DE19714911A1

DE19714911A1 - Peptide mimotopes for low molecular haptens, process for their preparation and their use

Info

Publication number: DE19714911A1
Application number: DE1997114911
Authority: DE
Inventors: Burkhard Prof Dr Micheel; Volker Dr Boettger; Lars-Erik Peters; Peter Dr Bendzko
Original assignee: Invitek GmbH
Current assignee: Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH
Priority date: 1997-04-04
Filing date: 1997-04-04
Publication date: 1998-10-08
Also published as: WO1998045321A2; WO1998045321A3

Abstract

The present invention relates to peptide mimotopes which mimic a low molecular hapten. The invention also relates to the production and the use thereof in detecting and isolating recombinant proteins.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptid-Mimotope, die eine Mimikry eines niedermolekularen Haptens darstellen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zum Nachweis und zur Isolierung von rekombinanten Proteinen.The present invention relates to peptide mimotopes that have a Represent mimicry of a low molecular hapten, method to their manufacture and their use for detection and Isolation of recombinant proteins.

Haptene sind niedermolekulare Substanzen, die nach Kopplung an Trägerproteine und anschließender Injektion in Versuchstiere zur Bildung spezifischer Antikörper führen.Haptens are low molecular weight substances that after coupling Carrier proteins and subsequent injection into experimental animals Form specific antibodies.

Derartige Hapten-Antikörper-Systeme eignen sich, ähnlich wie das Biotin-Avidin-System (Wilchek und Bayer, Methods Enzymol. 184, 5-13, 1990), ausgezeichnet als Indikatorsysteme zum Aufbau von Immunassays. Hierbei hat sich besonders das FITC-Anti-FITC-System bewährt (Samuel et al., J. Immunol. Meth. 107, 217-224, 1988; Micheel et al., J. Immunol. Meth. 111, 89-94, 1988; Karawajew et al., J. Immunol. Meth. 111, 95-99, 1988; Harmer und Samuel J. Immunol. Meth. 122, 115-121, 1989; Serke und Pachmann J. Immunol. Meth. 112, 207-211, 1988). Fluoresceinisothiozyanat (FITC) läßt sich leicht an Proteine koppeln, und monoklonale Antikörper gegen FITC, die mit diesen gekoppelten Proteinen reagieren, eignen sich damit als universelle Indikatorantikörper.Such hapten-antibody systems are suitable, similar to that Biotin-avidin system (Wilchek and Bayer, Methods Enzymol. 184, 5-13, 1990), distinguished as indicator systems for the construction of Immunoassays. This is where the FITC Anti-FITC system comes in proven (Samuel et al., J. Immunol. Meth. 107, 217-224, 1988; Micheel et al., J. Immunol. Meth. 111, 89-94, 1988; Karawajew et al., J. Immunol. Meth. 111, 95-99, 1988; Harmer and Samuel J. Immunol. Meth. 122, 115-121, 1989; Serke and Pachmann J. Immunol. Meth. 112, 207-211, 1988). Fluorescein isothiocyanate (FITC) leaves easily attach to proteins, and monoclonal antibodies against FITC that react with these coupled proteins are suitable thus as a universal indicator antibody.

Für die Identifizierung und Isolierung von rekombinanten Proteinen, die mit Hilfe von Expressionsvektoren in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen exprimiert werden, können spezifische Antikörper gegen das jeweilige Protein eingesetzt werden. Als universelle Nachweissysteme, die dann auch zur Isolierung dienen können, werden kurze Peptidsequenzen eingesetzt, deren kodierende Nukletidsequenzen in den Expressionsvektor eingebaut werden und die demzufolge als Peptide zusammen mit dem rekombinanten Protein exprimiert werden. Bei solchen, im angloamerikanischen Sprachgebrauch als "tag" (Etiketten) bezeichneten Sequenzen handelt es sich bisher um Histidinsequenzen, die an Nickelionen binden (Hengen, Trends Biochem. Sci. 20, 285-286, 1995) bzw. um kurze, in normalen Proteinen vorkommende Peptide, gegen die monoklonale Antikörper hergestellt wurden (Cravchik und Matus, Gene 137, 139-143, 1993). Da derartige Peptide oder kreuzreagierende Varianten auch in den für die Proteinproduktion eingesetzten pro- oder eukaryontischen Zellen vorkommen können, kann dies zu Fehlern beim Nachweis und bei der Isolierung der rekombinanten Proteine führen.For the identification and isolation of recombinant proteins, which with the help of expression vectors in prokaryotic or eukaryotic cells can be expressed specific Antibodies against the respective protein can be used. As universal detection systems, which then also serve as insulation short peptide sequences are used, their coding Nuclide sequences are built into the expression vector and the consequently as peptides together with the recombinant protein be expressed. With such, in the Anglo-American Sequences referred to as "tag" (labels) histidine sequences that bind to nickel ions (Hengen, Trends Biochem. Sci. 20, 285-286, 1995) or short, in peptides occurring normal proteins, against the monoclonal Antibodies were produced (Cravchik and Matus, Gene 137, 139-143, 1993). Because such peptides or cross-reactive Variants also in those used for protein production Pro or eukaryotic cells can occur, this can lead to errors in the detection and isolation of the recombinant proteins to lead.

