DE19840489A1 - Wirkstoffzubereitungen sowie ein Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents
Wirkstoffzubereitungen sowie ein Verfahren zu deren HerstellungInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Wirkstoffzubereitungen, bei denen ein oder mehrere Wirkstoffe von mindestens einer Schicht oder Teile einer Schicht aus einem Protein umgeben sind, das mit einem Enzym, ausgewählt aus der Gruppe der Lipoxygenasen, Proteindisulfidisomerasen, Phenoloxidasen, Lysyloxidasen, Proteindisulfidreduktasen oder Sulfhydryloxidasen, quervernetzt wurde. DOLLAR A Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Wirkstoffzubereitungen, in denen ein oder mehrere Wirkstoffe von mindestens einer Schicht umgeben sind, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der den oder die Wirkstoffe umgebenden Schichten oder Teile dieser Schichten aus einem Protein bestehen, das mit einem Enzym, ausgewählt aus der Gruppe der Lipoxygenasen, Proteindisulfidisomerasen, Phenoloxidasen, Lysyloxidasen, Proteindisulfidreduktasen oder Sulfhydryloxidasen, quervernetzt wurde sowie die Verwendung der genannten Enzyme zur Formulierung von Wirkstoffen. DOLLAR A Weiterhin betrifft die Erfindung Lebensmittel, Futtermittel oder pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend die erfindungsgemäße Wirkstoffzubereitung sowie das Enzym Lysyloxidase. Im Besonderen betrifft die Erfindung Trockenpulver, die Vitamine, Enzyme, Lebensmittel- und Futtermittelzusatzstoffe, wie z. B. Carotinoide, enthalten. Außerdem können noch verschiedene Zusatzstoffe eingebettet sein.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Wirkstoffzubereitungen, bei
denen ein oder mehrere Wirkstoffe von mindestens einer Schicht
oder Teilen einer Schicht aus einem Protein umgeben sind, das
mit einem Enzym ausgewählt aus der Gruppe der Lipoxygenasen,
Proteindisulfidisomerasen, Phenoloxidasen, Lysyloxidasen,
Proteindisulfidreduktasen, Tyrosinoxidasen oder Sulfhydryl
oxidasen quervernetzt wurde.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
von Wirkstoffzubereitungen, in denen ein oder mehrere Wirkstoffe
von mindestens einer Schicht umgeben sind, dadurch gekennzeich
net, daß mindestens eine der den oder die Wirkstoffe umgebenden
Schichten oder Teile dieser Schichten aus einem Protein bestehen,
das mit einem Enzym ausgewählt aus der Gruppe der Lipoxygenasen,
Proteindisulfidisomerasen, Phenoloxidasen, Lysyloxidasen,
Proteindisulfidreduktasen, Tyrosinoxidasen oder Sulfhydryl
oxidasen quervernetzt wurde sowie die Verwendung der genannten
Enzyme zur Formulierung von Wirkstoffen.
Weiterhin betrifft die Erfindung Lebensmittel, Futtermittel oder
pharmazeutische Zubereitungen enthaltend die erfindungsgemäße
Wirkstoffzubereitung sowie das Enzym Lysyloxidase. Im Besonderen
betrifft die Erfindung Trockenpulver, die Vitamine, Enzyme,
Lebensmittel- und Futtermittelzusatzstoffe, wie z. B. Carotinoide
enthalten. Außerdem können gegebenenfalls noch verschiedene
Zusatzstoffe eingebettet sein.
Pulverförmige Wirkstoffzubereitungen wie Vitamin- und Carotinoid-
Präparate sind allgemein bekannt und werden in der pharma
zeutischen Industrie sowie in der Nahrungs- und Futtermittel
industrie in großem Umfang verwendet. In der Literatur werden
viele Verfahren zur Herstellung geeigneter Präparate beschrieben.
Zur Herstellung von pulverförmigen Zubereitungen, in denen
oxidationsempfindliche Stoffe wie öllösliche Vitamine oder
Carotinoide gegen oxidative Einflüsse geschützt werden sollen,
werden verschiedene Herstellverfahren, insbesondere Sprüh
verfahren beschrieben.
In der deutschen Patentschrift 10 35 319 wird beschrieben, wie
eine Dispersion eines öligen Vitamins in einen hohen Überschuß
von pulverförmiger Stärke mit einem geringen Feuchtegehalt (unter
8%) versprüht wird. Durch das trockene Stärkepulver wird den
versprühten Partikeln Wasser entzogen. Hierdurch erstarren sie,
wobei eine große Menge der Stärke an der Oberfläche der Partikel
haften bleibt. Außerdem muß der überschüssige Stärkeanteil abge
trennt und anschließend wieder dem Prozeß zugeführt werden.
In der schweizerischen Patentschrift 488 455 wird dargelegt, daß
als Puderungsmittel ein Gemisch aus anorganischen Substanzen ein
gesetzt wird, das aus wasserabweisenden und wasserabsorbierenden
Substanzen besteht. Hierdurch soll die Explosionsgefahr, die
durch die trockene, feinverteilte Stärke besteht, vermieden
werden.
Aus der schweizerischen Patentschrift 389 505 ist bekannt, daß
die Dispersion des Wirkstoffs in ein gekühltes, gasförmiges
Medium versprüht wird, in dem die versprühten Partikel durch
Abkühlung erstarren. Für diesen Prozeß werden Fallhöhen von bis
zu 15 m benötigt, außerdem müssen die Temperaturen deutlich
unter Raumtemperatur gehalten werden.
Eine weitere Methode zur Verfestigung der versprühten Partikel
kann auch durch Auffangen in einem Pulver, das aus Metallsalzen
höherer Fettsäuren besteht, erfolgen. Dieses Verfahren wird in
der schweizerischen Patentschrift 431 252 beschrieben.
Eine alternative Methode zur Herstellung von wirkstoffhaltigen,
stabilen Zubereitungen wird in der europäischen Patentschrift
EP-A-0 618 001 beschrieben. Hier erfolgt die Herstellung der
kugelförmigen Partikel, die eine Einbettung des Wirkstoffs in
einem Gemisch aus verschiedenen Trägersubstanzen darstellen,
indem man zunächst durch kontrollierte Teilung Kügelchen aus
einer primären Öl-in-Wasser-Emulsion bildet, die aus der Zugabe
von Wirkstoffen, ölförmigen Stoffen, Proteinen und Wasser zum
einem nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel besteht, und
anschließend die erhaltenen Kügelchen abtrennt. Für die Her
stellung der Kügelchen ist ein spezielles Mischsystem erforder
lich. Die hierbei erhaltenen Partikel werden anschließend mit
einem Aldehyd, beispielsweise Acetaldehyd, Glutaraldehyd oder
Glyoxal nachbehandelt, wodurch eine chemische Vernetzung, die
sich auch in der Wasserunlöslichkeit des erhaltenen Materials
ausdrückt, und damit eine zusätzliche Stabilisierung des Wirk
stoffs erreicht wird.
In der amerikanischen Patentschrift 4 670 247 wird eine weitere
Methode zur Herstellung von vernetzten Partikeln beschrieben.
Hierzu wird zunächst eine Emulsion, die im wesentlichen aus einem
öllöslichen Vitamin, einem Schutzkolloid wie z. B. Gelatine und
einem reduzierenden Zucker besteht, durch einen Sprüh- und Trock
nungsprozeß in pulverförmige Partikel überführt. Diese Partikel
werden anschließend in einem thermischen Prozeß bei Temperaturen
zwischen 105 und 180°C behandelt. In einer Maillard-Reaktion
zwischen den Aminogruppen der Proteine und den Oxo-Gruppen der
reduzierenden Zucker wird dabei eine Wasserunlöslichkeit der
Trockenpulverpartikel erzielt, die durch eine Vernetzung der
Matrixbestandteile erreicht wird.
In EP 782883 werden eßbare Mikrokapseln beschrieben, die eine
Kapselwand enthalten, die durch Aussalzen des Proteins mit einem
eßbaren Salz und Vernetzung der Kapselwand mit Transglutaminase
hergestellt werden. Nachteilig bei dieser Methode ist, daß sie
nicht breit anwendbar ist. So ist die Transglutaminase beispiels
weise für Sprühformulierungen ungeeignet, da sie versprühte
und getrocknete Wirkstofformulierungen nicht mehr richtig quer
vernetzten kann und so die Wirkstoffe während der Lagerung schon
einem verstärkten Abbau ausgesetzt sind. Wartet man bis die Quer
vernetzung durch die enzymatische Aktivität abgeschlossen ist,
so lassen sich die Formulierungen nicht mehr versprühen.
Wenn oxidationsempfindliche Verbindungen, in diesem Falle
insbesondere fettlösliche Vitamine und Carotinoide, mit Luft
in Kontakt kommen, erfolgt eine Umsetzung mit Sauerstoff, die
zu einem Wirkstoffverlust durch Umsetzung zu ungewünschten Ver
bindungen führt. Um diese Oxidation zu verhindern, kann man zum
Beispiel bestimmte Zusätze den Zubereitungen hinzufügen, die
durch Umsetzung mit reaktiven Gruppen der Proteine diese wiederum
weniger durchlässig für Sauerstoff machen und dadurch den Wirk
stoffen einen stabilisierenden Schutz verleihen. Dies kann bei
spielsweise dadurch geschehen, daß durch Umsetzung von Proteinen
mit reduzierenden Zuckern im Sinne einer Maillard-Reaktion die
Löslichkeit der Proteine in Wasser verhindert wird. Weiterhin
kann durch Umsetzung der Proteine mit Aldehyden eine Vernetzung
erreicht werden, die ebenfalls der Trägermatrix eine erhöhte
Stabilität verleiht.
