DE19808969C2 - Verfahren und Gerät zur Isolierung von aeroben und anaeroben prokaryotischen Einzelzellen bzw. Klonen aus Misch- oder Reinkulturen - Google Patents

Verfahren und Gerät zur Isolierung von aeroben und anaeroben prokaryotischen Einzelzellen bzw. Klonen aus Misch- oder Reinkulturen

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
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Description

Eine Voraussetzung für die biochemische und physiologische Untersuchung von Prokaryonten wie auch für ihre technische Verwendung ist die Isolierung und die Handhabung von Reinkulturen. Besonders ökologisch orientierte Mikrobiologen, aber auch Hygieniker oder medizinische Mikrobiologen sind oft mit dem Problem konfrontiert, Reinkulturen aus komplexen Mischungen zu erhalten. Weiterhin ist es für manche Fragestellungen von Interesse, aus einer Reinkultur eine Einzelzelle zu entnehmen. Die Isolierung über konventionelle Plattierungstechniken ist oft schwie­ rig und zeitaufwendig. In vielen Fällen können auch keine Verdünnungstechniken angewendet werden, da andere Prokaryonten als der interessierende in der Mehrzahl sind. Im allgemeinen sind die prinzipiellen Verfahren zur Isolierung von Prokaryonten seit Robert Koch nicht wesentlich verbessert worden (Gerhardt et al., 1994). Einer neuerer Ansatz für die Isolierung von Einzellern stellt die Verwendung von optischen Laserpinzetten dar (Huber et al., 1995), für das aber sehr große Aufwendungen notwendig sind.
Aufgabe der Erfindung soll ein einfach handhabbares Verfahren zur Isolierung von prokaryontischen Einzelzellen aus Mischkulturen oder einzelnen Zellklonen aus einer Kultur sein.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß ein Mikromanipulator mit Kapillare eingesetzt wird. Um die Isolierung von Reinkulturen von Prokaryonten (Bacteria, Archaea) aus komplexen natürlichen Populationen und gemischten Laborkulturen sowie das Klo­ nieren von Einzelzellen aus Reinkulturen zu erleichtern, wurde ein Verfahren ent­ wickelt, mit dem ein einzelner Zellklon aus einer Mischkultur oder Reinkultur direkt zu entnehmen ist (siehe Fig. 1). Die Zelle kann dann kultiviert oder kann in einer Single Cell PCR eingesetzt werden.
Die Isolierung wird mit Hilfe eines Mikromanipulators, der in der Regel für intrazyto­ plasmatische Spermieninjektion (ICSI), Transfer von embryonalen Stammzellen (ES- Cells) in Plastozysten, Transfer von Spermien, Halten von suspendierten Zellen (Oozyten), Mikroinjektion in adhärente Zellen eingesetzt wird, ausgerüstet mit einer Kapillare (siehe Fig. 2), durchgeführt. Diese Methode kann auch zur Isolierung von anderen Mikroorganismen wie z. B. Protozoen, Hefen, Pilzsporen und anderen eukaryontischen Einzelzellen sowie Zellkernen angewandt werden. Für die Isolierung von prokaryontischen Zellen wird der Mikromanipulator weiter mit einem Transjektor oder einer Handpumpe ausgerüstet.
Das Verfahren wird in folgenden Verfahrensschritten durchgeführt:
Aerobe Prokaryonten
  • - Die Probe mit den Prokaryonten wird in sterilem Puffer bzw. in einer anderen Flüssigkeit suspendiert.
  • - Dann wird mit demselben Puffer bzw. Flüssigkeit eine geeignete Verdünnung her­ gestellt.
  • - Die Bakteriensuspension wird auf einem Deckglas als dünner Film ausgestrichen.
  • - Die Kapillare wird vor der Bakterienaufnahme teilweise mit sterilem Puffer bzw. Flüssigkeit befüllt.
  • - Die Spitze der Kapillare vorzugsweise mit Anschliff wird so nahe an die zu iso­ lierende prokaryontische Zelle gebracht, bis ein Tropfen aus der Spitze austritt und die Prokaryontenzelle benetzt.
  • - Die in dem Tropfen suspendierte Prokaryontenzelle wird in die Kapillare einge­ saugt.
  • - Die Einzelzelle wird dann in ein steriles Kulturgefäß mit geeignetem Kulturmedium überführt oder auf die Oberfläche eines sterilen festen Nährmediums aufgebracht und inkubiert.
Anaerobe Prokaryonten
  • - Die Probe mit den Prokaryonten wird in sterilem anaerobem Puffer bzw. Flüssigkeit suspendiert.
  • - Dann wird unter anaeroben Bedingungen mit demselben Puffer bzw. Flüssigkeit eine geeignete Verdünnung hergestellt.
  • - Mit einer Spritze mit Kanüle wird anaerobes Kulturmedium z. B. Hungate-Kultur­ röhrchen entnommen.
  • - Ein Aliquot der Prokaryontenkultur wird unter anaeroben Bedingungen (Inertgas­ atmosphäre, z. B. Stickstoff oder Argon) auf einem Deckglas als dünner Film verteilt.
  • - Die Kapillare wird vor der Bakterienaufnahme teilweise mit sterilem anaerobem Puffer bzw. Flüssigkeit befüllt.
  • - Die Spitze der Kapillare vorzugsweise mit einem Anschliff wird so nahe an die zu isolierende prokaryontische Zelle gebracht, bis ein Tropfen aus der Spitze austritt und die Prokaryontenzelle benetzt.
  • - Die Einzelzelle wird dann z. B. in ein Hungate-Kulturröhrchen mit anaerobem Kulturmedium überführt und inkubiert.
Die Bakterien werden mit einer Kapillare transferiert. Das andere Ende der Kapillare wird mit einem sterilen Öltropfen verschlossen. Bei Bedarf kann die Innenfläche der Kapillare mit Dichlordimethylsilan behandelt werden.
Fig. 1 und 2 zeigen die Verfahrensschritte als auch die Kapillare. Die Kapillare hat vorzugsweise einen Anschliff und hat in Abhängigkeit von der Größe der zu entnehmenden Zelle eine Öffnung bis ca. 100 µm, vorzugsweise von ca. 5 µm-10 µm.
Die Anwendung der Erfindung bringt beispielsweise folgende Vorteile:
  • - Direkte selektive Auswahl einzelner prokaryontischer Zellen aus Mischpopulationen oder Reinkulturen für die Kultur unter dem Mikroskop.
  • - Große Zeitersparnis gegenüber Plattierungstechniken und Verdünnungstechniken zur Isolierung von bestimmten Prokaryonten aus Mischkulturen.
  • - Möglichkeit der Vereinzelung langsamwachsender Prokaryonten, ohne daß diese überwachsen werden können.
  • - Möglichkeit der selektiven Kultivierung von einzelnen, in der Minderheit vorhandener Prokaryonten.
  • - Möglichkeit des direkten Einsatzes von mikroskopisch sichtbaren Prokaryonten- Zellen in der PCR.
Literatur
Eppendorf, Hamburg (
1997
) Katalog: Produkte und Systeme für das Labor, S. 66-71.
Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Wood, W. A., Krieg, N. R. (
1994
) Methods for General and Molecular Bacteriology. American Society for Microbiology, Washington D. C.
Huber, R., Burggraf, S., Mayer, T., Barns, S. M., Rossnagel, P., Stetter, K. O. (
1995
) Isolation of a hyperthermophilic archaeum predicted by in situ RNA analysis. Nature
376
,
57-58
.
Verwendete Bezugszeichen
1
Markierungszeichen
2
Schrägschliff
3
Silylierte Glasoberfläche
4
Steriles Mineralöl
5
Spannkopf