Ziel der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein Verfahren zur Herstellung und Nutzung von artifiziellen "tag"-Sequenzen gegen spezifisch monoklonale Antikörper, insbesondere Peptid-Mimotopen, für das niedermolekulare Fluorescein und seine Derivate zu entwickeln, die ebenso wie Fluorescein und seine Derivate von monoklonalen Anti-FITC-Antikörpern spezifisch gebunden werden.The aim of the present invention was therefore to provide a method for Production and use of artificial "tag" sequences against specifically monoclonal antibodies, especially peptide mimotopes, for the low molecular weight fluorescein and its derivatives develop which, like fluorescein and its derivatives of monoclonal anti-FITC antibodies are specifically bound.

Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen 1, 18 und 22 realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.The invention is implemented according to claims 1, 18 and 22, the subclaims are preferred variants.

Die FITC-Peptid-Mimotope werden erfindungsgemäß hergestellt durch:
The FITC peptide mimotopes are produced according to the invention by:

A) Identification of peptides specific to Anti-fluorescein and anti-FITC antibodies respond with the help of synthetic or peptide-based peptide libraries of filamentous phages,
B) Preparation of the synthetic peptides according to the identified sequences and determination of binding specificities,
C) coupling the synthetic peptides to carrier proteins and Determination of binding specificities,
D) synthesis of the nucleotide sequences encoding these peptides, and Cloning of these sequences into expression vectors,
E) Use of these expression vectors for production recombinant proteins,
F) Detection of the synthesis of the recombinant proteins by detection the "tag" peptides using the specific antibodies and
G. Isolation of the synthesized recombinant proteins by Binding of the "tag" peptides to specific antibodies.

Gegenstand der Erfindung sind auch die mit Hilfe von Peptid-Phagenbibliotheken und mit Hilfe des monoklonalen Anti-FITC-Antikörpers B13-DE1 isolierten FITC-Peptid-Mimotope mit den Sequenzen WLPWEW (bzw. mit den flankierenden Sequenzen ADGAWLPWEWGA), GSWGEW (bzw. mit den flankierenden Sequenzen ADGAGSWGEWGA) und GPPGMVGDWWDW.The invention also relates to those using Peptide phage libraries and using the monoclonal Anti-FITC antibody B13-DE1 isolated FITC peptide mimotopes with the sequences WLPWEW (or with the flanking sequences ADGAWLPWEWGA), GSWGEW (or with the flanking sequences ADGAGSWGEWGA) and GPPGMVGDWWDW.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Peptide als synthetische Peptide, die mit einem zusätzlichen Marker, wie z. B. Biotin versehen sind.Another object of the present invention is Use of the peptides produced according to the invention as synthetic peptides with an additional marker, such as. B. Biotin are provided.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Peptide als synthetische Peptide, die an Träger gekoppelt werden.Another object of the present invention is Use of the peptides produced according to the invention as synthetic peptides that are coupled to carriers.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Peptide in ihrer Form als kodierende Nukleotidsequenzen.Another object of the present invention is Use of the peptides produced according to the invention in their form as coding nucleotide sequences.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Peptide in ihrer Form als kodierende Nukleotidsequenzen, die in Expressionsvektoren kloniert werden. Another object of the present invention is Use of the peptides produced according to the invention in their form as coding nucleotide sequences that are in expression vectors to be cloned.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Peptide zum Nachweis und zur Isolierung von rekombinanten Proteinen nach Einsatz der Expressionsvektoren, die diese Sequenzen als "tag" exprimieren.Another object of the present invention is Use of the peptides produced according to the invention for detection and for the isolation of recombinant proteins after using the Expression vectors that express these sequences as "tag".

