DE19728663C1

DE19728663C1 - Reagentienlose Biosensorsysteme zur Formaldehydbestimmung

Info

Publication number: DE19728663C1
Application number: DE1997128663
Authority: DE
Inventors: Manfred Dipl Ing Dr Kuehn; Barbara Dipl Biol Rodewyk; Dieter Dipl Chem Dr Bryniok
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 1997-07-04
Filing date: 1997-07-04
Publication date: 1998-10-01
Anticipated expiration: 2017-07-05

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Formaldehyd sowie neue, reagentienlose, elektroenzymati sche Biosensorsysteme zur Durchführung dieser Verfahren.

Formaldehyd ist eine sehr reaktive organische Verbindung. Er wird als Industriechemikalie in einer Vielzahl industrieller Prozesse, z. B. der Kunststoff-/Kunstharzproduktion, Farb stoffsynthese, Leim- und Bindemittelherstellung eingesetzt. Weiterhin findet Formaldehyd Anwendung als Desinfektions- und Konservierungsmittel. Unproblematisch sind diese Anwendungs felder jedoch nicht, denn Formaldehyd-Dämpfe sind gesundheits schädlich und sogar eine kanzerogene Wirkung wird diskutiert.

Aufgrund der großen Anwendungsbreite und der nicht geringen toxischen Eigenschaften des Formaldehyds ist es wünschenswert und erforderlich, auf ein einfaches, spezifisches und sensiti ves Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Formaldehyd zu rückgreifen zu können. Deshalb existieren auch schon eine Rei he von Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Formaldehyd, die z. B. auf spektralphotometrischen, elektrochemischen, gas chromatographischen oder auf HPLC-Meßmethoden beruhen. Diese Verfahren haben aber erhebliche Nachteile, weil sie entweder nicht empfindlich bzw. nicht spezifisch genug sind oder weil toxische und/oder teure und nicht wiederverwendbare Chemikali en eingesetzt werden müssen.

Neben den genannten Methoden besteht auch die Möglichkeit der quantitativen Formaldehydbestimmung mit Biokatalysatoren. Dazu wurden in der Literatur bisher Formaldehyd-Dehydrogenasen (DE- OS 37 20 506 und Anal. Chim. Acta, 215, 249-257, 1988) be schrieben. Diese Verfahren zur Formaldehydbestimmung haben al lerdings den Nachteil, daß das dafür benötigte teure Coenzym NAD⁺ nach der erfolgten quantitativen Bestimmung des Formalde hyds nicht wieder verwendet werden kann. Da bisher auch der Einsatz von Methoden zur Coenzym-Regenerierung in analytischen Systemen zur Formaldehydbestimmung nicht erfolgreich gelöst und eingeführt werden konnte, finden solche Analysenmethoden auch wenig Akzeptanz in der Praxis.

In der Literatur sind auch Biosensoren zur quantitativen Be stimmung von Formaldehyd beschrieben. Bei diesen technischen Vorrichtungen zur Formaldehydbestimmung wird ein Formaldehyd metabolisierender Biokatalysator in engen Kontakt zu einem physikalischen Transducer gebracht, der ein aus der Formalde hyd-Metabolisierung durch den Biokatalysator entstehendes Pro dukt, das in definierten Mengen aus dem Formaldehyd gebildet wird, quantitativ erfaßt. Sofern diese Metabolisierungen auch auf der Basis der Oxidation von Formaldehyd zu Ameisensäure mit Hilfe der Formaldehyd-Dehydrogenase und dem Coenzym NAD⁺ beruhen (Sens. Actuators, B 1996, B34 (1-3), 516-523, Biosen. Bioelectron. 1996, 11(3), 239-246), Lebensmittelchemie, 1996, 50(5), 103-105), Anal. Chem. 1995, 67(21), 3936-3944), bieten diese Entwicklungen lediglich eine Verbesserung hinsichtlich der Wiederverwendung des teuren Enzyms, nicht jedoch eine sol che in Bezug auf den Wiedereinsatz des Coenzyms NAD⁺.

