DE19710497C2 - Use bi- and trispecific antibodies to induce tumor immunity - Google Patents

Use bi- and trispecific antibodies to induce tumor immunity

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Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung intakter bispezifischer Antikörper zur Induktion einer Tumorimmunität bei Mensch und Tier.The invention relates to the use of intact bispecific Antibodies to induce tumor immunity in humans and Animal.

Maligne Erkrankungen des Menschen, beispielsweise Brustkrebs im fortgeschrittenen Stadium, haben trotz der Fortschritte der Chemo- und Radiotherapie in den letzten Jahren noch immer eine äußerst ungünstige Prognose. Eine Heilung dieser Erkrankungen ist nicht möglich. Es ist daher notwendig, neue Behandlungs­ strategien zu entwickeln. Große Hoffnungen werden dabei auf immuntherapeutische Ansätze gesetzt, mittels derer das Immun­ system des Patienten dazu gebracht werden soll, den Tumor ab­ zustoßen. Es ist bekannt, daß auf Tumorzellen tumorassoziierte Antigene vorkommen und daß das Immunsystem prinzipiell durch­ aus in der Lage ist, diese zu erkennen und die malignen Zellen anzugreifen. Tumoren haben jedoch verschiedene Strategien ent­ wickelt, die es ihnen erlauben, sich der Immunantwort zu ent­ ziehen. Dies gelingt ihnen z. B. durch ungenügende Präsentation von tumorassoziierten Antigenen und/oder durch unzureichende Aktivierung der in der Regel vorhandenen tumorspezifischen T-Zellen.Malignant diseases in humans, for example breast cancer at an advanced stage, despite the progress of Chemotherapy and radiotherapy have still been one in recent years extremely unfavorable forecast. A cure for these diseases can not. It is therefore necessary to get new treatment develop strategies. Great hopes will arise  set immunotherapeutic approaches by means of which the immune system of the patient should be brought to the tumor to happen. It is known that tumor-associated on tumor cells Antigens occur and that the immune system in principle is able to recognize these and the malignant cells to attack. However, tumors have different strategies that allow them to evade the immune response pull. They succeed z. B. due to insufficient presentation of tumor-associated antigens and / or by insufficient Activation of the usually existing tumor-specific T cells.

Bei etwa 43 000 Neuerkrankungen/Jahr steht Brustkrebs an der Spitze der Krebsstatistik für Frauen in Deutschland. Weniger als ein Drittel der Frauen mit Lymphknotenbefall bei Diagnose leben 10 Jahre ohne Rückfall.With around 43,000 new cases per year, breast cancer is at the Top cancer statistics for women in Germany. Fewer than a third of women with lymph node involvement when diagnosed live 10 years without relapse.

Vor diesem Hintergrund wird seit einigen Jahren versucht, mit Hilfe der autologen Knochenmark- und Blutstammzell-Transplan­ tation in Verbindung mit der Hoch-Dosis-Therapie Patientinnen mit ausgedehntem Lymphknotenbefall und Fernmetastasen eine Lebensverlängerung oder sogar Heilung zu ermöglichen. Trotz hoher Ansprechraten bei der Hoch-Dosis-Therapie ist eine Hei­ lung im metastasierten Stadium selten.Against this background, attempts have been made for several years Help with the autologous bone marrow and blood stem cell transplan tation in connection with high-dose therapy patients with extensive lymph node involvement and distant metastases one Allow life extension or even healing. In spite of high response rates in high-dose therapy is a hot thing in the metastatic stage rare.