Diese Verfahren zeigen jedoch bestimmte Nachteile, die es
wünschenswert erscheinen lassen, nach verbesserten Stabili
sierungsverfahren zu suchen. So bedeutet die Anwendung einer
Maillard-Reaktion zwischen einem Protein und reduzierenden
Zuckern in jedem Falle eine thermische Belastung und damit
zumindest in einem geringen Maße einen Abbau des Wirkstoffs.
Außerdem neigen die Produkte zu einer bräunlichen Färbung. Ein
Verfahren zur Formulierung von Wirkstoffen über Maillard-Reaktion
ist beispielsweise der Patentanmeldung EP-A-0 547 422 zu ent
nehmen.
Von Nachteil bei der Verwendung von chemischen Agentien wie
Aldehyden oder Säuren wie Tanninsäure als Vernetzungsmittel ist,
daß zur Vernetzung hochreaktive und gesundheitlich nicht unbe
denkliche Zusatzstoffe eingesetzt werden. Die Produkte, die nach
diesen Verfahren hergestellt werden, finden beim Verbraucher nur
bedingt unumschränkte Akzeptanz.
Es war daher die Aufgabe der Erfindung ein leichtes, kosten
günstiges, breit anwendbares Verfahren zur Formulierung von
Wirkstoffen zu entwickeln, das die oben genannten Nachteile
nicht aufweist.
Diese Aufgabe wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Her
stellung von Wirkstoffzubereitungen, in denen ein oder mehrere
Wirkstoffe von mindestens einer Schicht umgeben sind, dadurch
gekennzeichnet, daß mindestens eine der den oder die Wirkstoffe
umgebenden Schichten oder Teile dieser Schichten aus einem
Protein bestehen, das mit einem Enzym ausgewählt aus der Gruppe
der Lipoxygenasen, Proteindisulfidisomerasen, Phenoloxidasen und
Peroxidasen, Lysyloxidasen, Proteindisulfidreduktasen, Tyrosin
oxidasen oder Sulfhydryloxidasen quervernetzt wurde, gelöst.
Die chemische Funktion dieser Enzyme im Stoffwechsel bzw.
ihre chemische Reaktion ist beispielsweise den Schriften von
Green et al. (Biochem. J. 1983, 211, 481-493), Kagan et al.
(Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 5, 1991, 206-210), Haywood
et al. (Biochem. J., 1981, 199, 187-201) oder Matheis et al.
(J. Food Biochem. 11, 1987, 309-327) zu entnehmen.
Durch die vorteilhafte enzymatischen Vernetzung im erfindungs
gemäßen Verfahren wird sowohl eine thermische Belastung der
Wirkstoffe wie bei der thermischen Vernetzung der Protein/
Zuckerschicht und ein damit verbundenes Bräunen der Wirkstoff
formulierungen über die Maillardreaktion sowie die Verwendung
reaktiver chemischer Substanzen wie Aldehyde vermieden. Die
Maillardreaktion bei der thermischen Vernetzung führt zu einer
Verknüpfung von reduzierenden Zuckern mit den freien Aminogruppen
der Proteine oder sonstigen freien Aminogruppen und damit zu ein
er Stabilisierung der Wirkstofformulierungen. Bei der Verwendung
von chemischen Verbindungen zur Vernetzung der Proteine bilden
sich Brücken zwischen den Aldehyden in der Regel den Dialdehyden
und den Aminogruppen der Proteine oder sonstigen Aminogruppen
aus. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Proteine direkt
beispielsweise über in den Proteinen oder Lipoproteinen vor
handenen Fettsäureresten, über Cyctein-Cysteinbrücken (= Cystin
brücken), über Michaeladditionsprodukte oder über die Bildung von
Aldehyden aus Lysin mit anschließender Vernetzung über freie
Aminogruppen vernetzt.
Dies führt zu den neuen erfindungsgemäßen Wirkstoffzubereitungen
enthaltend mindestens eine einen oder mehrere Wirkstoffe umge
bende Schicht oder Teile einer Schicht aus einem Protein, das
mit einem Enzym ausgewählt aus der Gruppe der Lipoxygenasen,
Proteindisulfidisomerasen, Phenoloxidasen und Peroxidasen,
Lysyloxidasen, Proteindisulfidreduktasen, Tyrosinoxidasen oder
Sulfhydryloxidasen quervernetzt wurde. Diese erfindungsgemäßen
Wirkstoffzubereitungen weisen bei einer guten Stabilität keine
bräunliche Färbung auf und enthalten keine chemischen Vernetzer.
Als Wirkstoffe im erfindungsgemäßen Verfahren oder in den
erfindungsgemäßen Wirkstoffzubereitungen sind prinzipiell alle
in der Pharmazie, Human- oder Tierernährung verwendeten Wirk
stoffe geeignet. Bevorzugte Wirkstoffe sind Vitamine, Enzyme,
Lebensmittel- und Futtermittelzusatzstoffe.
Unter Enzymen im erfindungsgemäßen Verfahren oder in den Wirk
stoffzubereitungen sind als Wirkstoff Enzyme wie z. B. Hydrolasen
wie Amidasen, Proteasen, Lipasen, Esterasen, Phospholipasen,
β-Glucosidasen, Amylasen, Nitrilasen, Mannanasen, Phytasen
oder Xylanasen, Transferasen wie Methyltransferasen oder Amino
transferasen, Oxidoreduktasen wie Glucoseoxidase oder Isomerasen
beispielhaft zu verstehen.
Insbesondere sind hydrophobe Wirkstoffe bevorzugt, besonders
bevorzugt solche, die leicht oxidierbar sind. Solche sind die
Vitamine der Gruppen A, D, E und K sowie deren Mischungen
speziell den Mischungen mit Carotinoiden und/oder Xanthophyllen.
Sie können im Rahmen der Erfindung in Form von Vitaminlösungen
in Ölen, als Provitamine sowie als reine Vitamine natürlichen
oder synthetischen Ursprungs eingesetzt werden. Von besonderem
Interesse sind Präparate von Vitamin D3, Vitamin K1, Vitamin A
und dessen Derivaten, insbesondere von Vitamin-A-Acetat, Vitamin-
A-Palmitat und Vitamin-A-Propionat sowie deren Mischungen. Auch
die verschiedenen Vitamin E-Derivate wie Vitamin E-Acetat,
Vitamin E-Palmitat sind von Interesse. Bevorzugte Lebensmittel-
und Futtermittelzusatzstoffe sind Carotine, Xanthophylle und
Carotinoide wie β-Carotin und wie z. B.: Astaxanthin, Astacin,
Bixin, Norbixin, Capsorubin, Violaxanthin, Rubixanthin,
Phodoxanthin, Apo-8'-carotinsäureethylester, Neurosporaxanthin,
Citranaxanthin, Canthaxanthin, Zeaxanthin, β-Apo-4'-carotinal,
β-Apo-8'-carotinaL, β-Apo-12'-carotinal, β-Apo-8'-carotinsäure,
Lutein, Capsanthin, Lycopin sowie Ester von hydroxy- und carboxy
haltigen Vertretern dieser Gruppe, z. B. die niederen Alkylester
wie Methyl- oder Ethylester oder deren Mischungen.
Die Anteile an den Wirkstoffen betragen in den erfindungsgemäßen
Wirkstoffzubereitungen im allgemeinen etwa 1 bis 75 Gew.-%, vor
zugsweise 5 bis 50 Gew.-%, besonders bevorzugt 10 bis 35 Gew.-%,
bezogen auf die Trockenmasse der Pulver.
Die Anteile an Vitaminen oder Carotinoiden betragen im all
gemeinen etwa 5 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis 35 Gew.-%,
bezogen auf die Trockenmasse der Pulver.
Bevorzugt sind erfindungsgemäße Verfahren, bei denen eine wirk
stoffhaltige Emulsion oder Dispersion in eine mit hydrophobierter
Kieselsäure beladene Atmosphäre, die gegebenenfalls inertisiert
sein kann, versprüht wird. Die Atmosphäre kann vorteilhaft
auch mit einem anderen Puderungsmittel wie einem Mittel auf
Basis eines Kohlenhydrats wie Stärke oder modifizierter Stärke
beispielsweise Maisstärke beladen sein.
Außerdem sind Verfahren bevorzugt, bei denen nach dem Herstellen
der Wirkstoffzubereitung beispielsweise über Versprühen getrock
net wird. Dabei wird bevorzugt bis zu einer Restfeuchte unter
10 Gew.-%, bevorzugt unter 6 Gew.-% getrocknet. Auch geringere
Restfeuchten können eingestellt werden.
Die Temperatur des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im Wesent
lichen unter 80°C, bevorzugt unter 60°C, gehalten.