Die beschriebenen Nachteile der Biosensoren auf der Basis iso lierter Formaldehyd-Dehydrogenasen zur Formaldehydbestimmung können jedoch auf verschiedenen Wegen überwunden werden. So wurde z. B. ein sogenannter reagentienloser Biosensor zur Form aldehydbestimmung ohne Coenzym-Verbrauch mit einem piezoelek trischen Kristall entwickelt (GBF-Monographie, 1987, 10, 187). Bei diesem Biosensor wird die Formaldehyd-Dehydrogenase auf einem Piezo-Kristall immobilisiert. Formaldehyd kann mit der immobilisierten Formaldehyd-Dehydrogenase in Wechselwirkung treten, und die dabei eintretende Masseänderung wird durch den Piezo-Kristall hochempfindlich gemessen. Bei diesem Sensor wird nur die Affinität des Formaldehyds zur Formaldehyd-Dehy drogenase ausgenutzt und im Gegensatz zu den Metabolismus- Sensoren zur Formaldehydbestimmung der Substratumsatz des Formaldehyds zu Ameisensäure abgekoppelt, so daß das Coenzym NAD⁺ nicht benötigt wird. Nachteilig bei dieser Biosensorkon struktion ist allerdings, daß der Formaldehyd nicht in wäßri gen Lösungen gemessen werden kann, sondern nur in der Gaspha se. Des weiteren bereitet die Regenerierung des Sensors nach dem Messen zum Erreichen seines Ausgangszustandes erhebliche Schwierigkeiten, und dieser piezoelektrische Biosensor ist nicht nur gegenüber Formaldehyd empfindlich, sondern auch ge genüber anderen Aldehyden.

Eine weitere Möglichkeit zur Entwicklung von reagentienlosen Biosensoren zur Formaldehydbestimmung mit Hilfe von Biokataly satoren besteht darin, daß anstelle einer Formaldehyd metabo lisierenden Formaldehyd-Dehydrogenase ein die gleichen Eigen schaften besitzender Mikroorganismus in engste Verbindung mit einem physikalischen Transducer gebracht wird. Solche Kon struktionen sind beschrieben in der Literatur (DE 42 18 937, Anal. Biochem. 1993, 215(2) 216-222). Bei ihnen wird zur Bio sensorentwicklung die Eigenschaft einiger Mikroorganismen aus genutzt, Formaldehyd unter Freisetzung von Ameisensäure als Energie- und Kohlenstoffquelle zu verwerten. Die Menge der ge bildeten Ameisensäure kann mit pH-Werte anzeigenden Meßgeräten erfaßt und quantitativ ausgewertet werden. Vorteil dieser mi krobiellen Formaldehydsensoren ist, daß auch sie kein Coenzym NAD⁺ zu ihrer Funktion benötigen. Die Nachteile solcher mikro bieller Biosensoren bestehen allerdings darin, daß sie weniger sensitiv und weniger selektiv sind als die Biosensoren auf En zymbasis zur Formaldehydbestimmung. Und schließlich ist auch der Zeitaufwand für eine Formaldehyd-Analyse wesentlich grö ßer, weil die Katalyse durch die Mikroorganismen im Vergleich zur Enzymkatalyse langsamer erfolgt und weil die Regeneration des mikrobiellen Biosensors in Vorbereitung für eine neue Mes sung länger dauert.

