'-positioned cDNA sample. For this, one of the Expert homology search performed (Ausubel et al. [eds.], 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). The is then on the isolated DNA fragment Start of transcription identified. The area before the transcript The start is then with a reporter gene such as β-galacto sidase or GFP (= green fluorescent protein) linked and in Cells or in transgenic animals such as mice, whether he belongs to the Ex specific for SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 pressure pattern (Ausubel et al. see above). The reporter gene can then be linked to other cDNAs to To create animal models in which the respective cDNA regionspe is expressed expressively (see for example Oberdick et al., Science, 248, 1990: 223-226).

Ausgehend von den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 können synthetische Peptide generiert werden, die als Anti gene für die Produktion von Antikörpern eingesetzt werden. Es ist auch möglich, das Polypeptid oder Bruchstücke davon zur Generie rung von Antikörpern einzusetzen. Mit Antikörpern sind sowohl po lyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder rekombi nante Antikörper oder Fragmente davon, single chain Antikörper oder auch synthetische Antikörper gemeint. Unter erfindungsgemä ßen Antikörpern oder deren Fragmente sind prinzipiell alle Immu noglobulinklassen wie IgM, IgG, IgD, IgE, IgA oder ihre Subklas sen wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen zu verste hen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgG₁, IgG₂, IgG_2a, IgG_2b, IgG₃ oder IgG_M. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgG₁/κ oder IgG_2b/κ. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit einer oder zwei dem Antigen-komplementären Bindungsstellen, wie Antikörper teile mit einer den Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂-Fragmente oder Einzelstrangfragmente, genannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂. Diese Fragmente können beispielsweise auf enzymatischem Wege durch Abspaltung des Fc-Teils der Antikörper mit Enzymen wie Pa pain oder Pepsin, durch chemische Oxidation oder durch gentechni sche Manipulation der Antikörpergene erhalten werden. Auch genma nipulierte nichtverkürzte Fragmente können vorteilhaft verwendet werden.Starting from the amino acid sequences SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, synthetic peptides can be generated which are used as anti genes for the production of antibodies. It is also possible to use the polypeptide or fragments thereof for the generation of antibodies. Antibodies mean both polyclonal, monoclonal, human or humanized or recombinant antibodies or fragments thereof, single chain antibodies or synthetic antibodies. Antibodies according to the invention or their fragments are in principle to be understood as meaning all immunoglobulin classes such as IgM, IgG, IgD, IgE, IgA or their subclasses such as the subclasses of IgG or their mixtures. IgG and its subclasses such as IgG ₁ , IgG ₂ , IgG _2a , IgG _2b , IgG ₃ or IgG _M are preferred. The IgG subtypes IgG ₁ / κ or IgG _2b / κ are particularly preferred. Fragments include all shortened or modified antibody fragments with one or two binding sites complementary to the antigen, such as antibody parts with a binding site formed by light and heavy chains corresponding to the antibody, such as Fv, Fab or F (ab ') ₂ fragments or single-strand fragments , called. Shortened double-strand fragments such as Fv, Fab or F (ab ') ₂ are preferred. These fragments can be obtained, for example, enzymatically by splitting off the Fc part of the antibodies with enzymes such as pa pain or pepsin, by chemical oxidation or by genetic engineering manipulation of the antibody genes. Genetically manipulated, unabridged fragments can also be used advantageously.

Die Antikörper oder Fragmente können allein oder in Mischungen verwendet werden.The antibodies or fragments can be used alone or in mixtures be used.

Die Antikörpergene für die gentechnischen Manipulationen lassen sich in dem Fachmann bekannterweise beispielsweise aus den Hybri domzellen isolieren (Harlow, E. and Lane, D. 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.; Ausubel et al., [eds], 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). Dazu werden Antikörper-produzierende Zellen angezogen und die mRNA bei ausreichender optischer Dichte der Zellen über Zellyse mit Guanidiniumthiocyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion mit Phenol, Chloroform/Isoamylalkohol, Fällungen mit isopropanol und Waschen mit Ethanol aus den Zellen in bekannter Weise isoliert. Anschließend wird mit Hilfe der Re versen Transcriptase cDNA aus der mRNA synthetisiert. Die synthe tisierte cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipulation bei spielsweise durch "site directed mutagenesis", Einführung von In sertionen, Inversionen, Deletionen oder Basenaustausche in geei gnete tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Vektoren in seriert und in den entsprechenden Wirtsorganismen exprimiert wer den. Bevorzugt werden bakterielle oder Hefe Vektoren wie pBR322, pUC18/19, pACYC184, Lambda oder Hefe-mu-Vektoren zur Klonierung der Gene und die Expression in Bakterien wie E. coli bzw. in der Hefe wie Saccharomyces cerevisiae.Leave the antibody genes for genetic engineering manipulation is known in the art, for example from the hybri isolate dome cells (Harlow, E. and Lane, D. 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y .; Ausubel et al., [eds], 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). To do this, antibody-producing Cells attracted and the mRNA with sufficient optical density the cells via cell lysis with guanidinium thiocyanate, acidification with Sodium acetate, extraction with phenol, chloroform / isoamyl alcohol, Precipitate with isopropanol and wash with ethanol from the cells isolated in a known manner. Then with the help of Re Verse transcriptase cDNA synthesized from the mRNA. The synthe cDNA can be directly or after genetic manipulation for example through "site directed mutagenesis", introduction of In Sertions, inversions, deletions or base changes in egg gnete animal, fungal, bacterial or viral vectors in seres and expressed in the corresponding host organisms the. Bacterial or yeast vectors such as pBR322 are preferred. pUC18 / 19, pACYC184, lambda or yeast mu vectors for cloning of genes and expression in bacteria such as E. coli or in the Yeast such as Saccharomyces cerevisiae.

Spezifische Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Proteine kön nen sich sowohl als diagnostische Reagenzien als auch als Thera peutika bei neurologischen oder psychiatrischen Krankheitsbildern eignen.Specific antibodies against the proteins of the invention can are both diagnostic reagents and thera peutics in neurological or psychiatric clinical pictures own.

