DE19824384A1 - Herstellung von Primmorphe·R· aus dissoziierten Zellen von Schwämmen, Korallen und weiteren Invertebraten: Verfahren zur Kultivierung von Zellen von Schwämmen und weiteren Invertebraten zur Produktion und Detektion von bioaktiven Substanzen, zur Detektion von Umweltgiften und zur Kultivierung dieser Tiere in Aquarien und im Freiland - Google Patents
Herstellung von Primmorphe·R· aus dissoziierten Zellen von Schwämmen, Korallen und weiteren Invertebraten: Verfahren zur Kultivierung von Zellen von Schwämmen und weiteren Invertebraten zur Produktion und Detektion von bioaktiven Substanzen, zur Detektion von Umweltgiften und zur Kultivierung dieser Tiere in Aquarien und im FreilandInfo
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Abstract
Diese Erfindung betrifft die Etablierung der ersten und damit einer neuen Methode zur Kultivierung von Schwammzellen, Korallenzellen und Zellen anderer Invertebraten in vitro. Die in vitro kultivierten Zellen, die als Aggregat-ähnliche Einheiten kultivierbar sind, werden Primmorphe DOLLAR I1 genannt. Damit ist eine Methode vorhanden, die es erstmalig möglich macht, mit Zellen/Aggregaten/Primmorphe DOLLAR I2 aus Schwämmen, Korallen und anderen Invertebraten Verfahren einzuführen: Verfahren (i) zur Herstellung von Proliferations-, DNA-Synthese-modulierenden Substanzen, (ii) zur Identifikation/Detektion umweltbelastender Substanzen, (iii) zur Kultivierung von Bakterien und anderer Mikroorganismen, (iv) zur Herstellung von ungeschlechtlichen Vermehrungskörpern, die in Aquakultur zum Auswachsen zu entsprechenden Organismen genutzt werden können, (v) zur Anlegung von Zellbanken, (vi) zur Optimierung der Nahrungsbedürfnisse der Zellen/Aggregate/Primmorphe DOLLAR I3 und (vii) zur Identifikation von Substanzen, die die Telomerase-Aktivität in Zellen/Aggregaten/Primmorphe DOLLAR I4 modulieren.
Description
Diese Erfindung betrifft die Etablierung der ersten und damit einer neuen Methode
zur Kultivierung von Schwammzellen, Korallenzellen und Zellen anderer
Invertebraten in vitro. Die in vitro kultivierten Zellen, die als Aggregatähnliche
Einheiten kultivierbar sind, werden Primmorphe® genannt. Damit ist eine Methode
vorhanden, die es erstmalig möglich macht, mit Zellen/Aggregaten/Primmorphe®
aus Schwämmen, Korallen und anderen Invertebraten Verfahren einzuführen:
Verfahren (i) zur Herstellung von Proliferations-, DNA-Synthese-modulierenden
Substanzen, (ii) zur Identifikation/Detektion umweltbelastender Substanzen, (iii)
zur Kultivierung von Bakterien und anderer Mikroorganismen, (iv) zur Herstellung
von ungeschlechtlichen Vermehrungskörpern, die in Aquakultur zum Auswachsen
zu entsprechenden Organismen genutzt werden können, (v) zur Anlegung von
Zellbanken, (vi) zur Optimierung der Nahrungsbedürfnisse der
Zellen/Aggregate/Primmorphe®, und (vii) zur Identifikation von Substanzen, die
die Telomerase-Aktivität in Zellen/Aggregaten/Primmorphe® modulieren.
Das Phylum Porifera (Schwämme) hat mit den anderen Metazoen-Phyla
einen monophyletischen Ursprung [Müller WEG (1995) Naturwissenschaften 82,
321-329]. Eine grundlegendes autapomorphes Merkmal der Metazoa, inclusive
der Porifera ist zum Beispiel die Anwesenheit der Rezeptor Tyrosin-Kinase, die
nur bei Metazoa zu finden ist [Müller WEG, Schäcke H (1996) Prog Molec Subcell
Biol 17, 183-208].
Innerhalb der Metazoa zeigen die Porifera ein plesiomorphes Merkmal, das
in keinem anderen höheren Metazoen-Phylum zu finden ist; alle (oder fast alle)
ihre Zellen haben hohe Spiegel an Telomerase-Aktivität [Koziol C, Borojevic R,
Steffen R, Müller WEG (1998) Mech Ageing Develop 100, 107-120]. Dies deutet
prinzipiell darauf hin, daß Schwammzellen nicht in Keim- oder somatische Zellen
eingeteilt werden können [Müller WEG (1998a) Progr Molec Subcell Biol 19, 98-132;
Müller WEG (1998b) Naturwiss 85: 11-25]. In höheren Metazoen sind nur die
Keimzellen Telomerase-positiv, während die somatischen Zellen Telomerase-
negativ sind; nur Tumorzellen sind in anderen Metazoen Telomerase-positiv
[Lange T v (1998) Science 279, 334-335].
Aufgrund dieser Eigenschaft, daß alle (oder fast alle) Zellen der
Schwämme Telomerase-positiv sind, könnte vermutet werden, daß
Schwammzellen unsterblich sind. Es gibt jedoch bisher noch keinen Bericht über
neoplastische Krankheiten bei Schwämmen [De-Flora S. Bagnasco M, Bennicelli
C, Camoirano A, Bojnemirski A, Kurelec B (1995). Mutagenesis 10, 357-364].
Schon in dem ersten Bericht über die hohe Telomerase-Aktivität in Schwämmen
wurde von unserer Gruppe gezeigt, daß die Zellen, wenn sie aus dem
Gewebeverband herausgelöst werden und in einen dissoziierten Zustand
überführt werden zu Telomerase-negativen Zellen werden [Koziol C, Borojevic R,
Steffen R, Müller WEG (1998) Mech Ageing Develop 100, 107-120]. Zellen in
Einzelzell-Suspension sterben sehr wahrscheinlich durch Apoptose ab [Wagner
C, Steffen R, Koziol C, Batel R, Lacorn M, Steinhart H, Simat T, Müller WEG
(1998) Marine Biol; im Druck]. Weiterhin veranlaßte uns die Tatsache, daß
Schwämme einen Spezies-spezifischen Bauplan haben, zu postulieren, daß diese
mit einem Mechanismus der Apoptose ausgestattet sind, um eine bestimmte
Gruppe von Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt zu ersetzten. Diese Annahme
wurde durch das Ergebnis unterstützt, daß Zellen im Schwammgewebe zur
Apoptose induziert werden als Antwort auf endogene (z. B. Zugabe von
hitzebehandelten Bakterien) sowie auf exogene (Kadmium) Faktoren [Wagner C,
Steffen R, Koziol C, Batel R, Lacorn M, Steinhart H, Simat T, Müller WEG (1998)
Marine Biol, im Druck].
Nachdem von unserer Gruppe nachgewiesen wurde, daß Schwammzellen
eine hohe Telomerase Aktivität besitzen [Koziol C, Borojevic R, Steffen R, Müller
WEG (1998) Mech Ageing Develop 100, 107-120], schien es leicht erreichbar
eine Schwammzellkultur einzurichten. Bis jetzt konnten jedoch Schwamm-Zellen
nur am Leben gehalten werden; wie bei den Arten Hymeniacidon heliophila
[Pomponi SA, Willoughby R (1994) In: R. van Soest, A. A. Balkema (Eds.)
