Bindungspartner und Verfahren zur kompetitiven Hemmung der Bindung zwischen NEF-Protein und calmodulin, sowie Mittel und Verwendung bei HIV-Erkrankungen Binding partner and method for competitive inhibition of the binding between NEF protein and calmodulin, as well as means and use in HIV diseases
Die vorliegende Erfindung betrifft Bindungspartner für NEF- Protein, Bindungspartner für Calmodulin, Verfahren zur kompetitiven Hemmung der Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin unter Verwendung dieser Bindungspartner, Mittel zur Behandlung von HIV-Er rankungen, die diese Bindungspartner enthalten, sowie die Verwendung dieser Bindungspartner zur Prävention, Diagnose und Behandlung von HIV-Erkrankungen.The present invention relates to binding partners for NEF protein, binding partners for calmodulin, methods for competitive inhibition of the binding between NEF protein and calmodulin using these binding partners, agents for the treatment of HIV achievements that contain these binding partners, and the use of these binding partners for the prevention, diagnosis and treatment of HIV diseases.
Weltweit sind etwa 30 Mio. Menschen mit HIV infiziert und die Rate an Neuinfizierten steigt jährlich an. Verläßliche Vakzine sind derzeit nicht verfügbar und können wegen der hohen Mutationsrate der viralen Hüllproteine möglicherweise niemals entwickelt werden. Das derzeitige Vorgehen gegen HIV umfaßt zwei Hauptstrategien: Zum einen reine Präventionsmaßnahmen ("sa er sex") und zum anderen eine medizinische Kombinationstherapie aus Substanzen, die alle unterschiedliche modulatorisσhe Effekte auf die Virus-eigene Reverse Transkriptase, Integrase und Proteinase haben. Die Kombiationstherapie ist bisher eine sehr erfolgreiche Therapie, allerdings müssen die Medikamente (ein Cocktail aus Proteinase-, Integrase- und Reverse Transkriptase-Hemmer) dauerhaft und in hohen Mengen eingenommen werden, um zu einer deutlichen Verringerung der viralen Replikation zu führen. Da diese Medikamente eine starke unspezifische cytotoxische Aktivität haben, führt gerade die hohe Dosierung zu signifikanten und unerwünschten Nebenreaktionen, deren Langzeitwirkungen noch gänzlich unbekannt sind.Around 30 million people worldwide are infected with HIV and the rate of newly infected people increases every year. Reliable vaccines are currently unavailable and may never be developed due to the high mutation rate of the viral coat proteins. The current approach to HIV comprises two main strategies: on the one hand, pure preventive measures ("sa er sex") and, on the other hand, a medical combination therapy consisting of substances, all of which have different modulatory effects on the virus-own reverse transcriptase, integrase and proteinase. Combination therapy has been a very successful therapy so far, however, the medication (a cocktail of proteinase, integrase and reverse transcriptase inhibitors) must be taken permanently and in large amounts to lead to a significant reduction in viral replication. Since these drugs have a strong non-specific cytotoxic activity, the high dosage leads to significant and undesirable side reactions, the long-term effects of which are still completely unknown.
Eine Schlüsselrolle bei AIDS kommt dem Virus-kodierten NEF- Protein zu. NEF (Negative factor) ist ein 27-35 kDa Protein, das N-terminal myristoyliert ist und bei HIV-1, -2 und SIV gefunden wurde.
Das NEF-Protein, dessen RNA 80% der gesamten frühen mRNA ausmacht, wird bereits in der frühen Phase der Virusreplikation in relativ großen Mengen im Vergleich zu den ebenfalls frühen Proteinen REV und TAT gebildet. Während REV und TAT sowohl für die Genexpression als auch die HIV-Replikation in Kultur essentiell sind, hat das NEF-Protein keinen Einfluß auf die HIV-Expression (AIDS-Forschung, April 1995, 171).The virus-encoded NEF protein plays a key role in AIDS. NEF (Negative factor) is a 27-35 kDa protein that is N-terminally myristoylated and found in HIV-1, -2 and SIV. The NEF protein, whose RNA makes up 80% of the total early mRNA, is already formed in the early phase of virus replication in relatively large amounts compared to the also early proteins REV and TAT. While REV and TAT are essential for both gene expression and HIV replication in culture, the NEF protein has no influence on HIV expression (AIDS research, April 1995, 171).
Dem NEF-Protein wird eine Vielzahl an Effekten in vitro zugeschrieben. Beispielsweise soll NEF nach HIV-Infektion von T-Helferzellen die Internalisierung und Degradation von CD4- Rezeptoren induzieren. In "Brian R. Cullen, Current Biology 1996, Vol. 6: 1557-1559" wird vorgeschlagen, daß NEF eine PAK- abhängige Signalkaskade spezifisch aktiviere. Nach "Bregino et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, April 1997, Vol. 94: S. 3178- 3182" soll Interleukin 10 durch rekombinantes HIV-1 NEF-Protein induziert werden. Auch für diesen Effekt wird eine Involvierung von Signalübertragungswegen in Betracht gezogen, da der Effekt auf die Produktion von Interleukin 10 durch W-7, einem Inhibitor von Calcium/Calmodulin-abhängigen Phosphodiesterase- Signalübertragungswegen, beeinflußt wird.A variety of effects in vitro are attributed to the NEF protein. For example, NEF is said to induce internalization and degradation of CD4 receptors after HIV infection of T helper cells. In "Brian R. Cullen, Current Biology 1996, Vol. 6: 1557-1559" it is suggested that NEF specifically activate a PAH-dependent signal cascade. According to "Bregino et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, April 1997, Vol. 94: pp. 3178-3182", interleukin 10 is to be induced by recombinant HIV-1 NEF protein. Involvement of signaling pathways is also considered for this effect, since the effect on the production of interleukin 10 is influenced by W-7, an inhibitor of calcium / calmodulin-dependent phosphodiesterase signaling pathways.
Als Interaktionspartner für NEF werden verschiedene Targets vorgeschlagen. In den obengenannten Publikationen von Cullen und Bregino et al wird vermutet, daß das NEF-Protein an zwei Serin-/Threonin-Kinasen, p62 und p72, bzw. an einen Oberflächenrezeptor oder an Calciumkanäle bindet.Various targets are proposed as interaction partners for NEF. In the above-mentioned publications by Cullen and Bregino et al it is assumed that the NEF protein binds to two serine / threonine kinases, p62 and p72, or to a surface receptor or to calcium channels.
Die überragende Bedeutung von NEF geht weiterhin aus Studien über sogenannte Langzeitüberlebende hervor, d.h. Menschen, deren HIV-Test positiv ausfällt, die jedoch auch nach 10 und mehr Jahren symptomfrei sind und das Vollbild AIDS nicht entwickelt haben: diese Personen zeigen häufig einen Defekt im nef-Gen.The paramount importance of NEF continues to emerge from studies on so-called long-term survivors, i.e. People whose HIV test is positive, but who are symptom-free even after 10 or more years and who have not developed the full AIDS picture: these people often show a defect in the nef gene.
Es ist vermutlich der unzureichenden Aufklärung der molekularen Mechanismen, die den Effekten von NEF zugrundeliegen, zuzuschreiben, daß bislang keine auf NEF abzielende Therapie
von HIV-Erkrankungen zur Verfügung gestellt werden konnte. Dies ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung.It is presumably due to the insufficient elucidation of the molecular mechanisms that underlie the effects of NEF that no therapy targeting NEF has been achieved so far of HIV diseases could be made available. This is the object of the present invention.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß NEF-Protein und Calmodulin aneinander binden und eine Behandlung von HIV- Erkrankungen möglich ist, indem man die Bindung zwischen NEF- Protein und Calmodulin hemmt.Surprisingly, it has been found that NEF protein and calmodulin bind to one another and treatment of HIV diseases is possible by inhibiting the binding between NEF protein and calmodulin.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Bindungspartner für NEF-Protein, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die Bindung von Calmodulin an NEF-Protein kompetitiv hemmen.The present invention therefore relates to binding partners for NEF protein, which are characterized in that they competitively inhibit the binding of calmodulin to NEF protein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Bindungspartner für Calmodulin, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die Bindung von NEF-Protein an Calmodulin kompetitiv hemmen.The present invention also relates to binding partners for calmodulin, which are characterized in that they competitively inhibit the binding of NEF protein to calmodulin.