Weiterhin können die cDNA, die genomische DNA, die regulatori schen Elemente der findungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, als auch das Polypeptid, sowie Teilfragmente davon in rekombinanter oder nichtrekombinanter Form zur Ausarbeitung eines Testsystems verwendet werden. Dieses Testsystem ist geeignet, die Aktivität des Promotors oder des Proteins in Anwesenheit der Testsubstanz zu messen. Bevorzugt handelt es sich hierbei um einfache Meßme thoden (kolorimetrische, luminometrische, auf Fluoreszenz beru hende oder radioaktive), die die schnelle Messung einer Vielzahl von Testsubstanzen erlauben (Böhm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirk stoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg). Die beschriebenen Testsysteme erlauben das Durchsuchen von chemischen Bibliotheken nach Substanzen, die agonistische oder antagonistische Wirkungen auf SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 oder den neuen GABA_B-Rezeptor- Komplex, bestehend aus dem bereits beschriebenen GABA_B-Rezeptor und dem in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 beschriebenen Protein, haben. Die Identifizierung solcher Substanzen stellt den ersten Schritt auf dem Weg zur Identifizierung neuartiger Medikamente dar, die spezifisch auf die GABAerge Signaltransduktion wirken.Furthermore, the cDNA, the genomic DNA, the regulatory elements of the nucleic acid sequences according to the invention, and also the polypeptide, as well as partial fragments thereof, can be used in recombinant or non-recombinant form to develop a test system. This test system is suitable for measuring the activity of the promoter or the protein in the presence of the test substance. These are preferably simple measuring methods (colorimetric, luminometric, based on fluorescence or radioactive) which allow the rapid measurement of a large number of test substances (Böhm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg). The test systems described allow chemical libraries to be searched for substances which have agonistic or antagonistic effects on SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or the new GABA _B receptor complex, consisting of the GABA _B receptor already described and the protein described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. The identification of such substances is the first step on the way to identifying new types of drugs that have a specific effect on GABAergic signal transduction.

Ein alternativer Weg zur Entwicklung von Wirkstoffen, die am neuen GABA_B-Rezeptor angreifen, besteht im rationalen Drug Design (Böhm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg). Hier wird die Struktur oder eine Teilstruktur von dem in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Protein, so weit sie vorliegt, oder ein von Computern erstelltes Modell der Struktur, benutzt, um mit Unterstützung von Molecular Modelling Programmen Strukturen zu finden, für die sich eine hohe Affinität an den GABA_B-Rezeptor vorhersagen läßt. Diese Substanzen werden dann synthetisiert und getestet. Hochaffine, selektive Substanzen werden auf ihre Verwendung als Medikamente gegen Epilepsie, Schlaganfall und andere neurologische Erkrankungen getestet. An alternative way of developing active substances that attack the new GABA _B receptor is by rational drug design (Böhm, Klebe, Kubinyi, 1996, active substance design, Spektrum publishing house, Heidelberg). Here, the structure or a partial structure of the protein represented in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, as far as it is available, or a computer-generated model of the structure, is used in order to find structures with the support of molecular modeling programs , for which a high affinity for the GABA _B receptor can be predicted. These substances are then synthesized and tested. Highly affine, selective substances are being tested for their use as medicines for epilepsy, stroke and other neurological diseases.

Die Bestimmung von Menge, Aktivität und Verteilung des neuen GABA_B-Rezeptor-Komplexes oder von dem in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Protein oder seiner zugrundeliegenden mRNA im menschlichen Körper kann zur Diagnose, Erfassung der Prädisposi tion und zum Monitoring bei bestimmten Erkrankungen dienen. Des gleichen kann die Sequenz der cDNA der Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 sowie der genomischen DNA zu Aussagen über ge netische Ursachen und Prädispositionen bestimmter Erkrankungen herangezogen werden. Dazu können sowohl DNA/RNA-Proben als auch Antikörper verschiedenster Art benutzt werden. Dabei dient die beschriebene Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder Teile davon in Form geeigneter Proben zur Aufdeckung von Punkt mutationen oder Deletionen/Insertionen/Rearrangements.The determination of the amount, activity and distribution of the new GABA _B receptor complex or of the protein shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or its underlying mRNA in the human body can be used for diagnosis, detection of the predisposition and for Monitoring for certain diseases. In the same way, the sequence of the cDNA of the sequences SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and the genomic DNA can be used to make statements about genetic causes and predispositions of certain diseases. Both DNA / RNA samples and various types of antibodies can be used. The nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 or parts thereof described in the form of suitable samples serves to detect point mutations or deletions / insertions / rearrangements.

Die vorliegende Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3, ihre funktionellen Äquivalente, Homologe oder Derivate, das von ihr kodierte Protein (SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4) oder das erfindungsgemäße Proteinheteromer sowie davon abgelei tete Reagenzien (Oligonukleotide, Antikörper, Peptide) können zur Diagnose und Therapie von neurologischen Erkrankungen eingesetzt werden. Außerdem wird die Diagnose und Behandlung von genetischen Prädispositionen für bestimmte neurologische Erkrankungen wie Epilepsie, Schlaganfall, psychische Erkrankungen wie Angst, ma nisch-depressive Erkrankungen, Migräne, kognitive Verluste und weitere neurologische Erkrankungen möglich. Weiterhin kann ein Monitoring der Behandlung oben angegebener Erkrankungen durchge führt werden.The present nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, their functional equivalents, homologs or derivatives, the protein it encodes (SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4) or the protein heteromer according to the invention and derived therefrom Tested reagents (oligonucleotides, antibodies, peptides) can be used Diagnosis and therapy of neurological diseases used become. It also diagnoses and treats genetic Predispositions to certain neurological diseases such as Epilepsy, stroke, mental illness such as fear, ma African depressive disorders, migraines, cognitive losses and further neurological diseases possible. Furthermore, a Monitoring the treatment of the diseases listed above leads.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum qua litativen und quantitativen Nachweis einer erfindungsgemäßen Nu kleinsäure in einer biologischen Probe, das folgende Schritte um faßt:
Another object of the invention is a method for the qualitative and quantitative detection of a nucleic acid according to the invention in a biological sample, which comprises the following steps:

a) Incubation of a biological sample with a known amount of nucleic acid according to the invention or a known amount on oligonucleotides that act as primers for amplification the nucleic acid according to the invention are suitable,
b) Detection of the nucleic acid according to the invention by specific Hybridization or PCR amplification,
c) comparison of the amount of hybridizing nucleic acid or nucleic acid obtained by PCR amplification with a Quantity standard.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis eines erfindungsgemäßen Proteinhetero mers oder eines erfindungsgemäßen Proteins in einer biologischen Probe, das folgende Schritte umfaßt:
The invention also relates to a method for the qualitative and quantitative detection of a protein hetero mer according to the invention or a protein according to the invention in a biological sample, which comprises the following steps:

a) incubation of a biological sample with an antibody that specifically against the protein heteromer or against the invent protein is directed according to the invention,
b) detection of the antibody / antigen complex,
c) Comparison of the amounts of the antibody / antigen complex with egg a quantity standard.