Sponges in Time and Space, Rotterdam, Brookfield, pp. 395-400], Latrunculia
magnifica [Ilan M, Contini H, Carmeli S. Rinkevich B (1996) J Mar Biotechnol 4,
145-149] und Suberites domuncula [Müller WEG, Steffen R, Rinkevich B,
Matranga V, Kurelec B (1996) Marine Biol 125, 165-170]. Diese Zellen
proliferieren jedoch nicht [Ilan M, Contini H, Carmeli S. Rinkevich B (1996) J Mar
Biotechnol 4, 145-149].
Die Gründe dafür, daß bisher Schwamm-Zellen, wenn sie in vitro gehalten
werden, nur im Ruhezustand verbleiben, sind z. B. nicht geeignete Methoden zur
Einrichtung der Einzelzellkultur, also Fehlen geeigneter Kulturbedingungen und
Kulturmedien [Pomponi SA, Willoughby R (1994) In: R. van Soest, A. A. Balkema
(Eds.) Sponges in Time and Space, Rotterdam, Brookfield, pp. 395-400; Ilan M,
Contini H, Carmeli S, Rinkevich B (1996) J Mar Biotechnol 4, 145-149]. Die
benutzten Medien wurden mit fötalem Kälber/Rinder Serum supplementiert
[Pomponi SA, Willoughby R (1994) In: R. van Soest, A. A. Balkema (Eds.)
Sponges in Time and Space, Rotterdam, Brookfield, pp. 395-400; Ilan M, Contini
H, Carmeli S, Rinkevich B (1996) J Mar Biotechnol 4, 145-149]. Bisher wurde
angenommen, daß Wachstumsfaktoren, die in Serum von Vertebraten
vorkommen, auch das Zellwachstum von Schwämmen und anderen Invertebraten
anregen. Diese Annahme erscheint jedoch nicht sinnvoll; Grund hierfür sind
unsere Erkenntnisse, die zeigten, daß Schwammzellen auf ihrer Oberfläche
Rezeptoren besitzen, die durch Liganden aktiviert werden, die sich von denen der
Säuger Rezeptoren im Allgemeinen und der menschlichen Rezeptoren im
Besonderen unterscheiden. Dementsprechend kann es als nicht sehr
wahrscheinlich angesehen werden, daß Wachstumsfaktoren, die in Kälber/Rinder
Seren vorkommen auf Schwamm-Rezeptoren im Speziellen und Invertebraten im
Allgemeinen wirken. Weiterhin bergen serumreiche Medien das Risiko einer
Verunreinigung duch Protozoen [Osinga R, Tramper J, Wijffels RH (1998) Trends
Biotechnol 16, 130-134].
Überraschend und neuartig ist unser Befund, der Gegenstand dieser
Patentanmeldung ist, daß in vitro-Bedingungen definiert werden können, die zur
Bildung multizellulärer Aggregate von Schwämmen, Korallen und anderer
Invertebraten aus dissoziierten Einzelzellen führen. Die Aggregate haben eine
gewebeähnliche Erscheinung und können für länger als fünf Monate in Kultur
gehalten werden. Diese Aggregate werden Primmorphe® genannt. Weiterhin
beschreiben wir, daß Zellen, nachdem sie sich zu Primmorphe® assoziiert haben,
Telomerase-positiv werden und zur DNA Synthese/Zell-Proliferation befähigt sind.
Mit der erfolgreichen Etalierung einer in vitro Kultur von Zellen von
Schwämmen, Korallen und anderen Invertebraten ist ein neuer Weg eröffnet zur
Einführung von Verfahren, wie sie anfangs dieser Beschreibung ausgeführt sind.
Natürliches Seewasser (S9148), Penicillin und Streptomycin wurden von Sigma
(Deisenhofen; Germany) erhalten, RNAguard (24,000 Einheiten/ml) von
Pharmacia (Freiburg; Germany), der "Telomerase Detection Kit" (TRAPeze) von
Oncor (Gaithersburg, MD; USA), "BrdU-labeling and detection kit" von Boehringer
Mannheim (Mannheim; Germany) und SYBR Green I von Molecular Probes
(Leiden; Netherlands).
Die Zusammensetzung von Ca2+ und Mg2+-freiem künstlichen Seewasser
[CMFSW] sowie von CMFSW, dem Ethylendiamin-tetraessigsäure (EDTA)
zugesetzt wurde [CMFSW-E] sind wie früher beschrieben [Rottmann M, Schröder
HC, Gramzow M, Renneisen K, Kurelec B, Dorn A, Friese U, Müller WEG (1987)
EMBO J 6, 3939-3944].
Exemplare des Meeresschwammes Suberites domuncula (Porifera,
Demospongiae, Hadromerida) wurden in der Nördlichen Adria bei Rovinj
(Kroatien) gesammelt und danach in Mainz (Germany) in Aquarien bei einer
Temperatur von 16°C gehalten.
Als Vertreter weiterer Invertebraten wurde die Weichkoralle
Dendronephthya hemprichi (Cnidaria, Anthozoa, Alcyonaria) aus einem
Zoogeschäft erworben und wie Schwämme gehältert.
Als Beispiel für Schwämme, Korallen und andere Invertebraten werden hier die
Untersuchungen exemplarisch mit dem Schwamm Suberites domuncula und der
Weichkoralle Dendronephthya hemprichi beschrieben.
Alle Materialien und Lösungen/Medien werden üblicherweise steril benutzt.
Gewebeproben [Größe von üblicherweise 4 bis 5 cm3] des Schwammes/der
Weichkoralle werden in Seewasser mit einem Skalpell in kleinere Gewebestücke
[ca 0.5-1 mm3] geschnitten. Anschließend werden diese in konische 50 ml
Röhrchen [z. B. Falcon-Katalog Nummer 2070], die mit CMFSW-E gefüllt sind
überführt [Verhältnis Gewebe zu Medium üblicherweise 1 : 10]. Nach leichtem
Schütteln, z. B. für 30 Min bei 16°C, auf einem rotierenden Schüttler, wird der
Überstand dekantiert und verworfen. Die verbleibenden Gewebe-Stücke werden
abermals mit neuem CMFSW-E im gleichen Verhältnis versetzt und wieder leicht
rotierend geschüttelt. Der Überstand wird dekantiert und verworfen.
Die Gewebe-Stücke werden jetzt mit neuem CMFSW-E versetzt und weiter
für üblicherweise 40 Min auf einem Schüttler bewegt. Der Überstand, der die
Zellen enthält wird durch ein Nylon-Netz, Maschenweite z. B. 40 µm, filtriert und in
einem Röhrchen, aufgefangen. Dieser Arbeitsvorgang, Schütteln der Gewebe-
Stücke in CMFSW-E und Filtration des Überstandes durch ein Nylon-Netz, wird
mehrmals wiederholt. Die vereinigten Zellsuspensionen werden leicht
abzentrifugiert, um die Zellen zu erhalten [üblicherweise bei 500 × g für 5 Min]. Die
Zell-Suspension wird in Seewasser/Antibiotika-Lösung [Antibiotika: üblicherweise
100 IE Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin] aufgenommen. Dieser
Arbeitsvorgang wird üblicherweise ein- bis mehrmals wiederholt. Die
gesammelten Zellen werden durch Zentrifugation gewonnen. Eine Zellsuspension
von 107 Zellen/ml wird eingestellt und 1 ml davon üblicherweise zu 5 ml
Seewasser/Antibiotika-Lösung in eine z. B. 60 mm Petri-Schale [z. B. Falcon-
Katalog Nummer 3004] hinzugegeben.