Immuntherapeutische Ansätze beim Mamma-Karzinom beschränkten sich bisher auf Methoden zur unspezifischen Stimulation wie die Behandlung mit BCG oder Levamisol, sowie den Einsatz von LAK- und NK-Zellen mit IL-2 (15, 16). Eine Lebensverlängerung konnte mit bisher eingesetzten Formen von Immuntherapie nicht nachgewiesen werden, die Behandlung mit BCG war sogar eher nachteilig (15). Nachdem unspezifische Aktivierungen von Zellen auch bei anderen Tumorarten wenig Erfolg gehabt haben, sollte nun versucht werden, eine spezifische Immunreaktion in Gang zu bringen. Restricted immunotherapeutic approaches to breast cancer So far, methods such as non-specific stimulation treatment with BCG or Levamisole, as well as the use of LAK and NK cells with IL-2 (15, 16). An extension of life could not with previously used forms of immunotherapy treatment with BCG was even earlier disadvantageous (15). After unspecific activations of Cells have had little success with other types of tumor, should now be tried in a specific immune response To get going.  

Für die Tumortherapie wurden beispielsweise T-Zell-redirigie­ rende bispezifische Antikörper verwendet. Diese binden mit ei­ nem Bindungsarm an einen T-Zell-Rezeptorkomplex und mit dem zweiten Bindungsarm an ein tumorassoziiertes Antigen auf einer Tumorzelle. Durch die daraus resultierende Aktivierung der T-Zelle und der räumlichen Nähe der Tumorzelle wird letztere durch Apoptose-Induktion bzw. Cytokine wie TNF-α oder Perforin zerstört.For example, T-cell redirection was used for tumor therapy Bispecific antibodies used. These bind with egg an arm to a T cell receptor complex and with the second binding arm to a tumor associated antigen on a Tumor cell. The resulting activation of T cell and the spatial proximity of the tumor cell becomes the latter by induction of apoptosis or cytokines such as TNF-α or perforin destroyed.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Mit­ tel bereitzustellen, um maligne Erkrankungen des Menschen zu therapieren.It is an object of the present invention to create a new to provide tel to human malignancies treat.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die im Anspruch 1 nä­ her gekennzeichneten Merkmale gelöst. Bevorzugte Ausgestaltung gen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.This object is achieved by the nä in claim 1 resolved features identified. Preferred configuration gene of the invention emerge from the subclaims.

Die Erfindung offenbart somit die Anwendung intakter bispezifischer oder trispezifischer Antikörper mit den nachfolgenden Eigenschaften und Wirkungen:
The invention thus discloses the use of intact bispecific or trispecific antibodies with the following properties and effects:

  • (a) bindet an eine T-Zelle und vermittelt ihr ein 1. Aktivie­ rungssignal;(a) binds to a T cell and gives it a 1st activation signal;
  • (b) bindet an tumorassoziierte Antigene auf einer Tumorzelle;(b) binds to tumor associated antigens on a tumor cell;
  • (c) bindet durch seinen Fc-Teil (bei bispezifischen Antikör­ pern) oder eine dritte Spezifität (bei trispezifischen Antikörpern) an den Fc-Rezeptor von Fc-Rezeptor positiven Zellen;(c) binds through its Fc part (with bispecific antibody pern) or a third specificity (for trispecific Antibodies) to the Fc receptor of Fc receptor positive Cells;
  • (d) aktiviert die Fc-Rezeptor positive Zelle durch seine Bin­ dung an die Fc-Rezeptor positive Zelle, wodurch die Ex­ pression von Cytokinen und/oder kostimulatorischen Anti­ genen initiiert oder erhöht wird; (d) activates the Fc receptor positive cell through its bin to the Fc receptor positive cell, whereby the Ex pression of cytokines and / or costimulatory anti genes is initiated or increased;  
  • (e) die kostimulatorischen Antigene übertragen an die T-Zelle zumindest ein 2. Aktivierungssignal, das für eine physio­ logische Aktivierung der T-Zelle benötigt wird, wobei sich diese Aktivierung in der Hochregulation von Aktivie­ rungsmarkern, der Zerstörung der Tumorzelle und/oder in einer Proliferation der T-Zelle zeigt(e) the costimulatory antigens are transferred to the T cell at least a second activation signal, which for a physio logical activation of the T cell is required, whereby this activation in the upregulation of activation marker, the destruction of the tumor cell and / or in shows a proliferation of the T cell

zur Induktion einer Tumorimmunität bei Mensch und Tier.for induction of tumor immunity in humans and animals.