Im folgenden werden die wesentlichen Punkte der Erfindung ausführlicher dargestellt.The following are the essential points of the invention shown in more detail.

1. Isolation of antibody-binding peptides

Zur Isolierung und Identifizierung von Peptiden, die an Antikörper gegen Haptene binden, werden Peptidbibliotheken (synthetische Bibliotheken oder Phagenbibliotheken; Scott und Smith, Science 249, 386-390, 1990; Felici et al., J. Mol. Biol. 222, 301-310, 1991; Cwirla et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6378-6382, 1990; Dower, Curr. Biol. 2, 251-253, 1992; Böttger und Lane J. Mol. Biol. 235, 61-67, 1994; Böttger et al., J. Mol. Biol. 247, 932-946, 1995; Daniels und Lane, Exp. Opin. Ther. Patents 5, 901-912, 1995) eingesetzt. Mit Hilfe üblicher Verfahren werden aus der Vielzahl der Peptidkombinationen diejenigen herausselektiert, die von einem Antikörper gegen Haptene gebunden werden. Bei der Nutzung von Phagenbibliotheken werden nur diejenigen Phagen gebunden, die Peptid-Mimotope an ihrer Oberfläche exprimieren, die eine Mimikry des Haptens darstellen. Da die gebundenen Phagen die genetische Information für das spezifische Peptid-Mimotop enthalten, können diese Phagen unbegrenzt vermehrt und damit sowohl die kodierenden Nukleotidsequenzen als auch die kodierten Peptidsequenzen identifiziert und genutzt werden.For the isolation and identification of peptides attached to antibodies bind against haptens, peptide libraries (synthetic Libraries or phage libraries; Scott and Smith, Science 249, 386-390, 1990; Felici et al., J. Mol. Biol. 222, 301-310, 1991; Cwirla et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6378-6382, 1990; Dower, curr. Biol. 2, 251-253, 1992; Böttger and Lane J. Mol. Biol. 235, 61-67, 1994; Böttger et al., J. Mol. Biol. 247, 932-946, 1995; Daniels and Lane, Exp. Opin. Ther. Patents 5, 901-912, 1995). With the help of customary procedures, the Variety of peptide combinations selected those that be bound by an antibody against haptens. When using only those phages are bound by phage libraries that Expressing peptide mimotopes on their surface that are a mimicry of the hapten. Because the bound phages are genetic May contain information for the specific peptide mimotope these phages increased indefinitely and thus both the coding Nucleotide sequences as well as the encoded peptide sequences identified and used.

Für den monoklonalen Antikörper B13-DE1 (Micheel et al., J. Immunol. Meth., 111, 89-94, 1988), der mit Fluorescein und Fluoresceinderivaten reagiert, wurden erfindungsgemäß bindende Peptide mit den folgenden Sequenzen identifiziert: WLPWEW (bzw. mit den flankierenden Sequenzen ADGAWLPWEWGA), GSWGEW (bzw. mit den flankierenden Sequenzen ADGAGSWGEWGA) und GPPGMVGDWWDW. For the monoclonal antibody B13-DE1 (Micheel et al., J. Immunol. Meth., 111, 89-94, 1988) using fluorescein and Fluorescein derivatives reacted, were binding according to the invention Peptides identified with the following sequences: WLPWEW (or with the flanking sequences ADGAWLPWEWGA), GSWGEW (or with the flanking sequences ADGAGSWGEWGA) and GPPGMVGDWWDW.

2. Confirmation of the specificity of the antibody-peptide reaction

Zur Absicherung der Spezifität der Bindung der Peptide an den Antikörper werden Versuche zur Inhibition dieser Reaktion mit dem jeweiligen Hapten und den Haptenderivaten durchgeführt. Im Falle des monoklonalen Antikörpers B13-DE1 wurde getestet, ob die Bindung des Antikörpers an die Peptid-exprimierenden Phagen mit oben angegebener Sequenz durch FITC, Fluorescein und Carboxyfluorescein sowie in viel geringerem Umfang durch strukturell ähnliche Substanzen, wie z. B. Phenolrot, gehemmt wird und ob diese Hemmung derjenigen entspricht, die bei der Bindung des Antikörpers B13-DE1 an FITC-markierte Proteine beobachtet wird.To ensure the specificity of the binding of the peptides to the Antibodies are attempts to inhibit this reaction with the respective hapten and the hapten derivatives. In the event of of the monoclonal antibody B13-DE1 was tested whether the Binding of the antibody to the peptide-expressing phage sequence given above by FITC, fluorescein and Carboxyfluorescein as well to a much lesser extent structurally similar substances, such as. B. phenol red is inhibited and whether this inhibition corresponds to that which occurs when the Antibody B13-DE1 to FITC-labeled proteins is observed.

