DE19733255C2

DE19733255C2 - Hydrolysestabile Analoga des GM¶3¶-Gangliosid-Lactons, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

Info

Publication number: DE19733255C2
Application number: DE19733255A
Authority: DE
Inventors: Lutz F Tietze; Holger Keim
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-08-01
Filing date: 1997-08-01
Publication date: 2000-08-24
Anticipated expiration: 2017-08-02
Also published as: DE19733255A1

Description

Die Behandlung maligner Tumore ist mit den heute zur Verfügung stehen den, fast ausschließlich chemotherapeutisch wirksamen Präparaten nur un ter Inkaufnahme gravierender Nebenwirkungen möglich. Die Wirksamkeit dieser Medikamente wurde immer weiter verbessert, doch ein entscheiden des Problem blieb bis heute ungelöst: Wie kann gesundes von malignem Gewebe unterschieden werden, d. h. wie kann erreicht werden, daß selektiv das maligne Gewebe erkannt und zerstört wird? Oberstes Ziel muß es sein, genetische und phänotypische Unterschiede von normalen und malignen Zellen zu nutzen, um eine höhere Selektivität zu erzielen.

Ein eleganter Ansatz ist die Ausnutzung von Unterschieden auf der Oberflä che der Zellmembran für immuntherapeutische Ansätze. So wird das GM₃- Gangliosid auf der Oberfläche von Melanomzellen in erhöhter Dichte vergli chen mit den Normalzellen gefunden (W. B. Hamilton et al., Intern. J. Can cer 1993, 53, 566). Es wird angenommen, daß ein kleiner Teil in der ent sprechenden Lactonform vorliegt. Die Ursachen hierfür sind noch nicht ab schließend geklärt; es ist jedoch möglich, daß die Bildung des Lactons auf das Vorliegen eines erniedrigten pH-Wertes im Tumor zurückzuführen ist. Das GM₃-Gangliosid-Lacton stellt somit das eigentliche tumorassoziierte Antigen dar (G. Magnusson et al., Alfred Benzon Symp. 36, Copenhagen, 1994, S. 89) und bietet einen Ansatzpunkt für eine Immuntherapie. Aus Im munisierung von Mäusen mit Melanomzellen erhaltene Antikörper erkennen das GM₃, reagierten aber wesentlich besser mit dem GM₃-Lacton. Da die Lactonform in Lösung jedoch nicht stabil ist (G. A. Nores et al., J. Immunol. 1987, 139, 3171), ist es nicht möglich, durch Applikation von GM₃- Gangliosid-Lacton Antikörper zu gewinnen. Daher ist die Synthese von hy drolysestabilen Analoga mit vergleichbarer räumlicher Struktur erforderlich, um damit die Möglichkeit einer aktiven Immunisierung gegen ein genau de finiertes Immunogen zu eröffnen.

Die Rolle der Ganglioside in der Krebstherapie 1. Eigenschaften

Die maligne Transformation gesunder Zeilen geht mit einer Änderung ihrer Oberflächenstrukturen einher, die ihrerseits intrazelluläre Regelkreise und die Interaktion mit Normalgeweben sowie immunologische Abwehrmechanismen beeinflussen. Neben Proteinen und Lipiden stellen Kohlenhydrate wesentliche Elemente der Zelloberfläche dar, unter denen Ganglioside einen Hauptanteil ausmachen. Ganglioside gehören zu den Glycosphingolipiden und sind aus einem Oligosaccharidanteil, dem Sphingosin und einer langkettigen Fettsäure aufgebaut und in allen menschlichen und tierischen Geweben weit verbreitet. Sie werden im Organismus durch eine schrittweise Addition von aktivierten Zuckern an das Ceramid synthetisiert. UDP-Glucose, UDP-Galactose, UDP- N-Acetylgalactosamin und CMP-N-Acetylneuraminat dienen als Glycosyldo noren. Die Struktur des zelleigenen Gangliosids wird durch die Spezifität der Glycosyltransferasen der jeweiligen Zelle bestimmt. Der Ceramidteil ist in der Lipiddoppelschicht der Membran verankert, während der Kohlenhydratteil an der Außenseite der Membran lokalisiert ist und senkrecht zur Achse des Ceramids entlang der Zelloberfläche verläuft. An diese nach außen gerichtete hydrophile Struktur können viele Liganden mit komplementären Strukturen wie z. B. Antikörper, Lectine, bakterielles Adhesin und auch andere Kohlenhy dratstrukturen binden.

Bisher konnten über 150 verschiedene Ganglioside identifiziert werden. Man hat sie in drei Hauptgruppen, die sich nur in ihrer Kohlenhydratstruktur un terscheiden, klassifiziert. Tabelle 1 zeigt die wichtigsten eingeteilt in Ganglio-, Globo-, und Lacto-Gruppe (H. Wiegandt, aus "Gangliosides and Cancer", 1. Aufl., 1994, 5; S. I. Hakomori, Biochem. Soc. Trans., 1993, 21, 583).

Tabelle 1

Strukturen der Ganglio-, Globo-, Lacto-Serie

2. Funktion der Ganglioside

Die genaue Funktion von Gangliosiden ist im Detail noch weitgehend uner forscht. Es existieren gesicherte Erkenntnisse, daß Ganglioside und ihre De rivate das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung sowie die Zell-Zell- Interaktionen beeinflussen. Zugleich spielen sie eine bedeutende Rolle in der Modulation der Immunantwort durch Abspaltung der Ganglioside von malignen Zellen (Y. A. Hannun, R. M. Bell, Science, 1989, 243, 500).

Neben der Erkennung von Kohlenhydratstrukturen auf der Zelloberfläche durch Proteine und der Zell-Zell-Erkennung vermittelt durch Lectine, scheinen Wechselwirkungen komplementärer Kohlenhydrateinheiten auf verschiedenen Zellen eine große Rolle zu spielen. Man fand zum Beispiel eine spezifische Adhäsion zwischen Melanomzellen B16 und Maus-Lymphomzellen L5178 AA12, welche auf eine Erkennung zwischen den komplementären Gangliosi den GM₃ (NeuAca2,3Galb1,4Glcβ1,4Cer) auf den Melanomzellen und Gg₃ (GalNAcb1,4Galb1,4Glcβ1,4Cer) auf den Lymphomzellen zurückgeführt wur de. Die analoge mutante Lymphomzellinie L5178 AV27, die kein Gg₃ expri miert, wird von den Melanomzellen nicht erkannt. Die Oberflächenprofile bei der Ganglioside besitzen gemeinsame Strukturmerkmale auf der Zelloberflä che, sie zeigen eine hydrophobe und eine hydrophile Seite, die zueinander komplementär sind. Diese Zell-Zell-Interaktionen durch Glycosphingolipide stellen nur den ersten Schritt zellulärer Interaktionen dar, der gefolgt wird von der Bindung durch adhäsive Proteine und Integrin-Rezeptoren. In diesem Zu sammenhang ergibt sich die Frage nach der Beeinflussung des Zellwachs tums durch Ganglioside.

2.1. Regulation des Zellwachstums

Die an der Regulation des Zellwachstums beteiligten und von Gangliosiden beeinflußten Mechanismen sind unterschiedlich. Von den drei Hauptmecha nismen der Signalübermittlung über die Membran, die das Wachstum der meisten eukaryontischen Zellen regulieren, werden zwei durch Glycosphin golipide beeinflußt. Es wird eine noch unbekannte gangliosidabhängige Proteinkinase postuliert (B. S. Hilbush, M. Levine, Proc. Nat. Acad. Sci. 1991, 88, 5616; F. J. Sharom, A. L. H. Chiu, J. W. K. Chu, Biochim. Biophys. Acta, 1991, 1094, 35; Y. Yada, Y. Okano, Y. Nozawa, Biochem. J., 1991, 279, 665), die in Abhängigkeit vom Zellzyklus zusammen mit Proteinkinase C die hemmende oder proliferative Wirkung von GM₁ auf die Zellen vermit telt. Die Ganglioside interagieren hier unmittelbar mit der Proteinkinase, während die G-Proteine, das dritte Regulationssystem, davon unbeeinflußt bleiben. In anderen Untersuchungen ist die direkte Modulation von Mem branproteinen mit Rezeptorfunktion nachgewiesen worden. So verhindert GM₁ die Phosphorylierung des PDGF-Rezeptors bei 3T3-Zellen, LM1 die Phosphorylierung des Insulinrezeptors bei bestimmten Leukämiezellen (H. Nojiri, M. Stroud, S. Hakomori, J Biol. Chem., 1991, 266, 4531) und GM₃ die Phosphorylierung des EGF-Rezeptors bei Zellen von Hautkarzinomen (S. Hakomori, Prog. Brain Res., 1994, 101, 24).

In Ovarialkarzinom KB-Zellen und A431 Zellen, die ebenfalls stark vom "epi dermal growth factor" (EGF) abhängig sind, wurde nach Zugabe von GM₃ die Funktion des EGF-Rezeptors herabgesetzt (F. M. B. Weis, R. J. Davis, J. Biol. Chem., 1990, 265, 12059). Außerdem beeinflussen Metabolite der Glycos phingolipide wie zum Beispiel lyso-GM₃ und de N-Acetyl-GM₃ die Wachs tumsregulation (Q. Zhou, S. Hakomori, K. Kitamura, Y. Igarashi, J. Biol. Chem., 1994, 269, 1959). In allen Fällen resultiert eine Hemmung der Zell teilung, die mit einer Differenzierung der Tumorzellen verbunden sein kann. Als gültige Erklärung wird das Modell von Hakomori (S. Hakomori, J. Biol. Chem., 1990, 265, 18713; S. Hakomori, Acta Anat. 1998, 161, 79) angese hen. Nach diesem Modell besetzen die spezifischen Ganglioside in Abhän gigkeit von ihrer Konzentration in der Zellmembran allosterische Bindungs stellen an Rezeptoren für Wachstumsfaktoren. Das verhindert die Oligomeri sierung und Phosphorylierung der Rezeptoren und führt infolgedessen zu ei ner Unterbrechung des Teilungssignals.