Als Standard wird üblicherweise eine biologische Probe aus einem gesunden Organismus entnommen.A standard is usually a biological sample from a taken from a healthy organism.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch an ein Protein mit einer Aminosäurese quenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 binden, das einen oder meh rere der folgenden Schritte umfaßt:
The invention further relates to a method for finding substances which specifically bind to a protein with an amino acid sequence SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, which comprises one or more of the following steps:

a) Expression of the protein in eukaryotic or prokaryotic cells.
b) Incubation of the protein with the substances to be tested.
c) detection of the binding of a substance to the receptor or egg effect on the receptor function.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch an ein Protein mit einer Aminosäurese quenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 bzw. an eine Nuklein säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 binden und da durch hemmende oder aktivierende funktionelle Effekte auf die GA BAerge Signalweiterleitung in zentralnervösen Neuronen hervorru fen.The invention also relates to a method for finding Substances that are specific to a protein with an amino acid synthesis sequence according to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or to a nucleus bind acid sequence according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 and there through inhibitory or activating functional effects on the GA BAge signal transmission in central nervous neurons fen.

Je nach dem Neurotransmittersystem (z. B. GABA oder Glutamat), in das der GABA_B-Rezeptor involviert ist, kann eine erhöhte oder eine erniedrigte GABA_B-Rezeptor-Aktivität zu einem Ungleichgewicht zwi schen den Neurotransmittersystemen und oftmals zu einer neurona len Übererregung führen, die eine Vielzahl neurologischer Erkran kungen charakterisiert, wie z. B. Epilepsie, Schlaganfall und de ren Folgen und andere. Depending on the neurotransmitter system (e.g. GABA or glutamate) in which the GABA _B receptor is involved, an increased or decreased GABA _B receptor activity can lead to an imbalance between the neurotransmitter systems and often to neuronal overexcitation lead, which characterizes a variety of neurological diseases, such. B. epilepsy, stroke and de ren consequences and others.

Mangelnde neuronale Aktivität, die z. B. Demenzen charakterisiert, kann die Folge sein, wenn präsynaptische GABA_B Rezeptoren an glu tamatergen Synapsen überaktiviert sind und die Transmitteraus schüttung so stark hemmen, daß keine Reizweiterleitung über die Synapse mehr möglich ist.Lack of neuronal activity, e.g. B. Characterized dementia, can be the result if presynaptic GABA _B receptors on glu tamatergenic synapses are overactivated and the transmitter release inhibit so strongly that it is no longer possible to transmit stimuli via the synapse.

In Situationen, in denen ein Mangel an der Aktivität des erfin dungsgemäßen Proteins oder des mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 komplettierten GABA_B-Rezeptors herrscht, können mehrere Methoden zur Substituierung eingesetzt werden. Zum einen kann das Protein, natürlich oder rekombinant direkt, oder durch geeignete Maßnahmen in Form seiner kodierenden Nukleinsäure (d. h. DNA oder RNA) ap pliziert werden. Dazu können sowohl virale, als auch nichtvirale Vehikel zum Einsatz kommen. Ein weiterer Weg bietet sich durch die Stimulation des endogenen, körpereigenen Genes durch geei gnete Substanzen. Solche Substanzen lassen sich beispielsweise auffinden, indem man ihre Wirkung auf die Transkriptionselemente des neuen GABA_B-Rezeptor-Genes ermittelt.In situations in which there is a lack of activity of the protein according to the invention or of the GABA _B receptor completed with SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, several methods of substitution can be used. On the one hand, the protein can be applied, naturally or recombinantly directly, or by suitable measures in the form of its coding nucleic acid (ie DNA or RNA). Both viral and non-viral vehicles can be used for this. Another way is through the stimulation of the endogenous, endogenous gene by suitable substances. Such substances can be found, for example, by determining their effect on the transcription elements of the new GABA _B receptor gene.

In Situationen, in denen ein Überschuß an Aktivität des ein Pro tein mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 beinhaltenden GABA_B-Rezeptors oder von einem Protein mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 allein herrscht, können spezifische, synthetische oder natürliche, kompetitive und nicht-kompetitive Antagonisten gegen das Protein mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 oder Antikörper oder Antikörperfragmente gegen das Protein mit der Se quenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 oder gegen das Proteinhete romer eingesetzt werden. Desweiteren kann sowohl durch antisense Moleküle oder Ribozyme oder Oligonukleotide als auch durch nie dermolekulare Verbindungen eine Inhibition der GABA_B-Rezeptor-Ak tivität bzw. der Aktivität des Proteins mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 erreicht werden.In situations in which there is an excess of activity of the GABA _B receptor containing a protein with the sequence SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or of a protein with SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 alone , specific, synthetic or natural, competitive and non-competitive antagonists against the protein with the sequence SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or antibodies or antibody fragments against the protein with the sequence SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or against the protein heteromer. Furthermore, an inhibition of the GABA _B receptor activity or the activity of the protein with the sequence SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 can be achieved both by antisense molecules or ribozymes or oligonucleotides and by never dermolecular compounds.

Examples

Die Nukleotidsequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Struk tur wurde aus einer cDNA Bibliothek aus Ratten-Gehirn identifi ziert. Bei der Suche nach Proteinen, die mit dem intrazellulären Carboxyterminus des bekannten GABA_B-Rezeptors interagieren, wurde die Nukleotidsequenz gefunden. Im Experiment wurde eine cDNA-Bi bliothek aus Ratten-Gehirn mit dem two-hybrid System nach Inter aktionspartnern des Carboxyterminus des oben beschriebenen GABA_B-Rezeptors durchsucht. Mehrere überlappende Fragmente einer unbekannten cDNA wurden gefunden. Mit Hilfe dieser Fragmente wurde aus einer cDNA-Bibliothek aus Ratten-Hippokampus ein 5kb langes Fragment der unbekannten cDNA durch Homologiescreening isoliert und anschließend sequenziert. Die so gewonnene cDNA-Se quenz enthält den kompletten kodierenden Bereich für die Sequenz SEQ ID NO: 2. Die Entdeckung und molekulare Charakterisierung von Interaktionspartnern des bekannten klonierten GABA_B-Rezeptors er möglicht es, die physiologischen Eigenschaften und die biochemi sche und pharmakologische Vielfalt des GABA_B-Rezeptors besser zu verstehen, sowie neue konkrete Angriffspunkte für pharmakothera peutische Interventionen zu erhalten.The nucleotide sequence with the structure shown in SEQ ID NO: 1 was identified from a rat brain cDNA library. When looking for proteins that interact with the intracellular carboxy terminus of the known GABA _B receptor, the nucleotide sequence was found. In the experiment, a rat brain cDNA library was searched with the two-hybrid system for interaction partners of the carboxy terminus of the GABA _B receptor described above. Several overlapping fragments of an unknown cDNA were found. Using these fragments, a 5 kb fragment of the unknown cDNA was isolated from a cDNA library from the rat hippocampus by homology screening and then sequenced. The cDNA sequence obtained in this way contains the complete coding region for the sequence SEQ ID NO: 2. The discovery and molecular characterization of interaction partners of the known cloned GABA _B receptor enables the physiological properties and the biochemical and pharmacological diversity of the To better understand the GABA _B receptor and to obtain new concrete targets for pharmacotherapeutic interventions.

