DE19827140C2

DE19827140C2 - Laserscanmikroskop mit AOTF

Info

Publication number: DE19827140C2
Application number: DE19827140A
Authority: DE
Inventors: Ulrich Simon; Stefan Wilhelm
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Jenoptik AG
Priority date: 1998-06-18
Filing date: 1998-06-18
Publication date: 2002-12-12
Anticipated expiration: 2018-06-19
Also published as: DE19827140A1; US6848825B1; DE19861383B4; JP2000047117A

Description

Es ist bereits bekannt, in einem Laser-Scanning-Mikroskop Laser unterschiedlicher Wellenlängen über Strahlteiler zusammenzuführen und über einen AOTF mit einem über Brechungsindexvariation realisierten Gitter, dessen Gitterkonstante entsprechend seiner hochfrequenten Ansteuerung variabel ist, in eine Lichtleitfaser einzukoppeln.

In DE 196 33 185 A1 ist beispielsweise vor der Einkopplung in das Mikroskop ein AOTF vorgesehen. US 4536062 betrifft die Anordnung eines Lasers in einem "heat sink" um seine Temperaturabhängigkeit auszugleichen, mit einer Bragg-Zelle oder einem AOM zur Strahlablenkung. In DD 239 699 A1 wird eine thermische Stabilisierung eines akustooptischen Modulators (AOM) beschrieben. US 5444528 beschreibt ein Spektrometer mit temperaturkontrolliertem AOTF und einer Weisslichtquelle.

Die durch den AOTF in erster Ordnung gebeugte Wellenlänge sowie die Intensität werden durch Ansteuerung des AOTF eingestellt, die Intensität über die Amplitude der Schallwelle und die Wellenlänge über die Frequenz der Schallwelle.

Die Verwendung von Akustoptik zur Linienselektion und Abschwächung von Laserlinien in einem modularen Aufbau hat den Nachteil, daß die Transmissionseigenschaften der akustoptischen Einheit stark temperaturabhängig sind.

Dies ist dadurch zu erklären, daß es mit Änderung der Temperatur zu einer Änderung der Schallgeschwindigkeit im Kristallmaterial kommt, die sich indirekt in einer Abweichung von der optimalen Frequenz und damit in einer Abnahme der Beugungseffizienz bemerkbar macht. Eine Frequenzverschiebung von ca. 16 KHz/°C wurde ermittelt.

Das führt zu Intensitätsverlusten und zu möglichen Intensitätsmodulationen im gescannten Bild. Wurde der AOTF beispielsweise auf 21°C abgestimmt, fällt bei einem Temperaturwechsel von 21°C auf 35°C die transmittierte Leistung ohne Korrekturmaßnahmen auf ca. 5% des Ausgangswertes ab. Selbst bei einer Temperaturänderung von nur 4°C kommt es zu einem Leistungsabfall um ca. 50%.

Eine akzeptable Performance des Laser-Scanning-Mikroskopes ist nur zu gewährleisten, wenn die Temperaturschwankungen auf +/-1°C eingegrenzt werden können.

Dies ist jedoch in der Praxis durch die vielfältigen Einsatzmöglichkeiten des Laser-Scanning-Mikroskopes kaum möglich.

Raumtemperaturen < 30°C werden darüber hinaus in vielen Labors schnell erreicht.

Die Erfindung hat daher die Aufgabe, die Intensitätskonstanz für alle Laserlinien unabhängig von den Aufstellbedingungen zu gewährleisten.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Merkmale der unabhängigen Patentansprüche 1 und 2 gelöst.

Vorteilhaft kann die AOTF-Frequenz über die Ansteuerung des AOTF durch eine Treiberschnittstelle in Abhängigkeit von der Temperatur gesteuert werden.

Die Temperaturerfassung kann hierzu in unmittelbarer Nähe des AOTF, beispielsweise direkt an seinem Gehäuse erfolgen.

Falls eine Temperaturabweichung von größer +/-1°C von einem vorgegebenen Referenzwert festgestellt wird, erfolgt eine automatische Frequenznachstellung innerhalb eines vorgegebenen Freuquenzfensters, vorzugsweise +/-200 KHz, um die bei dem Referenzwert (Temperatur) festgelegte Frequenz. Die Frequenz kann auch anhand vorher aufgenommener und tabellarisch abgespeicherter, temperaturabhängiger Frequenzwerte eingestellt werden.