2.2. Ganglioside als tumorassoziierte Antigene

Das an der Oberfläche einer Zelle exprimierte Kohlenhydratmuster ist ab hängig von der Spezies und dem Zelltyp sowie von Funktionszustand und Differenzierungsgrad von Zellen. Auf der Oberfläche maligner Tumore kann man ein gegenüber der Normalzelle verändertes Muster an Gangliosiden finden (H. Seiffert, G. Uhlenbruck, Die Naturwissenschaften, 1965, 52, 190). So sind auf Zellen maligner Melanome die Ganglioside GM₃, GM₂, GD₃ und GD₂ stark exprimiert. In Gehirntumoren korreliert die Expression spezifischer Ganglioside mit der Histologie und dem Tumorstadium. Nach Hakomori sind in Tumorzellen folgende Veränderungen festzustellen (S. I. Hakomori, R. Kannagi, JNCl, 1983, 71, 231; S. Hakomori, aus "Gangliosides and Can cer", 1. Aufl., 1994, 57):

1. Akkumulation von einfachen Glycolipiden, da Glycosyltransferasen, welche die Synthese höherer Glycolipide katalysieren, blockiert werden.
2. Verstärkte Bildung von Neoglycolipiden, also eine Verschiebung von einer Glycolipidserie zu einer anderen.
3. Verlust an "contact response", d. h. keine Einschränkung des Wachstums bei zunehmender Eingrenzung durch benachbarte Zellen.
4. Veränderte Organisation und Ausrichtung der Glycolipide auf der Membran.

Mit Hilfe monoklonaler Antikörper konnten viele Ganglioside als sogenannte tumorassoziierte Antigene identifiziert und in vier Gruppen klassifiziert werden:

1. Ganglioside, die nur auf Tumorzellen vorhanden sind und auf Normalzellen nicht bzw. nur in Spuren exprimiert werden.
2. Ganglioside, die nur auf Tumorzellen in hoher Konzentration vorhan den sind, auf den entsprechenden Normalzellen nicht und in anderen Zellen nur in Spuren exprimiert werden.
3. Ganglioside, die aufgrund einer Umorganisation der Zellmembran sehr viel exponierter vorliegen.
4. Ganglioside, die im Organismus weit verbreitet sind, aber auf der Tumorzelle in höherer Konzentration als auf der Normalzelle vorliegen.

Das GM₃-Gangliosid gehört zur vierten Gruppe und ist eines der wichtigsten Ganglioside. Als tumorassoziiertes Antigen kommt ihm eine besondere Be deutung zu.

2.3. Das GM₃-Gangliosid und sein Lacton

Das GM₃-Gangliosid ist das kleinste aller Sialylganglioside und Ausgangsver bindung in der Biosynthese der höheren Ganglioside. Der Oligosaccharidteil besteht aus den drei Monosacchariden D-Glucose, D-Galactose und N- Acetylneuraminsäure.

Abb. 5: GM₃-Gangliosid A und GM₃-Gangliosid-Lacton B

GM₃ wurde in Nervenzellen und einigen malignen Zellarten, insbesonders in Melanomzellen, in stark erhöhter Konzentration gefunden. Durch Immunisie rung von Mäusen mit B 16 Melanomzellen konnten Antikörper gewonnen werden, die mit dem GM₃-Gangliosid A wechselwirken und daneben auch die Lactonform B dieses Gangliosids erkennen (G. A. Nores, T. Dohi, M. Tani guchi, S. I. Hakomori, J. Immunol., 1987, 139, 3171). Es konnte gezeigt werden, daß diese Antikörper eine im Vergleich zu GM₃ A erhöhte Affinität zu dem entsprechenden GM₃-Lacton B aufweisen, das aus GM₃ A in vitro durch Umsetzung mit HCl gebildet werden kann. Andererseits zeigt das GM₃- Gangliosid keine immunogene Wirkung, während die Lactonform die Bildung von Antikörpern induziert. Außerdem wurde nach extensiver Immunisierung von C57/BL6 Mäusen mit dem Lacton ein beschleunigtes Tumorwachstum induziert, während eine schwache Immunisierung eine eindeutige Rückbil dung der Tumore bewirkte. Dieser Befund läßt den Schluß zu, daß die Lac tonform und nicht das offene GM₃ das eigentliche Immunogen ist.

Zugleich wurde eine starke Abhängigkeit der Reaktivität des Antikörpers von der GM₃-Dichte festgestellt und die Existenz eines Grenzwertes beobachtet, bei dem der Antikörper die Melanomzelle erkennt, bzw. unbehelligt läßt (T. Dohi, G. Nores, S. I. Hakomori, Cancer Research, 1988, 48, 5680). Dieser Befund ist von großer Bedeutung für die Entwicklung eines möglichen Impf stoffes gegen Melanome und im weiteren für maligne Tumore generell, da damit die Hoffnung auf den Einsatz von Antikörpern als melanomselektive Transporter, der selektiv ausschließlich an die onkogen transformierte Zelle bindet, verbunden ist.

Erste Hinweise, daß die Lactonbildung tatsächlich in vivo auf der Membran von Tumorzellen erfolgt, ergab die Reduktion einer Gangliosidfraktion, die aus Gehirngewebeproben von Mäusen unter neutralen Bedingungen isoliert und mit NaBT₄ behandelt wurde. Es wurden hierbei Nonalosamin und Glycosan erhalten. Die Bildung dieser Verbindungen sollte nur bei Vorliegen eines an der Carboxylgruppe aktivierten GM₃ wie z. B. des GM₃-Lactons B erfolgen, da GM₃ A selbst nicht mit NaBT₄ reagiert (S. K. Gross, M. A. Williams, R. H. McCluer, J. Neurochem., 1980, 34, 1351). Die biologische Relevanz der Gangliosidlactone wird unterstrichen durch die Ergebnisse einer Untersu chung des Gangliosidmusters von 20 Melanomzellinien. Dabei wurden in 16 der 20 untersuchten Proben Gangliosidlactone nachgewiesen (G. A. Nores, T. Dohi, M. Taniguchi, S. I. Hakomori, J. Immunol., 1987, 139, 3171). Ungeklärt blieb aber die Frage, ob diese Ergebnisse ganz oder teilweise Artefakte der Aufarbeitung waren.

Erste Versuche eines direkten Beweises der in vivo Bildung des GM₃-Lactons B auf Melanomzellen wurden im Arbeitskreis von L. F. Tietze von F. Fütterer durchgeführt (M. Fütterer, Dissertation Göttingen 1995). Mittels nicht invasiver, on-line ¹³C-NMR-Spektroskopie an immobilisierten Zellen gelang der Nachweis, daß extern zugeführtes GM₃-Gangliosid, welches an C-1" der Neuraminsäure zu annähernd 100 Prozent ¹³C-markiert war, in die Zellmem bran eingelagert wird und dort für einen längeren Zeitraum verbleibt. Die Lactonbildung wurde anhand der Bildung eines zusätzlichen Signals für C-1", welches durch die Lactonisierung entsteht, verfolgt. Die Nachweisempfind lichkeit der Methode liegt bei einem Prozent. Da bei den Untersuchungen ein Signal für das Lacton nicht eindeutig nachgewiesen werden konnte, muß an genommen werden, daß das Lacton auf der Zelloberfläche nur in geringen Mengen gebildet wird (D. Gretzke, Dissertation Göttingen 1999).

Das isolierte GM₃-Lacton B zeigt eine geringe Halbwertszeit unter physiologi schen Bedingungen. Bei pH 7.4 erfolgte innerhalb von zwei Sunden eine fast vollständige Hydrolyse zum offenen GM₃. Diese Hydrolyse konnte von M. Fütterer NMR-spektroskopisch sowohl in reinem Nährmedium als auch an Melanomzellen nachgewiesen werden. Aus diesem Grund ist eine aktive Im munisierung mit dem Lacton, obwohl bereits durchgeführt, wenig sinnvoll, da nach kurzer Zeit nur noch geringste Mengen zur Verfügung stehen und somit Zweifel über das eigentliche Immunogen angebracht sind.

Kürzlich konnte ein GM₃-Lactam synthetisiert und zur Immunisierung einge setzt werden. Die Struktur des Lactams wurde mittels NMR-Spektroskopie als mit der des Lactons übereinstimmend identifiziert. Das Lactam besitzt gegenüber dem Lacton eine größere Stabilität bei neutralem pH-Wert und ist daher wesentlich besser zur Herstellung monoklonaler Antikörper geeig net. Es wurden IgG-Antikörper erhalten, die das GM₃-Lacton und das GM₃- Lactam erkennen, nicht aber die offene, nicht-lactonisierte Form des GM₃- Gangliosids (K. Ding, A. Rosén, A. K. Ray, G. Magnusson, Glucoconjugate J., 1992, 9, 303; G. Magnusson, K. Ding, K. Nilsson, A. K. Ray, A. Rosen, H. O. Sjögren aus "Complex Carbohydrates in Drug Research", A. Benz. Symp. 36, 89, Copenhagen 1994). Nach Inkubation von Melanomzellen mit diesem Antikörper wurde eine Wachstumshemmung beobachtet, was auf die Möglichkeit einer passiven Immunisierung deutet. Allerdings zeigt auch das Lactam eine geringe Hydrolysetendenz (M. Wilstermann, L. O. Kono nov, U. Nilsson, A. K. Ray, G. Magnusson, J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 474), so daß auch hier kein genau definiertes Immunogen vorliegt.

Für die Diagnostik und Therapie von malignen Tumoren wäre es jedoch von großem Wert, wenn hochaffine Antikörper gegen das GM₃-Lacton zur Verfü gung ständen. Mit Hilfe der erhaltenen Antikörper wäre eine genaue Lokalisa tion der Gangliosid-Lactone im Tumorgewebe möglich. Über die Charakteri sierung ihrer biologischen Funktion hinaus eröffnen sie auch neue therapeuti sche Perspektiven. So können Anti-Lacton-Antikörper möglicherweise Wachstums- und Differenzierungsvorgänge von Tumorzellen und Zell-Zell- Interaktionen während der Tumorprogression beeinflussen. Wenn in vivo mit diesen Antikörpern eine Differenzierung zwischen normalen und malignen Zellen möglich ist, wäre ihr Einsatz zum Tumortargeting denkbar, beispiels weise im Rahmen einer ADEPT-Therapie. Außerdem würde die Entwicklung eines Vakzines zur körpereigenen Erkennung von GM₃-Lacton eine Verstär kung der Immunanwort gegen maligne Zellen ermöglichen. Die Anforderun gen, die an ein geeignetes Hapten gestellt werden, sind zum einen eine glei che oder sehr ähnliche räumliche Struktur wie das GM₃-Lacton und zum an deren eine große Stabilität bei neutralem bzw. schwach saurem pH-Wert, um Hydrolyseprodukte als mögliche Immunogene ausschließen zu können. Die erste Anforderung wird sowohl vom GM₃-Lactam als auch vom GM₃-Lacton erfüllt, aber beide Verbindungen sind bei nahezu neutralem pH-Wert nicht sta bil. Daher sind sie für die Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen GM₃-Lacton nur sehr schlecht geeignet. Für die Entwicklung eines Vakzines sind sie vollständig ungeeignet, da es bei der Immunisierung zu gefährlichen Cross-Reaktionen kommen wird.