Die Sequenzanalyse des durch die vorliegende cDNA ( = SEQ ID NO: 1) kodierten Polypeptides läßt darauf schließen, daß es sich um einen metabotropen Rezeptor handelt. Es enthält eine aminoter minale Signalsequenz [Aminosäuren 1-40 (G. von Heijne, N. A. R., 14, 4683, 1986)] sowie sieben charakteristisch angeordnete hydro phobe Bereiche, die mit hoher Wahrscheinlichkeit die Plasmamem bran durchspannen. Das Vorhandensein dieser sieben hydrophoben Bereiche ist ein Charakteristikum von metabotropen Rezeptoren. Sequenzvergleiche (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 mit den Sequenzen der offenen Leseraster der translatierten öffentlichen Nukleotidda tenbanken (nrdb) mit Hilfe des BLAST-Programmes (Version BLASTP 2.0a19-WashU [05-Feb-1998]) zeigten Ähnlichkeiten zu dem oben beschriebenen GABA_B-Rezeptor (höchste Bewertung (best score): 36% Sequenzidentität über 804 Aminosäuren mit GABA_B-Rezeptor 1B und 36% Sequenzidentität über 744 Aminosäuren mit GABA_B-Rezeptor 1A) sowie eine wesentlich geringere Sequenzähnlichkeit zu metabotro pen Glutamatrezeptoren und Calciumsensitiven Rezeptoren. Die Ähnlichkeit erstreckt sich über den aminoterminalen Bereich sowie besonders über die Transmembranregionen, aber nicht über den car boxyterminalen, intrazellulären Bereich (siehe Fig. 2). Bei dem in SEQ ID NO: 2 beschriebenen Protein handelt es sich demnach um einen neuen metabotropen Rezeptor, der entweder allein oder in Komplex mit dem bekannten GABA_B-Rezeptor Signalweiterleitung im ZNS vermittelt oder diese reguliert.The sequence analysis of the polypeptide encoded by the present cDNA (= SEQ ID NO: 1) suggests that it is a metabotropic receptor. It contains an amino-minimal signal sequence [amino acids 1-40 (G. von Heijne, NAR, 14, 4683, 1986)] as well as seven characteristically arranged hydrophobic areas which are highly likely to span the plasma membrane. The presence of these seven hydrophobic areas is a characteristic of metabotropic receptors. Sequence comparisons (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) of the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 with the sequences of the open reading frames of the translated public nucleotide databases (nrdb) using the BLAST program ( Version BLASTP 2.0a19-WashU [05-Feb-1998]) showed similarities to the GABA _B receptor described above (highest score: best score): 36% sequence identity over 804 amino acids with GABA _B receptor 1B and 36% sequence identity over 744 Amino acids with GABA _B receptor 1A) and a significantly lower sequence similarity to metabotropic glutamate receptors and calcium-sensitive receptors. The similarity extends over the amino-terminal area and especially over the transmembrane regions, but not over the car boxy-terminal, intracellular area (see FIG. 2). The protein described in SEQ ID NO: 2 is therefore a new metabotropic receptor that either alone or in complex with the known GABA _B receptor mediates or regulates signal transmission in the CNS.

Fig. 2 gibt einen Sequenzvergleich des erfindungsgemäßen Pro teins mit der SEQ ID NO: 2 mit den bekannten GABAB-Rezeptor-Pro teinen ( = GBR) 1A und 1B (Kaupmann et al. 1997, siehe oben) wie der. Identische Aminosäuren sind durch schwarze, konservative Veränderungen durch hellgraue Schattierungen dargestellt. Die sieben Transmembranregionen ( = TM1 bis TM7) sind durch darüber liegende Balken markiert. Fig. 2 gives a sequence comparison of the protein according to the invention with SEQ ID NO: 2 with the known GABAB receptor proteins (= GBR) 1A and 1B (Kaupmann et al. 1997, see above) as the. Identical amino acids are represented by black, conservative changes by light gray shades. The seven transmembrane regions (= TM1 to TM7) are marked by bars above them.

Die Analyse der Verteilung der mRNA, von der die cDNA-Sequenz SEQ ID NO: 1 stammte, wurde mittels Northern Blot und mittels In-situ Hybridisierung auf Rattenhirnschnitten durchgeführt. Eine Analyse in 10 verschiedenen Ratten-Geweben ergab eine gehirnspezifische Expression einer 5-6 kb großen mRNA. In sehr geringem Umfang läßt sich eine kleinere mRNA in Ratten-Testis nachweisen (siehe Fig. 1). Die In-situ Hybridisierung ergab eine starke Expression in Hippokampus, Cortex, Cerebellum sowie in thalamischen Kernen. Das Expressionsmuster überlappt mit dem des GABA_B-Rezeptors und deutet auf eine wichtige zentralnervöse Funktion des in SEQ ID NO: 2 dagestellten Proteins hin.The analysis of the distribution of the mRNA from which the cDNA sequence SEQ ID NO: 1 was derived was carried out by Northern blot and by in-situ hybridization on rat brain sections. Analysis in 10 different rat tissues revealed brain-specific expression of a 5-6 kb mRNA. A smaller mRNA can be detected in rat testis to a very small extent (see FIG. 1). In situ hybridization resulted in strong expression in the hippocampus, cortex, cerebellum and thalamic nuclei. The expression pattern overlaps that of the GABA _B receptor and indicates an important central nervous function of the protein shown in SEQ ID NO: 2.