Unter Bindung versteht man jede molekulare Wechselwirkung zwischen Calmodulin und NEF-Protein, vorzugsweise in Anwesenheit von Calcium-Ionen und insbesondere unter physiologischen Bedingungen. Dies sind in der Regel klassische Protein-Protein-Wechselwirkungen, zu denen elektrostatische Anziehung, Wasserstoffbrücken-Bindung, hydrophobe Bindungen, van-der-Waals-Kräfte oder metallkomplexartige koordinative Bindungen gehören. Zusätzlich zu den vorstehend genannten reversiblen molekularen Wechselwirkungen kommen für die Bindung erfindungsgemäßer Bindungspartner an Calmodulin oder NEF- Protein auch irreversible Wechselwirkungen, wie kovalente Bindungen, in Betracht.Binding means any molecular interaction between calmodulin and NEF protein, preferably in the presence of calcium ions and in particular under physiological conditions. These are usually classic protein-protein interactions, which include electrostatic attraction, hydrogen bonding, hydrophobic bonds, van der Waals forces or metal complex-like coordinative bonds. In addition to the reversible molecular interactions mentioned above, irreversible interactions, such as covalent bonds, can also be considered for the binding of binding partners according to the invention to calmodulin or NEF protein.
Unter kompetitiver Hemmung versteht man, daß erfindungsgemäße Bindungspartner mit Calmodulin oder NEF-Protein um die Bindung an NEF-Protein bzw. Calmodulin konkurrieren, d.h. die Bindung des einen behindert die Bindung des anderen.Competitive inhibition means that binding partners according to the invention compete with calmodulin or NEF protein for binding to NEF protein or calmodulin, i.e. the bond of one hinders the bond of the other.
Vorzugsweise wird die NEF-seitige Bindungsstelle, über die der Bindungspartner an NEF-Protein bindet, von wenigstens einem Teil der NEF-seitigen Bindungsstelle, über die NEF-Protein an
Calmodulin bindet, gebildet. Entsprechendes gilt für die Calmodulin-seitige Bindungsstelle im Hinblick auf die Bindung zwischen Calmodulin und NEF-Protein bzw. Calmodulin und Bindungspartner.The NEF-side binding site, via which the binding partner binds to NEF protein, is preferably attached to the NEF protein by at least a part of the NEF-side binding site Calmodulin binds, is formed. The same applies to the binding site on the calmodulin with regard to the binding between calmodulin and NEF protein or calmodulin and binding partner.
Bevorzugt werden Bindungspartner für NEF-Protein.Binding partners for NEF protein are preferred.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung binden Bindungspartner für NEF-Protein an einen Teil der in Figur 1 gezeigten Aminosäuresequenz 1 bis 206, oder homologe Sequenzen davon (S. Wain-Hobson et al, Cell 1985, 40, S. 9-17) .According to a preferred embodiment of the present invention, binding partners for NEF protein bind to a part of the amino acid sequence 1 to 206 shown in FIG. 1, or homologous sequences thereof (S. Wain-Hobson et al, Cell 1985, 40, pp. 9-17) .
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung binden Bindungspartner für NEF-Protein an einen Teil der in Figur 1 gezeigten Aminosäuresequenz 1 bis 80, oder homologe Sequenzen davon, wobei die Bindung an einen Teil der Aminosäuren 1 bis 57 oder an einen Teil der Aminosäuren 1 bis 57 und einen Teil der Aminosäuren 58 bis 80 erfolgen kann.According to a particularly preferred embodiment of the present invention, binding partners for NEF protein bind to a part of the amino acid sequence 1 to 80 shown in FIG. 1, or homologous sequences thereof, the binding to a part of the amino acids 1 to 57 or to a part of the amino acids 1 to 57 and part of the amino acids 58 to 80 can be done.
Unter homologen Sequenzen versteht man Aminosäuresequenzen, die sich von der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz durch ein- oder mehrfache Aminosäuredeletion, -Substitution, -insertion und/oder -Inversion ableiten. Homologe Sequenzen sind somit Teil utierter NEF-Proteine oder alleler Varianten davon, sofern man die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz als Wildtyp-Sequenz definiert. Definitionsgemäß sind homologe Sequenzen der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz zu dieser im wesentlichen funktioneil gleichwirkend. Insbesondere vermögen homologe NEF-Sequenzen an Calmodulin zu binden, wobei sich die Bindungsaffinität einer homologen NEF-Sequenz zu Calmodulin von der Bindungsaffinität der in Fig. 1 gezeigten Sequenz zu Calmodulin unterscheiden kann.Homologous sequences are understood to mean amino acid sequences which are derived from the amino acid sequence shown in FIG. 1 by single or multiple amino acid deletion, substitution, insertion and / or inversion. Homologous sequences are thus part of selected NEF proteins or allelic variants thereof, provided that the amino acid sequence shown in FIG. 1 is defined as a wild-type sequence. By definition, homologous sequences of the amino acid sequence shown in FIG. 1 are essentially functionally equivalent to this. In particular, homologous NEF sequences can bind to calmodulin, wherein the binding affinity of a homologous NEF sequence to calmodulin can differ from the binding affinity of the sequence shown in FIG. 1 to calmodulin.
Erfindungsgemäß steht der Begriff "NEF-Protein" für die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz genauso wie für homologe Sequenzen davon.
Vorzugsweise binden erfindungsgemäße Bindungspartner an Calmodulin oder NEF-Protein mit höherer Affinität als Calmodulin an NEF-Protein bzw. NEF-Protein an Calmodulin. Eine höhere Bindungsaffinität hat den Vorteil, daß geringere Konzentrationen an Bindungspartner erforderlich sind, um eine kompetitive Hemmung zu bewirken. Andererseits kann eine geeignete Hemmung auch mit Bindungspartnern geringerer Bindungsaffinität erreicht werden, indem man eine höhere Konzentration an Bindungspartner anwendet.According to the invention, the term “NEF protein” stands for the amino acid sequence shown in FIG. 1 as well as for homologous sequences thereof. Binding partners according to the invention preferably bind to calmodulin or NEF protein with higher affinity than calmodulin to NEF protein or NEF protein to calmodulin. A higher binding affinity has the advantage that lower concentrations of binding partner are required to cause competitive inhibition. On the other hand, a suitable inhibition can also be achieved with binding partners of lower binding affinity by using a higher concentration of binding partners.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt die Dissoziations-Konstante für die Bindung eines Bindungspartners an NEF-Protein oder Calmodulin weniger als 1 μM, vorzugsweise weniger als 0,1 μM und insbesondere weniger als 10 nM.According to a preferred embodiment of the present invention, the dissociation constant for the binding of a binding partner to NEF protein or calmodulin is less than 1 μM, preferably less than 0.1 μM and in particular less than 10 nM.
Bei den erfindungsgemäßen Bindungspartnern kann es sich um Peptide, Peptoide, organische oder anorganische Substanzen handeln. Bevorzugt sind Peptide und Peptoide.The binding partners according to the invention can be peptides, peptoids, organic or inorganic substances. Peptides and peptoids are preferred.
Unter Peptiden versteht man Sequenzen natürlich vorkommender, proteogener Aminosäuren, die über Peptidbindung miteinander verknüpft sind. Sequenzen von Peptoiden, d.h. Peptid-ähnlichen Verbindungen, können neben natürlich vorkommenden, proteogenen Aminosäuren auch weitere Aminosäuren und Aminosäure-Derivate enthalten, beispielsweise bestimmte Stereo- und Diastereoisomere, wie D-Aminosäuren, natürlich vorkommende, nichtproteogene Aminosäuren oder chemisch synthetisierte Verbindungen mit Eigenschaften, die dem Fachmann als Aminosäure-ähnlich bekannt sind, wie ß-Alanin, 7-Peptides are understood to be sequences of naturally occurring, proteogenic amino acids which are linked to one another via peptide binding. Sequences of peptoids, i.e. Peptide-like compounds can contain, in addition to naturally occurring, proteogenic amino acids, further amino acids and amino acid derivatives, for example certain stereo and diastereoisomers, such as D-amino acids, naturally occurring, non-proteogenic amino acids or chemically synthesized compounds with properties that are known to those skilled in the art as amino acids are similarly known, such as ß-alanine, 7-
Carboxyglutaminsäure, Hydroxyprolin, Norleucin, Norvalin, Ornithin, Phenylglycin, Pyroglutaminsäure, Sarcosin, Statin, oder t-Leucin. Unter Peptiden versteht man auch solche Sequenzen, deren N- und/oder C-Terminus modifiziert sein kann, beispielsweise mit acetyliertem N-Terminus und/oder amidiertem C-Terminus. Das gleiche gilt natürlich auch für chemisch- modifizierbare Aminosäuren-Seitengruppen, die insbesondere die in der organischen Chemie geläufigen und vor allem in der
Peptidchemie zur Anwendung kommenden Schutzgruppen tragen können.Carboxyglutamic acid, hydroxyproline, norleucine, norvaline, ornithine, phenylglycine, pyroglutamic acid, sarcosine, statin, or t-leucine. Peptides are also understood to mean those sequences whose N- and / or C-terminus can be modified, for example with an acetylated N-terminus and / or amidated C-terminus. The same naturally also applies to chemically modifiable amino acid side groups, in particular those familiar in organic chemistry and especially in Peptide chemistry can be used protective groups.