Aufgabe der Erfindung ist es, Biosensorsysteme und Verfahren zur Formaldehydbestimmung zu entwickeln, die nicht die be schriebenen Nachteile bisher bekannter Biosensoren und der an deren Verfahren zur Formaldehydbestimmung besitzen. Die Bioka talysatorkomponente des Biosensors bzw. Biosensorsystems soll - um die Wiederverwendung des Enzyms zu gewährleisten - aus einem immobilisierten Enzym bestehen, mit dem der Formaldehyd einfach, schnell, kostengünstig, zuverlässig, spezifisch und empfindlich bestimmt werden kann. Das Verfahren der Formalde hydbestimmung soll breit einsetzbar sein, z. B. in der Mikro biologie, in der Chemie, in der Medizin, im Umweltschutz sowie in der Textil-, Holz-, Kunststoff-, Kosmetik- oder Nahrungs mittelindustrie. Zur Durchführung des Bestimmungsverfahrens sollen auch keine toxischen Verbindungen verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung ist Biosensorsysteme zur quantitati ven Formaldehydbestimmung, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie das Enzym Formaldehyd-Dismutase entweder immobilisiert an der pH-sensitiven Fläche eines pH-Werte messenden elektro chemischen Transducers oder als Immobilisat an sphärischen Partikeln in einem Reaktor mit nachgeschaltetem pH-Werte mes senden elektrochemischen Transducer enthalten.

Als pH-Werte messende elektrochemische Transducer können die verschiedenen am Markt erhältlichen bekannten Sensoren einge setzt werden, z. B. Glas- oder Metallelektroden, pH-sensitive, ionenselektive Feldeffekttransistoren oder mit einer pH-sensi tiven Polymermembran versehene, chemisch modifizierte Senso ren.

Das erfindungsgemäß eingesetzte Enzym Formaldehyd-Dismutase, das in Agric. Biol. Chem. 1984, 48, 2017-2023 beschrieben ist, besitzt ein pH-Optimum von 6,8 und katalysiert ohne externe Cofaktorzugabe die Bildung von Ameisensäure als Produkt aus Formaldehyd. Es ist gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht, das bei 216.000 ± 16.000 Dalton liegt und aus vier identischen Untereinheiten besteht. Der apparente K_m-Wert des Enzyms im Rohextrakt liegt über 100 mmol Formaldehyd und die maximale Umsatzgeschwindigkeit v_max über 300 Mikromol Formaldehyd pro Minute und Milligramm Protein. Diese Formaldehyd-Dismutase ist spezifisch für Formaldehyd, andere Aldehyde, weder aliphati sche noch aromatische, werden mit Raten unter 0,5 Prozent im Vergleich zu Formaldehyd umgesetzt. Das Temperatur-Optimum der Formaldehyd-Dismutase liegt bei 35-40°C. Bei einer Temperatur von 20-25°C weist die Formaldehyd-Dismutase noch 80 Prozent Aktivität im Vergleich zur optimalen Temperatur auf.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur quantitati ven Bestimmung des Formaldehyds in wäßrigen Medien, das da durch gekennzeichnet ist, daß man

(a) das Enzym Formaldehyd-Dismutase an der pH-sensitiven Oberfläche eines pH-Werte messenden elektrochemischen Transducers immobilisiert,
(b) en pH-Werte messenden Sensor mit der immobilisierten Formaldehyd-Dismutase mit definierten Mengen wäßriger Meßmedien mit bekanntem Formaldehydgehalt eicht,
(c) den pH-Werte messenden Sensor mit der immobilisierten Formaldehyd-Dismutase mit der gleichen, wie bei der Ei chung verwendeten, definierten Menge des zu untersuchen den wäßrigen Mediums mit unbekannter Formaldehydkonzen tration in Kontakt bringt und daß man die pH-Wertände rung, die durch die in einem definierten Zeitintervall durch das Enzym Formaldehyd-Dismutase aus Formaldehyd er zeugten Produkte verursacht worden ist, als Meßsignal er faßt und
(d) die Formaldehydkonzentration des zu untersuchenden, wäß rigen Mediums durch Vergleich dieser Meßsignale mit den Meßsignalen der Meßmedien bekannter Formaldehydkonzentrationen bestimmt.