Neben der Gewinnung von Antikörpern bieten GM₃-Lacton-Analoga die Möglichkeit weiterer Untersuchungen über die biologische Funktion der GM₃-Lactone. In Zellkultur können Funktionsanalysen durchgeführt werden, um die Bedeutung der Lactonisierung für die Tumorzelle zu überprüfen. Der Einfluß auf Proliferations- und Invasionseigenschaften der Tumorzelle sowie auf die Signaltransduktion von Rezeptortyrosinkinasen kann untersucht werden. Hierfür können aber ebenfalls nur hydrolyse-stabile Analoga des GM₃-Lactons eingesetzt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Analoga des GM₃-Gangliosid- Lactons I.

R der allgemeinen Formel I steht für eine Hydroxylschutzgruppe oder Reste der allgemeinen Formel

(3) (CH₂)_nCH₃ (linear oder verzweigt)
(4) (CH₂)_nCO₂R' (linear oder verzweigt)
worin R' Wasserstoff, Alkyl, Phenyl oder Benzyl bedeutet und m bzw. n Zahlen von 0 bis 30 sind.

Außerdem wurde ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung der allgemeinen Formel I gefunden, dadurch gekennzeichnet, daß Verbindungen der allgemeinen Formel II

in welcher R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ für eine Hydroxylschutzgruppe ste hen, in organischen Lösungsmitteln und für einzelne Derivatisierungsschritte in Anwesenheit eines Katalysators umgesetzt werden.

Hydroxylschutzgruppen im Rahmen der oben angegebenen Definitionen steht im allgemeinen für eine Schutzgruppe aus der Reihe: tert.Butoxydiphenylsilyl, Trimethylsilyl, Triethylsilyl, Triisopropylsilyl, tert.Butyldimethylsilyl, Triphenylsilyl, Trimethylsilylethyl, Trimethylsilylethoxy carbonyl, Benzyl, Benzyloxycarbonyl, 2-Nitrobenzyl, 4-Nitrobenzyl, 2- Nitrobenzyloxycarbonyl, 4-Nitrobenzyloxycarbonyl, tert.Butyloxycarbonyl, Allyl, Allyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, For myl, Acetyl, Trichloracetyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, 2,4- Dimethoxybenzyl, 2,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, Methylthiomethyl, Me thoxyethoxymethyl, [2-(Trimethylsilyl)ethoxy]methyl, 2- (Methylthiomethoxy)ethoxycarbonyl, Benzoyl, 4-Methylbenzoyl, 4- Nitrobenzoyl, 4-Fluorobenzoyl, 4-Chlorbenzoyl oder 4-Methoxybenzoyl. Be vorzugt sind Acetyl, Benzyl, Benzoyl, Trimethylsilylethyl oder 4- Methoxybenzyl.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann durch folgende Formelschemata beispielhaft erläutert werden:

Die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgt nach üblicher Methode in inerten Lösungsmitteln in Anwesenheit einer Base oder durch Hydrogenolyse.

Als Basen eignen sich für die Abspaltung die üblichen anorganischen Ba sen. Hierzu gehören bevorzugt Alkalihydroxide, Erdalkalihydroxide oder Al kalicarbonate wie Natrium- oder Kaliumcarbonat oder Natriumhydrogencar bonat oder organische Basen wie Natriummethanolat, Natriumethanolat, Kaliummethanolat, Kaliumethanolat oder Kalium-tert.Butanolat. Besonders bevorzugt werden Kaliumcarbonat oder Natriummethanolat eingesetzt.

Als Lösungsmittel eignen sich für die Abspaltung bevorzugt Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol oder Butanol, bevorzugt wird Methanol verwendet.

Die Abspaltung wird im allgemeinen in einem Temperaturbereich von 0°C bis +100°C, bevorzugt von +20°C bis +40°C durchgeführt.

Die Abspaltung von speziellen Hydroxyschutzgruppen (z. B. Benzylgruppen) erfolgt durch hydrogenolytische Spaltung in Anwesenheit eines Katalysators, beispielsweise Palladium/C, Palladium/CaCO₃, Palladium/BaSO₄ oder Ra ney-Ni, mit Wasserstoff in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C, vor zugsweise Raumtemperatur, unter Normaldruck oder erhöhtem Druck. Als Lösungsmittel eignen sich für die Abspaltung bevorzugt Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol oder Butanol, oder Ester wie Es sigsäureethylester oder Essigsäuremethylester, oder auch Säuren wie Es sigsäure oder Ameisensäure, bevorzugt wird Methanol oder Essigsäure verwendet.

Die Cyclisierung wird in einer organische Säure wie Essigsäure oder Amei sensäure oder einer Kombination aus organischem Lösungsmittel und Mine ralsäure durchgeführt. Bevorzugt wird Essigsäure bzw. die Kombination Salzsäure/Diethylether.

Die Kombination von hydrogenolytischer Abspaltung und Cyclisierung ist durch Kombination der beiden Methoden möglich. Bevorzugt wird eine Ka talyse mit Palladium/C in Essigsäure bei Raumtemperatur unter Wasser stoffnormaldruck.

Die Reduktion zum Lactol ist mit Reduktionsmitteln wie NaH[Al(CH₂CH₂OMe)₂OEt], Alkali-Boranen, wie Li-Selectride, Alkali- bzw. Erdalkaliborhydriden, wie Lithiumborhydrid oder Zinkborhydrid oder lewis sauren Aluminiumhydriden, wie Diisobutylaluminiumhydrid möglich. Beson ders bevorzugt wird NaH[Al(CH₂CH₂OMe)₂OEt] eingesetzt.

Als Lösungsmittel eignen sich etherische Lösungsmittel wie Diethylether oder Tetrahydrofuran oder auch halogenierte Lösungsmittel wie Dichlor methan oder Chloroform. Bevorzugt wird Tetrahydrofuran.

Die Reduktion wird im allgemeinen in einem Temperaturbereich von -110°C bis 20°C, bevorzugt bei -55°C, unter Ausschluß von Luft und Feuchtigkeit durchgeführt.

Die Überführung in das Thiolactol gelingt mit Kombinationen von (R¹S)₂ und (R²)₃P, wobei R¹, R² gleich geradkettigen Alkyl, verzweigten Alkyl, Aryl oder Heteroaryl sein können. Bevorzugt wird eine Kombination aus R¹ gleich 2- Pyridil und R² gleich n-Butyl eingesetzt.

Als Lösungsmittel eignen sich etherische Lösungsmittel wie Diethylether oder Tetrahydrofuran oder auch halogenierte Lösungsmittel wie Dichlor methan oder Chloroform. Bevorzugt wird Dichlormethan eingesetzt.

Die Reaktion wird im allgemeinen in einem Temperaturbereich von 0°C bis 100°C, bevorzugt bei Raumtemperatur, unter Ausschluß von Luft und Feuchtigkeit durchgeführt.

Die Reduktion des Thioacetals wird mit Nickelkatalysatoren wie Raney- Nickel oder P2-Nickel durchgeführt.

Als Lösungsmittel eignen sich Alkohole wie Methanol, Ethanol, Pro panol, Isopropanol oder Butanol, bevorzugt wird Ethanol verwendet. Die Reaktion wird im allgemeinen in einem Temperaturbereich von 0°C bis 100°C, bevorzugt bei Raumtemperatur durchgeführt.

Die Kombination von Reduktion und hydrogenolytischer Abspaltung eventu eller Schutzgruppen ist möglich und wird bevorzugt mit Wasserstoff unter Normaldruck oder erhöhtem Druck in einem Temperaturbereich zwischen 0°C und 80°C durchgeführt. Als Katalysatoren kommen Nickelkatalysatoren, bevorzugt Raney-Nickel in Betracht.

Als Lösungsmittel eignen sich dazu Alkohole wie Methanol, Ethanol, Pro panol, Isopropanol oder Butanol, bevorzugt wird Methanol verwendet.

Die Nachacetylierung eventuell abgespaltener Acetylgruppen erfolgt unter den bekannten Standardbedingungen. Bevorzugt wird eine Kombination von Acetanhydrid und Pyridin/DMAP in einem inerten Lösungsmittel wie Dichlormethan oder Diethylether eingesetzt.

Mit der Entwicklung eines Ether-Analogons des GM₃-Lactons haben wir erst malig ein hydrolyse-stabiles Analogon aufbauen können, das eine ähnliche Struktur wie das Lacton aufweist und im neutralen, sauren (bis pH 2.0) und basichen Milieu (bis pH 10) stabil ist. Somit ist eine Struktur entwickelt wor den, die erstmalig den erforderlichen Anforderungen an ein Hapten für eine aktive Immunisierung gegen das GM₃-Lacton gerecht wird. So erkennen durch Immunisierung gegen das Ether-Analogon des GM₃-Lactons herge stellte polyklonale Antiköper sowohl das Ether-Analogon als auch das GM₃- Lacton.

Experimenteller Teil 1. Allgemeine Verfahren

Sämtliche Reaktionen wurden unter Argon in ausgeheizten Glasapparaturen durchgeführt, sofern nicht in wäßrigen System gearbeitet wurde. Die Lö sungsmittel für chemische Reaktionen wurden destilliert und, soweit notwen dig, entsprechend den üblichen Laboratoriumsmethoden getrocknet bzw. ge gebenenfalls absolutiert. Käufliche Reagenzien wurden ohne weitere Reini gung eingesetzt.

1.1. Verwendete Geräte

Schmelzpunkte: Die Schmelzpunkte wurden mit einem Schmelzpunkt bestimmungsapparat bzw. einem Kofler-Heiztischmikroskop gemessen. Die Werte sind nicht korrigiert.

Drehwerte: Die Drehwerte wurden mit einem Polarimeter (Standardküvette) bestimmt.

Infrarotspektren: Zur Aufnahme der Infrarotspektren diente ein FT-IR Spek trometer IFS 25. Nichtkristalline Substanzen wurden als Film zwischen NaCl- Platten, Feststoffe als KBr-Preßlinge vermessen. Zur Eichung diente die Poly styrolbande bei = 1601 cm^-1

¹H-NMR-Spektren: Zur Aufnahme der Protonenresonanzspektren wurden die Geräte FT-80 (80 MHz), XL-200, VXR-200 (200 MHz), AMX-300 (300 MHz) und VXR-500 S (500 MHz) verwendet. Die chemischen Ver schiebungen sind in Einheiten der δ-Skala angegeben. Als interner Standard diente Tetramethylsilan oder Aceton (δ_TMS = 0.00 ppm bzw. δ_Aceton = 2.17 ppm). Die Multiplizität der Signale wurde durch folgende Abkürzungen ange geben: s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett, m = Multiplett, so wie mc für das Zentrum eines symmetrischen Multipletts und br für verbrei terte Signale. Die Spektren wurden entsprechend den Regeln erster Ordnung interpretiert. Die Kopplungskonstanten J sind in Hertz (Hz) angegeben.