Geeignete Bindungspartner sind auch Antikörper, insbesondere monoklonale und rekombinante Antikörper, die an wenigstens einen Teil der Bindungsstelle zwischen NEF-Protein und calmodulin binden. Ganz besonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang antigenbindende Fragmente der hypervariablen Domänen derartiger Antikörper, beispielsweise Fab-, Fv-, scFv- Fragmente Oder auf einer oder mehrere CDRs aufbauende Fragmente.Suitable binding partners are also antibodies, in particular monoclonal and recombinant antibodies, which bind to at least part of the binding site between NEF protein and calmodulin. In this context, antigen-binding fragments of the hypervariable domains of such antibodies, for example Fab, Fv, scFv fragments or fragments based on one or more CDRs, are very particularly preferred.
Im Hinblick auf die erfindungsgemäße Verwendung der Bindungspartner in pharmazeutischen Mitteln ist der Einbau von Aminosäuren, die in der Natur nicht vorkommen, insofern von Vorteil, als dadurch die Stabilität gegenüber natürlichen Abbauprozessen erhöht wird. Soll einem Säuger als erfindungsgemäßer Bindungspartner ein bestimmtes Peptid verabreicht werden, so läßt sich dessen Halbwertszeit in vivo beispielsweise dadurch verlängern, daß man zumindest einen Teil der natürlichen L-Aminosäuren durch D-Isomere ersetzt und so zu einem entsprechenden Peptoid gelangt.With regard to the use according to the invention of the binding partners in pharmaceutical compositions, the incorporation of amino acids which do not occur in nature is advantageous in that it increases the stability towards natural degradation processes. If a particular peptide is to be administered to a mammal as the binding partner according to the invention, its half-life can be extended in vivo, for example, by replacing at least some of the natural L-amino acids with D-isomers and thus obtaining a corresponding peptoid.
Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Peptide und Peptoide sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt werdenMethods for producing peptides and peptoids according to the invention are known to the person skilled in the art. To be favoured
Festphasen-Synthesen unter Verwendung funktionalisierter Harze, an welche die zu synthetisierenden Peptide geknüpft werden können. Wang-Harze für die FMOC-Festphasen-Peptidsynthese oder Merrifield-Harze zur BOC-Festphasen-Peptidsynthese sind geläufige Beispiele. Nach erfolgtem Aufbau eines gewünschten Peptids wird dieses dann vom Träger abgelöst, wobei gleichzeitig oder auch im Anschluß daran möglicherweise vorhandene Schutzgruppen abgespalten werden können. Eine gegebenenfalls erforderliche, sich anschließende Aufreinigung, beipsielsweise über HPLC, liefert das Peptid in gewünschter Reinheit, die beispielsweise mittels Massenspektroskopie oder NMR festgestellt werden kann. Die genaue Ausgestaltung des Verfahrens richtet sich nach dem zu synthetisierenden Peptid
oder Peptoid und beruht auf fachmännischem Wissen.Solid phase syntheses using functionalized resins to which the peptides to be synthesized can be linked. Wang resins for FMOC solid phase peptide synthesis or Merrifield resins for BOC solid phase peptide synthesis are common examples. After the desired peptide has been built up, it is then detached from the support, it being possible for protective groups which may be present to be split off simultaneously or subsequently. Any subsequent purification required, for example via HPLC, provides the peptide in the desired purity, which can be determined, for example, by mass spectroscopy or NMR. The exact design of the method depends on the peptide to be synthesized or peptoid and is based on professional knowledge.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Peptide und Peptoide auch mit Hilfe molekularbiologischer Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann die primäreIn addition, the peptides and peptoids according to the invention can also be produced using molecular biological methods. For example, the primary
Aminosäuresequenz des zu synthetisierenden Peptids in die entsprechende c-DNA- oder m-RNA-Sequenz umgesetzt werden. Die Nukleinsäuren können auf bekannte Art synthesiert werden und dann in eine geeignete Wirtszelle eingeschleust, expri iert und anschließend gegebenfalls zu den gewünschten Peptoiden modifiziert werden. Weitere Ausgestaltungen dieses Verfahrens beruhen ebenfalls auf fachmännischem Wissen.Amino acid sequence of the peptide to be synthesized can be converted into the corresponding c-DNA or m-RNA sequence. The nucleic acids can be synthesized in a known manner and then introduced into a suitable host cell, expressed and, if necessary, subsequently modified to the desired peptoids. Further refinements of this process are also based on expert knowledge.
Eine weitere Möglichkeit besteht in der Anlage von Bibliotheken randomisierter Peptidgene, aus denen dann Peptide mit der gewüschten Bindungsspezifität isoliert werden können. Beispielsweise kann man randomisierte Oligonukleotide in ein geeignetes Expressionssystem einfügen, welches die Auswahl von erfindungsgemäßen aus Oligopeptiden unterschiedlicher Aminosäuresequenz erlaubt.Another possibility is to create libraries of randomized peptide genes, from which peptides with the desired binding specificity can then be isolated. For example, randomized oligonucleotides can be inserted into a suitable expression system which allows the selection of oligopeptides of different amino acid sequences according to the invention.
Die Herstellung spezifischer, monoklonaler und rekombinanter Antikörper und insbesondere Antikörperfragmente ist dem Fachmann ebenfalls geläufig.The production of specific, monoclonal and recombinant antibodies and in particular antibody fragments is also familiar to the person skilled in the art.
Beispielsweise können monoklonale Antikörper, die spezifisch gegen die NEF- bzw. Calmodulin-seitige, an der Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin beteiligte Bindungsstelle gerichtet sind, mittels herkömmlicher Hybridomtechnik gezogen werden, indem man Peptidfragmente aus der NEF- bzw. Calmodulin-seitigen Bindungsstelle zur Immunisierung verwendet. Antikörperfragmente dieser monoklonalen Antikörper können auf übliche Weise, beispielsweise durch Verdauung, erhalten werden.For example, monoclonal antibodies that are specifically directed against the NEF or calmodulin-side binding site involved in the binding between NEF protein and calmodulin can be raised by means of conventional hybridoma technology, by removing peptide fragments from the NEF or calmodulin-side binding site used for immunization. Antibody fragments of these monoclonal antibodies can be obtained in the usual way, for example by digestion.
Die Grundlage zur Herstellung rekombinanter Antikörper und Antikörperfragmente bilden bevorzugt Antikörper- Genbibliotheken, die von unterschiedlicher Komplexität sein können. Durch die Anwendung der PCR gelingt es beispielsweise,
ausgehend von antikörperbezogener genetischer Information derartige Bibliotheken anzulegen. Als genetische Information können beispielsweise cDNA aus definierten Zellinien, wie Hybridomen oder Myelomen, cDNA aus seropositiven Spendern oder nicht immunisierten Spendern, genomische DNA als Gesamtheit der variablen Regionen oder randomisierte Oligonukleotide für hypervariable Regionen verwendet werden, was in der Reihenfolge der vorstehend genannten Beispiele zu Bibliotheken mit zunehmender Komplexität führt. Aus diesen können dann einzelene Antikörper oder Antikörperfragmente mit der gewünschtenThe basis for the production of recombinant antibodies and antibody fragments is preferably formed by antibody gene libraries, which can be of different complexity. Using PCR, for example, create such libraries based on antibody-related genetic information. For example, cDNA from defined cell lines, such as hybridomas or myelomas, cDNA from seropositive donors or non-immunized donors, genomic DNA as a whole of the variable regions or randomized oligonucleotides for hypervariable regions can be used as genetic information, which results in libraries in the order of the examples mentioned above leads to increasing complexity. Individual antibodies or antibody fragments with the desired one can then be obtained from these
Spezifität, d.h. erfindungsgemäße Bindungspartner, hergestellt werden, indem man das bestreffende Gen in einen Produktionsvektor kloniert und in prokaryontisehen, wie E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, oder eukaryontisehen Systemen, wie Plasmacytoma- oder Myelo a-Specificity, i.e. binding partners according to the invention can be produced by cloning the relevant gene into a production vector and in prokaryotic systems such as E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, or eukaryotic systems such as plasmacytoma or myelo a-
Zellen, COS-2ellen, CHO-Zellen, bestimmten Insekten-, Pflanzenoder Pilzzellen, beispielsweise einzelligen Hefezellen, exprimiert. Auch zellfreie Systeme, insbesondere bei Anfügung eines zytotoxischen Fusionsanteils an den erfindungsgemäßen Bindungspartner, können zur Anwendung kommen. Beispiele hierfür bieten Retikulozyten-Extrakte.Cells, COS-2ellen, CHO cells, certain insect, plant or fungal cells, for example unicellular yeast cells, expressed. Cell-free systems can also be used, in particular if a cytotoxic fusion component is added to the binding partner according to the invention. Examples of this are reticulocyte extracts.