Die Zellen werden inkubiert, üblicherweise bei 16°C, und üblicherweise vier
Mal durch vorsichtige Resuspension mit Seewasser/Antibiotika-Lösung in eine
neue Petri-Schale überführt. Damit soll auch erreicht werden, daß die Zellen nicht
auf der Schale anheften. Nachdem sich Aggregate gebildet haben, werden diese
täglich von der jetzt vorhandenen Mutter-Petri-Schale, durch Pipettierung in ein
konisches Röhrchen [z. B. 15 ml Röhrchen (Falcon-Katalog Nummer 2096)]
überführt. In dem Röhrchen sedimentieren die Aggregate schneller. Nach etwa 10 sec
wird der Überstand dekantiert und die Aggregat-Suspension in neue Petri-
Schalen überführt. Die Aggregate werden mit einer Pipette aufgesaugt und noch
ein- bis mehrere Male über die beschriebene Gravidations-Methode unter
Resuspension in der Seewasser/Antibiotika-Lösung gewaschen. Aus der Mutter-
Petri-Schale können mehrere Male, meist zwei bis fünf Mal, neue Aggregate
gewonnen werden. Die gewaschenen Aggregate verbleiben in den Petri-Schalen
so lange bis sie eine glatte Oberfläche gebildet haben. Üblicherweise wird die
Seewasser/Antibiotika-Lösung jeden Tag erneuert; zwei Drittel der Lösung
werden durch frische Seewasser/Antibiotika-Lösung ersetzt.
Anschließend werden die sich jetzt bildenden Aggregate (Primmorphe®)
(Durchmesser etwa 1-3 mm), in 24-Loch Platten [z. B. Nunclon™ (Nunc)-
Katalog Nummer 143982] überführt und 1 ml Seewasser/Antibiotika-Lösung
hinzugegeben. Ein bis zwei Primmorphe® werden pro Loch inkubiert.
Falls die Kulturen weitgehend steril gehalten werden kann auf den Zusatz
der Antibiotika im Seewasser verzichtet werden.
Zur Bestimmung der Zellproliferation wurde der Einbau von BrdU [5-Bromo-2'-
deoxy-uridin] in die zelluläre DNA unter Anwendung des "BrdU-labeling and
detection kit", entsprechend den Angaben des Herstellers gemessen.
Hierzu werden die Primmorphe® in üblicherweise 1 ml der
Seewasser/Antibiotika-Lösung, die auch die BrdU Markierungslösung enthält,
inkubiert [Endverdünnung; üblicherweise 1 : 1000 (10 µM of BrdU)]. Die
Inkubationsdauer ist üblicherweise 12 Std; die Inkubation selbst wird in
Kulturkammern [z. B. den "culture chamber slides (Nung)"-Katalog Nummer 177453]
durchgeführt. Anschließend werden die Zellen in CMFSW-E dissoziiert,
drei Mal in CMFSW-E gewaschen und in 70% Ethanol [pH 2.0] fixiert/denaturiert.
Danach werden die Zellen mit anti-BrdU Maus-Monoclonalen-Antikörpern
inkubiert und der Immunkomplex mit Anti-Maus Ig/gekoppelt mit alkalischer
Phosphatase und mit dem Farb-Substrat Nitroblau-Tetrazolium-Salz sichtbar
gemacht. Die Zellen werden lichtmikroskopisch analysiert.
Die Primmorphe® werden in 4% Paraformaldehyd/Phosphat-gepufferte
Kochsalzlösung fixiert [Romeis, B. (1989) Mikroskopische Technik. München;
Urban und Schwarzenberg]. Nach Dehydrierung mit Ethanol werden die
Primmorphe® in Technovit 8100 eingebettet [Beckstead J H (1985) J Histochem
Cytochem 9, 954-958]. Schnitte mit einer Dicke von 2 µm werden angefertigt und
mit Ziehl's Fuchsin-Lösung angefärbt [Martoja R, Martoja M (1967) Initiation aux
Techniques de l'Histologie Animale. Prem. Ed. Masson et Cie, Paris].
Die Telomerase-Aktivität wird mit Hilfe der Methode der Polymerase-
Kettenreaktion [PCR] unter Anwendung des "Telomerase Detection Kit
(TRAPeze)" nachgewiesen; Details wurden früher beschrieben [Kim NW,
Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PLC, Coviello GM, Wright
WE, Weinrich SL, Shay JW (1994) Science 266: 2011-2014; Koziol C, Borojevic
R, Steffen R, Müller WEG (1998) Mech Ageing Develop 100, 107-120]. Die
zugegebenen Zellextrakte entsprechen 5 × 103 Zelläquivalenten. Die
Amplifikations-Produkte werden mittels Elektrophorese quantifiziert unter
Anwendung eines 12.5% nicht-denaturierenden Polyacrylamid Gels in 0.5 × TBE-
Puffer [Durchführung nach Angaben des Herstellers]. Die Gele werden mit SYBR
Green I gefärbt, um DNA Fragmente zu erkennen [Molecular Probes (1996) MP
7567 07/16/96]. Die Signale werden mit einem GS-525 Molecular Imager (Bio-
Rad) quantifiziert. Der Grad der Telomerase Aktivität wird in TPG (total product
generated) angegeben und wird wie beschrieben errechnet [Oncor (1996)
TRAPeze telomerase detection kit; catalog no. S7700-Kit; second edition. Oncor,
Gaithersburg, MD; USA].
Die Resultate wurden auf Signifikanz mittels des gepaarted Student's t-Test
analysiert [Sachs L, Angewandte Statistik (Springer, Berlin) (1984)].
Zur Isolierung der Zellen wurden Exemplare des Meeresschwammes S.
domuncula benutzt (Abb. 1A). Einzelzellen wurden durch Dissoziation wie oben
beschrieben, erhalten. Nach den angegebenen Wasch-Schritten werden die
Protozoen entfernt, die bevorzugt auf der Oberfläche der Plastik-Kulturgefäßen
haften. Die Zellen werden in eine Seewasser/Antibiotika-Lösung überführt. Nach
der gesamten Behandlungs/Inkubations Periode von üblicherweise fünf Tagen
bilden sich Primmorphe® (Abb. 1D) aus den Zellaggregaten (Abb. 1B und C). Der
Durchmesser der Zellaggregate beträgt nach einer Inkubationszeit von zwei
Tagen etwa 100 µm (Abb. 1B) und nimmt beständig an Größe zu; nach vier
Tagen wird ein Durchmesser von üblicherweise 300 µm erreicht (Abb. 1C).
Während dieser Zeit runden sich die Aggregate ab. Normalerweise bilden sich
nach weiteren drei bis fünf Tagen Primmorphe® von einer Größe von etwa 1 bis 2 mm
(Abb. 1D).
Querschnitte durch die Primmorphe® zeigen bei mikroskopischer Analyse,
daß die Zellen im Inneren von einer deutlichen mehrere Lagen dichten Schicht
Epithel-ähnlicher Zellen umgeben sind (Abb. 1E und F). Die Zellen, die das
squamöse Epithel der Primmorphe® bilden sind Pinakozyten, wie aus ihren
abgeflachten fusiformen Ausläufern und ihren deutlichen Nuklei geschlossen
werden kann [Übersicht: Simpson TL (1984) The Cell Biology of Sponges.