3. Detection of the binding of synthetic peptides to the Anti-hapten antibody

Als weitere Tests zum Nachweis der Spezifität der Mimikry des Haptens durch Peptid-Mimotope werden Peptide mit der identifizierten Sequenz synthetisiert und ihre Bindung an die Antikörper getestet. Im Falle der Peptid-Mimotope, die eine Mimikry des Fluoresceins darstellen, zeigte sich für zwei der Peptidsequenzen auch eine Bindung des monoklonalen Antikörpers B13-DE1 an synthetisierte Biotin-markierte Peptide. Andere monoklonale Antikörper reagierten nicht, und Inhibitionsversuche konnten auch hier die Spezifität der Mimikry beweisen.As further tests to demonstrate the specificity of the mimicry of the Haptens by peptide mimotopes are peptides with the identified sequence synthesized and their binding to the Antibody tested. In the case of peptide mimotopes that have a mimicry of fluorescein was shown for two of the Peptide sequences also bind the monoclonal antibody B13-DE1 on synthesized biotin-labeled peptides. Other monoclonal antibodies did not respond and attempts to inhibit them were able to prove the specificity of the mimicry.

4. Detection of antibody-peptide binding after coupling synthetic peptides on proteins

Zum Nachweis der Universalität der Mimikry wird überprüft, ob eine Bindung der Peptide durch den Anti-Hapten-Antikörper auch in Nachbarschaft anderer Proteinsequenzen erfolgt. Dazu werden die Peptide an Proteine gekoppelt, und anschließend erfolgen die Tests zum Nachweis der Bindung. Im Falle der Peptid-Mimotope, die eine Mimikry des Fluoresceins darstellen, zeigte sich eine Bindung des monoklonalen Antikörpers B13-DE1 an eine der Peptidsequenzen nach Kopplung an Proteine.To demonstrate the universality of the mimicry, it is checked whether a Binding of the peptides by the anti-hapten antibody also in Neighboring other protein sequences occurs. To do this, the Peptides coupled to proteins, and then the tests are done to prove the bond. In the case of peptide mimotopes, the one Mimicry of fluorescein, binding of the monoclonal antibody B13-DE1 to one of the peptide sequences Coupling to proteins.

5. Use of the mimotope sequences as a "tag" for the detection and the Isolation of recombinant proteins

Die Nukleotidsequenzen, die die Peptide kodieren, werden zu diesem Zweck über geeignete Schnittstellen in Expressionsvektoren nach üblichen Methoden kloniert. In diese Vektoren können beliebige Proteingene kloniert und die Vektoren zur Expression in geeigneten pro- oder eukaryontischen Zellen genutzt werden. Antikörper gegen das jeweilige Hapten werden dann zum Nachweis der Synthese der jeweiligen Genprodukte und zur Isolierung eingesetzt. Im Falle der Peptid-Mimotope, die eine Mimikry des Fluoresceins darstellen, werden die Nukleotidsequenzen, die die oben angegebenen Peptide (mit oder ohne die flankierenden Sequenzen) kodieren, in geeignete Expressionsvektoren kloniert. Für den Nachweis der "tag"-Peptide wird der monoklonale Antikörper B13-DE1 eingesetzt.The nucleotide sequences encoding the peptides become this Purpose via suitable interfaces in expression vectors usual methods cloned. Any of these can be used in these vectors Protein genes cloned and the vectors suitable for expression in Pro or eukaryotic cells can be used. Antibodies against the respective hapten are then used to demonstrate the synthesis of the respective gene products and used for isolation. In case of Peptide mimotopes, which represent a mimicry of fluorescein, are the nucleotide sequences that make up the peptides given above encode (with or without the flanking sequences) into appropriate ones Expression vectors cloned. For the detection of the "tag" peptides the monoclonal antibody B13-DE1 is used.