Erfindungsgemäße Bindungspartner binden an NEF-Protein oder Calmodulin, wobei sie die Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin kompetitiv hemmen. Zum Nachweis einer derartigenBinding partners according to the invention bind to NEF protein or calmodulin, where they competitively inhibit the binding between NEF protein and calmodulin. To prove such
Bindung sind dem Fachmann eine Vielzahl von Verfahren bekannt.A number of methods are known to those skilled in the art of binding.
In der Regel wird wenigstens eine an der Bindung beteiligte Komponente, d.h. Bindungspartner, NEF-Protein und/oder Calmodulin, mit Markierungen und/oder Immobilisierungsmitteln versehen. Eine Markierung kann so gewählt sein, daß der Nachweis direkt oder indirekt unter Verwendung spezifischer Bindungspaare geführt werden kann.As a rule, at least one component involved in the binding, i.e. Binding partner, NEF protein and / or calmodulin, provided with labels and / or immobilizing agents. A label can be selected so that the detection can be carried out directly or indirectly using specific binding pairs.
Derartige spezifische Bindungspaare können immunologischer oder nicht-immunologischer Art sein. Immunologische, spezifische Bindungspaare basieren in der Regel auf Hapten/anti-Hapten- Systemen unter Verwendung spezifischer anti-Hapten-Antikörper.
Hierzu gehören beispielsweise Fluoreszein/anti-Fluoreszein-, Dinitrophenyl/anti-Dinitrophenyl-, Biotin/anti-Biotin-, Digoxigenin/anti-Digoxigenin-Syste e und dergleichen. In nichtimmunologischen Bindungspaaren besitzen beide Komponenten eine natürliche Affinität zueinander, wie Biotin/Streptavidin.Such specific binding pairs can be immunological or non-immunological. Immunological, specific binding pairs are usually based on hapten / anti-hapten systems using specific anti-hapten antibodies. These include, for example, fluorescein / anti-fluorescein, dinitrophenyl / anti-dinitrophenyl, biotin / anti-biotin, digoxigenin / anti-digoxigenin systems and the like. In non-immunological binding pairs, both components have a natural affinity for one another, such as biotin / streptavidin.
Markierungen oder Teile von Markierungen, beispielsweise eine Komponente eines spezifischen Bindungspaares, können kovalent an das nachzuweisende Molekül gebunden werden. Dazu sind dem Fachmann verschiedene Verfahren bekannt und vielfach auch geeignete Reagenzien im Handel erhältlich. Beispielsweise kann Biotin an A in-, Aldehyd-, Carboxyl- und Sulfhydrylgruppen unter Verwendung von Biotin-N-Hydroxysuccinimidester, Biotinhydrazid, Biotinmaleimid bzw. Jodacetylbiotin gebunden werden. Analoge Reagenzien sind auch für Fluorescein oderMarkings or parts of markings, for example a component of a specific binding pair, can be covalently bound to the molecule to be detected. Various methods are known to the person skilled in the art and in many cases suitable reagents are also commercially available. For example, biotin can be bound to A in, aldehyde, carboxyl and sulfhydryl groups using biotin-N-hydroxysuccinimide ester, biotin hydrazide, biotin maleimide or iodoacetylbiotin. Analog reagents are also for fluorescein or
Digoxigenin erhältlich. Der Nachweis wird dann über eine an das Hapten bindende Komponente geführt, die beispielsweise an ein radioaktives Isotop, wie 125I oder 3H, ein Enzym, sowie fluorogene, chemilumineszierende oder elektrochemische Mittel gekoppelt sein kann. Meßmethoden zum Nachweise vonDigoxigenin available. The detection is then carried out via a component which binds to the hapten and which can be coupled, for example, to a radioactive isotope, such as 125 I or 3 H, an enzyme, and fluorogenic, chemiluminescent or electrochemical agents. Measurement methods for the detection of
Radioaktivität, Fluoreszenz, z.B. der EVOTEK-Ansatz zum Nachweis von Fluoreszenzkorrelation, Fluoreszenzenergietransfer, vgl. z.B. WO 97/28261, oder konventionellem Fluoreszenz-Quenching, chemilumineszenz oder elektrochemischen Vorgängen sind dem Fachmann bekannt. Geeignete Enzyme sind beispielsweise Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, ß-Galactosidase, Glukoseoxidase, Luciferase, jS-Lactamase, Urease oder Lysozy . Die daran gebundenen Nachweisreaktionen, wie die Umsetzung von o-Phenylendiamin, 4-Chlornaphthol oder Tetramethylbenzidin durch Meerrettich-Perioxidasen, sind dem Fachmann ebenfalls hinlänglich bekannt.Radioactivity, fluorescence, e.g. the EVOTEK approach for the detection of fluorescence correlation, fluorescence energy transfer, cf. e.g. WO 97/28261, or conventional fluorescence quenching, chemiluminescence or electrochemical processes are known to the person skilled in the art. Suitable enzymes are, for example, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucose oxidase, luciferase, jS-lactamase, urease or lysozy. The associated detection reactions, such as the reaction of o-phenylenediamine, 4-chloronaphthol or tetramethylbenzidine by horseradish peroxidases, are also well known to the person skilled in the art.
Der Nachweis und gegebenenfalls die Quantifizierung einer kompetitiven Hemmung kann mittels Verdrängungstitration erfolgen. Beispielsweise wird fluoreszenzmarkiertes NEF-Protein einerseits und Bindungspartner andererseits in einer Stopped Flow-Vorrichtung zusammengeführt und die resultierende Fluoreszenzzunähme gemessen. In einer zweiten Messung wird ein
Gemisch aus fluoreszenzmarkiertem NEF-Protein und Bindungspartner einerseits und Calmodulin andererseits in einer Stopped Flow-Vorrichtung zusammengeführt. Die Fluoreszenz bleibt unverändert, wenn der Komplex aus NEF-Protein und Bindungspartner stabiler ist als der Komplex aus NEF-Protein und Calmodulin.The detection and, if necessary, the quantification of a competitive inhibition can be done by displacement titration. For example, fluorescence-labeled NEF protein on the one hand and binding partner on the other hand are combined in a stopped flow device and the resulting increase in fluorescence is measured. In a second measurement, a Mixture of fluorescence-labeled NEF protein and binding partner on the one hand and calmodulin on the other hand combined in a stopped flow device. The fluorescence remains unchanged when the complex of NEF protein and binding partner is more stable than the complex of NEF protein and calmodulin.
Die Nachweisverfahren können auch eine Immobilisierung wenigstens einer Bindungskomponente an einen festen Träger beinhalten. Geeignete sind beispielsweise Träger aus synthetischen Polymeren, wie Polypropylen, Polystyrol, substituiertem Polystyrol, beispielsweise aminiertem oder carboxyliertem Polystyrol, Polyacrylamiden, Polyamiden, Polyvinylchloriden und dergleichen. Es kann sich um Gefäße, wie Mikrotiterkam ern, Tauchstäbe, Fasern oder Partikel, beispielsweise magnetische Kügelchen, handeln. Bei der Immobilisierung finden weitgehend die zuvor als Markierungsmittel beschriebenen spezifischen Bindungspaare Anwendung. In der Regel wird NEF-Protein oder Calmodulin immobilisiert, während der Bindungspartner frei an diese immobilisierten Proteine binden kann.The detection methods can also include immobilization of at least one binding component on a solid support. Suitable are, for example, carriers made of synthetic polymers, such as polypropylene, polystyrene, substituted polystyrene, for example aminated or carboxylated polystyrene, polyacrylamides, polyamides, polyvinyl chlorides and the like. Vessels such as microtitre cameras, dipsticks, fibers or particles, for example magnetic beads, can be involved. The specific binding pairs previously described as markers are largely used in the immobilization. As a rule, NEF protein or calmodulin is immobilized, while the binding partner can bind freely to these immobilized proteins.
Der Nachweis der kompetitiven Bindung erfindungsgemäßer Bindungsparther an Calmodulin oder NEF-Protein läßt sich auch über strukturabbildende Verfahren, wie Kernspinresonanz oder Röntgen-Kristallbeugung, führen. Hierzu werden Komplexe aus Bindungspartnern mit NEF oder Calmodulin oder Fragmenten davon spektroskopisch untersucht. Auf diese Weise kann der Bindungsbereich zwischen einem erfindungsgemäßen Bindungspartner und NEF oder Calmodulin abgebildet werden. Erfindungsmäß überlappt dieser Bindungsbereich zumindest teilweise mit dem Bindungsbereich zwischen NEF-Protein und Calmodulin.The competitive binding of binding partners according to the invention to calmodulin or NEF protein can also be demonstrated by means of structure-imaging methods, such as nuclear magnetic resonance or X-ray crystal diffraction. For this purpose, complexes from binding partners with NEF or calmodulin or fragments thereof are examined spectroscopically. In this way, the binding area between a binding partner according to the invention and NEF or calmodulin can be mapped. According to the invention, this binding area overlaps at least partially with the binding area between NEF protein and calmodulin.
