DE19807338A1 - Kapazitive Vorrichtung für die Detektion der Polynukleotid-Hybridisierung - Google Patents

Kapazitive Vorrichtung für die Detektion der Polynukleotid-Hybridisierung

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DE19807338A1
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Vladimir M Mirsky
Michael Riepl
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MIRSKY
WOLFBEIS
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MIRSKY
WOLFBEIS
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
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    • G01N27/221—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance by investigating capacitance by investigating the dielectric properties

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung, die geeignet ist die Hybridisierung von Nukleotidsequenzen mittels kapazitiver Messungen detektieren zu können.
Dazu wird ein Oligo- oder Polynukleotidstrang auf die Oberfläche einer Elektrode immobilisiert. Auf Zugabe der komplementären Nukleotidsequenz erfolgt eine Änderung der Elektrodenkapazität, welche durch ein Meßgerät registriert werden kann.
In den Bildern sind typische Meßdaten der Erfindung dargestellt. Sie sind im folgenden näher beschrieben. Es zeigt
Bild 1 die kovalente Immobilisierung einer biotinylierten Polynukleotidsequenz auf Elektroden, welche mit Mercaptohexadecansäure und Avidin beschichtet waren. Die Beschichtung wird durch Kapazitätsänderungen verfolgt.
Bild 2 die kapazitive Detektion der Polynukleotid-Fragmente. Die komplementäre Polynukleotidsequenz ist dabei kovalent an eine ω-funk­ tionalisierte Alkylthiolschicht auf einer Goldlegierung gebunden.
Bild 3 die Hybridisierung des immobilisierten Polynukleotidstranges mit seinem komplementären Gegenstück. Die Kapazitätsänderung wird zeitlich verfolgt.
Bild 4 die Gesamtänderung der Kapazität, aufgeteilt auf die Einzelschritte der Sensorvorbereitung und Anwendung.
Beispiel Sensor für die Detektion der Hybridisierung von Polynukleotidsequenzen Vorbereitung der Elektroden
Silizium-Wafer Stückchen mit einer Größe von 3,20 mm × 10,02 mm und einer Stärke von 450 µm werden in einem allgemein üblichen Sputterprozeß oder Bedampfungsprozeß mit einer Elektrode der Größe 1,56 mm × 1,56 mm (reaktive Oberfläche) und einer Zuleitung von 10 µm Breite und 6,65 mm Länge versehen. Die Elektrode wurde aus Titan- und Palladiumschichten (Haftvermittler, jeweils 50 nm dick) und einer deckenden Schicht aus Goldlegierung (200 nm) aufgebaut. Als Kontaktstelle für das Meßsystem wird am oberen Ende der Zuleitungen ein versilberter Draht angelötet. Die Reinigung erfolgte in mehreren Schritten. Zuerst wurden die Wafer 30 min vollständig in Chloroform getaucht. Nach dem Trocknen im Stickstoffstrom wurden die Wafer in eine 1 : 1 (v/v) Mischung aus Chloroform und Methanol getaucht und 10 min im Ultraschallbad behandelt. Analog zu dem verwendeten Chloroform kann man bei diesen Reinigungsschritten auch Ethanol (99%) und eine 1 : 1 (v/v) Mischung aus Ethanol und Methanol benutzen. Die Wafer mit Goldlegierung wurden für 5 min in eine heiße 3 : 1 (v/v) Mischung aus konzentrierter Schwefelsäure und 30% Wasserstoffperoxid getaucht. Die Elektroden wurden gründlich mit Reinstwasser (Millipore: Mili-QPlus-185; 18,2 MΩ. cm-1) gespült und getrocknet. Alle Glas- und Teflongeräte wurden vor ihrer Verwendung in analoger Weise gereinigt, um eine Kontaminierung mit möglichen Adsorbat-Molekülen zu verhindern.
Beschichtung der Elektroden
Zur Beschichtung wurde eine Chloroform-Lösung verwendet, welche 5 mM Mercaptohexadecansäure enthalten hat. Durch 15stündiges Eintauchen des Wafers bei Raumtemperatur in die ungerührte Beschichtungslösung wurde die Oberfläche der Elektrode mit dem Alkylthiol beschichtet. Zum Entfernen überschüssiger, auf der Oberfläche haftender Moleküle spülte man die Elektrode 15 Sekunden mit Chloroform. Nach dem Trocknen im Stickstoffstrom und mehrmaligem Waschen mit Reinstwasser wurde die Elektrode in die Meßzelle eingebaut.
Durchführung der Messung