Springer-Verlag, New York]; die Größe der Zellen schwankt um 20-30 µm. Die
Zellen innerhalb der Primmorphe® sind hauptsächlich sphärulöse Zellen. Sie
haben einen Durchmesser von etwa 30 bis 40 µm und sind durch große runde
Vakuolen gekennzeichnet, die den meisten Raum der Zellen einnehmen. Die
anderen Zellen können als Amoebozyten and Archaeozyten bezeichnet werden
und haben eine Größe von etwa 40 µm.
Die äußere Erscheinung der Primmorphe® in glatt und fast Ball-ähnlich
(Abb. 1D); die histologischen Schnitte zeigen, daß die Zellen in den Primmorphe®
gut zu einem Gewebe-ähnlichen Körper organisiert sind (Abb. 1E and F). Es ist
auffällig, daß das squamöse Epithel aus einer mehrzelligen Lage von meist
Pinakozyten gebildet wird (Abb. 1F), die in natürlichen Schwämmen nicht zu
finden ist; diese werden durch ein einzelliges Epithel begrenzt. Das organisierte
Arrangement der Zellen innerhalb der Primmorphe® unterscheidet sie auch von
den Aggregaten, die aus dissoziierten Zellen in Anwesenheit des homologen
Aggregationsfaktors gebildet werden [Müller WEG (1982) Intern Rev Cytol 77,
129-181].
Im Gegensatz zu den in vivo gebildeten asexuellen Reproduktionskörpern,
Knospen, Reduktionskörper und Gemmulae [Übersicht: Simpson TL (1984) The
Cell Biology of Sponges. Springer-Verlag, New York] bilden sich die hier
beschriebenen Primmorphe® aus eine Einzel-Zellsuspension in vitro. Wie hier
gezeigt, bilden die dissozüerten Zellen Gewebe-ähnliche Körper. Der Aufbau von
funktionellen Primmorphe® aus einer Einzel-Zellsuspension impliziert, daß diese
Entstehung ein aktiver Prozess ist, der die Ausschleusung von toten Zellen und
Zellfragmenten umfaßt; dies ist bei mikroskopischer Betrachtung als
"ausgefranste" Ränder der Primmorphe® zu sehen. Die Bildung eines squamösen
Epithels aus Pinakozyten deutet weiter darauf hin, daß Schwammzellen de- und
anschließend re-differenzieren und zwar zu solche Zellen, die zum Aufbau von
Primmorphe® nötig sind.
Die Reorganisation der Zellen während des Umbildens in Primmorphe®
setzt die Anwesenheit von Strukturen und damit assoziierten Proteinen für eine
Zellwanderung voraus; Kollagen als ein wesentliches Strukturelement für
Zellwanderung ist bei Schwämmen gründlich dokumentiert. Die Existenz des
adhäsiven Glykoproteins Fibronectin, das bei höheren Invertebraten und
Vertebraten zelluläre Interaktionen mit der extrazellulären Matrix einschließlich
der Zellwanderung vermittelt, konnte bislang durch immunologische
Kreuzreaktionen mit heterologen Antikörpern und durch Isolierung der putativen
cDNA für dieses Polypeptid aus dem Schwamm Geodia cydonium [Pahler S.
Blumbach B, Müller IM, Müller WEG (1998) J Exp Zool; im Druck] für Schwämme
nachgewiesen werden. Die Anwesenheit von Morphogenen in Primmorphe® muß
postuliert werden, um das präzise Arrangement von proliferierenden Zellen in
diesen Körpern zu erklären. Kürzlich wurde von uns die cDNA, die für ein
mögliches Morphogenen "morphogen endothelial-monocyte-activating
polypeptide" kodiert, aus dem Schwamm Geodia cydonium (Pahler et al., 1998a)
isoliert.
Die Primmorphe®, gewonnen von S. domuncula, wurden bisher über fünf Monate
in Kultur gehalten.
Diese Primär-Primmorphe® können wieder in CMFSW-E in Einzelzellen
dissoziiert werden. Die entstandene Einzel-Zell-Suspension ist weiterhin befähigt,
Aggregate und anschließend Primmorphe® zu bilden, die jetzt Sekundär-
Primmorphe® genannt werden. Dieser Prozeß erfolgt, wenn die Zellen in
Seewasser/Antibiotika-Lösung überführt werden. Die Kinetik der Primmorphe®-
Bildung ist üblicherweise identisch mit der, die für Primär-Primmorphe®
beobachtet wurde. Ohne Ca2+, also in CMFSW-E Medium, haften die Zellen aus
Primär-Primmorphe® nach Dissoziation schwach an die Oberfläche der
Kulturgefäße [z. B. Falcon-Katalog Nummer 3004] an. Für optimale Haftung
müssen die Gefäße leicht mit einem Deckglas oder einem Gummischaber
angerauht werden.
Wie früher von uns beschrieben [Koziol et al., 1998 (s. o.)] durchlaufen
Schwammzellen nach Dissoziation in Einzel-Zellen einen Übergang von einem
Telomerase-positiven Zustand zu einem Telomerase-negativen Zustand.
Die Höhe der Telomerase Aktivität wurde in den Zellen während der
Bildung von Primmorphe® aus einer Einzel-Zellsuspension bestimmt. Die
Ergebnisse zeigen, daß Zellen im natürlichen Zellverband eine hohe Telomerase-
Aktivität haben; eine quantitative Analyse ergab eine Aktivität von 8.9 TPG
Einheiten/5 × 103 Zell-Äquivalenten (Abb. 2; Spur a). Wurde die Telomerase-
Aktivität in Zellen, die für 14 Std. im dissoziierten Einzel-Zellzustand belassen
wurden, bestimmt, fiel der Enzym-Pegel auf 0.9 TPG Einheiten/5 × 103 Zell-
Äquivalenten ab (Abb. 2; Spur b). Wenn jedoch Zellen von Primmorphe® [etwa 10
Tage nach der Bildung aus Einzel-Zellen] für die Analyse benutzt wurden ergab
sich eine Telomerase Aktivität von 4.7 TPG Einheiten/5 × 103 Zellen (Abb. 2;
Spur c).
Diese Ergebnisse zeigen, daß dann wenn Zellen aus ihrem
Gewebeverband gelöst werden, diese ihre Telomerase-Aktivität verlieren. Wie
jetzt gezeigt wurde, erholen sich die Einzel-Zellen wieder nach der Bildung von
Gewebe-ähnlichen Körpern, den Primmorphe®, und werden wieder Telomerase-
positiv.
Die BrdU-Markierung und der "Detection"-Ansatz wurden benutzt um zu zeigen,
daß diejenigen Zellen, die in sich in Primmorphe® organisiert haben, ihre
Proliferationsfähigkeit wiedererlangen. Als Maß für Proliferation wurden die Zellen
12 Std mit BrdU inkubiert. Danach wurde der Einbau von BrdU in die DNA
bestimmt und mit Hilfe eines anti-BrdU monoklonalen Antikörpers, wie oben
beschrieben, quantifiziert. Zellen, die BrdU in die DNA eingebaut haben zeichnen
sich durch einen dunkel (dunkelbraun) gefärbten Zellkern aus (Abb. 3B-D).
Kontrollen, die nicht mit dem primären Antikörper gegen BrdU inkubiert waren,
sind nicht gefärbt (Abb. 3A).