Die Temperaturabweichung kann auch durch eine Intensitätserhöhung ausgeglichen werden, die den Effizienzverlust des AOTF ausgleicht.

Das dargestellte LSM realisiert auf dem VIS-Lasermodul im Extremfall die Vereinigung von einem Ar-Laser (458 nm, 488 nm, 514 nm) bzw. ArKr-Laser (488 nm, 568 nm) mit jeweils zwei HeNe-Lasern. Die Laserlinien werden über Dichroite und Spiegel auf eine gemeinsame Achse vereinigt, in einem AOTF selektiert und die erste Beugungsordnung des VIS-AOTF wird in eine Single Mode Faser gekoppelt. Auf dem UV-Lasermodul erfolgt die Selektion der Laserlinien 351 nm und 364 nm über einen UV-AOTF; die erste Beugungsordnung wird ebenfalls in eine Single Mode Faser eingekoppelt.

Die Erfindung wird nachstehend anhand der schematischen Darstellungen näher erläutert.

Es zeigen:

Fig. 1 den Strahlengang eines Laser-Scanning-Mikroskopes

Fig. 2 den beheizbaren AOTF in einem seitlichen Teilschnitt und in räumlicher Darstellung

In Fig. 1 sind schematisch eine Mikroskopeinheit M und ein Scankopf S dargestellt, die eine gemeinsame optische Schnittstelle über eine Zwischenabbildung Z gemäß Fig. 2 ausweisen.

Der Scankopf S kann sowohl an den Phototubus eines aufrechten Mikroskopes oder auch an einen seitlichen Ausgang eines inversen Mikroskopes angekoppelt sein.

In Fig. 1 ist ein zwischen Auflichtscan und Durchlichtscan mitttels eines schwenkbaren Spiegels 14 umschaltbarer, mikroskopischer Strahlengang dargestellt, mit Lichtquelle 1, Beleuchtungsoptik 2, Strahlteiler 3, Objektiv 4, Probe 5, Kondensor 5, Lichtquelle 7, Empfängeranordnung 8, einer ersten Tubuslinse 9, einem Beobachtungstrahlengang mit einer zweiten Tubuslinse 10 und einem Okular 11 sowie einem Strahlteiler zur Einkopplung des Scanstrahls.

Ein Lasermodul 13.1, 13.2 nimmt die Laser auf und ist über Monomode-Lichtleitfasern 14.1, 14.2 mit der Lasereinkoppeleinheit des Scankopfes S verbunden.

Die Einkopplung der Lichtleitfasern 14.1, 14.2 erfolgt mittels einer verschieblichen Kollimationsoptik 16, auf die noch näher eingegangen wird, sowie Strahlumlenkelementen 17.1, 17.2.

Mittels eines teildurchlässigen Spiegels 18 wird ein Überwachungsstrahlengang in Richtung einer Monitordiode 19, der vorteilhaft auf einem nicht dargestellten drehbaren Filterrad Linienfilter 21 sowie Neutralfilter 20 vorgeordnet sind, ausgeblendet. Die eigentliche Scaneinheit besteht aus Scanningobjektiv 22, Scanner 23, Hauptstrahlteiler 24 und einer gemeinsamen Abbildungsoptik 25 für Detektionskanäle 26.1-26.4.

Ein Umlenkprisma 27 hinter der Abbildungsoptik 25 spiegelt die vom Objekt 5 kommende Strahlung in Richtung dichroitischer Strahleiler 28 im konvergenten Strahlengang der Abbildungsoptik 25, denen in Richtung und senkrecht zur optischen Achse verstellbare und in ihrem Durchmesser veränderbare Pinholes 29, individuell für jeden Detektionskanal sowie Emissionsfilter 30 und geeignete Empfängerelemente 31 (PMT) nachgeordnet sind.

Die Strahlteiler 27, 28 können vorteilhaft, wie in Fig. 5 schematisch dargestellt, als Tellerrad mit mehreren Positionen, motorisch durch Schrittmotoren umschaltbar, ausgebildet sein.