Die Erfindung betrifft außerdem Wirkstoffzubereitungen erhältlich
nach einem erfindungsgemäßen Verfahren, und solche, die als zu
sätzliches Merkmal den 0,025-fachen bis 4-fachen Gewichtsanteil
bezüglich Wirkstoff an Trennmittel oder Trennmittelgemischen
enthalten, sowie Lebensmittel oder Futtermittel enthaltend eine
solche Wirkstoffzubereitung.
Bevorzugte Trennmittel sind hydrophobierte Kieselsäuren, Mais
stärke, durch chemische Behandlung hydrophobierte Maisstärke,
Metallsalze höherer Fettsäuren und andere pflanzliche Stärken
oder Mischungen dieser Trennmittel. Besonders bevorzugt sind
Mischungen aus mindestens einem dieser Trennmittel mit weiteren
Hilfsstoffen wie anorganischen Verbindungen, die als Gleitmittel
wirken, wie zum Beispiel Neusilin® oder Zeolex®.
Im Fall von hydrophober Kieselsäure liegt der Anteil bezüglich
Wirkstoff bevorzugt in einem Bereich zwischen 0,025 und 0,4,
besonders bevorzugt zwischen 0,05 und 0,2. Bei Maisstärke liegt
das entsprechende Verhältnis bevorzugt zwischen 0,25 und 2,
besonders bevorzugt zwischen 0,5 und 1,5.
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffzubereitungen sind erhältlich
durch Herstellung einer Dispersion enthaltend im wesentlichen
diese Wirkstoffe, ein Protein und weitere Träger- und Füllstoffe
z. B. aus der Gruppe der Kohlenhydrate und/oder natürliche oder
chemisch modifizierte Stärken. Sie kann noch weitere Zusatzstoffe
wie Stabilisatoren oder Emulgierhilfsmittel enthalten. Außerdem
enthält sie ein Enzym, das in der Lage ist, auf verschiedene
Weise Proteinmoleküle miteinander zu verknüpfen. Die hierdurch
erreichte Vernetzung verleiht dem Protein und damit auch der
Matrix, in dem die Wirkstoffe eingebettet sind, eine verminderte
Wasserlöslichkeit und somit eine erhöhte Stabilität.
Als Protein im erfindungsgemäßen Verfahren können prinzipiell
alle Proteine verwendet werden. Bevorzugte vernetzbare Proteine
sind aus wirtschaftlichen Gründen Gelatine, Kasein, Soja-Protein,
Weizenproteine, Mais-Protein und Kollagen.
Bevorzugte vernetzbare Proteine sind alle Formen von pflanzlichen
oder tierischen Proteine wie Gelatine, z. B. Knochengelatine,
Rindergelatine, Fischgelatine, Milchproteine, wie z. B. Kasein,
Sojaproteine, Weizenproteine wie Gluten, Maisproteine und
Kollagene, besonders bevorzugte Proteine sind Gelatine, Milch
proteine und Sojaproteine. Unter Gelatine im erfindungsgemäßen
Verfahren sind alle Formen von Gelatine zu verstehen, egal,
ob es sich um natürliche Gelatinen handelt oder um chemisch
modifizierte Derivate.
Für die Herstellung der Dispersion wird bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren vorteilhaft Gelatine des A- und B-Typs in einem weiten
Bloombereich eingesetzt. Mit besonderem Vorteil arbeitet man mit
Gelatine mit einem Bloomwert von etwa 50 bis etwa 250.
Die Gelatine verwendet man erfindungsgemäß in Mengen von 10 bis
50 Gew.-%, vorzugsweise 15 bis 40 Gew.-%, insbesondere 20 bis
35 Gew.-%, bezogen auf die Trockenmasse der Wirkstoffzubereitung.
Vorteilhaft werden den Proteinen zur mechanischen Stabilisierung
Weichmacher wie Zucker und/oder Zuckeralkohole wie Saccharose,
Glucose, Sorbit, Sorbose, Mannit oder Polyole wie Glycerin zuge
setzt.
Die erfindungsgemäßen vernetzenden Enzyme sind ausgewählt aus der
Gruppe der Lipoxygenasen, Proteindisulfidisomerasen (bevorzugt
E.C.-Klasse 5.3.4), Phenoloxidasen (bevorzugt E.C.-Klasse 1.14.)
und Peroxidasen (bevorzugt E.C.-Klasse 1.11), Lysyloxidasen
(bevorzugt E.C.-Klasse 1.4.3), Proteindisulfidreduktasen (bevor
zugt E.C.-Klasse 1.6.4), Tyrosinoxidasen (bevorzugt E.C.-Klasse
1.14) oder Sulfhydryloxidasen (bevorzugt E.C.-Klasse 1.8.). Diese
können tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Ursprungs
sein. Bevorzugt sind sie mikrobiellen Ursprungs, das heißt aus
Eukaryonten wie Pilzen oder Hefen oder Prokaryonten wie gram
positiven oder gram-negativen Bakterien oder Archaebakterien.
Bevorzugt werden als Enzym die Lysyloxidasen verschiedenen
Ursprungs verwendet. Besonders bevorzugt werden die Lysyloxidasen
aus Hefen wie aus den Gattungen Candida, Hansenula, Pichia,
Sporobolomyces, Sporopachydermia, oder Trigonopsis verwendet.
Ganz besonders bevorzugt sind Lysyloxidasen aus den Gattungen und
Arten Candida nagoyaensis, Candida nemodendra, Candida boidinii,
Candida lipolytica, Candida steatolytica, Candida tropicalis,
Candida utilis, Hansenula minuta, Hansenula polymorpha, Pichia
pinus, Pichia pastoris, Sporobolomyces albo-rubescens, Sporo
pachydermia cereana oder Trigonopsis variabilis. Herausragend
geeignet für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Lysyloxidase
aus der Gattung und Art Pichia pastoris.
Die erfindungsgemäße Lysyloxidase von Pichia patoris läßt sich
aus der Zellmaße von Pichia pastoris Zellen über einen Zell
aufschluß, der mit üblichen Methoden durchgeführt wurde, einer
Ionenaustauschchromatographie mit einer anschließenden Molekular
siebohromatographie und abschließender nochmaliger Ionenaus
tauschchromatographie aufreinigen. Mit diesem Reinigungsschema
konnte die Lysyloxidase mit einer Reinheit von über 90%, bevor
zugt von über 95%, besonders bevorzugt von über 99% dargestellt
werden.
Die aufgereinigte Lysyloxidase wurde einer Proteinsequenzierung
nach Edman unterzogen. Dabei wurde das N-terminale Ende sowie
verschiedene Peptide, die in einem Verdau mit Trypsin erhalten
wurden, bestimmt (siehe Beispiel 5).
Die Erfindung betrifft damit ein isoliertes Protein, das
mindestens eine der folgenden Sequenzen enthält:
eine aminoterminale Sequenz
G(S)(C)Q(C)KTNEKVNIEAPKPNI(C)DT(L)(S)
oder Teilsequenzen, die Peptiden des Proteins entsprechen,
die nach einem Verdau mit Trypsin erhalten wurden:
EYP(C) APGVVYNTK
GGTYSTVTQNPTLNR
DYNIMPGGGXVHR
ATGGTYSTVXAQN
APETENNAR
GPL(P)VNE(E)TTIEPLSFYNT
IYELSLQELIAEYGSDDPNNQHTFYSDI
DNVDDLSCTIIQR
VAPETENCAR
NVDVEYPCAPGVVYNTK
GYPNAEY(S)LDF/ER
GGTYSTVTQNPTLNR
DYNIMPGGGXVHR
ATGGTYSTVXAQN
APETENNAR
GPL(P)VNE(E)TTIEPLSFYNT
IYELSLQELIAEYGSDDPNNQHTFYSDI
DNVDDLSCTIIQR
VAPETENCAR
NVDVEYPCAPGVVYNTK
GYPNAEY(S)LDF/ER
und das die ε-Aminogruppen des Lysins speziell in einem Protein
zu Aldehydgruppen oxidieren kann. Die Buchstaben und Zeichen in
den oben genannten Sequenzen haben folgende Bedeutung: X ist eine
unbekannte Aminosäure, die an dieser Position nicht identifiziert
werden konnte, die Klammern bedeuten nicht eindeutig ermittelbare
Aminosäuren, wobei die angegebenen Aminosäure, die wahrscheinlich
richtige Aminosäure ist, der Schrägstrich bedeutet Aminosäure
alternativen, wobei die Aminosäure vor dem Schrägstrich oder die
nach dem Schrägstrich an der Position richtig sein kann. Durch
die Oxidation der ε-Aminogruppen kommt es schließlich zur Quer
vernetzung von Proteinen, wobei Bereiche desselben Proteins mit
einander vernetzt werden können oder verschiedener Proteine.
Die Lysyloxidase (= PROTEIN-LYSINE 6-OXIDASE, EC 1.4.3.13 oder
LYSYL OXIDASE) speziell die Lysyloxidase von Pichia pastoris
ermöglicht die enzymatische Quervernetzung von Proteinen, wobei
als Protein vorteilhaft Gelatine verwendet wird. Dabei werden
die ε-Aminogruppen der Lysine zu Aldehydgruppen oxidiert. Diese
Aldehyde können dann unter Bildung Schiff'scher Basen mit den
Aminogruppen anderen Lysine oder anderen freien Aminogruppen bei
spielsweise Aminozuckern reagieren. Ein besonderer technischer
Vorteil für den Anwender ist die zeitliche Trennung innerhalb der
gesamten Reaktionssequenz, das heißt, die Bildung der Aldehyde
aus den ε-Aminogruppen der Lysine und die Reaktion der Amino
gruppen mit den gebildeten Aldehydgruppen ist zeitlich getrennt.