Einzel-Zellsuspensionen, die für einen Tag in CMFSW-E gehalten wurden,
enthielten keine Zelle, die DNA Synthese durchmachten (Tabelle 1). Der
Prozentsatz der BrdU-positiven Zellen, gewonnen aus Zellaggregaten, die nach
einem Tag aus einer Einzel-Zellsuspension in Kultur gebildet werden ist gering
(6.5%). Die Zahl der DNA-synthetisierenden/proliferierenden Zellen in
Primmorphe® ist jedoch hoch. Wie in Tabelle 1 zusammengefaßt beträgt der
Anteil der BrdU-positiven Zellen in Primär-Primmorphe® 33,8% und in Sekundär-
Primmorphe® 22,3%. Diese Angaben bestätigen, daß die Zellen, die in
Primmorphe® organisiert sind, eine DNA Synthese durchlaufen und danach auch
wieder zur Zell-Teilung befähigt sind.
Zur Bestimmung, ob sich die Zellen nach der DNA-Synthese auch teilen, wurden
die gleichen Ansätze, die auch für die Bestimmung des BrdU-Einbaues in Zellen
der Primmorphe® von S. domuncula benutzt wurden, analysiert. Ausgezählt
wurden diejenigen Zellen, die positiv für BrdU sind, und sich nach durchlaufener
Mitose noch im Zweikern-Stadium befinden.
Die Ergebnisse zeigen, daß in Einzel-Zellsuspensionen oder Zellaggregaten
keine Zweikern-Stadien vorkommen, während in Primär-Primmorphe® 19,4%
Zweikern-Stadien und in Sekundär-Primmorphe® 13,8% Zweikern-Stadien
vorhanden sind (Tabelle 1).
Damit ist nachgewisen, daß Zellen in Primmorphe®, neben einer DNA-
Synthese, auch eine Zellteilung durchmachen.
Es ist bekannt, daß nahezu alle Schwammspezies in einer Symbiose-ähnlichen
Beziehung zu Mikroorganismen leben [Müller WEG, Zahn RK, Kurelec B, Lucu C,
Müller I, Uhlenbruck G (1981) J Bacteriol 145, 548-558]. Neben procaryontischen
werden auch eucaryontische Organismen gefunden, die in Assoziation mit dem
Wirt (Schwamm, Koralle oder anderen Invertebraten) leben. Die in den
Schwämme vorhandenen Organismen können durch PCR-Analyse [Althoff
K, Schütt C, Steffen R, Batel R, Müller WEG (1998) Marine Biol 130, 529-536]
und/oder durch Analyse der rRNA im Agarose-Gel nachgewisen werden.
Während procaryontische rRNA zwei Hauptspezies, 23S und 16S rRNA enthält,
kommen bei eucaryontischen rRNAs die zwei Hauptspezies 28S und 18S rRNA
vor.
Die Analyse von Gewebeproben, nach Extraktion der RNA und
anschließender Auftrennung im Agarose-Gel zeigt, daß in S. domuncula neben
den beiden Wirts-rRNAs, 28S und 18S rRNA, auch procaryontische rRNAs, 23S
und 16S rRNA, vorkommen (Abb. 4; Spur a). Nach Dissoziation und
anschließender Herstellung von Primmorphe® in Kultur wird üblicherweise auch
die procaryontische rRNAs, 23S und 16S rRNA, nachgewiesen (Abb. 4; Spur b).
Damit ist gezeigt, daß Primmorphe® auch Mikroorganismen enthalten
können, ohne daß damit eine "Kontamination der Kultur" erfolgt.
Entsprechend den Angaben für Primmorphe® des Schwammes S. domuncula
wurden auch Primmorphe® der Weichkoralle D. hemprichi in Kultur gezüchtet.
Die Ergebnisse zeigen, daß in Einzel-Zellsuspensionen oder
Zellaggregaten, keine bzw. wenig Zellen positiv für BrdU-Einbau sind, während
sowohl in Primär-Primmorphe® als auch in Sekundär-Primmorphe® eine hohe
Anzahl an Zellen BrdU positiv sind, also eine DNA-Synthese durchlaufen (Tabelle
1).
Weiterhin, wurde gefunden, daß in Einzel-Zellsuspensionen oder
Zellaggregaten keine Zweikern-Stadien vorkommen, während in Primär-
Primmorphe® 12,9% Zweikern-Stadien und in Sekundär-Primmorphe® 8,2%
Zweikern-Stadien vorhanden sind. Damit ist auch für D. hemprichi nachgewiesen,
daß Zellen in Primmorphe® neben einer DNA-Synthese auch eine Zellteilung
durchmachen (Tabelle 1).
Analyse der Zellen auf DNA Synthese mittels BrdU-Markierung und des
"Detektion-Kits". Als Modelle wurden der Schwamm S. domuncula und die
Weichkoralle D. hemprichi eingesetzt. Einzel-Zellsuspension wurde mit BrdU
inkubiert; die eingebauten Nukleotide wurden immunologisch sichtbar gemacht
mittles anti-BrdU monoklonalen Antikörpern. Der Prozentsatz von BrdU-positiven
Zellen, als auch Zweikern-Stadien ist für jede Ansatzreihe angegeben. Die
Analyse wurde durchgeführt mit: (i) dissoziierten Zellen, die für 1 Tag in CMFSW-E
gehalten wurden, (ii) Zellaggregaten aus Einzel-Zellsuspension nach einem Tag
in Kultur in Seewasser, (iii) Primär-Primmorphe® [Bildung nach 10 Tagen] und (iv)
Sekundär-Primmorphe® [gebildet aus ein Monate alten Primär-Primmorphe®
nach Dissoziation in Einzel-Zellen und anschließender Bildung von Sekundär-
Primmorphe®]. Pro Ansatz wurden 300 Zellen gezählt.
Die Beschreibung der Anwendung des Verfahrens zur Herstellung der Kultur von
Primmorphe® erfolgt an dem Beispiel von S. domuncula. Die hier gezeigten
Effekte sind auch bei Primmorphe® von D. hemprichi gefunden worden und gelten
deshalb für diese Spezies im Besonderen, als auch für Schwämme [Porifera] und
Korallen [und generell für Cnidaria] und weiterhin für Invertebraten im
Allgemeinen.
Die Primär-Primmorphe® wurden aus Einzelzellen von S. domuncula
gewonnen und nach 21 Tagen für die Versuche eingesetzt.
Der Effekt von Phorbolester auf die DNA-Synthese und die Zell-Proliferation ist
bei Vertebraten gut nachgewiesen [Parker PJ, Dekker LV (1997) Protein Kinase
C. Springer-Verlag, New York]. Das (Ein) Zielenzym dieser Substanzen ist die
Protein-Kinase C. (n Vorarbeiten konnten wir nachweisen, daß Schwämme dieses
Enzym ebenfalls besitzen [Kruse M, Gamulin V, Cetkovic H, Pancer Z, Müller I M,
Müller WEG (1996) J Molec Evol 43, 374-383].
Deshalb wurde der Einfluß eines Phorbolesters, von Phorbol 12-myristat 13-
acetat (PMA), auf den prozentualen Anteil von BrdU-positiven Zellen in
Primmorphe® von S. domuncula bestimmt. Die Primmorphe© wurden für zwei
Tage mit unterschiedlichen Konzentrationen von PMA inkubiert. Anschließend
erfolgte die Bestimmung der DNA-Synthese mittels BrdU-Markierung wie oben
beschrieben. Die Kontrolle, prozentualer Anteil von BrdU-positiven Zellen in
Primmorphe® ohne Prüf-Substanz, wurde 100% gesetzt. Die Ergebnisse, die in
Abb. 5 zusammengestellt sind zeigen, daß in dem Konzentrationsbereich von
0,01 bis 1 µg PMA/ml eine deutliche prozentuale Erhöhung von BrdU-positiven
Zellen in Primmorphe® erfolgt (Abb. 5).