Massenspektroskopische Verfahren sind insbesondere zum raschen Nachweis von Bindungen mit kleinen Substanzmengen von Vorteil.Mass spectroscopic methods are particularly advantageous for the rapid detection of bonds with small amounts of substance.
Computergestützte, qualitative und quantitative Methoden unter
Zuhilfenahme zweckmäßiger Suchalgorithmen oder Substanz-Datenbänke, wie das Programm DOCK der Universität von San Franzisko oder QSAR-Methoden, und struktureller Vorgaben für NEF-Protein und/oder Calmodulin, wie Kristall- und NMR-Strukturdaten, bieten eine weitere Möglichkeit zum Bindungsnachweis.Computer-aided, qualitative and quantitative methods under Using suitable search algorithms or substance databases, such as the DOCK program of the University of San Francisco or QSAR methods, and structural specifications for NEF protein and / or calmodulin, such as crystal and NMR structural data, offer a further possibility for the detection of binding.
Auch eignen sich bekannte Systeme zum Nachweis von Protein/Protein-Interaktionen, wie der sogenannte GST-pull- down-Assay und insbesondere Yeast-two-hybrid-Ansätze. Letztere basieren auf dem modularen Aufbau eukaryotischerKnown systems are also suitable for the detection of protein / protein interactions, such as the so-called GST pull-down assay and in particular yeast-two-hybrid approaches. The latter are based on the modular structure of eukaryotic
Transkriptionsfaktoren, wobei erfindungsgemäß die Interaktion von Bindungspartner mit NEF-Protein bzw. mit Calmodulin zur funktioneilen Rekonstitution eines Transkriptionsfaktors führt, dessen DNA-Binde- und Transaktivierungsdomäne zuvor getrennt worden ist. Der Nachweis der Interaktion, d.h der Bindung, gelingt beispielsweise über auxotrophe Marker oder Reportergene, wie dem LacZ-Gen aus E.coli und den daran gekoppelten enzymatischen Nachweisreaktion.Transcription factors, wherein according to the invention the interaction of binding partner with NEF protein or with calmodulin leads to the functional reconstitution of a transcription factor whose DNA binding and transactivation domain has been previously separated. The interaction, i.e. the binding, can be detected, for example, via auxotrophic markers or reporter genes, such as the LacZ gene from E. coli and the enzymatic detection reaction coupled to it.
Erfindungsgemäße Bindungspartner, die in Gen-Bibliotheken niedergelegt sind, können auf ihre Bindung an NEF-Protein bzw. Calmodulin untersucht werden, indem man sie oberflächengebunden, d.h. in der Regel membrangebunden auf der Oberfläche eines Organismus exprimiert. Hierzu eignen sich beispielsweise Bakteriophagen, insbesondere filamentöseBinding partners according to the invention, which are stored in gene libraries, can be examined for their binding to NEF protein or calmodulin by surface-binding, i.e. usually expressed in membrane-bound form on the surface of an organism. Bacteriophages, in particular filamentous ones, are suitable for this
Bakteriophagen, Bakterien, wie E. coli, in deren Zellwand der Bindungspartner verankert werden kann, oder auch eukaryontische Viren, wie Baculoviren. Phagen-Display und Bakterien-Display werden zum Screenen erfindungsgemäßer Bindungspartner bevorzugt. Eukaryontische Viren, die erfindungsgemäßeBacteriophages, bacteria, such as E. coli, in the cell wall of which the binding partner can be anchored, or eukaryotic viruses, such as baculoviruses. Phage display and bacteria display are preferred for screening binding partners according to the invention. Eukaryotic viruses, the invention
Bindungspartner tragen, besitzen den Vorteil, daß sie direkt zur Einschleusung des Bindungspartners in Targetzellen, insbesondere Hiv-infizierten Zellen, benutzt werden können.Binding partners have the advantage that they can be used directly for introducing the binding partner into target cells, in particular HIV-infected cells.
Die Bindung der oberflachenexprimierten Bindunspartner an NEF- Protein bzw. Calmodulin kann dann über die oben beschriebenen Methoden nachgewiesen werden, die auf der Bindungspartneraffinität zu NEF-Protein bzw. Calmodulin
basieren. Darüber hinaus kann diese Bindung zur Abtrennung er indungsgemäßer Bindungspartner von anderen in der Bibliothek niedergelegten Peptiden benutzt werden. Der Einsatz von Fluoreszenz und Biotinylierung zur Markierungen und Abtrennung mittels FACS, Affinitätschromatographie oder Adsorption an feste, beispielsweise immobilisiertes Streptavidin aufweisende Träger, wie Poylstyrolgefäßen, ist von Vorteil.The binding of the surface-expressed binding partners to NEF protein or calmodulin can then be demonstrated using the methods described above, based on the binding partner affinity for NEF protein or calmodulin based. In addition, this binding can be used to separate the binding partners according to the invention from other peptides stored in the library. The use of fluorescence and biotinylation for labeling and separation by means of FACS, affinity chromatography or adsorption on solid supports, for example immobilized streptavidin, such as polystyrene vessels, is advantageous.
Es können auch Kombinationen der vorstehend beschriebenen Verfahren zum Nachweis der Bindung erfindungsgemäßerCombinations of the methods described above for detecting the binding of the invention can also be used
Bindungspartner an NEF-Protein bzw. Calmodulin durchgeführt werden. Besonders effiziente Bindungspartner führen in mehreren dieser Verfahren zu einem positiven Nachweis. Auch können die Eigenschaften eines Bindungspartners optimiert, d.h. vorteilhaft ausgestaltet werden, indem man durch leichte Veränderungen des Bindungspartners einen Pool möglicher weiterer Bindungspartner mit abweichenden Eigenschaften bereitstellt, aus denen Bindungspartner mit verbesserten Eigenschaften durch die nochmalige Durchführung eines oder mehrerer der oben genannten Verfahren abgeleitet werden können. Ein derartiges iteratives Vorgehen führt zu besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.Binding partners to NEF protein or calmodulin are carried out. Particularly efficient binding partners lead to positive evidence in several of these methods. The properties of a binding partner can also be optimized, i.e. can be advantageously designed by making a pool of possible further binding partners with different properties available from slight changes in the binding partner, from which binding partners with improved properties can be derived by performing one or more of the above-mentioned methods again. Such an iterative procedure leads to particularly preferred embodiments of the present invention.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung leiten sich Bindungspartner für NEF-Protein von den in Fig. 2 und 3 gezeigten Calmodulin-Aminosäuresequenzen 1 bis 148 bzw. 149 ab (D. Marshak et al., Biochemistry 1984, 23, S. 2891-2899). Bevorzugt sind Fragemente davon mit 3 bis 30, vorzugsweise 4 bis 20 und insbesondere 5 bis 15 Aminosäuren. Vorteilhafterweise unterscheidet sich die Aminosäuresequenz eines Bindungspartners von der entsprechenden in Fig. l gezeigten Aminosäuresequenz dadurch, daß wenigstens eine Aminosäure derart ausgetauscht, entfernt, hinzugefügt oder modifiziert ist, daß der Bindungspartner eine höhere Affinität für die Bindung an NEF-Protein aufweist als Calmodulin selbst.According to one embodiment of the present invention, binding partners for NEF protein are derived from the calmodulin amino acid sequences 1 to 148 and 149 shown in FIGS. 2 and 3 (D. Marshak et al., Biochemistry 1984, 23, pp. 2891-2899 ). Fragments thereof with 3 to 30, preferably 4 to 20 and in particular 5 to 15 amino acids are preferred. The amino acid sequence of a binding partner advantageously differs from the corresponding amino acid sequence shown in FIG. 1 in that at least one amino acid is exchanged, removed, added or modified in such a way that the binding partner has a higher affinity for binding to NEF protein than calmodulin itself.