Die erfindungsgemäß angewandten Antikörper sind bevorzugt in der Lage, die tumorspezifischen T-Zellen, die über den T-Zell-Rezeptor ein tumorspezifisches Peptid, welches über MHC Klasse I und/oder Klasse II auf Tumorzellen präsentiert wird, erkennen, nach Bindung durch den bispezifischen oder trispezifischen Antikörper, wie unter (e) beschrieben, zu aktivieren.The antibodies used according to the invention are preferably in able to target the tumor-specific T cells via the T cell receptor a tumor-specific peptide, which via MHC class I and / or class II is presented on tumor cells, recognize after binding by the bispecific or trispecific antibodies as described under (e) activate.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Antikörper sind weiterhin zur Reaktivierung von in Anergie befindlichen, tumorspezifischen T-Zellen befähigt. Weiterhin sind sie zur Induktion von tumorreaktiven Komplement-bindenden Antikörpern und damit zur Induktion einer humoralen Immunantwort in der Lage.The antibodies used according to the invention are also for Reactivation of anergic, tumor-specific T cells enabled. Furthermore, they are for induction of tumor-reactive complement-binding antibodies and thus to Able to induce a humoral immune response.

Die Bindung erfolgt bevorzugt über CD3, CD2, CD5, CD28 und/oder CD44 an die T-Zelle. Die Fc-Rezeptor positiven Zellen weisen zumindest einen Fcγ-Rezeptor I, II oder III auf.Binding is preferably via CD3, CD2, CD5, CD28 and / or CD44 to the T cell. The Fc receptor positive cells have at least one Fcγ receptor I, II or III.

Erfindungsgemäß verwendbare Antikörper sind zur Bindung an Monozyten, Makrophagen und/oder Dendriten als Fcγ-Rezeptor I positive Zellen befähigt.Antibodies which can be used according to the invention are for binding to Monocytes, macrophages and / or dendrites as Fcγ receptor I empowered positive cells.

Die erfindungsgemäß einsetzbaren Antikörper bewirken, daß die Expression von CD40, CD80, CD86, ICAM-1 und/oder LFA-3 als kostimulatorische Antigene oder/und die Sekretion von Cytokinen durch die Fc-Rezeptor positive Zelle initiiert oder erhöht wird. Die Cytokine sind bevorzugt IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12 und/oder TNF-α.The antibodies which can be used according to the invention cause the Expression of CD40, CD80, CD86, ICAM-1 and / or LFA-3 as costimulatory antigens and / or the secretion of Cytokines initiated by the Fc receptor or positive cell  is increased. The cytokines are preferably IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12 and / or TNF-α.

Die Bindung an die T-Zelle erfolgt bevorzugt über den T-Zell-Rezeptor-Komplex der T-Zelle.The binding to the T cell is preferably via the T cell receptor complex of the T cell.

Der erfindungsgemäß anwendbare bispezifische Antikörper ist bevorzugt ein anti-CD3 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD2 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD5 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD28 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD44 X anti- Tumor-assoziiertes Antigen-Antikörper.The bispecific antibody that can be used according to the invention is preferably an anti-CD3 X anti-tumor associated antigen and / or anti-CD2 X anti-tumor associated antigen and / or anti-CD5 X anti-tumor associated antigen and / or anti-CD28 X anti-tumor associated antigen and / or anti-CD44 X anti Tumor-associated antigen antibody.