Die Formaldehyd-Dismutase kann nach bekannten Methoden (be schrieben in Biosensoren, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, 1995, 22-31) am Transducer irreversibel immobilisiert werden. Als Immobilisierungsverfahren kommen für die Immobilisierung der Formaldehyd-Dismutase

(i) die Rückhaltung hinter einer inerten, formaldehyddurch lässigen Membran,
(ii) die physikalische Adsorption an einer auf die Transdu ceroberfläche aufgebrachte inerte, den Formaldehyd durchlassende Membran,
(iii) die Vernetzung der Formaldehyd-Dismutase mit bifunktio nellen Reagentien in Gegenwart eines oder ohne ein ver netzungsfähiges Makromolekül
(iv) der Einschluß in polymere Matrices oder
(v) die kovalente Bindung an eine auf die Transducerober fläche aufgebrachte Membran mit funktionellen Gruppen,

nach dem Fachmann bekannten Methoden, die beispielsweise in der Patentschrift DE 42 18 937 beschrieben sind, in Frage.

Neben dieser direkten Immobilisierung auf der pH-sensitiven Oberfläche eines pH-Werte messenden Transducers kann die Form aldehyd-Dismutase auch an sphärischen Trägermaterialien nach den bekannten Methoden der adsorptiven und/oder kovalenten oder quervernetzenden Bindung immobilisiert werden und zur Formaldehydbestimmung in der Anordnung eines analytischen Durchflußreaktorsystems, wie es noch näher beschrieben wird, mit einem pH-Werte messenden Transducer kombiniert werden.

Als besonders geeignete Methoden zur Immobilisierung der Form aldehyd-Dismutase erwiesen sich die direkte, quervernetzende Immobilisierung auf pH-sensitiven Oberflächen, vorzugsweise in Gegenwart eines ebenfalls vernetzungsfähigen Makromoleküls, beispielsweise Polyvinylalkohol oder Gelatine, mit bifunktio nellen Vernetzungsmitteln, vorzugsweise Glutaraldehyd oder der Einschluß in eine polymere Matrix direkt auf der pH-sensitiven Oberfläche des Transducers, z. B. in eine Polyurethanmatrix.

Die Bestimmung unbekannter Formaldehydkonzentrationen beginnt zunächst mit der Eichung des erfindungsgemäßen Biosensors, d. h. mit der Erstellung einer Eichkurve. Dazu wird der Biosen sor zunächst in einer Meßzelle, in der sich ein Meßpuffer be findet, plaziert, danach - in der einfacheren Variante - mit einer kommerziell erhältlichen Auswerteeinheit (pH-Meßgerät) verbunden und anschließend mit mehreren wäßrigen Lösungen be kannter Formaldehydkonzentrationen in Kontakt gebracht. Dabei wird so vorgegangen, daß, angefangen mit niedrigen Formalde hydkonzentrationen in wäßrigen Lösungen, eine Formaldehydlö sung mit bekanntem Formaldehydgehalt in die mit dem Meßpuffer gefüllte Meßzelle gegeben wird, nach einer bestimmten Zeit (der sogenannten Meßzeit) die Signaländerung erfaßt wird, die Meßzelle danach geleert wird, durch Meßpufferwechsel der Grundzustand (das Grundsignal) des Biosensors wieder einge stellt wird und danach der Meßvorgang mit einer neuen Formal dehydlösung mit bekannter Formaldehydkonzentration wiederholt wird. Nach diesen Eichmessungen werden die erhaltenen Meßwerte verwendet zur Erstellung der Eichkurve, bei der die Formalde hydkonzentrationen gegen die erhaltenen Meßsignale aufgetragen werden. Nach seiner Eichung wird der Biosensor im nächsten Schritt mit Formaldehydlösungen unbekannter Konzentration in gleicher Weise kontaktiert. Die dabei erhaltenen Meßwerte wer den in Vergleich gesetzt zur erstellten Eichkurve und aus die ser die Konzentration des Formaldehyds der unbekannten wäßri gen Probe abgelesen.