Erfindungsgemäß steht der Begriff "Calmodulin" für die in den Fig. 2 und 3 gezeigten Aminosäuresequenz genauso wie für
homologe Sequenzen davon.According to the invention, the term "calmodulin" stands for the amino acid sequence shown in FIGS. 2 and 3 as well as for homologous sequences thereof.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung leiten sich Bindungspartner für Calmodulin von der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz 1 bis 206 und insbesondere 1 bis 80 ab. Bevorzugt sind Fragemente davon mit 3 bis 30, vorzugsweise 4 bis 20 und insbesondere 5 bis 15 Aminosäuren. Vorteilhafterweise unterscheidet sich die Aminosäuresequenz eines Bindungspartners von der entsprechenden in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz dadurch, daß wenigstens eine Aminosäure derart ausgetauscht, entfernt, hinzugefügt oder modifiziert ist, daß der Bindungspartner eine höhere Affinität für die Bindung an Calmodulin aufweist als NEF-Protein selbst.According to a further embodiment of the present invention, binding partners for calmodulin are derived from the amino acid sequence 1 to 206 shown in FIG. 1 and in particular 1 to 80. Fragments thereof with 3 to 30, preferably 4 to 20 and in particular 5 to 15 amino acids are preferred. The amino acid sequence of a binding partner advantageously differs from the corresponding amino acid sequence shown in FIG. 1 in that at least one amino acid is exchanged, removed, added or modified in such a way that the binding partner has a higher affinity for binding to calmodulin than NEF protein itself.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur intra- und/oder extrazellulären kompetitiven Hemmung der Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man wenigstens einen i) Bindungspartner für NEF-Protein, der die Bindung von Calmodulin an NEF-Protein kompetitiv hemmt und/oder ii) Bindungspartner für Calmodulin, der die Bindung von NEF an Calmodulin kompetitiv hemmt, mit HlV-infizierten Zellen, vorzugsweise T-Lymphozyten und Makrophagen, und/oder mit NEF-Protein aus Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, in Kontakt bringt.The present invention also relates to a method for intra- and / or extracellular competitive inhibition of the binding between NEF protein and calmodulin, which is characterized in that at least one i) binding partner for NEF protein, which binds calmodulin to NEF -Protein competitively inhibits and / or ii) binding partner for calmodulin, which competitively inhibits the binding of NEF to calmodulin, with HIV-infected cells, preferably T lymphocytes and macrophages, and / or with NEF protein from body fluid, in particular blood, in Brings contact.
Dieses Verfahren kann sowohl in vitro als auch in vivo durchgeführt werden. In vitro kann der Bindungspartner direkt in eine die HIV-infizierten Zellen und/oder NEF-Protein enthaltende Lösung, beispielsweise ein Gewebekulturmedium, gegeben werden oder zunächst selbst in einer geeigneten Flüssigkeit, beispielsweise einem Puffer, gelöst oder dispergiert und anschließend zu dem zell- und/oder NEF-Protein- haltigen Medium gegeben werden.This method can be carried out both in vitro and in vivo. In vitro, the binding partner can be added directly to a solution containing the HIV-infected cells and / or NEF protein, for example a tissue culture medium, or first of all itself dissolved or dispersed in a suitable liquid, for example a buffer, and then added to the cell and / or medium containing NEF protein.
Die in vitro Anwendung ist auch für die Diagnose von HIV- Erkrankungen von großer Bedeutung. So können die erfindungsgemäßen Bindungspartner zum spezifischen Nachweis von
intra- und/oder extrazellulärem NEF-Protein benutzt werden. Dadurch kann nicht nur eine HIV-Infektion allgemein festgestellt sondern auch eine NEF-abhängige Diagnose gestellt werden, die weitere qualitative und auch qunatitative Rückschlüsse über die Infektion, beispielsweise deren Stadium, ermöglicht. Bindungspartner zur diagnostischen Anwendung werden in der Regel auf die oben beschriebene Art und Weise markiert und/oder immobilisiert, so daß sie in üblichen Tests, die auf den oben beschriebenen Nachweisverfahren basieren, eingesetzt werden können. Handliche Kits zur raschen und zuverlässigenIn vitro use is also of great importance for the diagnosis of HIV diseases. The binding partners according to the invention can thus be used for the specific detection of intra- and / or extracellular NEF protein can be used. As a result, not only can an HIV infection be determined in general, but an NEF-dependent diagnosis can also be made, which enables further qualitative and qualitative conclusions to be drawn about the infection, for example its stage. Binding partners for diagnostic use are generally marked and / or immobilized in the manner described above, so that they can be used in conventional tests based on the detection methods described above. Handy kits for quick and reliable
Durchführung des diagnostischen Verfahrens stellen ausreichend Bindungspartner und wenigstens einen Teil der weiteren, zur Erkennung der Bindung an NEF-Protein erforderlichen Reagenzien in einer zweckmäßigen Anordung zur Verfügung, beispielsweise beschichtete Gefäße zur Immobilisierung von bindungspartner- gebundene Nef-Protein und/oder Antikörper zur spezifischen Erkennung des Blndungspartner/NEF-Protein-Komplexes. Kits zum serologischen Nachweis von NEF-Protein sind bevorzugt. Diese können die zur Blutaufbereitung üblichen Mittel beinhalten, wie gängige Lyse-Puffer und Mittel zur Anreicherung bestimmter Zellf aktionen.Carrying out the diagnostic method provides sufficient binding partners and at least some of the further reagents required for recognizing the binding to NEF protein in a suitable arrangement, for example coated vessels for immobilizing binding partner-bound Nef protein and / or antibodies for specific recognition of the blinding partner / NEF protein complex. Kits for serological detection of NEF protein are preferred. These can include the usual means for blood processing, such as common lysis buffers and means for enriching certain cell fractions.
Für eine Anwendung in vivo eignen sich pharmazeutische Formulierungen, die einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Bindungspartner zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder üblichen Hilfsstoffen enthalten.Pharmaceutical formulations which contain one or more of the binding partners according to the invention together with a pharmaceutically acceptable carrier and / or customary auxiliaries are suitable for use in vivo.
Zur Bewirkung einer ko petiven Hemmung der NEF-CalmodulinBindung werden vorzugsweise Dosierungen an Bindungspartner gewählt, die extrazelluläre Bindungspartner-Konzentrationen von weniger als 100 ng/ml, vorzugsweise von weniger als 10 ng/ml und insbesondere von weniger als 1 ng/ml Körperflüssigkeit ergebe .To effect a potent inhibition of the NEF-calmodulin binding, doses of binding partner are preferably selected which result in extracellular binding partner concentrations of less than 100 ng / ml, preferably less than 10 ng / ml and in particular less than 1 ng / ml of body fluid.
Beispiele geigneter pharmazeutischer Formulierungen sind feste Arzneiformen, wie Pulver, Puder, Granulate, Tabletten, Dragees, Kapseln, Suppositorien oder vaginale Arzneiformen, halbfeste Arzneiformen, wie Salben, Cremes, Hydrogele, Pasten oder
Pflaster, sowie flüssige Arzneiformen, wie Lösungen, Emulsionen, insbesondere öl-in-Wasser-Emulsionen, Suspensionen, beispielsweise Lotionen, Injektions- und Infusionszubereitungen, Augen- und Ohrentropfen, zu nennen. Auch implantierte Abgabevorriσhtungen können zur Verabreichung erfindungsgemäßer Bindungspartner verwendet werden. Ferner können auch Liposomen, Mikroshären oder Polymermatrizes zur Anwendung kommen.Examples of suitable pharmaceutical formulations are solid dosage forms, such as powder, powder, granules, tablets, dragees, capsules, suppositories or vaginal dosage forms, semi-solid dosage forms, such as ointments, creams, hydrogels, pastes or Plasters and liquid pharmaceutical forms, such as solutions, emulsions, in particular oil-in-water emulsions, suspensions, for example lotions, injection and infusion preparations, eye and ear drops. Implanted delivery devices can also be used for the administration of binding partners according to the invention. Liposomes, micro-spheres or polymer matrices can also be used.