¹³C-NMR-Spektren: Die Aufnahme der Spektren erfolgte mit Hilfe der Spek trometer FT-80 (20.0 MHz), XL-200, VXR-200 (50.3 MHz), AMX-300 (75.5 MHz) und VXR-500 S (125.7 MHz). Die chemischen Verschiebung der Si gnale entnahm man ¹H-breitbandentkoppelten Spektren(δ_TMS = 0.00 ppm bzw. δ_Aceton = 29.8 ppm), ihre Feinstruktur wurde durch ATP-Pulsfolgen be stimmt.

Massenspektren: Die Aufnahme der Massenspektren erfolgte mit einem Spektrometer MAT 311A (niederaufgelöste Spektren) und einem Spektrome ter MAT 731 (hochaufgelöste Spektren). Die Ionisierungsenergie betrug 70 eV, die relativen Peakintensitäten bezüglich des Basispeaks (I = 100%) und mögliche Zuordnungen sind in Klammern angegeben. Von Zuckern wurden allgemein Massenspektren nach der DCI-Technik bzw. FAB-Technik aufge nommen.

Ultraschallbad: Es wurde das Modell Bandolin Sonorex RK 102 (HF- Frequenz 50 kHz, HF-Leistung 120/240 W) verwendet.

1.2. Chromatographische Methoden

Dünnschichtchromatographie (DC): Es wurden DC-Fertigfolien SIL® G/UV₂₅₄ mit einer Schichtdicke von 0.25 mm verwendet. Als Anfärbereagenz diente 1%ige Kaliumpermanganatlösung, konzentrierte Schwefelsäure oder eine Mischung aus 0.85 Teilen Methanol, 0.10 Teilen Essigsäure, 0.05 Teilen Schwefelsäure und 1 Gewichtsprozent Vanilin.

Säulenchromatographie (SC): Für säulenchromatographische Trennungen wurde Kieselgel der Korngröße 0.063-0.200 mm benutzt. Die präparative Trennung empfindlicher Substanzen erfolgte durch "Flashchromatographie" an Kieselgel der Korngröße 0.032-0.063 mm.

1.3. Reagentien und Lösungsmittel

Die Lösungsmittel für die Chromatographie wurden entsprechend den übli chen Laboratoriumsmethoden getrocknet und destilliert. Folgende Laufmittel systeme kamen zum Einsatz:
LM1: tert-Butylmethylether/Petrolether 2 : 1
LM2: Essigester/Petrolether 2 : 1
LM3: Essigester/Petrolether 1 : 1
LM4: Essigester/Petrolether 1 : 2
LM5: Essigester/Petrolether 1 : 3
LM6: Essigester/Petrolether 1 : 7
LM7: Essigester/Methanol 4 : 1
LM8: Essigester/Methanol 2 : 1
LM9: Essigester/Methanol 10 : 1
LM10: Diethylether/Petrolether 1 : 5
LM11: Essigester/Petrolether 1 : 10
LM12: Essigester/Petrolether 1 : 9
LM13: Essigester/Methanol 1 : 1

2. Synthesen

Es wird beispielhaft die Synthese der Verbindungen 4, 5, 6, 7, 11 und 12 des Typs I beschrieben.

2-(Trimethylsilyl)ethyl-2,3,6,-tri-O-benzyl-4-O-[4,6-di-O-acetyl-3-O-(4,7,8,9- tetra-O-acetyl-5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2- nonulopyranosyloyl-1"→2'-lactol)-β-D-galactopyranosyl]-β-D- glucopyranosid 2

Zuerst wurde eine 1.06 M Reduktionslösung hergestellt: Man löste 1 ml einer 3.4 M Red-Al-Lösung in 2 ml absolutem Toluol, versetzte bei 0°C mit 0.20 ml absolutem Ethanol und ließ weitere 0.5 h bei 0°C rühren.

Eine Lösung von 638 mg (0.516 mmol) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl- 2,3,6,-tri-O-benzyl-4-O-[4,6-di-O-acetyl-3-O-(4,7,8,9-tetra-O-acetyl-5- acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyloyl-1"→2'- lacton)-β-D-galactopyranosyl]-β-D-glucopyranosid 1 in 18 ml absolutiertem Toluol wurde auf -55°C abgekühlt und 1.62 ml der frischen 1.06 M Redukti onslösung langsam zugespritzt. Die Temperatur wurde 60 min sorgfältig zwi schen -55°C und -50°C gehalten, bis im Dünnschichtchromatogramm kein Edukt mehr zu sehen war. Es wurde auf -78°C abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von 0.2 ml Eisessig gequencht. Danach wurde mit 30 ml Dichlormethan verdünnt, mit 2 N Salzsäure und ges. Natriumhydrogen carbonatlösung gewaschen und die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels bei 13.3 mbar (10 Torr) wur de flashchromatographiert (70 g Kieselgel, EE). Es wurden 514 mg (80.4%) eines weißen Feststoffes erhalten.

R_f = 0.34 (EE).

Smp.: 97.1°C.

[a] 20|D = +7.2° (c = 0.5 in CHCl₃).

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃, beide Isomere): δ = 0.00 u. 0.03 (s, 9H, SiMe₃), 1.04 (mc, 2H, CH₂SiMe₃), 1.88, 1.90, 1.95, 1.96, 2.01, 2.02, 2.03, 2.04, 2.06, 2.07, 2.11, 2.13 (s, 21H, 7 CH₃CO), 2.61 u. 2.74 (dd, J = 5.0, 13.0 Hz, 1H, 3"- H_eq), 3.36-4.22 (m), 4.39 u. 4.40 (d, J = 8.0 Hz, 1H, 1-H), 4.46-5.39 (m), 7.22-7.40 (m, 15H, Ph).

¹³C-NMR (125.7 MHz, CDCl₃, beide Isomere): δ = -1.50 (SiMe₃), 18.34 (CH₂SiMe₃), 20.30, 20.35, 20.46, 20.54, 20.71, 20.84, 20.98. 21.04, 23.18, 23.28 (7 CH₃CO), 33.01 u. 34.32 (C-3"), 49.39 u. 50.08 (C-5"), 61.05, 61.11, 62.42, 63.20, 66.08, 66.75, 66.81, 67.46, 67.52, 68.17, 68.41, 68.69, 68.73, 69.12, 69.20, 70.55, 71.41, 71.51, 72.07, 72.42, 72.44, 72.65, 72.71, 72.97, 73.18, 73.26, 74.54, 74.81, 74.89, 74.90, 75.13, 77.64, 81.97, 82.10, 82.96, 83.18, 89.56 u. 94.35 (C-1"), 96.93 u. 98.16 (C-2"), 100.8 u. 101.1 (C-1'), 103.2 (C-1), 127.3, 127.4, 127.5, 127.6, 127.7, 127.8, 128.1, 128.2, 128.3, 128.4, 128.5 (m-, p-, o-Ph), 138.6, 138.7, 139.1 (3 i-Ph), 170.0, 170.1, 170.2, 170.3, 170.4, 170.5, 170.6, 170.8, 171.1, 171.6 (7 MeCO).

IR (Pille): = 3394 cm^-1, 2932, 1748, 1688, 1666, 1454, 1432, 1370, 1230, 1068, 1054, 860, 838, 740, 700.

MS (DCl): m/z (%) = 1300.7 (28) [M + C₂H₂O + NH₃ + H]⁺, 1258.7 (100) [M + NH₃ + H]⁺, 1216.6 (15) [M - C₂H₂O + NH₃ + H]⁺.

C₆₁H₈₁O₂₄NSi (1240.39):
Berechnet:
C 59.07; H 6.58.
Gefunden:
C 51.19; H 6.60.

2-(Trimethylsilyl)ethyl-2,3,6,-tri-O-benzyl-4-O-[4,6-di-O-acetyl-3-O-(4,7,8,9- tetra-O-acetyl-5-acetamido-1,3,5-trideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2- nonulopyranosyloyl-1"→2'-thiolactol)-β-D-galactopyranosyl]-β-D- glucopyranosid 3

Eine Lösung von 514 mg (0.415 mmol) Edukt 2 in 30 ml trockenem Dichlor methan wurde mit 861 mg (3.91 mmol) Bispyridiniumdisulfid und 0.97 ml (3.91 mmol) Tributylphosphin versetzt und 3 d bei RT und 6 h unter Rückfluß ge rührt. Es wurde mit 50 ml Dichlormethan verdünnt, mit 30 ml Wasser gewa schen, das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und über Magnesiumsulfat ge trocknet. Flashchromatographie (100 g Kieselgel, EE) lieferte 553 mg eines gelben Feststoffes, der noch Verunreinigungen aufwies (DC). Daher wurde nochmals an 100 g Kieselgel flashchromatographiert und 370 mg (71%) eines schwach gelben Feststoffes erhalten.

R_f = 0.38 (EE).

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃, beide Isomere): δ = 0.03 u. 0.04 (s, 9H, SiMe₃), 1.04 (mc, 2H, CH₂SiMe₃), 1.93, 1.95, 2.01, 2.05, 2.06, 2.13, 2.14 (s, 15.3H, 7 CH₃CO, Hauptisomer), 1.93, 1.95, 1.97, 2.03, 2.06, 2.13, 2.17 (s, 5.7H, 7 CH₃CO, Minderisomer), 2.67 (dd, J = 5.0, 14.0 Hz, 0.27H, 3"-H_eq, Minderiso mer), 2.73 (dd, J = 5.5, 13.0 Hz, 0.63H, 3"-H_eq, Hauptisomer), 3.35-4.37 (m), 4.39 (d, J = 8.0 Hz, 0.27H, 1-H, Minderisomer), 4.40 (d, J = 8.0 Hz, 0.63H, 1- H, Hauptisomer), 4.51-5.46 (m), 5.93 (s, 0.63H, 1"-H_ax, Hauptisomer), 6.21 (s, 0.27H, 1"-H_eq, Minderisomer), 7.22-7.43 (m, 15H, Ph).