Vorteilhaft erfolgt eine Einkopplung von UV-Strahlung in Glasfaser 14.1, vorzugsweise einer Single-Mode-Glasfaser mittels eines AOTF, als Strahlablenker, d. h. wenn der Strahl nicht auf den Fasereingang fallen soll, wird er mittels des AOTF vom Fasereingang, beispielsweise in Richtung einer nicht dargestellten Lichtfalle, abgelenkt.

Die Einkoppeloptik 33 zur Einkopplung der Laserstrahlung weist zur Einkopplung nicht dargestellte Linsensysteme auf, deren Brennweite durch den Strahlquerschnitt der Laser und die für die optimale Einkopplung erforderliche numerische Apertur festgelegt ist. Im Lasermodul 13.2, sind Einzel- und Multiwellenlängenlaser vorgesehen, die einzeln oder gemeinsam über einen AOTF in eine oder mehrere Fasern eingekoppelt werden. Weiterhin kann die Einkopplung auch über mehrere Fasern gleichzeitig erfolgen, deren Strahlung mikroskopseitig nach Durchlaufen einer Anpaßoptik durch Farbvereiniger gemischt wird.

Auch die Mischung der Strahlung verschiedener Laser am Fasereingang ist möglich und kann anhand der schematisch dargestellten, auswechselbaren und schaltbaren Teilerspiegel 39 erfolgen.

Die aus dem Faserende der Fasern 14.1, 2 an der Scaneinheit s austretende Laserstrahlung wird mittels der Kollimationsoptik 16 auf einen Unendlichstrahl kollimiert. Das erfolgt vorteilhaft mit einer einzelnen Linse, die durch Verschiebung entlang der optischen Achse mittels einer über eine zentrale Ansteuereinheit 34 ansteuerbare Steuereinheit 37 eine Fokussierungsfunktion hat, indem ihr Abstand zum Ende der Lichtleitfaser 14.1, 2 an der Scaneinheit erfindungsgemäß veränderbar ist.

Die Monitordiode 19, die auch, hier nicht dargestellt, eine vorgesetzte Fokussierlinse aufweisen kann, wirkt in Verbindung mit einem linien- oder bereichsselektiven Filterrad oder Filterschieber 21, angesteuert von einer Steuereinheit 36, zur permanenten Überwachung der in das Scanmodul eingekoppelten Laserstrahlung, insbesondere um die Leistung in einer bestimmten Laserlinie isoliert zu kontrollieren und gegebenenfalls über den AOTF 32 mittels eines Regelsignales der Ansteuereinheit 34 zu stabilisieren

Die Detektion mittels der Monitordiode 19 erfaßt das Laserrauschen und Variationen aufgrund des mechanisch-optischen Übertragungssystems.

Aus der detektierten momentanen Laserleistung kann dabei ein Fehlersignal abgeleitet werden, das on-line direkt auf den Laser oder einen dem Laser nachgeschalteten Intensitätsmodulator (ASOM, AOTF, EOM, Shutter) zwecks der Stabilisierung der in das Scanmodul eingestrahlten Laserleistung zurückwirkt.

Durch die Ansteuerung der Filtereinheit 21 kann somit eine wellenlängenweise Stabilisierung der Intensität und Laserleistungskontrolle erfolgen.

Durch eine Verbindung zur Detektion 31 (PMT) und jeweils zur zentralen Ansteuereinheit kann durch Bildung von Signalquotienen/oder Signalsubtraktion des Detektionssignales und des Monitorsignales der Diode 19 eine Rauschverminderung bewirkt werden, indem das entsprechende Sensorsignal eines Detektionskanals pixelweise als Pixel- Bildinformation auf das Signal der Monitordiode normiert wird (z. B. Division), um auf diese Weise Intensitätsfluktuationen im Bild zu verringern.

Unmittelbar am AOTF ist ein Temperaturfühler TF befestigt, der die Umgebungstemperatur des jeweiligen AOTF erfaßt.

Diese wird zur Ansteuereinheit 34 übermittelt, die einen Rechner enthält, der anhand vorher eingespeicherter Korrekturkurven und über einen RS 232-Treiberschaltkreis die AOTF- Frequenz in Abhängigkeit von der Temperatur in einem vorgegebenen Frequenzfenster einstellt und optimiert, das heißt, die durch die Temperaturabweichung aufgetretene Frequenzverschiebung durch Frequenzerhöhung oder Verringerung ausgleicht.