Dies bietet gegenüber beispielsweise der enzymatischen Quer
vernetzung mit Hilfe der Transglutaminase einen wesentlichen
Fortschritt, da bei dieser Reaktion immer sofort die Vernetzung
erfolgt und damit keine zeitliche Trennung in der Enzymreaktion
und der Vernetzung möglich ist. Diese zeitliche Trennung ermög
licht die vorteilhafte Verwendung der enzymatischen Reaktion
für Verfahren wie zum Beispiel die Herstellung von Wirkstoff
zubereitungen über Sprühtrocknung oder über das sogenannte Mikro
nisierungsverfahren (siehe EP-A-0 065193). Ein weiterer Vorteil
ist die Unbedenklichkeit der gebildeten Moleküle, da sie ein
natürlicher Bestandteil des Bindegewebes sind (Abb. 1 und
2). Sie werden dort von einer Gewebe-Lysinoxidase erzeugt.
Die genannten Enzyme können in Form der gereinigten Enzyme
oder in Form von Rohextrakten aus natürlichen Quellen wie aus
Eukaryonten wie Pilzen, Hefen, tierischen oder pflanzlichen
Zellen oder Prokaryonten wie gram-positiven, gram-negativen
Bakterien oder Archaebakterien verwendet werden. Auch ganze
Organismen oder Zellen können für das erfindungsgemäße Verfahren
verwendet werden, soweit die Enzyme ins extrazelluläre Milieu
sezerniert werden oder die Zellen permeabilisiert wurden. Bevor
zugt wird das erfindungsgemäße Verfahren mit gereinigten Enzymen
oder, soweit keine unerwünschten Nebenaktivitäten vorhanden sind,
mit Rohextrakten durchgeführt.
Die für die Quervernetzung der Proteine benötigten Enzymmengen
bzw. -aktivitäten lassen sich in herkömmlicher Weise in dem
Fachmann bekannter Art durch einfache Vorversuche bestimmen.
Üblicherweise werden die Enzyme in einer Menge zugesetzt, daß
20 bis 100% der quervernetzbaren Gruppen beispielsweise der
Lysinreste im Protein vernetzt werden. Vorteilhafterweise werden
0,001 bis 1000 Units Enzym pro Gramm Protein, vorzugsweise
0,01 bis 100 Units Enzym pro Gramm Protein, besonders bevorzugt
0,1 bis 10 Units pro Gramm Protein zugesetzt.
Die Wirkstoffzubereitungen können einen oder mehrere Wirkstoffe
enthalten, wobei unterschiedliche Wirkstoffklassen wie Vitamine
oder Carotinoide oder mehrere Wirkstoffe einer Wirkstoffklasse
beispielsweise mehrere verschiedene Carotinoide oder Vitamine
oder deren Mischungen in den Zubereitungen enthalten sein können.
Die Wirkstoffe in den Zubereitungen können von einer oder
mehreren Schichten umgeben sein. Diese Schichten können aus
einer oder mehreren erfindungsgemäß quervernetzten Protein
schichten oder aus einer oder mehreren erfindungsgemäß quer
vernetzten Proteinschichten und mindestens einer chemisch
quervernetzten Proteinschicht und/oder weiteren Schichten aus
natürlichen oder künstlichen Polymeren bestehen. Die nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren quervernetzten Proteine können auch
Teile mindestens einer den oder die Wirkstoffe umgebenden Schicht
sein.
Unter natürlichen und/oder künstlichen Polymeren sind prinzipiell
alle Polymere denkbar, die für die Formulierung von Wirkstoffen
geeignet sind. Als natürlichen Proteine seihen beispielsweise
Polymere wie Guar Gum, Alginate, Carrageenan, Pektine oder
Polymere auf Basis von Mannose und/oder Galaktose genannt. Als
künstliche Proteine seinen beispielsweise Polymere auf Basis
von Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylaten, Methacylaten oder
Mischungen aus diesen Monomeren wie beispielsweise Eudragit
L30D-55 (Methacrylsäure : Ethylacrylat, 1 : 1) oder Eudragit S
(Methacrylsäure : Methylmethacrylat, 1 : 2). Auch andere Monomere
können in den Polymeren enthalten sein beipielsweise Monomere,
die eine positive Ladung mitbringen wie Trimethlyammonioethyl
methacrylat, Polylysin oder Polyallylamin. Je nach verwendetem
Polymer oder Polymergemisch lassen sich mit Hilfe der erfindungs
gemäßen Schichten herstellen, die es vorteilhaft ermöglichen den
oder die Wirkstoffe so zu formulieren, daß sie gezielt am Wirkort
freigesetzt werden können. So lassen sich Schichten erzeugen die
beispielsweise Magensaft-resistent sind, die sich im Darm auflö
sen, die sich gezielt im Magen auflösen, die durch das Pansenmi
leu nicht aufgelöst werden oder die bei Verbringung in den Körper
den Wirkstoff erst nach einiger Zeit freigeben. In Futter- oder
Nahrungsmitteln kann der Wirkstoff so formuliert werden, daß er
erst nach Aufnahme der Wirkstoffzubereitung in den Körper freige
setzt wird.
Vorteilhaft wird der Wirkstoff oder die Wirkstoffe von einer
oder mehreren über das erfindungsgemäße Verfahren quervernetzten
Proteinschichten umgeben.
Die die Wirkstoffzubereitungen enthaltenden Emulsionen werden
vorteilhaft unter Verwendung von hydrophoben Trennmitteln wie
hydrophobe Kieselsäure, natürliche Stärke, wie z. B. Maisstärke,
hydrophobierte Stärkederivate, wie z. B. hydrophobierte Mais
stärke, Salzen von langkettigen Fettsäuren oder Gemischen aus
diesen Stoffen versprüht. Das Trennmittel kann aber auch in der
Sprühkammer z. B. als hydrophobe Kieselsäurepartikel in Luft oder
Inertgas (z. B. Stickstoff) vorgelegt werden. Anschließend erfolgt
die Trocknung der versprühten Partikel gegebenenfalls nach
Abtrennung der Trennmittel, gegebenenfalls unter leichter
Erwärmung bis 80°C, bevorzugt bis 60°C, besonders bevorzugt bei
Raumtemperatur, durch Behandlung in einem Luft- oder Schutzgas
strom.
Zusätzlich zu den obligatorischen Bestandteilen werden der
Dispersion mit Vorteil noch andere, bei der Herstellung von
Wirkstofftrockenpulvern übliche Verbindungen, zugefügt.
Von besonderer Bedeutung für einen Einsatz der Trockenpulver als
Futtermittelzusatz ist bei oxidationsempfindlichen Wirkstoffen
ein Zusatz von Antioxidantien, wie Ethoxyquin, butyliertes
Hydroxytoluol (BHT), butyliertes Hydroxyanisol (BHA) oder
Tocopherol, sowie Stabilisatoren, wie Ascorbylpalmitat, Mono-
und Diglyceride, Ester von Monoglyceriden mit Essigsäure,
Zitronensäure, Milchsäure, Diacetylweinsäure, Polyglycerinfett
säureester, Sorbitanfettsäureester, Propylenglykolfettsäureester,
Stearoyl-2-Lactylat, Phosphorsäure oder Phytinsäure und deren
Alkali- oder Erdalkalisalze, oder aber Komplexbildner, wie
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Nitrilotriessigsäure
(NTA).
Häufig werden der Emulsion aber auch Feuchthaltemittel, wie
Glycerin, Sorbitol, Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglykole
oder auch zusätzliche Emulgatoren, wie Lecithin, zugefügt.
Darüberhinaus haben sich Zusätze wie Kohlenhydrate wie Zucker,
Stärke oder Stärkederivate insbesondere Maisstärke oder Malto
dextrin oder Dickungsmittel, wie Gummiarabicum, Guargummi,
Traganth, AgarAgar, Carrageenan, Locust-Bean-Gum, Alginate,
Pektine, Xanthan, Curdlan und bestimmte abgebaute Stärken zur
Einstellung der Viskosität der Emulsion als nützlich erwiesen.
Bezüglich näherer Details über Bedeutung, Art und Menge solcher
Zusätze verweisen wir auf entsprechende Fachliteratur, beispiels
weise auf die obengenannte Monographie "Fat-soluble Vitamins",
Vol. 9, insbesondere Seiten 128 bis 133.