Mit den erfindungsgemäßen Peptid-Mimotopen steht eine Möglichkeit zur Verfügung, Proteine in komplexen Gemischen wie Zellextrakten spezifisch nachzuweisen und zu isolieren. Der Vorteil gegenüber anderen Markierungen besteht darin, daß die biologische Aktivität im Gegensatz z. B. von Fluorescein- oder Biotinmarkierungen nicht verändert wird.There is one possibility with the peptide mimotopes according to the invention available proteins in complex mixtures such as cell extracts specifically detect and isolate. The advantage over Another mark is that the biological activity in contrast z. B. from fluorescein or biotin labels is changed.

Die Erfindung soll nachstehend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail below by means of exemplary embodiments are explained.

example 1 1. Isolation and identification of peptide mimotopes attached to the bind monoclonal antibody B13-DE1

Das Arbeiten mit Phagenbibliotheken erfolgte entsprechend etablierter Methoden (Böttger und Lane J. Mol. Biol. 235, 61-67, 1994), hier adaptiert für den Antikörper B13-DE1. Peptid-Phagenbibliotheken wurden eingesetzt, die 6- oder 12mer-Sequenzen von zufällig kombinierten Aminosäuren im N-Terminus des Hüllproteins pIII eingebaut haben. Zur Selektion der bindenden Phagen wurden im ersten Schritt 5 µl der Phagenbibliothek mit 10¹¹ Phagenpartikeln und 5 µl des monoklonalen Antikörpers B13-DE1 (100 µg/ml) zusammen inkubiert. Anschließend erfolgte eine Inkubation mit Biotin-markiertem Anti-Maus-Immunglobulin. Danach wurde das Gemisch auf Streptavidin-beschichtete Petrischalen übertragen. Nach 10maligem Waschen wurden die gebundenen Phagenpartikel im sauren pH eluiert. Die eluierten und neutralisierten Phagen wurden dann zur Infektion von E.coli-K91-Zellen benutzt. Infizierte Zellen wurden durch Wachstum in Tetracyclin-haltigem Medium selektiert, da die Phagen das Tetracyclin-Resistenz-Gen tragen. Die Phagen wurden aus dem Überstand der vermehrten Zellen isoliert und für einen weiteren Selektionsschritt mit dem Antikörper B13-DE1 (jedoch mit geringerer Antikörperkonzentration) genutzt. Wenn erforderlich, wurden weitere Selektionsschritte durchgeführt. Im letzten Schritt wurden K91-Zellen mit den Phagen infiziert und auf Agarplatten (mit Tetracyclin-haltigem Medium) ausgestrichen. Einzelkolonien wurden isoliert und weitervermehrt. Die isolierten Phagen wurden anschließend auf Bindung an den monoklonalen Antikörper B13-DE1 getestet. Positive Phagen wurden zur Extraktion von ssDNA durch Phenol- und Chloroformbehandlung eingesetzt. Die DNA-Präzipitate wurden als Templates für die Sequenzierung des Nukleotidinserts im pIII-Gen mit Hilfe eines Sequenase-Testbestecks (Fa. USB) genutzt. Nach 2 oder 3 Selektionsschritten wurden 3 Phagenklone selektiert, die als spezifische Inserts folgende Aminosäuresequenzen besitzen (Tab. 1). Alle Sequenzen haben eine deutliche Ähnlichkeit. Klon 5 ist identisch in 4 Positionen mit Klon 8, G-(X)-W-(X)-D/E-W, und in 3 Positionen mit Klon 4, W-D/E-W. Alle Klone besitzen das gemeinsame C-terminale Dipeptid D/E-W. Working with phage libraries was carried out according to established methods (Böttger and Lane J. Mol. Biol. 235, 61-67, 1994), here adapted for the antibody B13-DE1. Peptide phage libraries were used which incorporated 6 or 12mer sequences of randomly combined amino acids in the N-terminus of the coat protein pIII. To select the binding phages, 5 μl of the phage library were incubated with 10 ¹¹ phage particles and 5 μl of the monoclonal antibody B13-DE1 (100 μg / ml) in the first step. This was followed by an incubation with biotin-labeled anti-mouse immunoglobulin. The mixture was then transferred to streptavidin-coated petri dishes. After washing 10 times, the bound phage particles were eluted in acidic pH. The eluted and neutralized phages were then used to infect E. coli K91 cells. Infected cells were selected by growth in medium containing tetracycline because the phages carry the tetracycline resistance gene. The phages were isolated from the supernatant of the expanded cells and used for a further selection step with the antibody B13-DE1 (but with a lower antibody concentration). If necessary, further selection steps were carried out. In the last step, K91 cells were infected with the phages and spread on agar plates (with a medium containing tetracycline). Single colonies were isolated and propagated further. The isolated phages were then tested for binding to the monoclonal antibody B13-DE1. Positive phages were used to extract ssDNA by phenol and chloroform treatment. The DNA precipitates were used as templates for the sequencing of the nucleotide insert in the pIII gene using a Sequenase test kit (from USB). After 2 or 3 selection steps, 3 phage clones were selected which have the following amino acid sequences as specific inserts (Table 1). All sequences have a clear similarity. Clone 5 is identical in 4 positions with clone 8, G- (X) -W- (X) -D / EW, and in 3 positions with clone 4, WD / EW. All clones have the common C-terminal dipeptide D / EW.