Der erfindungsgemäß einsetzbare trispezifische Antikörper ist bevorzugt ein anti-CD3 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD2 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD5 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD28 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD44 X anti- Tumor-assoziiertes Antigen-Antikörper mit einem zusätzlichen anti-Fc-Rezeptor-Bindungsarm.The trispecific antibody that can be used according to the invention is preferably an anti-CD3 X anti-tumor associated antigen and / or anti-CD2 X anti-tumor associated antigen and / or anti-CD5 X anti-tumor associated antigen and / or anti-CD28 X anti-tumor associated antigen and / or anti-CD44 X anti Tumor-associated antigen antibody with an additional anti-Fc receptor binding arm.

Bezugnehmend auf das Merkmal (a) wird das 1. Signal beispiels­ weise über den T-Zell-Rezeptor-Komplex der T-Zelle übertragen und kann damit, für sich allein betrachtet, zu einer unphysio­ logischen Aktivierung der T-Zelle führen. Die Zelle wird hier­ durch anergisiert und kann auf T-Zell-Rezeptor vermittelte Stimuli nicht mehr angemessen reagieren. Durch die erfindungs­ gemäßen bispezifischen oder trispezifischen Antikörper wird zusätzlich gleichzeitig durch die kostimulatorischen Antigene auf der Fc-Rezeptor positiven Zelle an die T-Zelle ein 2. Aktivierungssignal übertragen, das zu einer physiologischen Aktivierung der T-Zelle und in der Folge entweder zu einer Zerstörung der Tumorzelle und/oder einer Proliferation der T-Zelle führt. Als weiteres Kriterium für die Aktivierung der T-Zelle kann die Hochregulation von Oberflächenantigenen wie z. B. CD2, CD25 und/oder CD28 und/oder die Sekretion von Cytokinen wie z. B. IL-2 herangezogen werden.Referring to feature (a), the 1st signal is exemplary transmitted via the T cell receptor complex of the T cell and, viewed in isolation, can become an unphysio logical activation of the T cell. The cell is here through anergized and can be mediated on T cell receptor Stimuli no longer respond appropriately. Through the fiction bispecific or trispecific antibody additionally at the same time through the costimulatory antigens on the Fc receptor positive cell to the T cell a 2nd Activation signal transmitted to a physiological Activation of the T cell and then either one Destruction of the tumor cell and / or proliferation of the T cell leads. As a further criterion for the activation of the  T cell can like the upregulation of surface antigens e.g. B. CD2, CD25 and / or CD28 and / or the secretion of Cytokines such as B. IL-2 can be used.

Mit den erfindungsgemäß verwendeten bsAk werden also T-Zellen aktiviert und gegen die Tumorzellen redirigiert. Unspezifische Aktivierungen von T-Zellen hatten in der Immuntherapie generell wenig Erfolg.With the bsAk used according to the invention, T cells become activated and redirected against the tumor cells. Nonspecific Activations of T cells had in immunotherapy generally little success.