Durch diese Zusätze werden die Wirkstoffzubereitungen vorteilhaft
stabilisiert und an die besonderen Darreichungsbedingungen ange
paßt.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geht man bei
spielsweise so vor, daß man zur Herstellung der die Wirkstoffe
enthaltenden Dispersion Gelatine in heißem Wasser (von 50 bis
70°C) zur Lösung bringt, zu dieser Lösung die Zucker, die Amino
verbindungen, die Vitamine und/oder Carotinoide, Stabilisatoren
und die anderen üblichen Zusatzstoffe sowie ggf. noch zusätzlich
Wasser addiert und das Ganze durch kräftiges Rühren bei erhöhter
Temperatur dispergiert. Für die im letzten Verarbeitungsschritt
erfolgende enzymatische Vernetzung des Pulvers sollte die fertige
Dispersion in einem pH-Bereich von 4 bis 10 vorliegen, welcher
durch Zugabe von Basen, wie NaOH, KOH, Ca(OH)2, MgO, Soda oder
NH4OH oder durch Zugabe von basisch reagierenden Salzen wie
Natriumacetat oder Na2HPO4 eingestellt werden kann. Die so herge
stellte Dispersion kann nach üblichen Methoden in ein trockenes
Pulver überführt werden beispielsweise durch Sprühtrocknung,
Sprühgranulation oder sonstige übliche Trocknungsmethoden.
Weitere Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind
beispielsweise die Verwendung der enzymatischen Quervernetzung
bei den unterschiedlichen Mikronisierungsverfahren.
In EP-B-0 065 193 wird beispielsweise ein Verfahren zur
Herstellung von sehr feinverteilten freifließenden Pulvern
der Carotinoide beschrieben, wobei das Carotinoid in einem
flüchtigen, mit Wasser mischbaren organischem Lösungsmittel
bei Temperaturen zwischen 50°C und 200°C, gegebenenfalls unter
erhöhtem Druck, innerhalb einer Zeit von weniger als 10 Sekunden
gelöst wird und anschließend die so erhaltene molekulardisperse
Lösung sofort durch schnelles Mischen mit einer wäßrigen Lösung
eines quellbaren Kolloids bei Temperaturen zwischen 0°C und 50°C
der Wirkstoff in kolloiddisperser Form ausfällt. Die Dispersion
wird anschließend vom Lösungsmittel und dem Dispergiermedium in
üblicher Weise befreit. Als quellbare Kolloide werden Proteine
verwendet. Diese können durch Zugabe der oben genannten Enzyme
im erfindungsgemäßen Verfahren quervernetzt werden. Vorteil
hafterweise werden die Enzyme der wäßrigen Mikronisatlösung vor
dem Trocknungsschritt zugesetzt, damit genügend reaktive Gruppen
für die Vernetzung hergestellt werden, bevor die Trocknung
erfolgt. Weitere Angaben zum Verfahren sind EP-B-0 065 193 zu
entnehmen.
EP-B-0 410 236 beschreibt ein weiteres Verfahren zur Herstellung
einer kolloid-dispersen Carotinoidpräparation, wobei eine Suspen
sion eines Carotinoides in einem hochsiedenden Öl während einer
Zeitdauer von höchstens 30 Sekunden mit überhitztem Wasserdampf
in Kontakt gebracht wird. Anstelle des Öls für das Lösen der
Carotinoide können auch organische Lösungsmittel wie Chloroform,
Methylenchlorid, Tetrachlorkohlenstoff oder Trichlorethylen ver
wendet werden (siehe DE/OS 12 11 911). Anschließend wird das er
haltene Gemisch mit einer wäßrigen Lösung eines Schutzkolloids
emulgiert und die Emulsion danach versprüht und getrocknet.
Auch hier werden als Schutzkolloide Proteine verwendet, die im
erfindungsgemäßen Verfahren über die Zugabe der genannten Enzyme
vor dem Vermischen und Versprühen quervernetzt werden können.
Weitere Angaben zum Verfahren sind EP-B-0 410 236 zu entnehmen.
EP-B-0 498 824 beschreibt ein zusätzliches vorteilhaftes Ver
fahren zur Herstellung von mikrodispersen Wirkstoffzubereitungen.
Dabei wird als Wirkstoff ein Carotinoid in Gegenwart eines
Schutzkolloides beispielsweise eines Proteins wie Gelatine
gemahlen und die gebildete Suspension anschließend getrocknet.
Durch Zusatz der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten
Enzyme lassen sich die Proteine vorteilhaft vernetzen und die
Wirkstoffzubereitung stabilisieren. Nähre Angaben zum Herstell
verfahren sind der genannten Patentschrift und WO 94/19411 zu
entnehmen.
Die anschließende Weiterverarbeitung der Dispersion zu den
erfindungsgemäßen Pulvern kann nach allen literaturbekannten
Verfahren erfolgen.
Wegen der gewünschten Kornverteilung der Pulver (0,1 bis 0,6 mm
Durchmesser) werden solche Verfahren bevorzugt, bei denen Vor
kehrungen getroffen werden, daß die gelierten Tröpfchen der
Dispersion voneinander getrennt bleiben, bis sich ihre Form
stabilisiert hat.
Genannt seien beispielsweise das Verfahren gemäß EP-B1-74050, bei
dem die Dispersion in hydrophobe Kieselsäure oder ein Metallsalz
einer höheren Fettsäure versprüht wird oder aber das Verfahren
gemäß EP-B1 285 682, bei dem die Dispersion in Stärkepulver
versprüht wird. Es hat sich erwiesen, daß insbesondere bei
Verfahren, die für Zubereitungen mit Gelatine-Gehalten unter
35 Gew.-% eingesetzt werden, die Versprühung mit hydrophobierten
Kieselsäuren als Pudermittel besonders vorteilhaft durchführbar
ist.
Die nach den beschriebenen Verfahren erzeugten Pulver besitzen
nach dem Trocknen einen Wassergehalt von weniger als 10%,
normalerweise weniger als 6%. Die so erhaltenen pulverförmigen
Präparate bestehen aus Teilchen mit gut ausgebildeter Oberfläche.
Sie lösen sich in warmem Wasser von ca. 40°C rasch zu einer
milchigen Dispersion.
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffzubereitungen eignen sich vorteil
haft zur Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen, sowie zur
Herstellung von Lebensmittel und Futtermittel.
Der Stamm wurde auf YM-Agar kultiviert:
3 g/l | Malt Extract Difco |
5 g/l | Pepton Difco |
3 g/l | Yeast Extract Difco |
20 g/l | Agar Difco |
Die Platten wurden bei 28°C für 48 h bebrütet und sind danach
bei 45°C für mindestens 4 Wochen haltbar.
10 g/l Glucose (30 min. bei 121°C autoklavieren)
separat ansetzen und 30 min bei 121°C autoklavieren:
separat ansetzen und 30 min bei 121°C autoklavieren:
0.2 g/l Magnesiumsulfat × 7 H2O
3.0 g/l Kaliumdihydrogenphosphat
0.2 ml/l Salzlösung nach Vishniac & Santer*
3.0 g/l Kaliumdihydrogenphosphat
0.2 ml/l Salzlösung nach Vishniac & Santer*
separat ansetzen und sterilfiltrieren:
10 ml/l Vitaminlösung nach Lodder**
Die Mediumsbestandteile werden nach der Sterilisation vereinigt.
* Rezeptur der Salzlösung. Nach Vishniac & Santer
50 g/l Titriplex III
22 g/l Zinksulfat × 7 H2O
5.54 g/l Calciumchlorid
5.06 g/l Manganchlorid × 4 H2O
4.99 g/l Eisensulfat × 7 H2O
1.1 g/l Ammoniumheptamolybdat × 4 H2O
1.57 g/l Kupfersulfat × 5 H2O
1.61 g/l Cobaltchlorid × 6 H2O
22 g/l Zinksulfat × 7 H2O
5.54 g/l Calciumchlorid
5.06 g/l Manganchlorid × 4 H2O
4.99 g/l Eisensulfat × 7 H2O
1.1 g/l Ammoniumheptamolybdat × 4 H2O
1.57 g/l Kupfersulfat × 5 H2O
1.61 g/l Cobaltchlorid × 6 H2O
mit KOH auf pH 6.0 einstellen
** Rezeptur der Vitaminlösung nach Lodder
20 µg/l Biotin
20 000 µg/l Ca-pantothenat
2 µg/l Folsäure
10 000 µg/l Inositol
200 µg/l p-Aminobezoesäure
400 µg/l Niacin (Nicotinsäure)
400 µg/l Pyridoxinhydrochlorid
200 µg/l Riboflavin
400 µg/l Thiaminhydrochlorid
20 000 µg/l Ca-pantothenat
2 µg/l Folsäure
10 000 µg/l Inositol
200 µg/l p-Aminobezoesäure
400 µg/l Niacin (Nicotinsäure)
400 µg/l Pyridoxinhydrochlorid
200 µg/l Riboflavin
400 µg/l Thiaminhydrochlorid
Für einen 10 l-Fermenter wurden 2 × 250 ml Vorkultur (= VK) im
1 l-Erlenmeyerkolben (= EMK) mit jeweils 3-4 Platinösen Lu 583
beimpft und 24 h bei 28°C und 200 Upm inkubiert.
Ansatz im 10 l-Infors-Fermenter mit folgenden Bedingungen:
Temperatur: 28°C
Belüftung: 5 l/min. über Ringbegasung
Drehzahl: 400 Upm.
Fermenterbestückung: 3 × Standardrührblätter sowie eingebaute Wellenbrecher
Belüftung: 5 l/min. über Ringbegasung
Drehzahl: 400 Upm.