¹³C-NMR (125.7 MHz, CDCl₃, beide Isomere): δ = -1.41 (SiMe₃), 17.42 (CH₂SiMe₃), 18.50, 18.53, 20.44, 20.54, 20.57, 20.61, 20.70, 20.75, 20.77, 20.86, 21.09, 21.21, 23.36, 23.40 (7 CH₃CO, beide Isomere), 34.52 (C-3", Hauptisomer), 50.39 u. 50.99 (C-5"), 61.05, 62.03, 66.73, 67.49, 67.76, 68.05, 68.24, 68.33, 68.88, 69.24, 70.66, 70.89, 71.29, 71.56, 71.74, 72.13, 72.19, 73.12, 74.30, 74.76, 75.04, 77.19, 77.36, 77.58, 81.84, 81.98, 82.11, 82.85, 83.13, 87.95 u. 90.57 (C-1"), 95.70 (C-2", Hauptisomer), 100.0 u. 101.0 (C-1'), 103.1 u. 103.3 (C-1), 110.0, 121.7, 127.2, 127.3, 127.4, 127.5, 127.6, 127.7, 127.8, 128.0, 128.1, 128.2, 128.3, 128.4, 128.5 (m-, p-, o-Ph), 138.5, 138.7, 139.7 (3 i-Ph), 170.0, 170.2, 170.3, 170.5, 170.6, 170.7 (7 MeCO).

MS (DCl): m/z (%) = 1276.3 (100) [M + NH₃ + 4H]⁺, 1240.3 (86) [M - SH + NH₃ + H]⁺.

C₆₁H₈₁O₂₃NSSi (1256.46).

2-(Trimethylsilyl)ethyl-2,3,6,-tri-O-acetyl-4-O-[4,6-di-O-acetyl-3-O- (4,7,8,9-tetra-O-acetyl-5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2- nonulopyranosyloyl-1"→2'-lactol)-β-D-galactopyranosyl]-β-D- glucopyranosid 9

Man löste 1 ml einer 3.4 M Red-Al-Lösung in 2 ml absolutem Toluol, versetzte bei 0°C mit 0.20 ml absolutem Ethanol, ließ weitere 0.5 h bei 0°C rühren und bewahrte unter Eiskühlung auf (1.06 M Reduktionslösung). Eine Lösung von 344 mg (0.315 mmol) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-2,3,6,-tri-O- acetyl-4-O-[4,6-di-O-acetyl-3-O-(4,7,8,9-tetra-O-acetyl-5-acetamido-3,5- dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyloyl-1"→2'-lacton)-β-D- galactopyranosyl)-β-D-glucopyranosid 8 in 7 ml absolutiertem Toluol wurde auf -78°C abgekühlt (Aceton/Trockeneis) und 1.50 ml der frischen Redukti onslösung langsam (am Kolbenrand runterlaufend) zugespritzt. Man rührte 45 min bei dieser Temperatur, bis im Dünnschichtchromatogramm kein Eduktspot mehr zu sehen war und quenchte die Reaktion durch Zugabe von 0.2 ml Ei sessig. Es wurde mit 30 ml Dichlormethan verdünnt, mit 2 N Salzsäure und ges. Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wurde flashchromatographiert (40 g Kieselgel, EE). Es wurden 241 mg (70.0%) eines weißen Feststoffes erhalten.

R_f = 0.31 (EE).

Smp.: 121.3°C.

[a] 20|D = -12.0° (c = 0.5 in CHCl₃).

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 0.01 (s, 9H, SiMe₃), 0.93 (mc, 2H, CH₂SiMe₃), 1.87 (2 s, 3H, CH₃CON) 2.01-2.15 (13 s, 27H, 9 CH₃CO), 2.71 (dd, J = 5.5, 13.0 Hz, 1H, 3"-H_eq), 3.52-4.54 (m, 15H), 4.69 (d, J = 11.5 Hz, 0.68H), 4.83-5.43 (m, 9H).

¹³C-NMR (125.7 MHz, CDCl₃): δ = -1.48 (SiMe₃), 17.88 (CH₂SiMe₃), 20.39, 20.51, 20.58, 20.64, 20.68, 20.73, 20.82, 20.91, 20.93, 20.95, 21.08, 23.10, 23.15 (10 CH₃CO), 33.61 u. 35.05 (C-3"), 49.12 u. 49.53 (C-5"), 61.35, 61.42, 62.52, 62.99, 63.04, 64.01, 67.54, 67.61 (C-6, C-6', C-9", OCH₂CH₂Si), 66.28, 66.33, 66.45, 66.52, 67.54, 67.61, 68.05, 68.56, 69.38, 69.57, 70.75, 71.62, 71.73, 71.79, 71.88, 72.32, 72.55, 72.60, 72.70, 72.87, 73.04, 73.59, 73.69, 77.99, 78.49, 90.90 u. 94.35 (C-1"), 97.15, 98.24 (C-2"), 100.0 (C-1'), 103.0 u. 103.4 (C-1), 169.6, 169.7, 170.0, 170.2, 170.3, 170.4, 170.6, 170.8, 170.9, 171.1, 171.3, 172.8 (10 MeCO).

IR (Pille): = 3442 cm^-1, 3406, 1748, 1372, 1236, 1170, 1060.

MS (DCl): m/z (%) = 1155.9 (33) [M + CH₂CO + NH₃ + H]⁺, 1114.0 (100) [M + NH₃ + H]⁺, 1071.9 (17) [M - CH₂CO + NH₃ + H]⁺.

C₄₆H₆₉O₂₇NSi (1096.13):
Berechnet:
C 50.41; H 6.34.
Gefunden:
C 51.08; H 6.24.

2-(Trimethylsilyl)ethyl-2,3,6,-tri-O-acetyl-4-O-[4,6-di-O-acetyl-3-O-(4,7,8,9- tetra-O-acetyl-5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2- nonulopyranosyloyl-1"→2'-thiolactol)-β-D-galactopyranosyl]-β-D- glucopyranosid 10

Zu einer Lösung von 757 mg (0.691 mmol) Lactol 9 in 30 ml trockenem Dichlormethan wurde 1.58 g (7.15 mmol) Bispyridiniumdisulfid und 1.78 ml (7.15 mmol) Tributylphosphin gegeben und 3 d bei RT gerührt. Abschließend wurde 6 h unter Rückfluß erhitzt. Es wurde mit 50 ml Dichlormethan verdünnt, jeweils mit 20 ml 2 N Salzsäure und 20 ml ges. Natriumhydrogencarbonatlö sung gewaschen, das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und über Magnesi umsulfat getrocknet. Flashchromatographie (100 g Kieselgel, EE) lieferte 789 mg (quant.) eines schwach gelben Feststoffes.

R_f = 0.34 (EE).

Smp.: 120.3°C.

[a] 20|D = -30.6° (c = 0.5 in CHCl₃).

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃, β-Anomer (C-1")): δ = -0.01 (s, 9H, SiMe₃), 0.91 (mc, 2H, CH₂SiMe₃), 1.90 (s, 3H, CH₃CON) 2.01-2.15 (8 s, 27H, 9 CH₃CO), 2.81 (dd, J = 5.5, 13.0 Hz, 1H, 3"-H_eq), 3.51-4.43 (m, 15H), 4.45 u. 4.48 (d, J = 8.0 Hz, 1H, 1-H, 1'-H), 4.54 (dd, J = 2.5, 12.5 Hz, 1H), 4.87 (dd, J = 8.0, 9.5 Hz, 1H, 2-H), 5.14-5.26 (m, 3H, 3-H, 4"-H, 8"-H), 5.30 (dd, J = 2.0, 4.5 Hz, 1H, 7"-H), 5.33 (dd, J = 1.5, 3.0 Hz, 1H, 4'-H), 5.52 (d, J = 9.5 Hz, 1H, NH), 6.02 (s, 1H, 1"-H).

¹³C-NMR (125.7 MHz, CDCl₃, β-Anomer (C-1")): δ = -1.43 (SiMe₃), 17.90 (CH₂SiMe₃), 20.40, 20.61, 20.70, 20.73, 20.78, 20.84, 20.89, 21.08, 23.24 (10 CH₃CO), 34.43 (C-3"), 49.73 (C-5"), 61.27, 62.14, 62.34, 67.58, (C-6, C-6', C- 9", OCH₂CH₂Si), 66.58, 67.51, 68.17, 68.53, 71.48, 71.82, 71.86, 72.08, 72.09, 72.41, 73.24, 77.40, 90.34 (C-1"), 95.85 (C-2"), 100.1, 101.3 (C-1, C- 1'), 169.6, 169.8, 170.0, 170.3, 170.4, 170.5, 170.7 (10 MeCO).

IR (Pille): = 2958 cm^-1, 1750, 1436, 1372, 1234, 1156, 1044, 840.

MS (DCl): m/z (%) = 1131.9 (100) [M + NH₃ + 4H]⁺, 1113.8 (70) [M + 3H]⁺, 1095.8 (56) [M - SH + NH₃ + H]⁺.

C₄₆H₆₉O₂₆NSSi (1112.20).

2-(Trimethylsilyl)ethyl-2,3,6,-tri-O-acetyl-4-O-(4,6-di-O-acetyl-3-O-(4,7,8,9- tetra-O-acetyl-5-acetamido-1,3,5-trideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2- nonulopyranosyloyl-1"→2'-pyranosyl)-β-D-galactopyranosyl)-β-D- glucopyranosid 4 Aus Verbindung 3

Es wurde 1 g Raney-Nickel (gebrauchsfertig) jeweils zweimal mit 5 ml Wasser und 5 ml Ethanol gewaschen und in 20 ml Ethanol suspendiert. Die Suspen sion wurde jeweils dreimal am Hausvakuum evaporiert und mit Wasserstoff belüftet, mit einer Lösung von 342 mg (0.273 mmol) der Verbindung 3 in 3 ml Ethanol versetzt und 20 h bei RT unter Normaldruck hydriert. Danach wurde über Celite filtriert, sorgfältig mit Ethanol gewaschen und das überschüssige Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 10 ml Pyri din/Acetanhydrid (2 : 1) aufgenommen und nach Zugabe von 20 mg DMAP 14 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde bei 0,7 mba (0,5 Torr) entfernt und der Rückstand flashchromatographiert (50 g Kieselgel, EE). Man erhielt 249 mg (85%) eines weißen Feststoffes.

Aus Verbindung 10

Es wurden 300 mg 10 und 5 g Raney-Nickel in 30 ml Ethanol 1 h nach obiger Vorschrift umgesetzt. Die Nachacetylierung wurde mit 0.3 ml Acetanhydrid, 0.6 ml Pyridin und 10 mg DMAP in 5 ml Dichlormethan durchgeführt. Man er hielt 282 mg (97%) eines weißen Feststoffes.