Soweit nicht anders angegeben wurde bei der experimentellen Durchführung entsprechend den Vorschriften in "Ausubel et al. (eds.), 1998. Current Protocols in Molecular Biology. John Wi ley& Sons, New York" verfahren.Unless otherwise stated, the experimental Implementation according to the regulations in "Ausubel et al. (eds.), 1998. Current Protocols in Molecular Biology. John Wi ley & Sons, New York "process.

example 1 Two-hybrid search with the carboxy terminus of GABA _B receptor 1

Die für den Carboxyterminus des GABA_B-Rezeptor 1A kodierende cDNA (Aminosäuren 857-960, accession no. Y10369, EMBL-Datenbank) wurde mit den spezifischen Primern GABA-CT5' (5'-GCGAATTCCGCAGGCTGAT CACCCGAGGG-3') und GABA-CT3' (5'-GCAGTCGACTCACTTGTAAAGCAAATG TACTCG-3') von Rattenhirn cDNA in einer Polymerase-Ketten-Reak tion (PCR) amplifiziert, mit den Enzymen EcoRI und SalI einer Re striktion unterzogen und danach über die überhängenden Enden in einen mit den Enzymen EcoRI und SalI vorgeschnittenenen Vektor pGBT (Firma Clontech) kloniert. Das so entstandene DNA-Kon strukt(pGBT-GABA_B-Rezeptor 1) kodiert für ein Protein, in dem die Gal4-DNA-Bindungsdomäne mit dem C-terminus des GABA_B-Rezeptors fu sioniert ist. Mit diesem Konstrukt wurde der Hefestamm HF7c (Fir ma Clontech) transformiert. Der resultierende Hefestamm wurde mit einer Rattenhirn cDNA Bank (Kornau et al., Science 269, 1737-1740, 1995) im Vektor pGAD (Firma Clontech) transformiert und 4 × 10⁶ Transformanden auf Tryptophan/Leucin/Histidin-Mangelme dium plattiert. Nach 3, 4 und 5 Tagen Wachstum bei 30°C wurden Ko lonien mit einem Durchmesser von mehr als 2 mm vereinzelt und ei ner XGal-Färbung unterzogen. Insgesamt 7 Kolonien erwiesen sich als His3 und lacZ positiv (pGAD-pos1-7). Aus diesen wurde die je weilige cDNA aus dem Vektor pGAD mit dem vektorspezifischen Pri mer Gal4AD3' (5'-AAGAGATCCTAGAACTAGTGGATC-3') sowie T7 (5'-CGTAATACGACTCACTATAGGGCG-3') amplifiziert und das Amplikon sequenziert. Die Sequenzanalyse ergab 5 verschiedene überlappende Fragmente (Nukleotidsequenzen 2399-3102 (a) 2432-3102 (b), 2447-3102 (c), 2462-3102 (d), 2468-3102 (e) in der Sequenz SEQ ID NO: 1).The cDNA coding for the carboxy terminus of the GABA _B receptor 1A (amino acids 857-960, accession no. Y10369, EMBL database) was primed with the specific primers GABA-CT5 '(5'-GCGAATTCCGCAGGCTGAT CACCCGAGGG-3') and GABA-CT3 '(5'-GCAGTCGACTCACTTGTAAAGCAAATG TACTCG-3') amplified from rat brain cDNA in a polymerase chain reaction (PCR), subjected to a restriction with the enzymes EcoRI and SalI and then via the overhanging ends in one with the enzymes EcoRI and SalI pre-cut vector pGBT (Clontech company) cloned. The resulting DNA construct (pGBT-GABA _B receptor 1) codes for a protein in which the Gal4-DNA binding domain is fused with the C-terminus of the GABA _B receptor. The yeast strain HF7c (Company ma Clontech) was transformed with this construct. The resulting yeast strain was transformed with a rat brain cDNA bank (Kornau et al., Science 269, 1737-1740, 1995) in the vector pGAD (from Clontech) and 4 × 10 ⁶ transformants were plated on tryptophan / leucine / histidine deficiency medium. After 3, 4 and 5 days of growth at 30 ° C., colonies with a diameter of more than 2 mm were separated and subjected to XGal staining. A total of 7 colonies were positive for His3 and lacZ (pGAD-pos1-7). From these, the respective cDNA from the vector pGAD was amplified with the vector-specific primer Gal4AD3 '(5'-AAGAGATCCTAGAACTAGTGGATC-3') and T7 (5'-CGTAATACGACTCACTATAGGGCG-3 ') and the amplicon was sequenced. Sequence analysis revealed 5 different overlapping fragments (nucleotide sequences 2399-3102 (a) 2432-3102 (b), 2447-3102 (c), 2462-3102 (d), 2468-3102 (e) in the sequence SEQ ID NO: 1 ).

Aus zwei verschiedenen positiven Kolonien (a und e) wurde die pGAD-Plasmid-DNA aufgereinigt und mit verschiedenen pGBT-Kon strukten in den Hefestamm HF7c kotransformiert. Nur in Kombina tion mit dem Konstrukt pBGT-GABA_B-Rezeptor 1 konnte eine Aktivie rung der Reportergene His3 und lacZ festgestellt werden.The pGAD plasmid DNA was purified from two different positive colonies (a and e) and cotransformed into the yeast strain HF7c with different pGBT constructs. An activation of the reporter genes His3 and lacZ was only found in combination with the construct pBGT-GABA _B receptor 1.

Example 2 Cloning of the cDNA for the new GABA _B receptor component SEQ ID NO: 2

Ein aus der two-hybrid Suche gewonnenes cDNA-Fragment gemäß Bei spiel 1 (a, Nukleotide 2399-3102 in Sequenz SEQ ID NO: 1) wurde mit dem random primed labelling kit (Boehringer Mannheim) ent sprechend den Herstellerangaben mit α-³²P-dCTP radioaktiv mar kiert. Die durch Erhitzen denaturierte radioaktive Sonde wurde auf 18 Nitrocellulose-Filter, auf die je 40000 Plaques einer cDNA-Bank aus Ratten-Hippokampus im Bakteriophagen λ transferiert worden waren, 16 Stunden lang hybridisiert (42°C, 5 × SSC, 50% For mamid) und daraufhin mehrfach mit 0,2 × SSC, 60°C gewaschen. Von 30 positiven λ-Klonen wurden 6 vereinzelt, Phagen-DNA isoliert und kartiert. Die beiden längsten cDNA-Fragmente (5kb) wurden voll ständig sequenziert. Sie enthalten ein offenes Leseraster für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2. Die Sequenzanalyse ergab bei diesen beiden Lambda-cDNA-Klonen vier Unterschiede in der kodie renden Sequenz, von denen 3 stille Mutationen darstellen (Nukleo tid 696 C zu T, Nukleotid 1104 T zu C, Nukleotid 2295 C zu T) und eine für ein zusätzliches Prolin in der aminoterminalen Signalse quenz kodiert (Insertion von CCG bei Nukleotid 171/172).A cDNA fragment obtained from the two-hybrid search in accordance with example 1 (a, nucleotides 2399-3102 in sequence SEQ ID NO: 1) was identified using the random primed labeling kit (Boehringer Mannheim) in accordance with the manufacturer's instructions with α- ³² P. -dCTP radioactively marked. The radioactive probe, denatured by heating, was hybridized for 16 hours on 18 nitrocellulose filters to which 40,000 plaques of a cDNA library from rat hippocampus in the bacteriophage λ had been transferred (42 ° C., 5 × SSC, 50% formamide ) and then washed several times with 0.2 × SSC, 60 ° C. 6 of 30 positive λ clones were isolated, phage DNA isolated and mapped. The two longest cDNA fragments (5kb) were completely sequenced. They contain an open reading frame for the amino acid sequence SEQ ID NO: 2. The sequence analysis revealed four differences in the coding sequence for these two lambda cDNA clones, of which 3 represent silent mutations (nucleotide 696 C to T, nucleotide 1104 T to C, nucleotide 2295 C to T) and one for an additional proline in the amino terminal signal sequence (insertion of CCG at nucleotide 171/172).