Fermenterbestückung: 3 × Standardrührblätter sowie eingebaute Wellenbrecher
Vor dem Start der Fermentation wurde durch die Zugabe von 50%iger
(V/V) n-Butylaminlösung in Wasser der pH auf ca. 7.0 eingestellt.
Anschließend wurde der Fermenter mit 2 × 250 ml Vorkultur
beimpft. Die Fermentationsdauer betrug etwa 28-30 h. Der Zeit
punkt des Fermentationsendes wurde über die Bestimmung der OD bei
600 nm festgelegt. Die OD 600 der Fermenterproben wurde dabei
gegen Luft gemessen und sollte bei 0.9-1.0 liegen. Bei höherer
OD nimmt die Aktivität des Enzyms schnell ab.
Der Fermenterinhalt wurde in einer Hereaus Cryofuge 8000 bei 45°C
und 5000 Upm (entspricht ca. 9500 × g) 20 min. zentrifugiert. Die
gesamte Biofeuchtmasse wurde in 250 ml 50 mM Kaliumphosphatpuffer
gewaschen und erneut zentrifugiert. Die Zellmasse kann bei -15°C
im Tiefkühlschrank gelagert werden.
Die Biofeuchtmasse (100 ml) wurde mit 100 ml Glasperlen (Durch
messer 0,5 mm) in der Kugelmühle unter Eiskühlung 30 Minuten
bei 5000 Umdrehungen pro Minute zerkleinert. Das Homogenat wurde
über Gaze filtriert und dann für 10 Minuten bei 10 000 rpm und
4°C zentrifugiert. Die Aktivität des Überstandes wurde
durch einen HPLC-Test ermittelt. Die Lysyloxidase wandelt Benzyl
amin in Benzaldehyd um (Detektion bei 250 nm). Die Menge an
entstandenem Benzaldehyd wurde über eine Eichkurve ermittelt.
Puffer A: Wasser, 0,1% TFA
Puffer B: Acetonitril, 0,1% TFA
Puffer B: Acetonitril, 0,1% TFA
0 Minuten 40% B
6 Minuten 70% B
6,1 Minuten 100% B
6,5 Minuten 100% B
Fluß 1 ml/min
6,5-9 min zurück auf 40% B, Fluß 1,5 ml/min
6 Minuten 70% B
6,1 Minuten 100% B
6,5 Minuten 100% B
Fluß 1 ml/min
6,5-9 min zurück auf 40% B, Fluß 1,5 ml/min
Die Lysyloxidase enthaltenden Überstände von 7 × 10 l Fermentern
wurden gesammelt und vereinigt. Es ergab sich eine Aktivität von
125,5 U/l in 1, 8 l.
Gelatine (10 g) wurde in 50 mM Natriumboratpuffer pH 9,0 gelöst.
Der pH wurde kontrolliert und mit 0,5 M NaHCO3 nachgestellt. Die
Fluoreszenzfarbstoffe Cy-5 oder Bodipy 630/650-X, SE) wurden in
5 ml DMSO (= Dimethylsulfoxid) gelöst und in einem Gewichtsver
hältnis von 1 : 100 den Proteinen zugesetzt. Während 16 Stunden bei
Raumtemperatur reagierten die Succinimidylester der Farbstoffe
mit den freien Aminogruppen der Proteine. Die Reaktionsansätze
wurden dann 5 mal gegen große Volumina 20 mM Natriumphosphat
puffer mit 0,01% Azid dialysiert und bei -20 Grad Celsius als
1%ige Proteinlösung gelagert.
In einem 4 l-Rührkolben wurden in 1800 ml einer Lösung, bestehend
aus vereinigten Überständen von Lysyloxidase-Fermentations
lösungen (ZH 29303/5; 125,5 U/l) bei 40°C 454 g Gelatine A 100
Bloom durch Rühren in Lösung gebracht. Dazu wurde mit Bodipy
dotierte Gelatine (siehe oben) gegeben. Der gesamte Ansatz wurde
48 h bei 40°C gerührt, wobei der Kolben nicht geschlossen wurde,
um einen dauernden Luftzutritt und damit den Zutritt von Sauer
stoff zu ermöglichen.
Es wurden aus der Lösung in den angegebenen zeitlichen Abständen
Proben à 300 g entnommen:
Probe 1: sofort nach Beginn des Versuchs
Probe 2: nach 2 Std.
Probe 3: nach 5 Std.
Probe 4: nach 24 Std.
Probe 5: nach 29 Std.
Probe 6: nach 48 Std.
Probe 2: nach 2 Std.
Probe 3: nach 5 Std.
Probe 4: nach 24 Std.
Probe 5: nach 29 Std.
Probe 6: nach 48 Std.
Die Proben wurden wie folgt aufgearbeitet:
- a) 200 g wurden mit einer Einstoffdüse direkt in eine Wolke aus hydrophobierter Kieselsäure (Sipernat D 17) zu Partikeln von ca. 200 µm Durchmesser versprüht. Das erhaltene feuchte Produkt wurde geteilt; eine Hälfte wurde bei Raumtemperatur und die andere bei 80°C jeweils auf einer Nutsche im Luft strom getrocknet.
- b) Die restlichen 100 g wurden nach Zusatz von Vitamin A,
Isosweet und Maisstärke nach Einemulgierung der Öl-Phase
mit einem Ultraturrax-Gerät in gleicher Weise versprüht
und durch Trocknung des Sprühproduktes bei Raumtemperatur
in ein Trockenpulver umgewandelt. Diese Produkte hatten
etwa folgende Zusammensetzung:
25% Vitamin A-Acetat stab. mit Ethoxyquin und BHT
30% Gelatine A 100 Bloom
25% Maisstärke
15% Isosweet
Rest: Wasser + Sipernat D 17 + Reste aus Fermentations rückstand
Die FCS ist eine Methode, die auf der Anzahlfluktuations-
Spektroskopie beruht. Mit der FCS können Diffusionskoeffizienten
und Anzahlkonzentrationen fluoreszierender Moleküle in hochver
dünnter Lösung gemessen werden. Die Fig. 1 und 2 zeigen den
Aufbau einer FCS-Apparatur und ihr Funktionsprinzip. Dabei wird
ein Laserstrahl über ein Mikroskopobjektiv in ein sehr kleines
Volumen einer flüssigen Probe fokussiert und die darin angeregte
Fluoreszenz gemessen.
Fig. 1 zeigt eine FCS-Apparatur. Der fokussierte Laserstrahl und
die konfokalen Blenden definieren ein sehr kleines Beobachtungs
volumen (das konfokale Volumen) in der Probe. Die zeitlichen
Schwankungen der Fluoreszenz aus diesem Volumen werden mit einem
Korrelator analysiert.
Fig. 2: (= Anzahlfluktuationen im Beobachtungsvolumen führen zu
Fluktuationen des FCS-Signals I(t). Aus der Autokorrelations
funktion G(t) des FCS-Signals können die mittlere Verweilzeit τ
(= mittlere Zeit für die Diffusion eines Teilchens durch das
Beobachtungsvolumen) und die Zahl der Moleküle N im Meßvolumen
abgelesen werden. τ ist direkt proportional zur Größe der
fluoreszierenden Moleküle.
Das Volumen ist dabei so klein, daß sich darin im Mittel nur
wenige Teilchen befinden. Die Teilchenzahl im Volumen schwankt
durch Diffusion ständig um einen mittleren Wert N. Damit schwankt
auch die Fluoreszenzintensität I(t) um einen mittleren Wert Im.
Aus den Schwankungen der Fluoreszenz lassen sich die Diffusions
zeit τ (proportional zur Molekülgröße) und die Anzahlkonzentration
der fluoreszierenden Moleküle berechnet (siehe Fig. 1).
Die Bestimmung der Molekulargewichtsverteilung (MGV) erfolgte
mittels GPC. Die wichtigsten Versuchsparameter:
Säule: TSK Gel, 4000 SWXL, 250.4 mm
Laufmittel: 0,01 M NaH2PO4, 0,1 M Na2SO4, 1% SDS
pH: 5,3
Temperatur: 30°C
Fluß: 0,5 ml/min
Detektion: UV-Spektrometer, 220 nm
Laufmittel: 0,01 M NaH2PO4, 0,1 M Na2SO4, 1% SDS
pH: 5,3
Temperatur: 30°C
Fluß: 0,5 ml/min
Detektion: UV-Spektrometer, 220 nm
Zur Probenvorbereitung wurden jeweils ca. 0,5 g Substanz in
100 ml Laufmittel für 15 min bei T = 60°C gerührt. Die so er
haltene trübe Lösung wurde durch einen 0,2 µm-Filter filtriert
und anschließend in die Probenschleife des GPC-Gerätes injiziert
(ca. 20 µl). Nicht wasserlösliche Gelatine-Bestandteile konnten
nicht detektiert werden.
Als direkte Meßgröße erhielt man bei dieser Methode das Intensi
tätssignal des Detektors (Maß für die Konzentration) als Funktion
der Elutionszeit. Bei der GPC wurden die Moleküle nach ihrem
hydrodynamischen Radius rH getrennt. Moleküle mit großem rH
werden dabei schneller eluiert als Moleküle mit kleinem rH.