R_f = 0.19 (EE).

[a] 20|D = -6.6° (c = 0.5 in CHCl₃).

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 0.01 (s, 9H, SiMe₃), 0.93 (mc, 2H, CH₂SiMe₃), 1.87 (dd, J = 10.5, 13.5 Hz, 1H, 3"-H_ax) 1.90 (s, 3H, CH₃CON), 2.03, 2.06, 2.08, 2.09, 2.13, 2.15 (s, 27H, 9 CH₃CO), 2.60 (dd, J = 5.5, 13.5 Hz, 1H, 3"-H_eq), 3.44 (d, J = 11.5 Hz, 1H, 1"-H_ax), 3.59 (dd, J = 7.5, 10.5 Hz, 1H, 2'-H), 3.52-3.58 (m, 1H, OCH₂CH₂Si), 3.64 (dt, J = 3.5, 10.0 Hz, 1H, 5- H), 3.71 (dd, J = 3.0, 10.5 Hz, 1H, 3'-H), 3.81 (t, J = 9.5 Hz, 1H, 4-H), 3.80- 3.91 (m, 4H, 5'-H, 5"-H, 6'-H, 6"-H), 3.89 (d, J = 11.5 Hz, 1H, 1"-H_eq), 3.92- 3.99 (m, 1H, OCH₂CH₂Si), 4.02-4.13 (m, 2H, 6-H, 6'-H'), 4.10 (q, J = 6.0 Hz, 1H, 9"-H), 4.35 (J = 7.5 Hz, 1H, 1'-H), 4.38-4.43 (m, 2H, 6-H', 9"-H'), 4.49 (d, J = 8.0 Hz, 1H, 1-H), 4.88 (dd, J = 8.0, 9.5 Hz, 1H, 2-H), 5.21 (t, J = 9.5 Hz, 1H, 3-H), 5.15-5.23 (m, 2H, 4"-H, 8"-H), 5,25 (dd, J = 2.0, 6.5 Hz, 1H, 7"-H), 5.29 (dd, J = 1.5, 3.0 Hz, 1H, 4'-H), 5.32 (d, J = 9.0 Hz, 1H, NH).

¹³C-NMR (125.7 MHz, CDCl₃): δ = -1.45 (SiMe₃), 17.89 (CH₂SiMe₃), 20.56, 20.61, 20.73, 20.76, 20.88, 20.91, 20.93, 23.28 (10 CH₃CO), 34.18 (C-3"), 50.39 (C-5"), 61.43, 62.31, 62.43, 62.52, 68.11 (C-1", C-6, C-6', C-9", OCH₂CH₂Si), 66.75, 68.00, 68.90, 70.49, 71.49, 71.66, 71.84, 72.59, 72.66, 73.19, 73.58, 77.19, 96.74 (C-2"), 100.1 (C-1'), 102.0 (C-1), 169.6, 169.9, 167.0, 170.4, 170.6, 170.7 (10 MeCO).

IR (Pille): = 1750 cm^-1, 1372, 1234, 1160, 1048, 840.

MS (DCl): m/z (%) = 1098.3 (100) [M + NH₃ + H]⁺.

C₄₆H₆₉O₂₆NSi (1080.13):
Berechnet:
C 51.15; H 6.44.
Gefunden:
C 51.10; H 6.11.

2-(Trimethylsilyl)ethyl-4-O-[3-O-(5-acetamido-1,3,5-trideoxy-D-glycero- α-D-galacto-2-nonulopyranosyloyl-1"→2'-pyranosyl)-β-D- galactopyranosyl]-β-D-glucopyranosid 4a

Man löste 50 mg (18.5 µmol) der Verbindung 4 in 2 ml absolutem Methanol und rührte nach Zugabe von 20 µl einer 2.3 M Natriummethanolatlösung in Methanol 14 h bei RT. Nach Verdünnung mit 5 ml Methanol wurde mit frisch regeneriertem Lewatit© 100 S neutralisiert (Kontrolle mit pH-Papier), abfiltriert, dreimal mit 5 ml Methanol gewaschen und die vereinigten organ. Phasen im Vakuum zur Trockene eingedampft. Nach Flashchromatographie an 8 g Kie selgel (LM8) wurden 26.7 mg (82%) eines weißen Feststoffes erhalten.

R_f = 0.22 (LM8).

¹H-NMR (500 MHz, MeOD, beide Anomere (C-2")): δ = 0.04 (s, 9H, SiMe₃), 1.00 (mc, 2H, CH₂SiMe₃), 1.63 (dd, J = 11, 13 Hz, 0.8H, 3"-H_ax, α-Anomer), 1.89 (dd, J = 11.0, 13.0 Hz, 0.2H, 3"-H_ax, β-Anomer), 2.01 (s, 3H, CH₃CO), 2.15 (dd, J = 5.0, 13.0 Hz, 0.2H, 3"-H_eq, β-Anomer), 2.70 (dd, J = 5.0, 13.0 Hz, 0.8H, 3"-H_eq, α-Anomer), 3.21 (t, J = 8.5 Hz, 1H, 2-H), 3.33-3.56 (m, 4H), 3.6-3.90 (m), 3.54 (d, J = 11.5 Hz, 0.8H, 1"-H_ax, α-Anomer), 3.59-3.66 (m, 1H, OCH₂CH₂Si), 3.96-4.02 (m, 1H, OCH₂CH₂Si), 4.04 (d, J = 11.5 Hz, 0.8H, 1"-H_eq, α-Anomer), 4.29 (d, J = 8.0 Hz, 0.8H, 1-H, α-Anomer), 4.30 (d, J = 8.0 Hz, 0.2H, 1-H, β-Anomer), 4.40 (d, J = 7.5 Hz, 0.2H, 1'-H, β-Anomer), 4.58 (d, J = 8.0 Hz, 0.8H, 1'-H, α-Anomer).

C₂₈H₅₁O₁₇NSi (701.80).

Ceramid- und Spacerkupplung des etherischen Analogons 2,3,6,-Tri-O-acetyl-4-O-[4,6-di-O-acetyl-3-O-(4,7,8,9-tetra-O-acetyl-5- acetamido-1,3,5-trideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyloyl- 1"→2'-pyranosyl)-β-D-galactopyranosyl]-αβ-D-glucopyranosyl-trichlor acetimidat 5

Man löste 110.0 mg (0.102 mmol) der Verbindung 4 in 1 ml trockenem Dichlormethan und versetzte mit 2 ml Trifluoressigsäure. Man rührte 30 min bei RT, entfernte das Lösungsmittel im Vakuum, nahm in 5 ml Toluol auf und reinigte, nach nochmaliger Entfernung des Lösungsmittels, durch Säulenfiltra tion an 20 g Kieselgel (LM9). Der Rückstand wurde 3 h im Hochvakuum ge trocknet und in 5 ml Dichlormethan aufgenommen. Nach Zugabe von 0.34 ml Trichloracetonitril und 13 µl DBU wurde 1 h bei 0°C gerührt und die Mischung im Vakuum eingedampft. Flashchromatographie (30 g Kieselgel, LM9) lieferte 106.5 mg (93%) eines schwach gelben Schaumes.

R_f = 0.55 (LM9).

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃, beide Anomere (C-2")): δ = 1.91-2.16 (s, 30H, 10 CH₃CO), 2.51 (dd, J = 5.5, 13.5, 1H, 3-H_eq, β-Anomer), 2.57 (dd, J = 5.5, 13.5 Hz, 1H, 3"-H_eq, α-Anomer), 3.43 (d, J = 11.5 Hz, 1H, 1"-H_ax), 4.39 (d, J = 8.0 Hz, 1H, 1'-H, β-Anomer), 4.64 (d, J = 8.0 Hz, 1H, 1'-H, α-Anomer), 6.49 (d, J = 3.5 Hz, 1H, 1-H, β-Anomer), 6,50 (d, J = 3.5 Hz, 1H, 1-H, α-Anomer), 8.66 (s, 1H, NH-Acetimidat, α-Anomer) 8.70 (s, 1H, NH-Acetimidat, β-Anomer).

C₄₃H₅₇O₂₆N₂Si₃ (1024.28).

(2S,3R,4E)-2-Azido-3-(benzoyloxy)octadec-4-enyl-2,3,6,-tri-O-acetyl-4-O- [4,6-di-O-acetyl-3-O-(4,7,8,9-tetra-O-acetyl-5-acetamido-1,3,5-trideoxy-D- glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyloyl-1"→2'-pyranosyl)-β-D- galactopyranosyl]-β-D-glucopyranosid 6

Es wurden 106 mg (0.0943 mmol) Glycosyldonor 5, 125 mg (0.291 mmol) Azidosphingosin 13 und 100 mg Molsieb MS 4 Å (über Nacht bei 180°C im Hochvakuum getrocknet) in 5 ml Dichlormethan gelöst und 2 h bei RT gerührt. Man kühlte auf -40°C, spritzte 30 µl Bortrifluorid-Etherat zu, ließ innerhalb 1 h auf -20°C erwärmen und versetzte bei dieser Temperatur mit 0.2 ml Tri ethylamin. Danach wurde vom Molsieb abdekantiert, mehrfach mit Dichlor methan nachgewaschen und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach Flashchromatographie an 20 g Kieselgel (EE) wurden 86 mg (66%) eines schwach gelben Feststoffes erhalten.

R_f = 0.33 (α-Anomer (C-2")) u. 0.29 (β-Anomer (C-2")) (EE).

[a] 20|D = -7.4° (c = 0.5, CHCl₃, β-Anomer (C-2")).

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃, α-Anomer (C-2")): δ = 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H, CH ₃), 1.20-1.40 (m, 22H, CH ₂), 1.90-2.15 (10 s, 30H, 10 CH₃CO), 2.50 (dd, J = 5.5, 13.5 Hz, 1H, 3"-H_eq), 3.45 (d, J = 11.5 Hz, 1H, 1"-H_ax), 3.56-3.61 (m, 2H, 2'-H, 1-H), 3.65 (mc, 1H. 5-H), 3.71 (dd, J = 3.0, 10.5 Hz, 1H, 3'-H), 3.83 (t, J = 10.0 Hz, 1H, 4-H), 3.89 (d, J = 11.5 Hz, 1H, 1"-H_eq), 3.80-3.96 (m, 4H, 5'-H, 6'-H, 1-H', 2-H), 4.02-4.09 (m, 2H, 6-H, 6'-H), 4.10 (q, J = 6.5 Hz, 1H, 9"-H), 4.34 (d, J = 8.0 Hz, 1H, 1'-H), 4.35-4.42 (m, 2H, 6-H', 9"-H'), 4.52 (d, J = 8.0 Hz, 1H, 1-H), 4.94 (dd, J = 8.0, 10.0 Hz, 1H, 2-H), 5.16-5.23 (m, 3H, 3- H, 4"-H, 8"-H), 5.25 (dd, J = 2.0, 6.5 Hz, 1H, 7"-H), 5.29 (dd, J = 1.5, 3.0 Hz, 1H, 4'-H), 5.31 (d, J = 9.0 Hz, 1H, NH), 5.53 (ddt, J = 1.5, 8.0, 15.0 Hz, 1H, 4- H), 5.59 (dd, J = 4.0, 8.0 Hz, 1H, 3-H), 5.92 (dt, J = 6.5, 15.0 Hz, 1H, 5-H), 7.44 (mc, 2H, OBz), 7.56 (mc, 1H, OBz), 8.03 (mc, 2H, OBz).