Aufgrund dieser Daten ist zu folgern, daß Primmorphe® ein
ausgezeichnetes System darstellen, um bei Invertebraten bioaktive Substanzen,
hier solche die auf die DNA-Synthese wirken, nachzuweisen.
Entsprechend den obigen Ausführungen wurden in Parallelansätzen auch
geprüft, ob es nach Inkubation mit dem hier verwendeten Agenz zu einer
Änderung der Proliferation kommt. Es konnte gezeigt werden, daß es im Bereich
von 0,01 bis 1 µg PMA/ml zu einer Proliferationzunahme der Zellen in
Primmorphe® kommt.
Cadmium stellt ein häufig in der Umwelt, speziell im aquatischen Milieu,
vorkommendes Umweltgift dar [Clark RB (1997) Marine pollution. Clarendon
Press, Oxford]. Dieses Schwermetall wurde ausgewählt, um zu zeigen, daß die
DNA-Synthese-Kapazität nach Einfluß von Cadmium auf die Primmorphe®
abnimmt.
Als Konzentrationen wurden solche ausgewählt, die auch in der natürlichen
Umwelt, z. B. in der nördlichen Adria, vorkommen. Aufgrund publizierter Daten
wurden Cadmium-Konzentrationen zwischen 0.1 ng/ml (südlich von Rovinj [Istria])
und 0.5 ng/ml (Pula-Siporex [Istria]) ausgewählt [Mikulic N (ed) (1994) Monitoring
programme of the Eastern Adriatic Coastal Area (1983-1991). United Nations
Environmental Programme, MAP Technical Reports Ser. 86, pp 275]; zusätzlich
wurden auch höhere Konzentrationen eingesetzt.
Die Ergebnisse zeigen, daß nach Einwirkung von Cadmium, ab einer
Konzentration von 1 ng/ml und höher, eine Abnahme des prozentualen Anteils
von BrdU-positiven Zellen zu messen ist (Abb. 6). Es ist zu betonen, daß (i) diese
Exposition einmalig war und (ii) in der Umwelt eine Akkumulation dieses
Schwermetalles in den Tieren erfolgt; die Akkumulation kann einen Faktor von
17,500-fach annehmen [Müller WEG, Batel R, Lacorn M, Steinhart H, Simat T,
Lauenroth S. Hassanein H, Schröder HC (1998) Marine Ecol Progr Ser, im Druck].
Aufgrund der hier dokumentierten experimentellen Daten und derjenigen
aus der Literatur über die Akkumulation von Schwermetallen in aquatischen
Organismen ist anzunehmen, daß das System der Primmorphe® ein sensitiver
Indikator für Umwelbelastungen darstellt.
Der Nachweis, daß Suberitine in S. domuncula-Exemplaren gebildet wird, ist in
der Literatur erbracht [Cariello L, Zanetti L (1979) Comp Biochem Physiol 64C: 15-19].
Diese Schwamm-Exemplare wurden in der Natur gefangen. Suberitine ist ein
toxisches Protein, das auch hämolytische Eigenschaft besitzt [Cariello L, Zanetti L
(1979)].
Es wurde nun erstmals - in der hier vorliegenden Schrift - gezeigt, daß
Schwamm-Zellen auch in vitro bioaktive Substanzen produzieren können.
Primmorphe® wurden von S. domuncula in Kultur genommen. Die Bioaktivität
wurde in Extrakten der Primmorphe® nach 0 bis 20 Tagen [Überführung der
Primmorphe® in die 24-Loch Platten] bestimmt. Als Parameter wurde die
hämolytische Aktivität ausgewählt. Rohextrakte wurden aus den Primmorphe®
entsprechend den Angaben von Cariello und Zanetti (1979) hergestellt und die
hämolytische Aktivität spektrophotometrisch bestimmt. 0,1 optische Einheit wird
hier als 1 willkürliche Einheit, die HE (hämolytische Einheiten), definiert. Wie in
Abb. 7 dokumentiert besitzen Primmorphe® am Tag der Überführung in 24-Loch
Platten eine geringe Bioaktivität von 3,5 ± 0.4 HE/mg Protein. Nach einer
Kultivierung der Primmorphe® über einen Zeitraum von länger als 3 Tagen kommt
es zu einer signifikanten Steigerung (P < 0.001) der Bioaktivität auf 6,9 ± 0.7 HE/mg;
nach einer Inkubationsperiode von 10 Tagen erreicht die Bioaktivität ihr
Maximum.
Aufgrund der hier dokumentierten experimentellen Daten muß
angenommen werden, daß Primmorphe® ausgezeichnete Produzenten für
bioaktive Substanzen in vitro darstellen.
Die Produktion der bioaktive Substanzen von Primmorphe® erfolgt in
kleinem (1 ml) oder größerem Umfang (20 l); sie kann daneben auch in größeren
Bioreaktoren und auch in Aquakultur erfolgen.
Erhöhung der Größe der Primmorphe® als auch deren prozentualen
Anteil von BrdU-positiven Zellen nach Zugabe von homologen Zellen (von S.
domuncula), als auch heterologe Zellen (von Geodia cydonium), die durch
Hitzeschock apoptotisch abgetötet wurden. Die Größe der Primmorphe® ist
angegeben durch den entsprechenden Durchmesser. Die abgetöteten Zellen (1 ×
103 Zellen pro Loch) wurden für drei Tage den Kulturen zugegeben;
anschließend erfolgte die Auswertung. Jeweils 10 Primmorphe® wurden
vermessen (die Mittelwerte als auch die Standardabweichungen sind angegeben);
pro Ansatz wurden 300 Zellen nach BrdU-positiven Zellen ausgezählt. Die
Größen vor Zugabe der Zellen als auch die nach der Inkubation wurde ermittelt
(die gleichen Primmorphe® wurden ausgewertet).
Oben wurde ausgeführt, daß Primmorphe® in Seewasser/Antibiotika-Lösung,
ohne Zusatz der üblichen Nährmedien, wie Serum, eine DNA-Synthese- und eine
Zell-Proliferation durchmachen.
Es wird nun gezeigt, daß sowohl die Größe der Primmorphe® als auch
deren prozentualer Anteil an BrdU-positiven Zellen durch Zusatz sowohl von
homologen Zellen (von S. domuncula), als auch heterologen Zellen (z. B. von
Geodia cydonium), die durch Hitzeschock apoptotisch abgetötet wurden,
signifikant (P < 0.001) erhöht werden kann (Tabelle 2).
Weiterhin wurde überraschenderweise gefunden, daß Phosphatidyserine
und auch Posphatidylinositole eine Erhöhung der Größe der Primmorphe® als
auch eine Zunahme deren prozentualen Anteils an BrdU-positiven Zellen
bewirken. Als Grundlage dafür wurde folgendes gefunden. Die durch Hitzeschock
apoptotisch abgetöteten Zellen (die als Nährstoffquelle dienen), exponieren auf
ihrer Zelloberfläche Phosphatidyserine als auch Posphatidylinositole u. a. Lipide.
Diese apoptotisch modifizierten Zellen/Membranen werden von den Primmorphe®
phagozitiert.