Aus den Insert-Nukleotidsequenzen abgeleitete Aminosäuresequenzen der mit dem monoklonalen Antikörper B13-DE1 selektierten PhagenDerived from the insert nucleotide sequences Amino acid sequences of the monoclonal antibody B13-DE1 selected phages

Example 2 Detection of the binding of mimotope-containing phages to the monoclonal antibody B13-DE1

Zu diesem Zweck wurde der gereinigte monoklonale Anti-FITC-Antikörper B13-DE1 an eine feste Phase adsorbiert und mit verschiedenen Verdünnungen der isolierten Phagen inkubiert. Der Nachweis, ob Phagenpartikel an den Festphasen-adsorbierten Antikörper gebunden werden, erfolgte durch Inkubation mit einem Kaninchen-Anti-Phagen-Antikörper und anschließend mit einem Peroxidase-markierten Anti-Kaninchen-Immunglobulin. Wie in Abb. 1 gezeigt, werden die selektierten Phagen der Klone 4, 8 und 5 von dem Antikörper B13-DE1 gebunden, nicht jedoch zwei Phagenklone, die mit anderen Antikörpern selektiert wurden.For this purpose, the purified monoclonal anti-FITC antibody B13-DE1 was adsorbed onto a solid phase and incubated with various dilutions of the isolated phages. The detection of whether phage particles were bound to the solid-phase-adsorbed antibody was carried out by incubation with a rabbit anti-phage antibody and then with a peroxidase-labeled anti-rabbit immunoglobulin. As shown in Fig. 1, the selected phages from clones 4, 8 and 5 are bound by the antibody B13-DE1, but not two phage clones which were selected with other antibodies.

Example 3 Detection of the specificity of the binding of the mimotope-containing phages the monoclonal antibody B13-DE1 by inhibition experiments

Die Inhibitionstests wurden in folgender Weise durchgeführt:
Gereinigte monoklonale Anti-FITC-Antikörper B13-DE1 wurden an eine feste Phase gekoppelt und mit einer Mischung aus 2×10¹⁰ Phagenpartikeln und verschiedenen Konzentrationen von Fluoresceinderivaten oder verwandten Farbstoffen inkubiert. Gebundene Phagenpartikel wurden wie unter Beispiel 2 beschrieben nachgewiesen. FITC, Fluorescein und 6-Carboxyfluorescein erwiesen sich als effektive Inhibitoren, Phenolrot und Cresolrot waren 100 bzw. 4000fach schwächer (Abb. 2). Gleiche Hemmwirkungen hatten sich in den Versuchen gezeigt, in denen diese Farbstoffe zur Inhibition der Bindung des Antikörpers B13-DE1 an FITC-markierte Proteine eingesetzt wurden (Micheel et al., J. Immunol. Meth. 111, 89-94, 1988). Diese Untersuchungen beweisen, daß die Peptidsequenzen tatsächlich eine Mimikry von Fluoresceinderivaten darstellen.The inhibition tests were carried out in the following way:
Purified monoclonal anti-FITC antibodies B13-DE1 were coupled to a solid phase and incubated with a mixture of 2 × 10 ¹⁰ phage particles and various concentrations of fluorescein derivatives or related dyes. Bound phage particles were detected as described in Example 2. FITC, fluorescein and 6-carboxyfluorescein proved to be effective inhibitors, phenol red and cresol red were 100 and 4000 times weaker ( Fig. 2). The same inhibitory effects had been shown in the experiments in which these dyes were used to inhibit the binding of the antibody B13-DE1 to FITC-labeled proteins (Micheel et al., J. Immunol. Meth. 111, 89-94, 1988). These studies demonstrate that the peptide sequences are actually mimicry of fluorescein derivatives.