Die Waferplatte mit der alkylthiolbeschichteten Elektrode wurde gemeinsam mit einer Ag/AgCl Referenzelektrode (Oberfläche ca. 1 cm2) an einem Teflonhalter befestigt, der als Deckel für die Meßzelle (Eppendorf-Cup 1,5 ml) dient und eine Öffnung für die Zugabe und Entnahme von Flüssigkeiten besitzt. Die Zelle wird mit Elektrolyt (100 mM KCl; pH 5,1; ca. 350 µl) soweit gefüllt, daß die reaktive Oberfläche der Goldelektrode und die Referenzelektrode (Ag/AgCl) vollständig eintauchen. Für eine gleichmäßige Durchmischung sorgt ein Magnetrührer. Ein Lock-in-Verstärker mit integriertem Sinusgenerator erzeugt ein konstantes Sinussignal mit einer Frequenz von 20 Hz und einer Amplitude von 10 mV. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur (22°C) durchgeführt. Der Lock-in- Verstärker wird auch zur Registrierung des kapazitiven Stroms verwendet. Zusätzlich zu der Wechselspannung wird eine Gleichspannung über einen Spannungsgeber zugegeben. Erfolgt die Adsorption von Molekülen auf die Elektrodenoberfläche, wurde dieses als Kapazitätsänderung gemessen. Das Meßsignal wurde auf einen x-t Schreiber aufgezeichnet und über einen 16 bit A-D Umwandler in den Rechner übertragen. Zu Beginn der Messung wurde die absolute Kapazität der beschichteten Elektroden bei einem elektrischen Potential von +300 mV bestimmt. Man erhielt Anfangswerte von ca. 1,8 µF/cm2 für Elektroden aus Goldlegierung und ca. 4 µF/cm2 für Palladiumelektroden.
Immobillsierung
Die Immobilisierung von Polynukleotidsequenzen erfolgt auf 2 unterschiedliche Arten. Bei der Verwendung von aminoterminierten Sequenzen wird zuerst die endständige COOH-Gruppe der Mercaptohexadecansäure aktiviert. Die Aktivierung kann u. a. durch N-Hydroxysuccinimid erfolgen. Dazu werden die beschichteten Elektroden in 5 ml Dioxan getaucht und die Lösung wird 10 Minuten lang gerührt. Nach Zugabe von 50 mg Dicyclohexylcarbodiimid and 25 mg of N-Hydroxysuccinimid wird die Lösung weitere 4 Stunden gerührt. Nach der Reinigung der aktivierten Elektrode mit Dioxan und Methanol wird sie in die Meßzelle gegeben. Die Kapazitätsänderung bei Zugabe einer aminofunktionalisierten DNA-Sequenz gibt die Immobilisierungsrate an. Verwendet man das wasserlösliche Carbodiimid EDC als Reagenz so kann die Immobilisierung direkt in der Meßzelle ohne externe Aktivierung erfolgen. Verwendet man biotinylierte Polynukleotidsequenzen wird die Immobilisierung von Avidin an die aktivierten endständigen COOH-Gruppen der Mercaptohexadecansäure notwendig, dann kann nach Spülen und Pufferwechsel die Polynukleotidsequenz durch die Avidin-Biotin Bindung mit der Oberfläche verknüpft werden (Bild 1).
DNA-Detektion
Die Detektion von DNA erfordert den Aufbau einer sensitiven Oberfläche, wie sie in der Beschreibung der Beschichtungs- und Immobilisierungsschritte beschrieben sind. Die Messung erfolgt in einem Eppendorf-Cup, der 350 µl Puffer (pH 7,1; 100 mM NaCl, 5 mM Imidazol) enthält. Zu einem Biosensor mit der Struktur Au(Legierung)-S-(CH2)15-CO-NH-DNA oder Au(Legierung)-S-(CH2)15-CO-N H-Avidin-Biotin-DNA werden unterschiedliche Konzentrationen an komplementärer DNA gegeben und die Hybridisierung wird als Kapazitätsänderung verfolgt (Bild 2). Bei Zugabe einer konstanten Menge des komplementären Stranges wurde die Kinetik der Hybridisierung kapazitiv gemessen (Bild 3). Die Zugabe von nichtkomplementärer DNA und RNA zeigt hingegen keine oder geringere Kapazitätsänderungen an.

Claims (1)

  1. Eine Vorrichtung um die Hybridisierung von Polynukleotidsequenzen zu detektieren, gekennzeichnet dadurch, daß sie aus einer Elektrode, Polynukleotidsträngen die auf der Elektrode immobilisiert sind und einem Gerät mit dem man die elektrische Kapazität der Elektrode messen kann, besteht.
DE19807338A 1998-02-20 1998-02-20 Kapazitive Vorrichtung für die Detektion der Polynukleotid-Hybridisierung Withdrawn DE19807338A1 (de)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2001053818A2 (de) * 2000-01-21 2001-07-26 Infineon Technologies Ag Messverfahren und sensorvorrichtung für die chemische und pharmazeutische analytik und synthese

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001053818A2 (de) * 2000-01-21 2001-07-26 Infineon Technologies Ag Messverfahren und sensorvorrichtung für die chemische und pharmazeutische analytik und synthese
WO2001053818A3 (de) * 2000-01-21 2002-03-21 Infineon Technologies Ag Messverfahren und sensorvorrichtung für die chemische und pharmazeutische analytik und synthese

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