Zu pharmazeutisch akzeptablen Trägern oder üblichen Hilfsstoffen zählen beispielsweise Antioxidantien, Antireizstoffe, Chelatbildner, Desinfektionsmittel, Dispergiermittel, Dragierhilfsmittel, Emulgatoren, Emulionsstabilisatoren, gegebenenfalls ethoxylierte und/oder propoxylierte Fettalkohole, Fettamine, Fettaminoxide, Fettsäurealkylolamide, Fettsäureester, Fettsäuren, Feuchthaltemittel, Filmbildner, Gelbildner, Geruchsmaskierungsmittel, Geschmackskorrigentien, Harze, Kydrokolloide, Konservierungsmittel, Lösemittel, Lösungsvermittler, Netzmittel, Neutralisierungsmittel, Permeationsbeschleuniger, Pigmente, Protein-Derivate und/oder -Hydrolysate, quaternäre Ammoniumverbindungen, Rückfettungs- und Überfettungsmittel, Salben-, Creme- oder Öl-Grundstoffe, Salbengrundlagen, Silikon-Derivate, Spreithilfsmittel, Stabilisatoren, Sterilanzien, Suppositoriengrundlagen, Suspendiermittel, Tabletten-Hilfsstoffe, wie Bindemittel, Füllstoffe, Gleitmittel, Sprengmittel oder Überzüge, Tone, Treibstoffe, Trocknungsmittel, Trübungsmittel, Verdickungsmittel, Wachse, Weichmacher, Weißöle. Eine diesbezügliche Ausgestaltung beruht auf fachmännischem Wissen, wie es beispielsweise in Fiedler, H.P., Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, 4. Auflage, Aulendorf: ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996, dargestellt ist.Pharmaceutically acceptable carriers or customary auxiliary substances include, for example antioxidants, anti-irritants, chelating agents, disinfectants, dispersants, coating aids, emulsifiers, Emulionsstabilisatoren, optionally ethoxylated and / or propoxylated fatty alcohols, fatty amines, fatty amine oxides, fatty acid alkylolamides, fatty acid ester, fatty acids, humectants, film formers, gelling agents, odor masking agents , Taste correctives, resins, hydrocolloids, preservatives, solvents, solubilizers, wetting agents, neutralizing agents, permeation accelerators, pigments, protein derivatives and / or hydrolyzates, quaternary ammonium compounds, refatting and overfatting agents, ointment, cream or oil bases, ointment bases, Silicone derivatives, spreading aids, stabilizers, sterilizers, suppository bases, suspending agents, tablet auxiliaries, such as binders, fillers, lubricants, disintegrants or coatings, clay e, fuels, desiccants, opacifiers, thickeners, waxes, plasticizers, white oils. A design in this regard is based on professional knowledge, as is shown, for example, in Fiedler, H.P., Lexicon of auxiliaries for pharmacy, cosmetics and related areas, 4th edition, Aulendorf: ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996.
Handelt es sich bei dem Bindungspartner um ein Peptid, kann das erfindungsgemäße Verfahren auch darin bestehen, daß ein zur Expression dieses Peptids befähigtes System, in der Regel ein geignetes Vekor-System, mit HIV-infizierten Zellen in Kontakt gebracht wird. Vorzugsweise werden geeignete
Nukleinsäurekonstrukte in die HlV-infizierten Zellen eingeschleust, in denen dann das Peptid exprimiert wird. Zu diesem Zweck können verschiedene physikalische Methoden verwendet werden, z.B. liposomen, virosomen- oder ligandenvermittelte Gentransfers, oder Viren, wie Retro-, Adeno-, Adenoassoziierte oder Herpesviren. Maßnahmen zur gewebsspezifischen Infektion und/oder Expression sind dem Fachmann bekannt.If the binding partner is a peptide, the method according to the invention can also consist in bringing a system capable of expressing this peptide, usually a suitable Vekor system, into contact with HIV-infected cells. Suitable ones are preferred Nucleic acid constructs are introduced into the HIV-infected cells, in which the peptide is then expressed. Various physical methods can be used for this purpose, for example liposome, virosome- or ligand-mediated gene transfers, or viruses such as retro, adeno, adeno-associated or herpes viruses. Measures for tissue-specific infection and / or expression are known to the person skilled in the art.
Auch kann ein peptidischer Bindungspartner direkt oder an Träger, beispielsweise Liposomen, gekoppelt in die Virusinfizierten Zellen eingeschleust werden.A peptide binding partner can also be introduced into the virus-infected cells directly or coupled to carriers, for example liposomes.
Aufgrund der kompetitiven Hemmung der Bindung zwischen NEF- Protein und Calmodulin sind die erfindungsgemäßenBecause of the competitive inhibition of the binding between NEF protein and calmodulin, those according to the invention
Bindungspartner und pharmazeutische Mittel, die wenigstens einen erfindungsgemäßen Bindungspartner enthalten, und das erfindungsgemäße Verfahren zur intra- und/oder extrazellulären kompetitiven Hemmung der Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin zur Prävention, Diagnose und/oder Behandlung von HIV-Erkrankungen geeignet.
Binding partners and pharmaceutical agents which contain at least one binding partner according to the invention and the method according to the invention for intra- and / or extracellular competitive inhibition of the binding between NEF protein and calmodulin are suitable for the prevention, diagnosis and / or treatment of HIV diseases.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.The following examples are intended to explain the invention in more detail without restricting it.
Beispiel 1example 1
Die Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin wurde mittels Protein-Overlay untersucht.The binding between NEF protein and calmodulin was examined using a protein overlay.
Das hierzu verwendete Calmodulin wurde in bekannter Weise erhalten, indem man das Calmodulin-Gen aus Dictyostelium discoideum in Escherichia coli (E. coli) expri ierte und reinigte.The calmodulin used for this was obtained in a known manner by expressing and purifying the calmodulin gene from Dictyostelium discoideum in Escherichia coli (E. coli).
Folgende NEF-Proben wurden untersucht:The following NEF samples were examined:
a) Das nef-Gen des HIV-1 Stammes pNL4-3 wurde in E. coli exprimiert und gereinigt (Wolber V. et al (1992) Eur. J. Biochem. 205:1115-1121). Das so erhaltene Protein wird als NEF-full bezeichnet.a) The nef gene of the HIV-1 strain pNL4-3 was expressed and purified in E. coli (Wolber V. et al (1992) Eur. J. Biochem. 205: 1115-1121). The protein thus obtained is called NEF-full.
b) Ein um 57 Aminosäuren N-terminal verkürztes NEF-Fragment (NEF-core ; Freund J. et al (1994) Eur. J. Biochem. 223:589-593) wurde ebenfalls in E. coli exprimiert und sukzessive mittels DEAE-Ionenaustauscher-Chromatographie, Ammoniumsulfatfällung (40%) und Gelfiltration gereinigt.b) A NEF fragment truncated by 57 amino acids N-terminally (NEF-core; Freund J. et al (1994) Eur. J. Biochem. 223: 589-593) was also expressed in E. coli and successively by means of DEAE- Ion exchange chromatography, ammonium sulfate precipitation (40%) and gel filtration cleaned.
c) Das 57 Aminosäuren umfassende N-terminale Fragment (NEF- Anker) wurde synthetisch hergestellt (Freund et al, ibid) .c) The 57 amino acid N-terminal fragment (NEF anchor) was produced synthetically (Freund et al, ibid).
1 μl einer NEF-full, NEF-core bzw. NEF-Anker enthaltenden Lösung (2mg/ml) wurde auf eine Nitrozellulose-Membran (Schleicher & Schuell) getropft. Um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, wurde die Membran lh bei Raumtemperatur mit 5% Milchpulver in TBS + 0,2% CaCl2 bzw. 5 M EGTA inkubiert. Nach 3-maligem Waschen von je 5 min mit TBS + 0,2% CaCl2 bzw. 5 mM EGTA wurde die Membran mit 5 μg Calmodulin in Anwesenheit von 0,2% CaCl2 oder 5 mM EGTA 2h bei Raumtemperatur inkubiert. Als Kontrolle diente eine mit NEF-
Protein behandelte Membran, die aber nicht mit Calmodulin inkubiert wurde, um unspezifische Bindungen des anti-Calmodulin Antikörpers erkennen zu können. Gebundenes Calmodulin wurde nach dreimaligem Waschen der Membran in TBS mit Antikörper detektiert. Als erster Antikörper dient polyklonaler anti- Calmodulin aus Rabbit, der 1:1000 in 3% Milchpulver in TBS eingesetzt wurde. Inkubiert wurde lh bei Raumtemperatur. Der zweite Antikörper, monoklonaler Goat anti-Rabbit von BioRad wurde ebenfalls 1:1000 eingesetzt. Der Immunkomplex wurde mit Sigma fast DAB-Tabletten detektiert.1 μl of a solution containing NEF-full, NEF-core or NEF-Anker (2 mg / ml) was dropped onto a nitrocellulose membrane (Schleicher & Schuell). In order to block non-specific binding sites, the membrane was incubated for 1 hour at room temperature with 5% milk powder in TBS + 0.2% CaCl 2 or 5 M EGTA. After 3 washes of 5 min each with TBS + 0.2% CaCl 2 or 5 mM EGTA, the membrane was incubated with 5 μg calmodulin in the presence of 0.2% CaCl 2 or 5 mM EGTA at room temperature. A NEF- Protein-treated membrane, but which was not incubated with calmodulin in order to detect non-specific binding of the anti-calmodulin antibody. Bound calmodulin was detected after washing the membrane three times in TBS with antibody. The first antibody used is polyclonal anti-calmodulin from Rabbit, which was used 1: 1000 in 3% milk powder in TBS. The incubation was at room temperature. The second antibody, monoclonal Goat anti-Rabbit from BioRad was also used 1: 1000. The immune complex was detected with Sigma almost DAB tablets.