Example 4 Binding of the monoclonal antibody B13-DE1 to biotinylated FITC mimotope peptides

Für diese Tests wurden die monoklonalen Antikörper mit den biotinylierten Peptiden inkubiert und das Gemisch auf Streptavidin-behandelte Mikrotitrationsplatten gegeben. Gebundener Antikörper-Peptid-Komplex wurde mit Peroxidase-markiertem Anti-Maus-Immunglobulin nachgewiesen. Der monoklonale Antikörper B13-DE1 reagierte mit den Peptiden der Phagenklone DE1/5 und DE1/8 (Abb. 3). Diese Reaktionen erwiesen sich als spezifisch, da andere monoklonale Antikörper nicht gebunden wurden und diese Bindung durch die gleichen Substanzen, wie unter Beispiel 3 beschrieben, gehemmt wurden (Ergebnisse nicht dargestellt).For these tests, the monoclonal antibodies were incubated with the biotinylated peptides and the mixture was placed on streptavidin-treated microtitration plates. Bound antibody-peptide complex was detected with peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin. The monoclonal antibody B13-DE1 reacted with the peptides of the phage clones DE1 / 5 and DE1 / 8 ( Fig. 3). These reactions turned out to be specific since other monoclonal antibodies were not bound and this binding was inhibited by the same substances as described in Example 3 (results not shown).

Example 5 Binding of the monoclonal antibody B13-DE1 to mimotope peptides after coupling to proteins

Für diese Zwecke wurden die Peptide an Rinderserumalbumin gekoppelt und das Konjugat an eine feste Phase adsorbiert. Anschließend wurde mit folgenden Reagenzien inkubiert:
Monoklonalen Antikörpern, Biotin-markiertem Anti-Maus-Immunglobulin und Streptavidin-β-Galaktose-Komplex, der dann durch eine Enzymreaktion mit fluoreszierendem Produkt nachgewiesen wurde. Es zeigte sich, daß der monoklonale Antikörper B13-DE1 an das Mimotop-Peptid des Phagenklons DE1/8 gebunden wurde. Andere Antikörper waren negativ.For this purpose the peptides were coupled to bovine serum albumin and the conjugate adsorbed onto a solid phase. The following reagents were then incubated:
Monoclonal antibodies, biotin-labeled anti-mouse immunoglobulin and streptavidin-β-galactose complex, which was then detected by an enzyme reaction with a fluorescent product. It was shown that the monoclonal antibody B13-DE1 was bound to the mimotope peptide of the phage clone DE1 / 8. Other antibodies were negative.

Reaktivität des monoklonalen Antikörpers B13-DE1 mit Mimotop-Peptid-gekoppeltem Rinderserumalbumin (RSA)Reactivity of the monoclonal antibody B13-DE1 with Mimotope-peptide-coupled bovine serum albumin (RSA)

Legend to the illustrations

Abb. 1: Bindung der Phagen an Festphasen-adsorbierten Antikörper B13-DE1. Phagenklone DE1/4, DE1/5 und DE1/8, die mit dem Antikörper B13-DE1 selektiert wurden, binden konzentrationsabhängig an den Antikörper, während zwei andere Phagenklone, die spezifisch für Anti-Proenkephalin-Antikörper sind (Böttger et al., J. Mol. Biol. 247, 932-946, 1995), nicht reagieren. Fig. 1: Binding of phages to solid phase adsorbed antibody B13-DE1. Phage clones DE1 / 4, DE1 / 5 and DE1 / 8, which were selected with the antibody B13-DE1, bind to the antibody in a concentration-dependent manner, while two other phage clones which are specific for anti-proenkephalin antibodies (Böttger et al., J Mol. Biol. 247, 932-946, 1995).

Abb. 2: Inhibition der Phagenbindung an Festphasen-B13-DE1 durch Fluoresceinderivate. Dargestellt sind die Untersuchungen mit dem Phagenklon DE1/4. Fig. 2: Inhibition of phage binding to solid phase B13-DE1 by fluorescein derivatives. The investigations with the phage clone DE1 / 4 are shown.

Abb. 3: Bindung des monoklonalen Antikörpers B13-DE1 an biotinylierte FITC-Mimotop-Peptide der Klone DE1/5 und DE1/8. Fig. 3: Binding of the monoclonal antibody B13-DE1 to biotinylated FITC mimotope peptides of the clones DE1 / 5 and DE1 / 8.