Mit moderneren Varianten der Meßwerterfassung und Meßwertaus wertung, wie sie beispielsweise in Bioinstrumentation: Re search, Developments and Applications, D. I. Wise, ed., Butter worth, Boston, London, 1990 beschrieben sind, können die Meß werte der Formaldehydmessungen mit Hilfe von (dem Fachmann be kannten) mathematischen Gleichungen in Konzentrationseinheiten an Formaldehydgehalt in den vermessen wäßrigen Lösungen umge rechnet werden und diese direkt, ohne Erstellung einer Eich kurve, angezeigt bzw. ausgedruckt werden. Bei dieser Vorge hensweise ist allgemein auch nur eine Einpunkteichung mit ei ner Formaldehydlösung bekannter Konzentration erforderlich.

Die Art und das eingesetzte Volumen der Meßpuffer beeinflussen das Meßergebnis in entscheidender Weise, daß sie großen Ein fluß auf die Meßsignalgröße haben, die wiederum für die Meß wertrichtigkeit bedeutsam ist. Als Pufferart sind Phosphatpuf fer mit niedrigen Pufferkapazitäten besonders geeignet für das Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Formaldehyd, auch wegen der guten Stabilität der Formaldehyd-Dismutase darin. So liegt beim erfindungsgemäßen Verfahren die Pufferkapazität der Meßpuffer bzw. auch der zu vermessenden Formaldehydproben im Bereich von 1 × 10^-5 und 1 × 10^-2mol/l, vorzugsweise aber im Be reich von 5 × 10^-3 bis 5 × 10^-4mol/1. Die pH-Werte der Meßpuffer liegen zwischen 4,0 und 9,0 mit besonderem Vorteil zwischen 6,5 und 7,5.

Die Meßvolumina sind in erster Linie abhängig von der Form und Größe der verwendeten pH-Sensoren. Große Volumenmengen sollten aber vermieden werden. Bevorzugte Meßvolumina betragen bis zu 50 ml, vorzugsweise liegen sie aber im Bereich von 1 bis 5 ml. Kleinere und größere als die angegebenen Volumina sind aber ebenfalls möglich.

Zur Bestimmung der Formaldehydkonzentration wird vom erfin dungsgemäßen Biosensor diejenige pH-Wertänderung bzw. die ihr entsprechende Potentialänderung erfaßt, die in einem vorgege benen definierten Volumen und in einem definierten Zeitinter vall durch die Wechselwirkung der Formaldehyd-Dismutase mit dem Formaldehyd (Bildung von Ameisensäure) verursacht wird. Die Meßzeitintervalle liegen im Bereich von 0 bis 10 Minuten, längere Meßzeiten sind durchaus möglich. Entscheidend für die Meßdauer ist das Erreichen eines genügend hohen Meßsignales, welches abhängig ist von der Qualität der Immobilisierung der Formaldehyd-Dismutase.

In der Reaktorvariante des elektrochemischen Biosensors zur quantitativen Formaldehydbestimmung wird beispielsweise eine mit einem Formaldehyd-Dismutase-Immobilisat gefüllte Säule (Säuleninhalt ist abhängig von der Immobilisierungsausbeute) in den Kreislauf eines Flow-Injektions-Analysensystems inte griert. Solche Flow-Injektions-Analysensysteme sind dem analy tischen Chemiker an sich bekannt. Sie werden u. a. für die quantitative Bestimmung von Enzymsubstraten eingesetzt und sind dadurch gekennzeichnet, daß das/die immobilisierte(n) En zym(e), das/die zur quantitativen Bestimmung seiner(s) Substrate(s) eingesetzt wird/werden und ein Transducer in ein geschlossenes Durchflußsystem integriert werden und in dessen Flüssigkeitsstrom das zu bestimmende Enzymsubstrat über ein Dosierventil injiziert wird. Durch den Flüssigkeitsstrom wird das Enzymsubstrat zu den(m) immobilisierten Enzym(en) trans portiert, durch diese(s) in ein Produkt oder mehrere umgewan delt, welche(s) durch den Transducer erfaßt und durch eine Auswerteeinheit quantitativ ausgewertet wird/werden. Die Vor teile solcher Flow-Injektions-Analysensysteme bestehen darin, daß sie automatisierte Probenvorbereitungen und Spülvorgänge gestatten, eine einfache Nachkalibrierung von Nullpunkt und Empfindlichkeit durch Null- und Referenzproben ermöglichen und hinsichtlich vorgeschalteter Probentrennungen und der Immobi lisierungsverfahren für Enzyme mehr Variationsmöglichkeiten bieten.