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃, β-Anomer (C-2")): δ = 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H, CH ₃), 1.20-1.42 (m, 22H, CH ₂), 1.90-2.16 (10 s, 30H, 10 CH₃CO), 1.96 (dd, J = 5.5, 12.5 Hz, 1H, 3"-H_eq), 3.39 (dd, J = 8.0, 10.0 Hz, 1H, 2'-H), 3.42 (d, J = 12.0 Hz, 1H, 1"-H_ax), 3.58 (dd, J = 6.0, 10.5 Hz, 1H, 1-H), 3.64 (ddd, J = 2,5, 10.0 Hz, 1H, 5-H), 3.76-4.10 (m, 11H), 4.23 (dd, J = 5.5, 12.0 Hz, 1H), 4.39 (dd, J = 2.0, 12.0 Hz, 1H), 4.50 (d, J = 8.0 Hz, 1H, 1'-H), 4.64 (d, J = 7.5 Hz, 1H, 1-H), 4.73 (dd, J = 3.0, 12.5 Hz, 1H), 4.97 (dd, J = 8.0, 9.5 Hz, 1H), 5.10 (mc, 1H), 5.20-5.26 (m, 2H), 5.31 (d, J = 10.5 Hz, 1H, NH), 5.36-5.43 (m, 2H), 5.56 (ddt, J = 1.5, 7.5, 15.0 Hz, 1H, 4-H), 5.62 (dd, J = 4.0, 8.5 Hz, 1H, 3- H), 5.92 (dt, J = 6.5, 15.0 Hz, 1H, 5-H), 7.45 (mc, 2H, OBz), 7.57 (mc, 1H, OBz), 8.04 (mc, 2H, OBz).

¹³C-NMR (125.7 MHz, CDCl₃, α-Anomer (C-2")): δ = 14.12 (CH₃), 20.65, 20,76, 20.91, 20.96, 23.33 (10 CH₃CO), 22.86, 28.73, 29.16, 29.35, 29.39, 29.59, 29.65, 31.92, 32.38 (12 CH₂), 50.46 (C-5"), 61.45, 62.30, 63.50, 66.75, 67.99, 68.12, 68.31, 68.87, 70.45, 71.51, 71.71, 72.65, 72.82, 72.98, 73.57, 74.66, 76.49, 96.75 (C-2"), 100.4 (C-1'), 102.1 (C-1), 122.6 (C=), 128.5, 129.7 (o-, m-Ph), 129.9 (i-Ph), 133.2 (p-Ph), 139.0 (C=), 165.1, 170.3, 170.4 (MeCO).

¹³C-NMR (125.7 MHz, CDCl₃, β-Anomer (C-2")): δ = 14.12 (CH₃), 20.69, 20.71, 20.74, 20.78, 20.86, 20.90, 21.03, 23.19 (10 CH₃CO), 22.70, 28.75, 29.17, 29.36, 29.41, 29.60, 29.66, 29.67, 29.69, 31.93, 32.39 (12 CH₂), 36.40 (C-3"), 49.48 (C-5"), 61.21, 62.17, 62.43, 68.34, 71.14 (C-1", C-6, C-6', C-9", C-1), 63.54, 66.91, 67.78, 68.57, 68.71, 70.36, 70.44, 71.26, 71.46, 72.90, 73.20, 74.48, 74.70, 96.07 (C-2"), 100.5, 101.2 (C-1, C-1'), 122.7 (C=), 128.5, 129.7 (o-, m-Ph), 130.0 (i-Ph), 133.2 (p-Ph), 139.0 (C=), 165.1, 169.6, 169.9, 170.0, 170.1, 170.3, 170.6, 170.7, 170.8, 171.0 (MeCO).

IR (Pille, β-Anomer): = 2928 cm^-1, 2108, 1748, 1690, 1372, 1232, 1176, 1110, 1068, 1042.

MS (DCl): m/z (%) = 1408.9 (100) [M + NH₃ + H]⁺.

C₆₆H₉₄O₂₈N₄ (1391.48).

(2S,3R,4E)-3-(Benzoyloxy)-2-(octadecanamido)octadec-4-enyl-2,3,6,-tri- O-acetyl-4-O-[4,6-di-O-acetyl-3-O-(4,7,8,9-tetra-O-acetyl-5-acetamido- 1,3,5-trideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyloyl-1"→2'- pyranosyl)-β-D-galactopyranosyl]-β-D-glucopyranosid 7a

Zu einer Lösung von 75 mg (0.54 µmol) Edukt 6 in 5 ml Dichlormethan wur den bei 0°C nacheinander 91 mg (0.27 mmol) Zinndithiophenyl, 28 µl (0.27 mmol) Thiophenol und 37 µl (0.27 mmol) Triethylamin gegeben. Man ließ 4 h bei RT rühren, versetzte mit 30 ml Essigester und schüttelte jeweils dreimal gegen 20 ml 0.1 N Natronlauge und einmal gegen 20 ml Wasser aus. Die vereinigten wäßrigen Phasen wurden jeweils zweimal mit 5 ml Dichlormethan extrahiert und die vereinigte organische Phase nochmals mit 5 ml Wasser gewaschen. Nach Vereinigung von Essigester- und Dichlormethanphase wur de über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum ent fernt. Nach einstündiger Trocknung im Hochvakuum wurde in 5 ml Dichlor methan aufgenommen und mit 77 mg (0.27 mmol) Stearinsäure und 52 mg (0.27 mmol) EDC versetzt. Die Mischung wurde 2 h bei RT gerührt, mit 20 ml Dichlormethan verdünnt und mit jeweils 8 ml 2 N Salzsäure und ges. Natrium hydrogencarbonatlösung gewaschen. Man trocknete über Magnesiumsulfat, entfernte das Lösungsmittel im Vakuum und reinigte den Rückstand durch Flashchromatographie an 20 g Kieselgel (EE). Es wurden 64.5 mg (73%) ei nes weißen Feststoffes erhalten.

R_f = 0.27 (EE, beide Anomere).

[a] 20|D = +4.8° (c = 0.5, CHCl₃, β-Anomer (C-2")).

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃, α-Anomer (C-2")): δ = 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H, CH ₃), 1.20-1.40 (m, 52H, CH ₂), 1.65 (mc, 2H, 6-H, 6-H'), 1.90-2.15 (10 s, 30H, 10 CH₃CO), 2.49 (dd, J = 5.5, 13.5 Hz, 1H, 3"-H_eq), 3.43 (d, J = 11.5 Hz, 1H, 1"-H_ax), 3.56-3.61 (m, 2H, 2'-H, 1-H), 3.64 (mc, 1H. 5-H), 3.70 (dd, J = 3.0, 10.5 Hz, 1H, 3'-H), 3.78 (t, J = 9.5 Hz, 1H, 4-H), 3.80-3.93 (m, 3H), 4.00 -4.12 (m, 5H), 4.23 (dd, J = 2.0, 12.0 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 4.0, 12.0 Hz, 1H), 4.32 (d, J = 7.5 Hz, 1H, 1'-H), 4.40 (dd, J = 2.5, 12.5 Hz, 1H), 4.45 (d, J = 8.0 Hz, 1H, 1-H), 4.47-4.51 (m, 1H), 4.89 (dd, J = 8.0, 9.5 Hz, 1H, 2-H), 5.16- 5.23 (m, 3H, 3-H, 4"-H, 8"-H), 5.25 (dd, J = 1.5, 6.5 Hz, 1H, 7"-H), 5.29 (dd, J = 1.5, 3.0 Hz, 1H, 4'-H), 5.38 (d, J = 9.0 Hz, 1H, NH), 5.46 (ddt, J = 1.5, 7.5, 15 Hz, 1H, 4-H), 5.52 (t, J = 7.0 Hz, 1H, 3-H), 5.74 (d, J = 9.0 Hz, 1H, NH), 5.87 (dt, J = 6.5, 15.0 Hz, 1H, 5-H), 7.44 (mc, 2H, OBz), 7.56 (mc, 1H, OBz), 8.00 (mc, 2H, OBz).

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃, β-Anomer (C-2")): δ = 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H, CH ₃), 1.20-1.40 (m, 52H, CH ₂), 1.63 (mc, 2H, 6-H, 6-H'), 1.90-2.15 (10 s, 30H, 10 CH₃CO), 3.41 (d, J = 12.0 Hz, 1H, 1"-H_ax), 3.58 (ddd; J = 2.0, 5.0, 10.0 Hz, 1H), 3.63 (dd, J = 4.5, 10.0 Hz, 1H), 3.75-3.82 (m, 3H), 3.97-4.11 (m, 6H), 4.14 (dd, J = 5.0, 12.0 Hz, 1H), 4.24 (dd, J = 2.0, 10.0 Hz, 1H), 4.44 (d, J = 8.0 Hz, 1H, 1'-H), 4.47 (mc, 1H), 4.61 (d, J = 7.5 Hz, 1H, 1-H), 4.72 (dd, J = 2.5, 12.5 Hz, 1H), 4.90 (dd, J = 8.0, 10.0 Hz, 1H), 5.07 (mc, 1H), 5.17 -5.22 (m, 2H), 5.32 (d, J = 11.0 Hz, 1H, NH), 5.34 (dd, J = 1.5, 5.5 Hz, 1H, 7"- H), 5.38 (mc, 1H), 5.46 (ddt, J = 1.5, 7.5, 15.0 Hz, 1H, 4-H), 5.52 (t, J = 7.0 Hz, 1H, 3-H), 5.74 (d, J = 9.0 Hz, 1H, NH), 5.87 (dt, J = 6.5, 15.0 Hz, 1H, 5-H), 7.43 (mc, 2H, OBz), 7.56 (mc, 1H, OBz), 8.00 (mc, 2H, OBz).