Example 3 Expression of the mRNA for the new GABA _B receptor component in rat ten tissues

Ein aus der two-hybrid Suche gewonnenes cDNA-Fragment gemäß Bei spiel 1 (a, Nukleotide 2399-3102 in SEQ ID NO: 1) wurde mit dem random primed labelling kit (Boehringer Mannheim) entsprechend den Herstellerangaben mit α-³²P-dCTP radioaktiv markiert. Die durch Erhitzen denaturierte radioaktive Sonde wurde mit einem Multiple Tissue Northern Blot (je 10 µg total RNA von Ratten-Ge hirn, -Leber, -Lunge, -Herz, -Niere, -Hoden, -Muskel und -Darm, isoliert nach "Chomczinski and Sacchi, Anal. Biochem., 162, 156-159, 1987") in QuickHyb-Lösung (Firma Stratagene) für eine Stunde bei 68°C hybridisiert und daraufhin bei 60°C und 0,1 × SSC gewaschen. Nach drei Tagen Exposition wurde ein starkes Hybridi sierungssignal auf Gehirn-RNA bei etwa 5-6 kb, ein wesentlich schwächeres Signal geringerer Größe auf Hoden-RNA und kein Signal in allen anderen untersuchten Geweben festgestellt (siehe Fig. 1a).A cDNA fragment obtained from the two-hybrid search according to Example 1 (a, nucleotides 2399-3102 in SEQ ID NO: 1) was analyzed using the random primed labeling kit (Boehringer Mannheim) in accordance with the manufacturer's instructions using α- ³² P-dCTP radioactively marked. The radioactive probe, denatured by heating, was isolated with a multiple tissue Northern blot (10 µg total RNA from rat brain, liver, lung, heart, kidney, testicle, muscle and intestine, according to "Chomczinski and Sacchi, Anal. Biochem., 162, 156-159, 1987 ") in QuickHyb solution (Stratagene) hybridized for one hour at 68 ° C and then washed at 60 ° C and 0.1 × SSC. After three days of exposure, a strong hybridization signal on brain RNA was found at about 5-6 kb, a much weaker signal of smaller size on testicular RNA and no signal in all other tissues examined (see FIG. 1a).

Example 4 Expression of the mRNA for the new GABA _B receptor component in the rat ten brain

Wenn nicht anders beschrieben, wurde die in-situ Hybridisierung durchgeführt wie in "Molecular Neurobiology: A Practical Appro ach. J. Chad and H. Wheat, eds. (Oxford: IRL Press), pp.205-225" beschrieben.Unless otherwise described, in situ hybridization was used carried out as in "Molecular Neurobiology: A Practical Appro Oh. J. Chad and H. Wheat, eds. (Oxford: IRL Press), pp.205-225 " described.

Zwei Antisense-Oligonukleotide (revers komplementär zu den Nu kleotiden 2463-2498 bzw. Nukleotiden 2538-2573 in der Sequenz SEQ ID NO: 1) wurden mit Terminaler Desoxynukleotid-Transferase (Boehringer Mannheim) entsprechend den Herstellerangaben mit α-³⁵S-dATP radioaktiv markiert. Diese radioaktiven Sonden wurden auf etwa 15 µm dicke horizontale Rattenhirnschnitte appliziert und 16 Stunden lang in 4 × SSC, 50% Formamid bei 42°C hybridisiert. Daraufhin wurden die Schnitte für 30 Minuten in 1 × SSC, 55°C gewa schen und für 8 Tage exponiert. Die Autoradiogramme für beide Oligonukleotide zeigten ein übereinstimmendes Bild (siehe Fig. 1b). Das stärkste Signal wurde in Purkinje-Zellen des Klein hirns, ebenfalls starke Signale in Kortex, Hippokampus und in verschiedenen thalamischen Kernen sowie schwächere Signale in den Körnerzellen des Kleinhirns gefunden.Two antisense oligonucleotides (reverse complementary to nucleotides 2463-2498 or nucleotides 2538-2573 in the sequence SEQ ID NO: 1) were radioactive with terminal deoxynucleotide transferase (Boehringer Mannheim) according to the manufacturer's instructions with α- ³⁵ S-dATP marked. These radioactive probes were applied to horizontal rat brain sections about 15 μm thick and hybridized in 4 × SSC, 50% formamide at 42 ° C. for 16 hours. The sections were then washed in 1 × SSC, 55 ° C. for 30 minutes and exposed for 8 days. The autoradiograms for both oligonucleotides showed an identical picture (see FIG. 1b). The strongest signal was found in Purkinje cells of the cerebellum, also strong signals in the cortex, hippocampus and in various thalamic nuclei as well as weaker signals in the cerebellar granule cells.

Example 5 Cloning and sequencing of the cDNA for the human form of the new GABA _B receptor component SEQ ID NO: 3 (DNA sequence) and SEQ ID NO: 4 (amino acid sequence)

Ausgehend von 5 µg totaler RNA aus dem Gesamthirn eines 57 Jahre alten Mannes (Firma Clontech) wurde mit Superscript Reverser Transkriptase (Gibco BRL) entsprechend den Hinweisen des Herstel lers cDNA synthetisiert. Mit mehreren Oligonukleotidprimern, die von SEQ ID NO: 1 bzw. von in der EMBL-Datenbank befindlichen hu manen EST-Sequenzen abgeleitet wurden, konnten in RCR-Reaktionen von der humanen cDNA spezifische Produkte amplifiziert werden. Hierbei handelte es sich um folgende Primer-Paare:
Starting from 5 µg of total RNA from the whole brain of a 57-year-old man (Clontech company), Superscript Reverser Transcriptase (Gibco BRL) was used to synthesize cDNA according to the manufacturer's instructions. With several oligonucleotide primers derived from SEQ ID NO: 1 or from human EST sequences found in the EMBL database, specific products of the human cDNA could be amplified in RCR reactions. The following primer pairs were used:

GB1s/GB6as
GB15s(hs)/GB18as
GB17s/GB11as
GB17s/GB16as(hs)
GB25s/GB4as
GB25s/GB23as(hs)
GB25sXbaI/GB23as(hs)
GB22s(hs)/GB16as(hs)
GB1s / GB6as
GB15s (hs) / GB18as
GB17s / GB11as
GB17s / GB16as (hs)
GB25s / GB4as
GB25s / GB23as (hs)
GB25sXbaI / GB23as (hs)
GB22s (hs) / GB16as (hs)

GB1s: 5'-CAGATCCGCAACGAGTCACTCCTG-3'
GB2as: 5'-CAGGAGTGACTCGTTGCGGATCTG-3'
GB3s: 5'-CAGTTTGACCAGAATATGGCAGC-3'
GB4as: 5'-GCTGCCATATTCTGGTCAAACTG-3'
GB6as: 5'-GACCTTCACCTCTCTGCTGTCTTG-3'
GB11as: 5'-GAAGGAGGGTGGTACGTGTCTGTG-3'
GB15s(hs): 5'-CTACGATGGCATCTGGGTCATC-3'
GB16as(hs): 5'-GTCCCATTTCCGTTCCTCTTC-3'
GB17s: 5'-CTCAACGACAGCAAGTACATC-3'
GB18as: 5'-GATGTACTTGCTGTCGTTGAG-3'
GB19as(hs): 5'-GCTCTAGACCGTATTTTATTGCATCGTAG-3'
GB22s(hs): 5'-GCGAATTCACAAAAAGACAAGACCATCATCCTG-3'
GB23as(hs): 5'-GCGAATTCAGGATGGTGAGGGCAGAGAGGATG-3'
GB25s: 5'-GTGAATTCGCGGCGCGGCATGGCTTC-3'
GB25sXbaI: 5'-GTTCTAGACGCGGCGCGGCATGGCTTC-3'
GB27as: 5'-CTGGTCCCGGGTCAGGAAGGAGAC-3'GB1s: 5'-CAGATCCGCAACGAGTCACTCCTG-3 '
GB2as: 5'-CAGGAGTGACTCGTTGCGGATCTG-3 '
GB3s: 5'-CAGTTTGACCAGAATATGGCAGC-3 '
GB4as: 5'-GCTGCCATATTCTGGTCAAACTG-3 '
GB6as: 5'-GACCTTCACCTCTCTGCTGTCTTG-3 '
GB11as: 5'-GAAGGAGGGTGGTACGTGTCTGTG-3 '
GB15s (hs): 5'-CTACGATGGCATCTGGGTCATC-3 '
GB16as (hs): 5'-GTCCCATTTCCGTTCCTCTTC-3 '
GB17s: 5'-CTCAACGACAGCAAGTACATC-3 '
GB18as: 5'-GATGTACTTGCTGTCGTTGAG-3 '
GB19as (hs): 5'-GCTCTAGACCGTATTTTATTGCATCGTAG-3 '
GB22s (hs): 5'-GCGAATTCACAAAAAGACAAGACCATCATCCTG-3 '
GB23as (hs): 5'-GCGAATTCAGGATGGTGAGGGCAGAGAGGATG-3 '
GB25s: 5'-GTGAATTCGCGGCGCGGCATGGCTTC-3 '
GB25sXbaI: 5'-GTTCTAGACGCGGCGCGGCATGGCTTC-3 '
GB27as: 5'-CTGGTCCCGGGTCAGGAAGGAGAC-3 '

Die PCR-Produkte wurden direkt mit den Primern, die schon zur Am plifikation benutzt worden waren bzw. mit den oben genannten Pri mern, sequenziert. Aus den erhaltenen Sequenzen wurden neue Pri mer abgeleitet und für die PCR-Reaktionen und Sequenzierungen eingesetzt (Liste der Primer siehe oben). Aus den Einzelsequenzen der erhaltenen PCR-Produkte konnte schließlich die Sequenz SEQ ID NO: 3 zusammengesetzt werden, die das offene Leseraster für ein Protein der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 enthält.The PCR products were directly mixed with the primers already at the Am plification were used or with the above pri mern, sequenced. New Pri mer derived and for the PCR reactions and sequencing used (list of primers see above). From the individual sequences of the PCR products obtained could finally the sequence SEQ ID NO: 3, which is the open reading frame for one Contains protein of the amino acid sequence SEQ ID NO: 4.

An den Positionen 360 und 2605 in der Sequenz SEQ ID NO: 3 wurde nach wiederholtem Sequenzieren aus beiden Richtungen neben dem A auch ein G-Signal detektiert, so daß an dieser Stelle die Sequenz entweder A oder G lautet. Diese Änderung gegenüber SEQ ID NO: 3 würde für Position 360 zu keiner Änderung der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 führen; an Position 2605 würde es zu einem Threonin zu Alanin-Austausch an Position 869 der Sequenz SEQ ID NO: 4 füh ren. Die Basenpaare 1 bis 8 in SEQ ID NO: 3 wurden durch den von 1 SEQ ID NO: 1 abgeleiteten Primer GB25s vorgegeben. Es kann daher nicht ausgeschlossen werden, daß eine oder mehrere Positionen in den Positionen 1 bis 8 in der SEQ ID NO: 3 anders lauten als an gegeben. Demzufolge kann auch eine oder mehrere der Aminosäuren 1 bis 3 in SEQ ID NO: 4 anders lauten als angegeben. At positions 360 and 2605 in the sequence SEQ ID NO: 3 after repeated sequencing from both directions next to the A also a G signal is detected, so that the sequence at this point is either A or G. This change from SEQ ID NO: 3 would not change the amino acid sequence for position 360 SEQ ID NO: 4 lead; at position 2605 it would become a threonine lead to alanine exchange at position 869 of sequence SEQ ID NO: 4 ren. The base pairs 1 to 8 in SEQ ID NO: 3 were by the of 1 SEQ ID NO: 1 derived primer GB25s specified. It can therefore it cannot be excluded that one or more positions in positions 1 to 8 in SEQ ID NO: 3 are different than given. Accordingly, one or more of the amino acids 1 to 3 in SEQ ID NO: 4 are different than specified.