Ergebnisse:Results:
Sowohl NEF-full als auch der NEF-Anker zeigten eine Bindung an Calmodulin in Anwesenheit von CaCl2. Die Bindung konnte durch die Anwesenheit von EGTA geschwächt (inhibiert) werden. Als Kontrollexperiment wurde eine mit NEF-full und NEF-core behandelte Membran ohne Calmodulin inkubiert, um sicherzugehen, daß der spezifisch gegen Calmodulin gerichtete Antikörper nicht auch NEF erkennt.Both NEF-full and the NEF anchor showed binding to calmodulin in the presence of CaCl 2 . Binding could be weakened (inhibited) by the presence of EGTA. As a control experiment, a membrane treated with NEF-full and NEF-core was incubated without calmodulin in order to ensure that the antibody directed specifically against calmodulin did not also recognize NEF.
Beispiel 2Example 2
Die Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin wurde mittels Fluoreszenzmessung untersucht.The binding between NEF protein and calmodulin was examined by means of fluorescence measurement.
Für die Fluoreszenzmessungen wurden sowohl Pyren-markiertes und unmarkiertes NEF (füll und core) , als auch Dansyl-markiertes und unmarkiertes Calmodulin eingesetzt. Die Messungen wurden bei 25°C durchgeführt.For the fluorescence measurements, both pyrene-labeled and unlabeled NEF (full and core), as well as dansyl-labeled and unlabeled calmodulin were used. The measurements were carried out at 25 ° C.
Pyren-Markierung:Pyrene marking:
NEF-Lösungen (füll und core) wurden mit einem zweifachen Überschuß an Pyrenmaleimid (gelöst in DMF) 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend über eine PD 10 Säule von überschüssigem Reagenz abgetrennt.
Das Dansyl-markierte Calmodulin wurde von der Firma Sigma bezogen.NEF solutions (filling and core) were incubated with a two-fold excess of pyrenmaleimide (dissolved in DMF) at room temperature for 1 h and then separated from excess reagent on a PD 10 column. The dansyl-labeled calmodulin was purchased from Sigma.
Die Fluoreszenz-Emissionsspektren für Pyren-markiertes NEF wurden von 360 nm bis 450 nm aufgenommen, bei einerThe fluorescence emission spectra for pyrene-labeled NEF were recorded from 360 nm to 450 nm, at one
Anregungswellenlänge von 344 nm. Die Schlitzbreiten betrugen für die Anregung 0,5 nm und für die Emission 2,0 nm.Excitation wavelength of 344 nm. The slot widths were 0.5 nm for the excitation and 2.0 nm for the emission.
Die Fluoreszenz-Emissionsspektren für Dansyl-markiertes Calmodulin wurden von 450 nm bis 550 nm aufgenommen, bei einer Anregungswellenlänge von 340 nm.The fluorescence emission spectra for dansyl-labeled calmodulin were recorded from 450 nm to 550 nm, with an excitation wavelength of 340 nm.
Von der jeweils markierten Probe wurde eine 1 μM Lösung in einer Quarzküvette vorgelegt und das Emissionsspektrum aufgenommen. Die Probe wurde dann mit dem unmarkierten Protein titriert und der Fluoreszenzverlauf gemessen.A 1 μM solution of the marked sample was placed in a quartz cuvette and the emission spectrum was recorded. The sample was then titrated with the unlabelled protein and the course of fluorescence measured.
Ergebnisse:Results:
Figur 4 zeigt das Fluoreszenz-Emissionsspektrum von Pyren- markiertem NEF-full allein (Kurve 1) , in Anwesenheit von Calmodulin (Kurve 2) und nach Zugabe von 5 M EGTA zu NEF- Calmodulin-Komplex (Kurve 3) .FIG. 4 shows the fluorescence emission spectrum of pyrene-labeled NEF-full alone (curve 1), in the presence of calmodulin (curve 2) and after adding 5 M EGTA to the NEF-calmodulin complex (curve 3).
Figur 5 zeigt das Fluoreszenz-Emissionsspektrum von Pyren- markiertera NEF-core allein (Kurve 1) und in Anwesenheit von Calmodulin (Kurve 2) .FIG. 5 shows the fluorescence emission spectrum of pyrene-labeled NEF-core alone (curve 1) and in the presence of calmodulin (curve 2).
Figur 6 zeigt das Fluoreszenz-Emissionsspektrum von Dansyl- markiertem Calmodulin allein (Kurven 1 und 2) und nach Zugabe von NEF-full (Kurve 3).FIG. 6 shows the fluorescence emission spectrum of dansyl-labeled calmodulin alone (curves 1 and 2) and after addition of NEF-full (curve 3).
Die Zugabe von Calmodulin zu gelabeltem NEF-full (Fig. 4) bewirkte einen deutlichen Anstieg der Fluoreszenz, was auf eine Interaktion der beiden Proteine hinweist. Durch Zugabe von 5 mM EGTA konnte diese Interaktion inhibiert werden. Calmodulin konnte auch eine Fluoreszenzzunahme bei NEF-core (Fig. 5) bewirken, die ebenfalls mit einem Überschuß an EGTA (5 mM)
inhibiert werden konnte.The addition of calmodulin to labeled NEF-full (FIG. 4) caused a significant increase in fluorescence, which indicates an interaction of the two proteins. This interaction could be inhibited by adding 5 mM EGTA. Calmodulin could also cause an increase in fluorescence in NEF-core (Fig. 5), which also with an excess of EGTA (5 mM) could be inhibited.
Die Zugabe von BSA (Bovine serum albumin) oder CaCl2 zu markiertem NEF zeigte diesen Effekt der Fluoreszenzänderung nicht. Die Zugabe von NEF-full zu markiertem Calmodulin (Fig. 6) zeigte ebenfalls einen Fluoreszenzanstieg und einen leichten Blauβhift.The addition of BSA (Bovine serum albumin) or CaCl 2 to the labeled NEF did not show this effect of the change in fluorescence. The addition of NEF-full to labeled calmodulin (Fig. 6) also showed an increase in fluorescence and a slight blue shift.
Beispiel 3Example 3
Die Bindung von NEF-Protein an Calmodulin wurde mittels Stopped-Flow untersucht.The binding of NEF protein to calmodulin was examined using a stopped flow.
Für die Stopped-Flow Messungen wurden die gleichen Proteinproben wie in Beispiel 2 eingesetzt. Die Messungen erfolgten bei 25°CThe same protein samples as in Example 2 were used for the stopped-flow measurements. The measurements were made at 25 ° C
Die Anregungswellenlänge für die Pyren-Markierung (Dansyl- Markierung) lag bei 344 nm (340 nm) , die Emission wurde mit einem Kantenfilter bei Wellenlängen über 370 nm (389 nm) gemessen.The excitation wavelength for the pyrene labeling (Dansyl labeling) was 344 nm (340 nm), the emission was measured with an edge filter at wavelengths above 370 nm (389 nm).
Um die Geschwindigkeitskonstante der Assoziation kon zu bestimmen, wurde eine 1 μM Lösung der markierten Probe in die eine Spritze der Stopped-Flow Apparatur und eine Proteinlösung der Konzentration von l μM bis -40(90) μM in die andere Spritze gefüllt.In order to determine the rate constant of the association k on , a 1 μM solution of the labeled sample was filled into one syringe of the stopped-flow apparatus and a protein solution with a concentration of 1 μM to -40 (90) μM into the other syringe.
Für eine genaue Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten ko££ wurde in eine Spritze eine Lösung aus 1 μM markierter NEF-Probe + 8 μM unmarkierte CaM-Probe gegeben und in die andere Spritze eine -40 μM unmarkierte NEF-Probe.For an exact determination of the rate constant k o ££ , a solution of 1 μM labeled NEF sample + 8 μM unlabeled CaM sample was placed in one syringe and a -40 μM unlabeled NEF sample in the other syringe.
Mit der Dansyl-markeirten Calmodulin-Probe wurde ebenso verfahren.
Ergebnisse:The same procedure was followed with the dansyl-labeled calmodulin sample. Results:
Mit Hilfe der Stopped-Flow wurden die Experimente der Beispiele 1 und 2 bestätigt. Es wurde jeweils eine Fluoreszenzzunähme beobachtet, wenn Calmodulin zu markiertem NEF (füll oder core) gegeben wurde. Jedoch wurde bei Dansyl-markiertem Calmodulin nur eine Änderung der Fluoreszenz mit NEF-full erreicht.
The experiments of Examples 1 and 2 were confirmed using the stopped flow. An increase in fluorescence was observed in each case when calmodulin was added to labeled NEF (fill or core). However, only a change in fluorescence with NEF-full was achieved with dansyl-labeled calmodulin.