Damit ist erwiesen, daß sowohl abgetötete Zellen, als auch reine
Komponenten, wie Lipide oder auch Kollagen oder andere extrazelluläre Moleküle
einen positiven Effekt auf die Zellgröße und den prozentualen Anteil von BrdU-
positiven Zellen bewirken.
Es ist bekannt, daß Tumorzellen eine hohe Telomerase-Aktivität haben [Hastie
ND, Dempster M, Dunlop AG, Thompson AM, Green DK, Allshire RC (1990)
Nature 346, 866-868]. Ein Ziel der medizinischen Forschung ist es, die Aktivität
dieses Enzymes in Tumorzellen herabzusetzen. Aufgrund der Tatsache, daß
Schwammzellen Telomerase-positiv sind ist deshalb das Modell der
Primmorphe® ausgezeichnet geeignet zur Testung von Substanzen, die diese
Aktivität herabsetzen.
In der folgenden Tabelle wird gezeigt, daß in der Tat die Telomerase-
Aktivität in Zellen von Primmorphe® moduliert werden kann. Als Agenz haben wir
Antikörper gegen das von uns aus S. domuncula klonierte und rekombinant
hergestellte Integrin-Protein genutzt. Wie in Tabelle 3 gezeigt reduzieren diese
Antikörper die Telomerase-Aktivität in Primmorphe® bereits nach 2 Tagen in
Kultur.
Damit ist gezeigt, daß Primmorphe® ein ausgezeichnetes Modell zum
Auffinden von Substanzen, die die Telomerase-Aktivität modulieren, darstellen.
Telomerase Aktivität in Zellen von S. domuncula nach Zugabe von
Antikörper (Kaninchen - polyklonal) zu Primmorphe®. Den Ansätzen wurden 50 µl
Antikörper pro Loch hinzugegeben. Die Telomerase Aktivität ist in TPG (total
product generated) angegeben und auf 5 × 103 Zelläquivalente standardisiert.
Primmorphe® lassen sich zur Züchtung von größeren Gewebekulturen, als auch
zur Züchtung ganzer entsprechender Organismen einsetzen. Hierzu wird sich der
Aquakultur bedient. Primmorphe® werden nach einer Inkubation von
üblicherweise zwei Monaten in z. B. "culture chamber slides" [(Nunc)-Katalog
Nummer 177453] mit diesen in größere künstliche Behältnisse (wie Aquarien),
oder direkt in die Natur (aquatisches Milieu), überführt.
Werden größere künstliche Behältnisse (wie Aquarien) benutzt, werden
diese, wie im Falle von S. domuncula, mit künstlichem Seewasser gefüllt und mit
den üblichen Spurenmineralien versetzt. Üblicherweise ein Mal pro Woche wird
dem Medium etwas organisches Materiel, wie z. B. Thunfisch, zugefügt. Nach
durchschnittlich einem Monat sind die Primmorphe® zu 5 mm großen
Organismen-ähnlichen Gebilden herangewachsen. Längere Inkubationszeiten
führen zu einem weiteren Wachstum bis zum fertigen Organismus.
Damit ist gezeigt, daß aus Primmorphe®, gehalten in Aquakultur, wieder
sich komplexe Organismen bilden können. Damit können entweder in künstlichen
Behältnisses (wie Aquarien) oder in der Natur Farmen von Schwämme, Korallen
und anderen Invertebraten angelegt werden.
Vor der Etablierung einer Zellbank mußte geprüft werden, ob Zellen z. B. von S.
domuncula ein Einfrieren und ein darauf folgendes Auftauen überleben und dann
wieder funktionsfähig sind.
Deshalb wurden Zellen, entweder direkt nach der Dissoziation von dem
Ausgangsorganismus, z. B. dem Schwamm S. domuncula, oder von Primmorphe®
gewonnen und eingefroren. Hierzu werden die Zellen in einem geeigneten
Röhrchen üblicherweise in Dimethyl-Sufoxid (üblicherweise 10% in Seewasser)
oder Glycerin (üblicherweise 20% in Seewasser) langsam eingefroren
(üblicherweise 1°C/Min). Die Zellzahl wird auf etwa 5 × 106 Zellen/ml eingestellt.
Nachdem eine Temperatur von etwa -70°C erreicht ist, werden die Zellen
anschließend in flüssigen Stickstoff überführt und können so für über sechs
Monate gelagert werden.
Werden die Zellen wieder aufgetaut können sie etappenweise auf
Temperaturen über +0°C gebracht werden. Dann werden die Zellen in
Seewasser überführt durch üblicherweise tropfenweises Zugeben. Wird eine
Temperatur erreicht, die auch üblicherweise von den Zellen in Kultur benötigt
wird, können wieder Aggregate und Primmorphe® etabliert werden. Ein
gravierender Vitalitätsverlust durch den Einfrier- und Auftauvorgang ist nicht
nachzuweisen. Außerdem zeigen die Zellen nach Bildung von
Aggregaten/Primmorphe® sowohl eine DNA-Synthese als auch eine Proliferation.
Damit ist gezeigt, daß Zellen von Schwämmen, Korallen und anderen
Invertebraten tiefgefroren werde können. Damit ist auch die Möglichkeit gegeben,
Zellen in üblicher Weise zu versenden (z. B. in Trockeneis). Somit können an
einem zentralen Ort Zellen in Kultur genommen werden, also Zellbanken etabliert
werden.
Abb. 1. Bildung von Primmorphe® von Zellen des Schwammes Suberites
domuncula. A. ein Exemplar von S. domuncula; Vergrößerung × 1. Die Zellen
werden durch Behandlung in CMFSW-E dissoziiert. Es bilden sich nach zwei
Tagen in Kultur Zellaggregate [Medium: Seewasser/Antibiotica] B, die an Größe
zunehmen [Aufnahme nach drei bis vier Tagen] C; × 10. Nach üblicherweise fünf
Tagen bilden sich Primmorphe® D; × 10. E und F, Querschnitte durch ein
Primmorphe®, zeigen die mehrzellige Epithel-ähnliche Lage von Pinacozyten,
die den inneren Teil umgibt, der aus spherulösen Zellen, Amoebozyten und
Archaeocyten besteht; E: × 20; F: × 45.
Abb. 2. Telomerase Aktivität in Zellen von S. domuncula. Die Telomerase-Aktivität
wurde bestimmt (i) in Zellen von Gewebe (Spur a), (ii) in Einzel-Zellsuspension [die
Zellen wurden 14 Stunden analysiert], (Spur b) und (iii) in Primmorphe® (Spur c).
Definierte Mengen an Material, entsprechend 5 × 103 Zell-Äquivalenten, wurden
im TRAP Ansatz inkubiert. Nach PCR Amplifikation wurden die Produkte in einem
nicht-denaturierendem Polyacrylamid Gel aufgetrennt; das Gel wurde mit SYBR
Green I gefärbt, um die DNA Fragment sichtbar zu machen.