¹³C-NMR (125.7 MHz, CDCl₃, β-Anomer (C-2")): δ = 14.12 (2 CH₃), 20.61, 20.68, 20.69, 20.74, 20.75, 20.79, 20.90, 21.02, 23.18 (10 CH₃C0), 22.70, 25.75, 28.96, 29.26, 29.37, 29.40, 29.44, 29.49, 29.54, 29.57, 29.63, 29.67, 29.70, 29.72, 31.93, 32.35, 36.39, 36.87, 49.46, 50.71 (C-2, C-5"), 61.20, 61.20, 62.16, 62.38, 66.89, 67.44, 67.75, 68.54, 68.71, 70.32, 70.43, 71.13, 71.22, 71.75, 72.82, 72.95, 74.12, 74.45, 76.67, 96.06 (C-2"), 100.5 (C-1'), 101.2 (C-1), 124.7 (C=), 128.4, 129.6 (o-, m-Ph), 130.3 (i-Ph), 133.0 (p-Ph), 137.6 (C=), 165.2, 169.7, 169.9, 170.1, 170.3, 170.5, 170.7, 170.9, 171.0, 172.7 (MeCO).

IR (Pille, β-Anomer): = 3402 cm^-1, 2926, 2854, 1750, 1666, 1372, 1234, 1112, 1042.

MS (DCl): m/z (%) = 1613.0 (16), 1510.8 (100) [M - OBz]⁺, 1468.6 (28).

MS (FAB^-): m/z (%) = 1785.0 (100) [M + m - NBA]^-, 1630.2 (35) [M]^-.

MS (DCl⁺): m/z (%) = 1510.2 (100) [M - OBz]⁺.

C₆₆H₉₄O₂₈N₄ (1631.95).

(2S,3R,4E)-3-Hydroxy-2-(octadecanamido)octadec-4-enyl4-O-[3-O-(5- acetamido-1,3,5-trideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyloyl- 1"→2'-pyranosyl)-β-D-galactopyranosyl]-β-D-glucopyranosid 7

Es wurden 64.5 mg (39.6 µmol) Edukt 7a in 4 ml absolutem Methanol gelöst und nach Zugabe von 60 µl 2.3 M Natriummethanolatlösung 20 h bei RT ge rührt. Nach Zugabe von 10 ml Methanol wurde mit Lewatit® 100 S (frisch rege neriert und 24 h bei RT im Hochvakuum getrocknet) neutralisiert (pH-Papier !), abfiltriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Flashchromatographie (LM8) an 20 g Kieselgel lieferte 22.7 mg (1. Frakt.) und 12.2 mg (2. Frakt.) (77%) eines weißen Feststoffes.

R_f = 0.38 (β-Anomer (C-2")) u. 0.35 (α-Anomer 7 (C-2")) (LM8).

¹H-NMR (500 MHz, MeOD, α-Anomer 7 (C-2")): δ = 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 6H, CH ₃), 1.22-1.41 (m, 50H, CH ₂), 1.56 (mc, 2H, 3'-H), 1.63 (dd, J = 11.0, 13.0 Hz, 1H, 3"-H_ax), 2.01 (s, 3H, CH₃CO), 2.16 (t, J = 7.5 Hz, 2H, 2'-H), 2.70 (dd, J = 5.0, 13.0 Hz, 1H, 3"-H_eq), 3.37 (mc, 1H), 3.42 (dd, J = 1.5, 9.5 Hz, 1H), 3.45-3.58 (m, 4H), 3.61 (dd, J = 5.5, 11.5 Hz, 1H), 3.64-3.90 (m, 13H), 3.92 -3.96 (m, 1H, 4"-H), 4.06 (t, J = 8 Hz, 1H, 1-H), 4.04 (d, J = 12 Hz, 1H, 1"- H_eq), 4.18 (dd, J = 4.5, 10.0 Hz, 1H), 4.30 (d, J = 8.0 Hz, 1H, 1-H), 4.57 (d, J = 8.0 Hz, 1H, 1'-H), 5.44 (dd, J = 7.5, 15.0 Hz, 1H, 4-H), 5.68 (dt, J = 6.5, 15.0 Hz, 1H, 5-H).

¹H-NMR (500 MHz, MeOD, β-Anomer (C-2")): δ = 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 6H, CH ₃), 1.22-1.41 (m, 50H, CH ₂), 1.62 (mc, 2H, 3'-H), 2.00 (s, 3H, CH₃CO),), 2.08 (dd, J = 5.5, 13.0 Hz, 1H, 3"-H_eq), 2.16 (t, J = 7.5 Hz, 2H, 2'-H), 3.27 (dd, J = 2.0, 11.0 Hz, 1H), 3.37 (mc, 1H), 3.48-3.88 (m, 18H), 3.94-3.98 (m, 1H, 4"-H), 4.03-4.09 (m, 3H), 4.17 (dd, J = 4.5, 10.0 Hz, 1H), 4.29 (d, J = 8.0 Hz, 1H, 1-H), 4.56 (d, J = 7.5 Hz, 1H, 1'-H), 5.44 (dd, J = 8.0, 15.0 Hz, 1H, 4-H), 5.67 (dt, J = 7.0, 15.0 Hz, 1H, 5-H).

C₅₉H₁₀₈O₁₉N₂ (1149.51).

6-Hydroxy-hexansäuremethylester 14

Zu einer Lösung von 3.20 g (2 mmol) Adipinsäuremonomethylester in 10 ml THF wurde bei -20°C 20 ml einer 1 M Lösung von Boran-THF-Komplex in THF zugegeben. Man rührte eine Stunde bei dieser Temperatur und ließ in nerhalb von vier Stunden auf RT erwärmen. Bei 0°C wurde mit 15 ml Wasser geqencht und nach Zugabe von 6 g Kaliumcarbonat die Phasen getrennt. Die wäßrige Phase wurde dreimal mit 30 ml Diethylether extrahiert und die verei nigten organischen Phasen über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfer nung des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer wurde durch Kugelrohrde stillation bei 0.931 mbar (0.7 Torr) aufgereinigt. Man erhielt 2.66 g (91%) einer klaren farblosen Flüssigkeit.

Sdp.: 79°C (0.7 Torr).

¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 1.34-1.75 (m, 7H, OH, 3-CH₂, 4-CH₂ 5- CH₂), 2.33 (t, J = 7.5 Hz, 2H, 2-CH₂), 3.65 (t, J = 6.5 Hz, 2H, 6-CH₂), 3.67 (s, 3H, OMe).

5-Methoxycarbonylpentenyl-4-O-[3-O-(5-acetamido-1,3,5-trideoxy-D- glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyloyl-1"→2'-pyranosyl)-β-D- galactopyranosyl]-β-D-glucopyranosid 12

Es wurden 82 mg (0.0730 mmol) Glycosyldonor 5, 85 mg (0.584 mmol) 6-Hydroxy-hexansäuremethylester 14 und 100 mg Molsieb MS 4 Å (über Nacht bei 180°C im Hochvakuum getrocknet) in 3 ml Dichlormethan gelöst und 2 h bei RT gerührt. Man kühlte auf -50°C, spritzte 30 µl Bortrifluorid- Etherat zu, ließ innerhalb 90 min auf -20°C erwärmen und versetzte bei dieser Temperarur mit 0.2 ml Triethylamin. Danach wurde vom Molsieb abdekantiert, mehrfach mit Dichlormethan nachgewaschen und das Lösungsmittel im Va kuum entfernt. Nach Flashchromatographie an 10 g Kieselgel (EE) wurden 56 mg (70%) eines schwach gelben Feststoffes 11 erhalten. Man löste 10 mg (9.03 µmol) davon in 5 ml absolutem Methanol. Nach Zugabe von 30 µl einer 5.4 M Natriummethanolatlösung wurde 24 h bei RT gerührt und 0.1 ml Was ser zugegeben. Nach einer weiteren Stunde bei RT wurde mit Kationenaus tauscher Lewatit® 100S neutralisiert (pH-Kontrolle) und abdekantiert. Es wur de gründlich mit Methanol gewaschen und die vereinigten organischen Pha sen im Vakuum zur Trockene eingedampft. Flashchromatographie an 5 g Kie selgel lieferte 6.0 mg (92%) von 12 als weißen Feststoff.

R_f = 0.13 (α- und β-Anomer (C-2")) (LM8).

¹H-NMR (500 MHz, MeOD, beide Anomere (C-2")): δ = 1.36-1.67 (m, 6H, 2- H, 3-H, 4-H), 2.00 (s, 1.29H, CH₃CO, β-Anomer), 2.01 (s, 1.71H, CH₃CO, α- Anomer), 2.15 (dd, J = 5.0, 13.0 Hz, 0.43H, 3"-H_eq, β-Anomer), 2.33 (t, J = 7.5 Hz, 2H, 5-H), 2.70 (dd, J = 5.0, 13.0 Hz, 0.57H, 3"-H_eq, α-Anomer), 3.20- 4.18 (m, 23H), 3.65 u. 3.76 (2 s, 3H, OMe, beide Anomre), 4.27 (d, J = 8.0 Hz, 0.43H, 1-H, β-Anomer), 4.28 (d, J = 8.0 Hz, 0.57H, 1-H, α-Anomer), 4.56 (d, J = 7.5 Hz, 0.43H, 1'-H, β-Anomer), 4.58 (d, J = 8.0 Hz, 0.57H, 1'-H, α-Anomer).

C₃₀H₅₁O₁₉N (729.73).

Claims

1. Verbindungen der allgemeinen Formel I
in der der Substituent R folgende Bedeutung hat:
eine Hydroxylschutzgruppe der üblichen Art oder Reste der allgemeinen Formel
worin R^' Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl bedeutet und m bzw. n Zahlen von 0 bis 30 sind.

2. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß

a) Verbindungen der allgemeinen Formel II
in welcher R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ für eine Hydroxylschutzgruppe stehen, in organischen Lösungsmitteln und für einzelne Derivatisierungsschritte in Anwesenheit eines Katalysators zu den GM₃-Lacton-Derivaten umgesetzt werden,
b) die GM₃-Lacton-Derivate zu den Lactolen reduziert,
c) in die O,S-Halbacetale überführt,
d) hydriert und acetyliert werden und
e) nach Abspaltung der Schutzgruppe an C-1
f) mit den Alkoholen ROH glykosidiert werden, wobei R die genannte Bedeutung hat.

3. Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel I zur aktiven Immunisierung.

4. Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel I zur Gewinnung von poly- und monoklonalen Antikörpern.