Das PCR-Produkt GB25sXbaI/GB23as(hs) wurde einem Restriktionsver dau mit XbaI und BglII unterzogen. Das PCR-Produkt GB22s(hs)/ GB16as(hs) wurde einem Restriktionsverdau mit BglII und XhoI un terzogen, Die beiden PCR-Produkte wurden in einen mit XbaI und XhoI vorgeschnittenen pBSIIKS(-)-Vektor (Firma Stratagene) klo niert (pBS-hsGB). The PCR product GB25sXbaI / GB23as (hs) was subjected to a restriction ver subjected to XbaI and BglII. The PCR product GB22s (hs) / GB16as (hs) was subjected to restriction digestion with BglII and XhoI un The two PCR products were merged with XbaI and XhoI pre-cut pBSIIKS (-) - vector (company Stratagene) klo niert (pBS-hsGB).

SEQUENCE LOG

Claims

1. Protein heteromer containing at least one GABA _B receptor protein and at least one protein with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or a sequence obtainable therefrom by substitution, inversion, insertion or deletion of one or more amino acid residues , whereby at least one of the essential biological properties of the protein shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or the protein heteromer is retained.

2. Isolated protein containing those in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 amino acid sequence shown or one thereof by substitution, inversion, insertion or deletion of sequence available from one or more amino acid residues, where with at least one of the essential biological properties properties of that shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 Protein remains intact.

3. Nucleic acid sequence coding for a protein according to An saying 2.

4. Nucleic acid sequence according to claim 3, characterized in that that it codes for a protein that has at least 60% identi with the one shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 Sequence.

5. Nucleic acid sequence according to claim 3, characterized in that that the one shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 Contains sequence.

6. Recombinant nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence according to claim 3 or a nucleic acid sequence according to claim 3 and a sequence which codes for a GABA _B receptor protein, functionally linked to at least one genetic regulatory element.

7. host organism transformed with a nucleic acid sequence according to claim 3 or a recombinant nucleic acid construct according to claim 6 or with a nucleic acid sequence according to claim 3 or a recombinant nucleic acid construct according to claim 6 together with a sequence which codes for a GABA _B receptor protein.

8. Host organism transformed with a recombinant nu small acid construct according to claim 6.

9. Transgenic animals containing a functional or non-radio tional nucleic acid sequence according to claims 3 to 5 or a functional or non-functional nucleic acid constructed according to claim 6.

10. Transgenic animals, in their germ cells or in their entirety or part of the somatic cells, or in its germ cells and all or part of the somatic Cells the nucleotide sequence according to claim 3 by genetic engineering procedures or by inserting DNA elements was interrupted.

11. Use of a nucleic acid sequence according to claim 3, one Nucleic acid construct according to claim 6, a protein hetero mer according to claim 1 or protein according to claim 2 Identification of proteins that lead to a protein heterome ren according to claim 1 or a protein according to claim 2 spe have specific binding affinities, or for identification tion of nucleic acids coding for proteins that lead to egg a protein heteromer according to claim 1 or a protein according to claim 2 have specific binding affinities.

12. Use of the two-hybrid system or biochemical process to identify the interaction domains of metabo tropical receptors and use for pharmacotherapeutic Intervention.

13. Use of the structure elucidation of a protein teromers according to claim 1 or a protein according to An Proverb 2 resulting information for targeted locating or for the targeted production of substances with specifi shear binding activity to a protein heteromer according to An saying 1 or a protein according to claim 2.

14. Use of a protein heteromer according to claim 1 or of a protein according to claim 2 or peptide fragments thereof as an antigen for the production of specific mono- or poly clonal antibodies or antibody mixtures directed against Proteins according to claim 1 or 2.

15. mono- or polyclonal antibodies or antibody mixtures, which specifically recognize proteins according to claim 1 or 2.

16. Use of a nucleic acid sequence according to claim 3 or a fragment thereof for the isolation of a genomic Se quence on homology screening.

17. Use of a nucleic acid sequence according to claim 3 as Marker for human hereditary diseases.

18. Use of a nucleic acid sequence according to claim 3 or Parts of it for gene therapy.

19. Use of a nucleic acid sequence according to claim 3 or in parts of its complementary nucleic acid sequence Gene therapy.

20. A method for finding substances with specific binding affinity for a protein according to claim 1 or 2, comprising the following steps:

a) Incubation of the protein according to claim 1 or 2 with the substance to be tested.
b) detection of the binding of the substance to be tested to the protein.

21. The method according to claim 20, characterized in that the detection of the binding is carried out by measuring the antagonization or agonization of the GABA _B receptor activity.

22. The method according to claim 20, characterized in that the Detection of the binding of substances to a protein according to An saying 1 by measuring a physiological effect, such as. B. a change in the calcium, cAMP, IP3 concentration or membrane potential.

23. A method for the qualitative or quantitative detection of a nucleic acid according to claim 3 in a biological sample, which comprises one or more of the following steps:

a) incubation of a biological sample with a known amount of nucleic acid according to claim 3 or a known amount of oligonucleotides which are suitable as primers for an amplification of the nucleic acid according to claim 3 or mixtures thereof,
b) detection of the nucleic acid according to claim 3 by specific hybridization or PCR amplification,
c) Comparison of the amount of hybridizing nucleic acid according to claim 3 or of nucleic acid obtained by PCR amplification according to claim 3 with a standard.

24. A method for the qualitative and quantitative detection of a protein according to claim 1 or 2 in a biological sample, which comprises one or more of the following steps:

a) incubation of a biological sample with an antibody according to claim 15, which is specifically directed against proteins according to claim 1 or 2,
b) detection of the antibody / antigen complex,
c) Comparison of the amounts of the antibody / antigen complex with a standard.

25. A method of finding substances that specifically bind to a protein having an amino acid sequence according to claim 2, which comprises one or more of the following steps:

a) Expression of the protein in eukaryotic or prokaryotic cells.
b) Incubation of the protein with the substances to be tested.
c) Detection of the binding of a substance to the receptor or an effect on the receptor function.

26. Method of finding substances specific to a Protein with an amino acid sequence according to claim 2 or bind a nucleic acid sequence according to claim 3 and thereby inhibitory or activating functional effects on GABA result in signal transmission in central nervous neurons call.

27. Method of finding substances that interact of proteins with amino acid sequences according to claim 2 with inhibit or enhance other metabotropic receptors.

28. Method of finding substances that interact of ligands with the protein heteromer according to claim 1 or Inhibit proteins with amino acid sequences according to claim 2 or reinforce.

29. Method of finding substances that interact of proteins with amino acid sequences according to claim 2 with G- Inhibit proteins or other signal transduction molecules or reinforce.

30. Procedure for the qualitative and quantitative determination of Proteins according to claim 2 using specific Agonists or antagonists.

31. Method for quantifying the protein activity of a pro teins according to claim 2.