Abb. 3. Zellen aus Primmorphe© mit dem Ziel dort die DNA-Synthese
nachzuweisen. Hierzu wurden die Primmorphe® in BrdU inkubiert (nähere
Angaben im Text); dabei wird BrdU in die DNA - falls eine DNA-Synthese
stattgefunden hat - eingebaut. Über eine Antikörperreaktion unter Zuhilfenahme
des "BrdU-labeling and detection kit" werden die eingebauten BrdU-Einheiten
nachgewiesen. Diese erscheinen als dunkle Flecken, die den Zell-Kern
markieren. B-D: Zellen aus Primmorphe®, die mit BrdU inkubiert wurden und
anschließend mit dem Identifikationsreagenz behandelt wurden, um BrdU
nachzuweisen. In Abb. 3D ist eine BrdU-positive Zelle, durch Pfeil
gekennzeichnet, gezeigt; eine BrdU-negative Zelle ist markiert durch einen
Pfeilkopf.
Abb. 4. Analyse von Gewebeproben und Primmorphe® auf rRNA. Das Material
wurde extrahiert und die RNA anschließend im Agarose-Gel aufgetrennt. Neben
den beiden eucaryontischen Wirts-rRNAs [euc], 28S und 16S rRNA, werden auch
procaryontische rRNAs [proc], 23S und 16S rRNA, durch Ethidium-Bromid
sichtbar gemacht.
Abb. 5. Einfluß des Phorbolesters Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) auf den
prozentualen Anteil von BrdU-positiven Zellen in Primmorphe© von S.
domuncula. Die Primmorphe® wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von
PMA für zwei Tage inkubiert. Anschließend erfolgte die Bestimmung der DNA
Synthese mittels BrdU-Markierung. Die Kontrolle, prozentualer Anteil von BrdU-
positiven Zellen in Primmorphe® ohne Prüf-Substanz, wurde 100% gesetzt. Pro
Ansatz wurden 300 Zellen gezählt.
Abb. 6. Einfluß von Cadmium, Konzentrationen zwischen 0.1 ng/ml und 100 ng/ml
wurden ausgewählt, auf die Höhe des prozentualen Anteils von BrdU-positiven
Zellen in Primmorphe®.
Abb. 7. Produktion von Suberitine, einem toxischen Protein, in Primmorphe® von
S. domuncula. Primmorphe® wurden kultiviert. Nach 0 [Überführung der
Primmorphe® in die 24-Loch Platten] bis 20 Tagen wurden Primmorphe®
entnommen und auf Bioaktivität hin ausgetestet. Pro Inkubationspunkt wurden in
fünf Parallelansätzen Primmorphe® entnommen, ein Rohextrakt hergestellt und
auf hämolytische Aktivität hin ausgetestet. Der Titer, angegeben in HE
(hämolytische Einheiten), ist bezogen auf 1 mg Proteinextrakt. Die Mittelwerte mit
den Standardabweichungen sind angegeben.* (P < 0.001).
Claims (15)
1. Der Name Primmorphe® zur Bezeichnung von Zell-Aggregaten aus
Schwämmen, Korallen und anderen Invertebraten.
2. Herstellungs-/Kultivierungsmethode von Zell-Aggregaten aus Schwämmen,
Korallen und anderen Invertebraten, die Primmorphe® genannt werden,
nach Anspruch 1, aus Zellen in vitro, in Kultur, die zur DNA Synthese
und/oder Zell-Proliferation befähigt sind.
3. Zell-Aggregate nach Anspruch 2, zur Identifikation von Proliferations-
modulierenden Substanzen.
4. Zell-Aggregate nach Anspruch 2, zur Identifikation von DNA-Synthese-
modulierenden Substanzen.
5. Zell-Aggregate nach Anspruch 2, zur Identifikation, Detektion von
umweltbelastenden Substanzen.
6. Zell-Aggregate nach Anspruch 2, zur Synthese von bioaktiven Substanzen in
vitro und im Bioreaktor.
7. Zell-Aggregate nach Anspruch 2, zur Kultivierung von Bakterien und anderer
Mikroorganismen.
8. Herstellungs-/Kultivierungsmethode von Zell-Aggregaten nach Anspruch 2,
aus Zellen in vitro, in Kultur, um größere Mengen an Gewebe-ähnlichem
Material des entsprechenden Organismus zu gewinnen.
9. Zell-Aggregate nach Anspruch 2, die zur Züchtung in Aquakultur, in
künstlichen Behältnissen, bis zum Auswachsen zu entsprechenden
Organismen genutzt werden.
10. Zell-Aggregate nach Anspruch 2, die zur Züchtung in Aquakultur, in der
Natur, bis zum Auswachsen zu entsprechenden Organismen genutzt
werden.
11. Methode zur Konservierung/Einfrierung von Zellen, Zell-Aggregaten und
Primmorphe® aus Schwämmen, Korallen und anderen Invertebraten.
12. Etablierung von Zellbanken zur Herstellung von Zell-Aggregaten nach
Anspruch 2, aus Zellen in vitro, in Kultur, die zur DNA Synthese und/oder
Zell-Proliferation befähigt sind.
13. Zell-Aggregate nach Anspruch 2, die Bakterien und andere
Mikroorganismen enthalten (Anspruch 7), zur Synthese von bioaktiven
Substanzen in vitro und im Bioreaktor.
14. Benutzung der Zell-Aggregate nach Anspruch 2, zur Identifikation von
Substanzen, die Telomerase-Aktivität modulieren.
15. Benutzung von Gewebe-ähnlichem Material aus Zell-Aggregaten nach
Anspruch 8, hervorgegangen aus Zell-Aggregaten nach Anspruch 2, zur
Abdeckung von Ansprüchen aus 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13 und 14.
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19824384A DE19824384B4 (de) | 1998-05-30 | 1998-05-30 | Herstellung von Primmorphen aus dissoziierten Zellen von Schwämmen und Korallen, Verfahren zur Kultivierung von Zellen von Schwämmen und Korallen zur Produktion und Detektion von bioaktiven Substanzen, zur Detektion von Umweltgiften und zur Kultivierung dieser Tiere in Aquarien und im Freiland |
| JP2000552256A JP2002517188A (ja) | 1998-05-30 | 1999-05-06 | 海綿動物、サンゴ、および他の無脊椎動物由来の単離細胞から、プライムモルフと称される細胞塊を調製および培養する方法、ならびにその使用 |
| US09/701,974 US6664106B1 (en) | 1998-05-30 | 1999-05-06 | Production of primmorphs from disassociated cells of sponges and corals |
| CA002332968A CA2332968A1 (en) | 1998-05-30 | 1999-05-06 | Method of preparing and culturing cell aggregates referred to as primmorphs from dissociated cells from sponges, corals and other invertebrates, and their use |
| AU42585/99A AU754250B2 (en) | 1998-05-30 | 1999-05-06 | The production of primmorphs from disassociated cells of sponges, corals and other invertebrates, and use thereof |
| NZ508602A NZ508602A (en) | 1998-05-30 | 1999-05-06 | The production of primmorphs from disassociated cells of sponges, corals and other invertebrates, and use thereof |
| PCT/EP1999/003121 WO1999063060A1 (de) | 1998-05-30 | 1999-05-06 | Herstellung von primmorphen aus dissoziierten zellen von schwämmen, korallen und weiteren invertebraten und deren verwendung |
| EP99955288A EP1084229A1 (de) | 1998-05-30 | 1999-05-06 | Herstellung von primmorphen aus dissoziierten zellen von schwämmen, korallen und weiteren invertebraten und deren verwendung |
| NO20006051A NO20006051L (no) | 1998-05-30 | 2000-11-29 | Fremgangsmåte for fremstilling av dyrkning av celleaggregater referert til som primmorfer fra dissosierte celler fra svamper, koraller og andre invertebrater, samt anvendelse av disse |
Applications Claiming Priority (1)
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