Über eine Kalibrierung mit Standard-Polymeren (hier: Pullul
standards) konnte aus den Elutionsdiagrammen MGV berechnet werden
[siehe M. D. Lechner, K. Gehrke und E. H. Nordmeier, in: "Makro
molekulare Chemie", Kapitel 4.3.6.1., Birkhäuser Verlag (1996)].
Zwischen der Elutionszeit tE und der Molmasse M der Pullul
standards gilt in erster Näherung folgende Proportionalität:
tE ∞ log(M) (1)
Exakter lassen sich bei einer Auftragung von tE vs. log(M) die
Daten jedoch mit einem Polynom dritten Grades beschreiben. Aus
der Inversen dieses Polynoms können aus den Gelatine-Elutions
zeiten Gelatine-Molekulargewichte berechnet werden. Die so
erhaltenen Molekulargewichte sind somit keine absoluten Gelatine-
Molekulargewichte (wie sie z. B. aus der LS erhalten werden
können), sondern lediglich relative Molekulargewichte (bezogen
auf die hier verwendeten Standards). Weiterhin ist zu beachten,
daß aufgrund der zur Verfügung stehenden Pullulstandards die
Elugramme nur im Bereich von 12 min < t < 25 min (∼ 103 g/mol < MG
< 107 g/mol) sinnvoll in die entsprechenden Molekulargewichte um
gerechnet werden können. Annähernd [siehe Gleichung (1)] ist bei
einer halblogarithmischen Auftragung (tE vs. log(M)) die Fläche
unter der Kurve der untersuchten Substanzmenge proportional. Die
Elutionsdiagramme wurden auf gleiche Gesamtflächen normiert, so
daß die Flächen unter den Kurven - und somit die jeweiligen Sub
stanzmengen - direkt miteinander verglichen werden konnten.
Folgende Beobachtungen wurden gemacht: Mit zunehmender Dauer der
Inkubation der markierten Gelatine mit der unmarkierten Gelatine
und der Lysyloxidase wurde der Wert τ (proportional zur Molekül
größe) bei Messungen durch die FCS immer kleiner und gleichzeitig
nahm die Intensität (I,kcps) der Fluoreszenz ab (Tabelle 1,
Fig. 3).
Weiterhin wurde in der GPC mit zunehmender Inkubationszeit
eine Abnahme der hochmolekuaren Gelatine-Anteile beobachtet
(Tabelle 2, Fig. 4).
Durch die Inkubation der Gelatine mit Lysyloxidase wurde die
Gelatine vernetzt. Diese vernetzten Anteile konnten in Wasser
nicht mehr vollständig gelöst werden, sondern lagen als ge
quollene Gelpartikel vor. Bei der FCS- und GPC-Probenpräparation
wurden diese Partikel durch Zentrifugation oder Filtration abge
trennt und konnten nicht mehr detektiert werden.
Mit zunehmender Inkubationszeit der Gelatine verschwanden bevor
zugt die hochmolekularen Gelatine-Anteile aus dem Elugramm. Dies
bedeutet, daß gerade die hochmolekularen Gelatine Anteile über
proportional von der Vernetzung betroffen sind. Aus statistischen
Gründen ist dieses Verhalten durchaus sinnvoll. Darüberhinaus
konnte aber auch eine molekulargewichtsabhängige Verteilung der
Lysingruppen für diesen Befund mit verantwortlich sein.
Die Abnahme von τ durch FCS-Messungen ist als Abnahme des Mole
kulargewichts zu interpretieren und konnte durch Gel-Permeations-
Chromatographie direkt gezeigt werden. Die Abnahme der Intensität
ist auf die Abnahme der Anzahl fluoreszenter Teilchen im Über
stand der rückgelösten Präparate zurückzuführen. Durch Querver
netzung wurden große Gelatinemoleküle mit höherer Wahrscheinlich
keit betroffen als kleine Moleküle. Außerdem können kleine Mole
küle das durch die Wirkung der Lysyloxidase entstandene Netzwerk
besser verlassen als unvernetzte, große Gelatinemoleküle, die im
unlöslichen Teil zurückbleiben.
Damit konnte gezeigt werden, daß durch die Lysyloxidase eine für
eine Quervernetzung ausreichende Zahl von Allysinen und später
Schiff'sche Basen gebildet werden.
Gelatine wurde mit 1 mM/l N-Hydroxysuccinimid aktiviertem Biotin
bei pH 8,4 in einem Boratpuffer markiert und anschließend gegen
einen 20 mM Phosphatpuffer pH 7,4 mehrfach dialysiert. Die Fähig
keit der so modifizierten Gelatine, Avidin oder Streptavidin zu
binden, konnte in Vorversuchen gezeigt werden. 10 und 100 mg/ml
Gelatine binden nach Biotin-Modifikation an die mit Avidin modi
fizierte Oberfläche eines Biacore-Sensorchips. Nicht modifizierte
Gelatine wurde nicht an diese Oberfläche gebunden.
Gelatine wurde an die Oberfläche von Mikrotiterplatten adsor
biert. Danach wurde Biotin-markierte Gelatine und die querver
netzende Substanz/Enzym zugefügt. Adsorbierte Gelatine wurde
mit biotinylierter Gelatine vernetzt. Nach einem intensiven
Waschschritt wurde die Biotinylierung durch einen Streptavidin-
Peroxidase-Komplex nachgewiesen.
0,4 ml einer 1%igen Gelatinelösung in 0,1 M NaHCO3, pH 9,2 wurde
für 3 Stunden bei Raumtemperatur an NUNC MaxiSorp Elisaplatten
adsorbiert. Danach wurde dreimal mit PBS, 0,05% Tween 20 Lösung
gewaschen.
Danach wurde biotinylierte Gelatine und in verschiedenen
Konzentrationen Quervernetzer zugegeben. Dies wurde in einem
PBS Puffer mit 5 mM DTT und 0,1% Tween 20 durchgeführt. Die
Mikrotiterplatten wurden anschließend für verschiedene Zeiten
bei verschiedenen Temperaturen inkubiert. Danach wurden die
Platte 6 mal gewaschen, um nicht-umgesetztes Material zu ent
fernen.
Zum Nachweis wurde Streptavidin-Peroxidase der Firma Boehringer
1 : 10 000 in PBS, 0,1% Tween 20 verdünnt und 1 ml pro Well zuge
geben. Es wurde erneut 30 Minuten bei Raumtemperatur (ca. 23°C)
inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurden 0,015 ml Reak
tionsgemisch (0,1 ml 42 mM Tetramethylbenzidin in DMSO, 10 ml
0,1 M Natriumacetat, pH 4,9 mit Zitronensäure eingestellt) zuge
geben. Es bildete sich eine blaue Farblösung im Laufe der Reak
tion. Die Reaktion wurde nach 5 Minuten mit 0,1 ml 2 M Schwefel
säure gestoppt. Die blaue Farbe wurde dabei gelb. Anschließend
erfolgte die Messung der Absorption bei 450 nm.
Die Zellen von Pichia pastoris (ca. 18 ml) wurden nach Lagerung
bei -20 Grad C aufgetaut und mit Puffer A (20 mM Natrium
phosphat, 1 mM Ethanolamin, pH 7,0 auf 50 ml verdünnt. Es wurden
50 ml Glasperlen, Durchmesser 0,5 mm, zugegeben und 30 Minuten
bei 5000 U/min unter Kühlung durch Eis homogenisiert. Das Homo
genat wurde über Gaze filtriert. Das Filtrat wurde 10 Minuten bei
8000 rpm und 4 Grad C zentrifugiert.
Der Überstand wurde mit NaOH auf pH 7,0 erneut eingestellt
und auf eine Q-Sepharose aufgetragen (Q-Sepharose Fast Flow,
Pharmacia, Durchmesser 5 cm, Höhe 13 cm, Volumen 250 ml). Nach
dem Auftrag (Leitfähigkeit 0,7 mS/cm, 540 ml) wurde mit 600 ml
Puffer A gewaschen. Die Säule wurde mit einem linearem Gradient
von 1 l Puffer A und 1 l Puffer B (wie Puffer A mit 1 M NaCl)
eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt.
Die Wertfraktion wurde nach Konzentrierung über einen 10 kDa-
Omega-Filter auf einer präparativen Superdex-Säule (Pharmacia,
Durchmesser 2,6 cm, Länge 60 cm Volumen 320 ml) in 20 mM Natrium
phosphatpuffer, 150 mM NaCl, 1 mM Ethanolamin, pH 7,5 getrennt.
Fluß 3 ml/Minute. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt.
Die Wertfraktion der Molekularsiebohromatographie wurde erneut
durch Chromatographie an einer Mono-Q-Säule gereinigt (Pharmacia,
HR5/5). Der Gradient wurde aus Puffer A und Puffer B erzeugt.
Flußgeschwindigkeit 1 ml/Minute, 100 Fraktionen zu je 1 ml. Die
Lysyloxidase eluierte als aktives Hauptprotein. Das Protein hatte
im SDS-Gel unter reduzierenden Bedingungen ein Molekulargewicht
von ca. 121 000 Da.