Der Säule nachgeschaltet wird ebenfalls in den Kreislauf einer der beschriebenen - diesmal jedoch unbeschichteten - pH-Senso ren, der wiederum mit einem pH-Meter oder einer anderen Poten tialänderungen auswertenden elektronischen Einheit verbunden ist. Die Formaldehydmessung wird in diesem Fall gestartet durch die Injektion einer Formaldehydprobe, im Falle der Ei chung mit einer solchen bekannten Formaldehydgehaltes und da nach mit einer solchen unbekannten Formaldehydgehaltes, in den Pufferstrom des Systems. Im Falle der Reaktoranordnung zur Formaldehydbestimmung werden die Meßergebnisse in gleicher Weise erhalten, wie es für die Membranvariante des Biosensors beschrieben wurde, d. h. mit Hilfe der Eichkurve oder der di rekten elektronischen Auswertung. Die Meßzeit beginnt hier mit der Injektion der Formaldehydproben in den Meßpufferstrom des Flow-Injektions-Systems und es gelten die gleichen Meßzeitin tervalle, wie für die Membranvariante oben beschrieben.

Mit der Formaldehyd-Dismutase ist in jüngster Zeit ein neues Enzym aufgefunden worden, das den Formaldehyd in einer Dispro portionierungsreaktion in Ameisensäure und Methanol metaboli siert. Die dabei gebildete Ameisensäure erlaubt damit erstma lig die Entwicklung eines reagentienlosen, potentiometrischen Biosensors zur Formaldehydbestimmung mit Hilfe eines Enzyms, ohne daß dazu Coenzyme benötigt werden. Damit verringern sich die Kosten pro quantitative Analyse des Formaldehyds wesent lich.

Im Vergleich zu den erwähnten mikrobiellen Biosensoren zur quantitativen Bestimmung von Formaldehyd kann mit dem erfin dungsgemäßen elektroenzymatischen Biosensor und dem dazugehö rigen Verfahren der Formaldehyd in wäßrigen Medien zudem ein facher, schneller, reproduzierbarer, spezifischer und sensiti ver bestimmt werden. Gegenüber chemischen und physikalischen Bestimmungsmethoden ist das neue Verfahren weniger kostenin tensiv, und es werden keine toxischen Reagentien zu seiner Durchführung benötigt.

Mit der Immobilisierung der Formaldehyd-Dismutase wurde im Vergleich zum gleichen Zweck der Formaldehydbestimmung verwen deten löslichen Enzym eine wesentlich verbesserte Stabilität des Enzyms erreicht, z. B. beim Aufbewahren und während der Meßzyklen. In immobilisierter Form ist die Formaldehyd-Dis mutase auch mehrfach einsetzbar, was ebenfalls die Analysenko sten verringert.

Der elektroenzymatische Biosensor und das mit ihm durchgeführ te Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Formaldehyd ist breit und in vielen Gebieten einsetzbar, d. h. überall dort, wo Formaldehyd in Produktionsprozessen oder als Desinfektions- bzw. Konservierungsmittel verwendet wird. Bevorzugte Anwen dungsbereiche sind daher in der Mikrobiologie, Chemie, Medizin und im Umweltschutz sowie in der Holz-, Textil-, Kunststoff-, Kosmetik- oder Nahrungsmittelindustrie zu finden.