Claims (2)

1. Verfahren zur Isolierung genau einer einzelnen prokaryontischen Zelle oder genau eines einzelnen eukaryontischen Zellkerns unter Verwendung einer Kapillare, dadurch gekennzeichnet, dass:
  • a) die verwendete Kapillare einen Schrägschliff mit einem Winkel von 45 bis 65 Grad aufweist und eine Öffnung von 5 bis zu 100 µm besitzt,
  • b) die Kapillare am anderen Ende mit einem sterilen Öltropfen verschlossen ist,
wobei:
  • a) die einzelnen Zellen oder Zellkerne suspendiert werden,
  • b) eine geeignete Verdünnung hergestellt wird,
  • c) die einzelnen suspendierten Zellen oder Zellkerne als dünner Film auf einem Deckglas ausgestrichen und damit vereinzelt werden,
  • d) die Spitze der Kapillare vor der Aufnahme teilweise mit Flüssigkeit gefüllt wird,
  • e) die Spitze der Kapillare nahe an die zu isolierende Zelle oder Zellkern gebracht wird, und diese mit einem Tropfen aus der Kapillare benetzt werden,
  • f) die in einem Tropfen resuspendierte Zelle oder Zellkern in die Kapillare aufgesaugt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Innenfläche mit Dichlordimethylsilan behandelt ist.
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HARBECK et al., A technique for isolating single cells for analysis by reverse transcription poly- merase chain reaction. In: Anal. Biochemistry. 1995, Vol. 230, S. 193-196 *
HUBERT et al., Isolation of a hyperthermophilic archaeum predicted by in situ RNA analysis. In: Nature. 1995, Vol. 376, S. 57-58 *

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