Dieser Ausgleich kann aber auch automatisch anhand des von der Diode 19 aufgenommenen und an die Ansteuereinheit übermittelten Intensitätswertes der Laserstrahlung erfolgen, indem die Diode 19 mit der Auswerteeinheit verbunden ist und der AOTF-Treiber die Frequenz anhand des aufgenommenen Intensitätssignales der Diode 19 nachstellt, indem die Frequenz vorzugsweise um +/-200 KHz variiert wird, bis ein maximales Signal erreicht ist.

Weiterhin besteht eine vorteilhafte Lösung darin, für den AOTF eine separate Heizung oder Kühlung vorzusehen.

Besonders vorteilhaft wird der Kristall auf einen Bereich größer 35°C, beispielswe ise 40°C geheizt und innerhalb eines vorgegebenen Fensters konstant gehalten.

Die Laserleistung in der ersten Beugungsordnung bleibt dann über den gesamten Temperaturbereich von beispielsweise 15°C-35°C innerhalb enger Grenzen konstant. Ein Beispiel einer stabilen Temperaturregelung, deren Regelungsschwankungen keine für die LaserScanMikroskopie nachteiligen Effekte zeigen, zeigt Fig. 2.

Auf einem Gehäuseteil G, das Zuführungen Z zur Spannungsversorgung des AOTF aufweist, ist der TeO2-Kristall des AOTF angebracht, wobei die durchgehende Laserstrahlung schematisch angedeutet ist.

Zwischen dem Gehäuse G und dem TeO2 Kristall befindet sich eine elektrisch beheizbare oder kühlbare Platte P, deren Stromversorgung ST beispielsweise wie dargestellt auf der Außenseite des Gehäuses angebracht sein kann.

Die Stromversorgung ST ist mit einer Regelung verbunden, die mit einem Temperaturfühler verbunden ist, der direkt am TeO2 Kristall oder an der Stromversorgung ST angeordnet sein kann.

Die Regelung kann Teil der Stromversorgung ST sein, aber auch über die Ansteuereinheit 34 erfolgen.

Der Temperaturfühler TF kann auch, wie in Fig. 1 bereits dargestellt, am Gehäuse angebracht sein und mit der Auswerteeinheit 34 verbunden sein, die die Temperaturänderung erfaßt und den AOTF entsprechend ansteuert.

Claims

1. Laserscanmikroskop,
mit einer Laseranordnung zur Beleuchtung einer zu untersuchenden Probe und mit einem der Laseranordnung nachgeschalteten AOTF (AcoustoOpticalTunableFilter) zur Auswahl und individuellen Einstellung der Intensität des Beleuchtungslichtes,
dadurch gekennzeichnet,
daß ein die Temperatur des AOTF (AcoustoOpticalTunableFilter) überwachender Temperaturfühler (TF) und eine zugehörige Heizungsregelung (P) vorgesehen ist, mit welcher der AOTF (AcoustoOpticalTunableFilter) auf eine konstante Temperatur oberhalb der Raumtemperatur beheizbar ist, um die Linienintensität über einen längeren Zeitraum konstant zu halten.

2. Laserscanmikroskop,
mit einer Laseranordnung zur Beleuchtung einer zu untersuchenden Probe und mit einem der
Laseranordnung nachgeschalteten AOTF (AcoustoOpticalTunabieFilter) zur Auswahl und individuellen
Einstellung der Intensität des Beleuchtungslichtes,
dadurch gekennzeichnet,
daß ein die Temperatur des AOTF (AcoustoOpticalTunableFilter) überwachender und mit der Ansteuereinheit (34) des AOTF (AcoustoOpticalTunableFilter) verbundener Temperaturfühler (TF) vorgesehen ist
und daß die Ansteuereinheit (34) abhängig vom Signal des Temperaturfühlers (TF) und zugehöriger, abgespeicherter Korrekturdaten die Linienintensität anhand der von der Ansteuereinheit (34) erzeugten Frequenz oder Amplitude nachregelt.