BEISPIEL

50 Mikroliter einer Lösung mit 10,5 Enzymaktivitätseinheiten Formaldehyd-Dismutase werden mit 12,5 Mikroliter einer 5%igen (w/v) Polyvinylalkohollösung versetzt und gut durchmischt. An schließend wird das Gemisch auf der pH-sensitiven Fläche einer pH-Glaselektrode gleichmäßig verteilt und schließlich bei Zim mertemperatur an der Elektrodenoberfläche angetrocknet. Die mit der Enzymschicht belegte pH-sensitive Oberfläche der pH- Elektrode wird danach 2 Minuten zur quervernetzenden Immobili sierung in eine auf einen pH-Wert von 6,80 eingestellte 2,5%- ige (v/v) Lösung von Glutaraldehyd eingetaucht. Nach dem Her ausnehmen des nun vorliegenden elektroenzymatischen Biosensors zur Formaldehydmessung aus der Glutaraldehydlösung wird dieser mit destilliertem Wasser und einem Phosphatpuffer (pH 6,80; 1 mM) gewaschen, an ein pH-Meßgerät angeschlossen und zur Äqui librierung bis zum Erreichen eines konstanten Grundsignals im gleichen Phosphatpuffer, der später auch der Meßpuffer ist, gelagert. Zur Messung des Formaldehyds wird der Biosensor aus der Äquilibrierlösung herausgenommen und in einer geeigneten Meßzelle plaziert.

Mit der Messung des Formaldehyds wird begonnen, indem in die Meßzelle mit dem darin befindlichen Biosensor 5 ml eines 1 mmolaren Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 6,80 gefüllt werden. In der Meßzelle wird der Puffer gerührt und auf einer konstanten Meßtemperatur von 25°C gehalten. Die Zugabe einer Formaldehydlösung mit bekanntem Formaldehydgehalt bewirkt eine pH-Änderung in der Enzymmembran, die diffusionsbedingt auf die pH-sensitive Fläche der pH-Elektrode übertragen wird, von die ser erfaßt und durch das an den Biosensor angeschlossene pH- Meßgerät als Potentialänderung angezeigt wird. Auf diese Weise kann jeder bekannten Formaldehydkonzentration eine ihr ent sprechende Potentialänderung zugeordnet werden, die Basis für die Erstellung der Eichkurve ist. Die Meßzeit eines einzelnen Meßvorgangs beträgt 2 Minuten. Danach wird die Meßzelle ent leert und mit dem Meßpuffer gewaschen, bis das Grundsignal wieder erreicht ist und ein neuer Meßvorgang begonnen werden kann. Eine auf die beschriebene Weise erstellte Eichkurve ist als Fig. 1 dokumentiert.

Die Konzentrationen an Formaldehyd in unbekannten Meßproben werden mit Hilfe der Eichkurve bestimmt.

Der lineare Meßbereich geht für diesen Formaldehydsensor bis etwa 20 mmol. Der elektroenzymatische Biosensor besitzt eine sehr gute Lagerstabilität und lange Arbeitsstabilität. Noch nach etwa einer Woche konnte der Biosensor zur Formaldehydbe stimmung bei einem Aktivitätsverlust des Enzyms von 40 Prozent eingesetzt werden. Die Reproduzierbarkeit der Meßergebnisse ist ebenfalls sehr gut. Der Variationskoeffizient liegt bei der Vermessung von 20 Meßproben bei 2%.

Claims

1. Biosensorsysteme zur quantitativen Formaldehydbestimmung, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Enzym Formaldehyd-Dismutase entweder immobilisiert an der pH-sensi tiven Fläche eines pH-Werte messenden elektrochemischen Trans ducers oder als Immobilisat an sphärischen Partikeln in einem Reaktor mit nachgeschaltetem pH-Werte messenden elektrochemi schen Transducer enthalten.

2. Biosensorsysteme nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß der elektrochemische Transducer aus der Gruppe bestehend aus Glas- oder Metallelektroden, pH-sen sitiven ionenselektiven Feldtransistoren oder mit einer pH- sensitiven Polymermembran versehenen, chemisch modifizierten Sensoren ausgewählt ist.