Claims

1. A method for obtaining peptide mimotopes which are a mimicry of a low-molecular hapten, which are produced by:

A) use of an antibody which reacts with the respective hapten to isolate peptide sequences from a peptide library,
B) ensuring the specificity of the binding of the isolated and identified peptide sequences to the antibodies used for the selection,
C) production of synthetic peptides according to the isolated and identified peptide sequence,
D) ensuring the specificity of the binding of the synthesized peptides to the antibodies used for the selection,
E) conjugation of the synthetic peptides to different carriers, and
F) Ensuring the specificity of the binding of the conjugated peptides to the antibodies used for the selection.

2. The method according to claim 1, characterized in that for Selection of the peptide sequences. Peptide phage libraries used will.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the Identification of the peptide sequences via the identification of the specific nucleotide sequence segments from phage libraries selected phage clones.

4. The method according to one or more of claims 1 to 3, characterized in that the peptide mimotopes as synthetic Peptides are made.

5. The method according to one or more of claims 1 to 4, characterized in that the synthetic peptides or their corresponding nucleic acid sequences on indicator molecules or Carrier to be coupled.

6. The method according to claim 5, characterized in that as Indicator molecules proteins, synthetic peptides or synthetic Oligonucleotides can be used.

7. The method according to one or more of claims 1 to 6, characterized in that the corresponding to the peptides Nucleotide sequences can be cloned into expression vectors.

8. The method according to claim 1 to 7, characterized in that the nucleotide sequences corresponding to the peptides in the Expression vectors 5'-downstream (N-terminal in the protein) or 3'-upstream (C-terminal in the protein) in relation to the cloned coding sequences of proteins are localized.

9. The method according to one or more of claims 1 to 8, characterized in that these expression vectors for Production of proteins can be used.

10. The method according to claim 1 to 6, characterized in that the nucleotide sequences corresponding to the peptides on the 5 'or 3'-end with specific primers for the polymerase chain reaction (PCR) can be coupled.

11. The method according to claims 1-6 and 10, characterized characterized that with the help of such primers DNA sections to be amplified for a protein or protein fragment code and the corresponding at the 5 or 3 end of the Mimicry peptides carry the corresponding nucleotide sequence.

12. The method according to claims 1-6 and 9-11, characterized characterized in that such DNA amplificates as a template in the in vitro transcription / translation for cell free synthesis of Proteins and protein fragments can be used.

13. The method according to one or more of claims 1 to 12, characterized in that the proteins produced using the Antibodies used for peptide-mimotope selection detected will.

14. The method according to one or more of claims 1 to 12, characterized in that the proteins produced using the antibodies used for peptide-mimotope selection isolated will.

15. The method according to one or more of claims 1 to 14, characterized in that monoclonal antibodies are used will.

16. The method according to one or more of claims 1 to 15, characterized in that monoclonal antibodies against Fluorescein or one of the fluorescein derivatives are used.

17. The method according to one or more of claims 1 to 16, characterized in that the monoclonal antibody B13-DE1 is used.

18. Peptide mimotopes which are a mimicry of fluorescein or Represent fluorescein derivatives and all Peptide mimitope sequences according to the universal genetic code corresponding nucleotide sequences.

19. Peptide mimotopes according to claim 18 with the sequence WLPWEW or with the flanking sequences ADGAWLPWEWGA.

20. Peptide mimotopes according to claim 18 with the sequence GSWGEW or with the flanking sequences ADGAGSWGEWGA.

21. Peptide mimotopes according to claim 18 with the sequence GPPGMVGDWWDW.

22. Use of the according to one or more of claims 1-17 prepared peptide sequences together with the corresponding Antibodies as a detection system.

23. Use according to claim 22 for the detection of with genetic engineering processes synthesized recombinant proteins or protein fragments.

24. Use according to claim 22 for detection and online Monitoring of synthesized by in-vitro translation Proteins or protein fragments.

25. Use according to claim 22 for the detection of specific Nucleic acids in nucleic acid hybridization assays.

26. Use of the according to one or more of claims 1-17 prepared peptide sequences together with the corresponding Antibodies as an isolation system.

27. Use according to claim 26 as a system for the isolation of genetic engineering processes synthesized recombinant proteins.

28. Use according to claim 26 as a system for the isolation of proteins synthesized by in vitro translation or Protein fragments.