Folgende Sequenzen wurden erhalten:
Aminoterminale Sequenz
G(S)(C)Q(C)KTNEKVNIEAPKPNI(C)DT(L)(S)
Sequenzen, die Peptiden des Proteins entsprechen, die nach einem
Verdau mit Trypsin erhalten wurden:
EYP(C)APGVVYNTK
GGTYSTVTQNPTLNR
DYNIMPGGGXVHR
ATGGTYSTVXAQN
APETENNAR
GPL(P)VNE(E)TTIEPLSFYNT
IYELSLQELIAEYGSDDPNNQHTFYSDI
DNVDDLSCTIIQR
VAPETENCAR
NVDVEYPCAPGVVYNTK
GYPNAEY(S)LDF/ER
EYP(C)APGVVYNTK
GGTYSTVTQNPTLNR
DYNIMPGGGXVHR
ATGGTYSTVXAQN
APETENNAR
GPL(P)VNE(E)TTIEPLSFYNT
IYELSLQELIAEYGSDDPNNQHTFYSDI
DNVDDLSCTIIQR
VAPETENCAR
NVDVEYPCAPGVVYNTK
GYPNAEY(S)LDF/ER
Claims (20)
1. Verfahren zur Herstellung von Wirkstoffzubereitungen, in
denen ein oder mehrere Wirkstoffe von mindestens einer
Schicht umgeben sind, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens
eine der den oder die Wirkstoffe umgebenden Schichten oder
Teile dieser Schichten aus einem Protein bestehen, das mit
einem Enzym ausgewählt aus der Gruppe der Lipoxygenasen,
Proteindisulfidisomerasen, Phenoloxidasen und Peroxidasen,
Lysyloxidasen, Proteindisulfidreduktasen, Tyrosinoxidasen
oder Sulfhydryloxidasen quervernetzt wurde.
2. Verfahren zur Herstellung von Wirkstoffzubereitungen nach
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der oder die Wirk
stoffe oder ein oder mehrere mit mindestens einer Schicht
umgebende Wirkstoffe in Lösung mit vernetzbarem Protein und
Enzym zur Beschichtung gemischt wird, wobei das Gewichts
verhältnis zwischen Wirkstoff und Protein zwischen 1 zu 100
und 5 zu 1 liegt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß
als Wirkstoff Vitamine, Enzyme, Lebensmittelzusatzstoffe oder
Futtermittelzusatzstoffe verwendet werden.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeich
net, daß der Wirkstoff hydrophob ist.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeich
net, daß ein vernetzbares Protein ausgewählt aus der Gruppe
Gelatine, Kasein, Sojaprotein, Weizenprotein, Maisprotein
oder Kollagen verwendet wird.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeich
net, daß ein aus Mikroorganismen gewonnenes Enzym verwendet
wird.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeich
net, daß die Quervernetzung mit dem Enzym Lysyloxidase durch
geführt wird.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeich
net, daß man mindestens einen Wirkstoff mit einer wäßrigen
Lösung aus vernetzbarem Protein und Enzym durchmischt und
versprüht.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß in
einer mit hydrophober Kieselsäure, Maisstärke oder hydro
phobierte Maisstärke beladenen Atmosphäre versprüht wird.
10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeich
net, daß die Wirkstoffzubereitung bis zu einer Restfeuchte
unter 10 Gew.-% getrocknet wird.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeich
net, daß die Temperatur bei der Herstellung der Wirkstoff
zubereitung im Wesentlichen unter 80°C gehalten wird.
12. Wirkstoffzubereitung erhältlich nach einem Verfahren gemäß
den Ansprüchen 1 bis 11.
13. Wirkstoffzubereitung enthaltend mindestens eine einen oder
mehrere Wirkstoffe umgebende Schicht oder Teile einer Schicht
aus einem Protein, das mit einem Enzym ausgewählt aus der
Gruppe der Lipoxygenasen, Proteindisulfidisomerasen, Phenol
oxidasen und Peroxidasen, Lysyloxidasen, Proteindisulfid
reduktasen, Tyrosinoxidasen oder Sulfhydryloxidasen quer
vernetzt wurde.
14. Wirkstoffzubereitung nach Anspruch 13, wobei die Wirkstoffe
ausgewählt sind aus der Gruppe:
Carotinoide
Xanthophylle
Vitamin A
Vitamin E
Vitamin D3
Vitamin K1
Carotinoide
Xanthophylle
Vitamin A
Vitamin E
Vitamin D3
Vitamin K1
15. Wirkstoffzubereitung nach Anspruch 13 oder 14, die den
0,025-fachen bis 4-fachen Gewichtsanteil bezüglich Wirk
stoff an Trennmittel oder Trennmittelgemischen enthält.
16. Wirkstoffzubereitung nach den Ansprüchen 13 bis 15, wobei
der Wirkstoffgehalt in der Wirkstoffzubereitung zwischen
1 bis 75 Gew.-% liegt.
17. Ein isoliertes Protein, das mindestens eine der folgenden
Aminosäuresequenzen enthält
G(S)(C)Q(C)KTNEKVNIEAPKPNI(C)DT(L)(S)
EYP(C)APGVVYNTK
GGTYSTVTQNPTLNR
DYNIMPGGGXVHR
ATGGTYSTVXAQN
APETENNAR
GPL(P)VNE(E)TTIEPLSFYNT
IYELSLQELIAEYGSDDPNNQHTFYSDI
DNVDDLSCTIIQR
VAPETENCAR
NVDVEYPCAPGVVYNTK
GYPNAEY(S)LDF/ER
und das die ε-Aminogruppen des Lysins zu Aldehydgruppen oxidieren kann.
G(S)(C)Q(C)KTNEKVNIEAPKPNI(C)DT(L)(S)
EYP(C)APGVVYNTK
GGTYSTVTQNPTLNR
DYNIMPGGGXVHR
ATGGTYSTVXAQN
APETENNAR
GPL(P)VNE(E)TTIEPLSFYNT
IYELSLQELIAEYGSDDPNNQHTFYSDI
DNVDDLSCTIIQR
VAPETENCAR
NVDVEYPCAPGVVYNTK
GYPNAEY(S)LDF/ER
und das die ε-Aminogruppen des Lysins zu Aldehydgruppen oxidieren kann.
18. Verwendung eines Enzyms ausgewählt aus der Gruppe der
Lipoxygenasen, Proteindisulfidisomerasen, Phenoloxidasen
und Peroxidasen, Lysyloxidasen, Proteindisulfidreduktasen,
Tyrosinoxidasen oder Sulfhydryloxidasen zur Formulierung
von Wirkstoffzubereitungen.
19. Lebensmittel oder Futtermittel, enthaltend eine Wirkstoff
zubereitung nach den Ansprüchen 13 bis 16.
20. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend eine Wirkstoff
zubereitung nach den Ansprüchen 13 bis 16.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19840489A DE19840489A1 (de) | 1998-09-04 | 1998-09-04 | Wirkstoffzubereitungen sowie ein Verfahren zu deren Herstellung |
EP99117095A EP0988859A1 (de) | 1998-09-03 | 1999-08-31 | Wirkstoffzubereitungen sowie ein Verfahren zu deren Herstellung |
JP11250617A JP2000189064A (ja) | 1998-09-03 | 1999-09-03 | 活性成分配合物の製造方法、活性成分配合物、単離タンパク、酵素の使用、食物材料、飼料材料、および医薬組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19840489A DE19840489A1 (de) | 1998-09-04 | 1998-09-04 | Wirkstoffzubereitungen sowie ein Verfahren zu deren Herstellung |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19840489A1 true DE19840489A1 (de) | 2000-03-09 |
Family
ID=7879883
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE19840489A Withdrawn DE19840489A1 (de) | 1998-09-03 | 1998-09-04 | Wirkstoffzubereitungen sowie ein Verfahren zu deren Herstellung |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19840489A1 (de) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10008594A1 (de) * | 2000-02-22 | 2001-08-23 | Zeiss Carl Jena Gmbh | Verfahren und Anordnung zur Detektion des von einer Probe kommenden Lichtes |
DE10350484A1 (de) * | 2003-12-20 | 2005-07-28 | Ehrfeld Mikrotechnik Bts Gmbh | Verfahren zur Markierung von Proteinen |
US9226515B2 (en) | 2004-02-03 | 2016-01-05 | Cargill, Incorporated | Protein concentrate and an aqueous stream containing water-soluble carbohydrates |
-
1998
- 1998-09-04 DE DE19840489A patent/DE19840489A1/de not_active Withdrawn
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US7456026B2 (en) | 2000-02-22 | 2008-11-25 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Imaging fluorescence correlation spectroscopy for analysis of molecular interactions in low volumes |
DE10008594B4 (de) | 2000-02-22 | 2018-09-20 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Einrichtung und Verfahren zur ortsaufgelösten Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie |
DE10350484A1 (de) * | 2003-12-20 | 2005-07-28 | Ehrfeld Mikrotechnik Bts Gmbh | Verfahren zur Markierung von Proteinen |
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US9226515B2 (en) | 2004-02-03 | 2016-01-05 | Cargill, Incorporated | Protein concentrate and an aqueous stream containing water-soluble carbohydrates |
US10154679B2 (en) | 2004-02-03 | 2018-12-18 | Cargill, Incorporated | Protein concentrate and an aqueous stream containing water-soluble carbohydrates |
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