3. Biosensorsysteme nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge kennzeichnet, daß die Formaldehyd-Dismutase ein Molekulargewicht von 216.000 ± 16.000 Dalton besitzt und aus vier identischen Untereinheiten besteht.

4. Biosensorsysteme nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Formaldehyd-Dismutase- Immobilisat an sphärischen Partikeln in einem Reaktor mit nachgeschaltetem pH-Werte messenden elektrochemischen Transdu cer in ein Flow-Injektions-Analysensystem integriert ist.

5. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Formaldehyd in wäßrigen Medien, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) das Enzym Formaldehyd-Dismutase an der pH-sensitiven Oberfläche eines pH-Werte messenden elektrochemischen Transducers immobilisiert,
b) den pH-Werte messenden Sensor mit der immobilisierten Formaldehyd-Dismutase mit definierten Mengen wäßriger Meßmedien mit bekanntem Formaldehydgehalt eicht,
c) den pH-Werte messenden Sensor mit der immobilisierten Formaldehyd-Dismutase mit der gleichen, wie bei der Ei chung verwendeten, definierten Menge des zu untersuchen den wäßrigen Mediums mit unbekannter Formaldehydkonzen tration in Kontakt bringt und daß man die pH-Wertände rung, die durch die in einem definierten Zeitintervall durch das Enzym Formaldehyd-Dismutase aus Formaldehyd er zeugten Produkte verursacht worden ist, als Meßsignal er faßt und
d) die Formaldehydkonzentration des zu untersuchenden, wäß rigen Mediums durch Vergleich dieser Meßsignale mit den Meßsignalen der Meßmedien bekannter Formaldehydkonzentra tionen bestimmt.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn zeichnet, daß man das Enzym Formaldehyd-Dismutase auf der pH-sensitiven Oberfläche des pH-Werte messenden elek trochemischen Transducers quervernetzend immobilisiert oder zwischen der Sensoroberfläche und einer wasserunlöslichen, für Formaldehyd und für die Produkte der Formaldehyd-Dismutase- Reaktion permeablen Membran in löslicher oder unlöslicher Form einschließt.

7. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Formaldehyd in wäßrigen Medien, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) das Enzym Formaldehyd-Dismutase an sphärischen Partikeln, eingebracht in einem Reaktor mit nachgeschaltetem pH- Werte messenden elektrochemischen Transducer, immobili siert,
b) den Reaktor mit dem nachgeschalteten pH-Werte messenden elektrochemischen Transducer in ein Flow-Injektions-Ana lysensystem integriert,
c) den pH-Werte messenden elektrochemischen Transducer mit definierten Mengen wäßriger Meßmedien mit bekanntem Form aldehyd-Gehalt eicht, dergestalt, daß man in den Flüssig keitsstrom des Flow-Injektions-Analysensystems das wäßri ge Meßmedium mit bekanntem Formaldehyd-Gehalt über ein Dosierventil injiziert, so daß durch den Flüssigkeits strom das Enzymsubstrat, d. h. die Formaldehydlösung, zu der immobilisierten Formaldehyd-Dismutase in den Reaktor transportiert wird, wodurch dieses in ein Produkt umge wandelt wird, welches durch den Transducer erfaßt und durch eine Auswerteeinheit quantitativ ausgewertet wird,
d) die gleiche wie bei der Eichung verwendete definierte Menge des zu untersuchenden wäßrigen Mediums mit unbe kannter Formaldehyd-Konzentration in das Flow-Injektions- Analysensystem injiziert und daß man die pH-Wertänderung, die durch die in einem definierten Zeitintervall durch das Enzym Formaldehyd-Dismutase aus Formaldehyd erzeugten Produkte verursacht worden ist, als Meßsignal durch den Transducer erfaßt, und
e) die Formaldehydkonzentration des zu untersuchenden wäßri gen Mediums durch die Auswerteeinheit des Flow-Injek tions-Analysensystems quantitativ bestimmt.