Bevorzugte Antikörper sind heterologe bispezifische Antikör­ per, die aus einer oder mehreren der nachfolgenden Isotypkom­ binationen ausgewählt werden:
Ratte-IgG2b/Maus-IgG2a,
Ratte-IgG2b/Maus-IgG2b,
Ratte-IgG2b/Maus-IgG3,
Ratte-IgG2b/Human-IgG1,
Ratte- IgG2b/Human- IgG2,
Ratte-IgG2b/Human-IgG3 [orientaler Allotyp G3m(st) = Bin­ dung an Protein A]-,
Ratte-IgG2b/Human-IgG4,
Ratte-IgG2b/Ratte-IgG2c,
Maus-IgG2a/Human-IgG3 [kaukasische Allotypen G3m(b+g) = keine Bindung an Protein A, im folgenden mit * gekenn­ zeichnet]
Maus-IgG2a/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]- Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2a/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2a/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]- Human-IgG1-[Hinge]-Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Hu­ man-IgG4-[Hinge]-Human-IgG4[N-terminale Region von CH2]- Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge-CH2- CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG2-[Hinge-CH2- CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG3-[Hinge-CH2- CH3, orientaler Allotyp]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge-CH2- CH3]
Human-IgG1/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]- Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3* [C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG4 [N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3* [C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL)-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG2 [N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3* [C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG2 [N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3* [C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Human-IgG3* [CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG2/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG2-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG4/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG4/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge]-Human- IgG4 [N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3* [C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Human-IgG3* [CH3]
Maus-IgG2b/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2b/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]. Preferred antibodies are heterologous bispecific antibodies, which are selected from one or more of the following isotype combinations:
Rat IgG2b / mouse IgG2a,
Rat IgG2b / mouse IgG2b,
Rat IgG2b / mouse IgG3,
Rat IgG2b / human IgG1,
Rat IgG2b / human IgG2,
Rat IgG2b / human IgG3 [oriental allotype G3m (st) = binding to protein A] -,
Rat IgG2b / human IgG4,
Rat IgG2b / rat IgG2c,
Mouse IgG2a / Human IgG3 [Caucasian allotypes G3m (b + g) = no binding to protein A, marked with * in the following]
Mouse IgG2a / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -Human IgG1- [Hinge] - Human IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse-IgG2a / Rat- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse IgG2a / Human- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -human IgG1 / rat- [VH-CH1, VL-CL] - human-IgG1- [Hinge] -human-IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -Human IgG4 / Rat- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG4- [Hinge] -Human-IgG4 [N-terminal region of CH2] - Human -IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS position 251] -Human-IgG3 * [CH3]
Rat IgG2b / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG1- [Hinge-CH2- CH3]
Rat IgG2b / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG2- [Hinge-CH2- CH3]
Rat IgG2b / mouse [VH-CH1, VL-CL] human IgG3 [hinge CH2-CH3, oriental allotype]
Rat-IgG2b / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -Human IgG4- [Hinge-CH2- CH3]
Human-IgG1 / Human- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] - Human-IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG1 / Rat- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG1 [Hinge] Human IgG4 [N-terminal region of CH2] Human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Human IgG1 / mouse [VH-CH1, VL-CL] human IgG1 [hinge] human IgG4 [N-terminal region of CH2] human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Human IgG1 / Rat- [VH-CH1, VL-CL) Human IgG1 [Hinge] Human IgG2 [N-terminal region of CH2] Human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Human IgG1 / mouse- [VH-CH1, VL-CL] -human IgG1- [hinge] -human IgG2 [N-terminal region of CH2] -human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Human IgG1 / Rat- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG1- [Hinge] Human IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG1 / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -Human IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG2 / Human- [VH-CH1, VL-CL] -Human IgG2- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG4 / Human- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG4- [Hinge] Human IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG4 / Human [VH-CH1, VL-CL] Human IgG4 [Hinge] Human IgG4 [N-terminal region of CH2] Human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Mouse IgG2b / Rat- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse IgG2b / Human- [VH-CH1, VL-CL] -Human IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse IgG2b / mouse [VH-CH1, VL-CL] human IgG1 [hinge] human IgG3 * - [CH2-CH3].

Die beiliegenden Abbildungen dienen zur weiteren Veranschauli­ chung der Erfindung. Die Abbildungen zeigen:The enclosed illustrations serve for further illustration chung of the invention. The pictures show:

Abb. 1 die Rolle von akzessorischen Zellen bei der Tumor- Immuntherapie mit bispezifischen Antikörpern. Fig. 1 the role of accessory cells in tumor immunotherapy with bispecific antibodies.

Abb. 2 die graphische Darstellung der Ergebnisse des in vivo-Versuchs. Fig. 2 shows the graphical representation of the results of the in vivo experiment.

Abb. 3 Beispiel für einen bispezifischen Antikörper der Erfindung. Fig. 3 Example of a bispecific antibody of the invention.

Abb. 4 Trispezifischer F(ab)2-Antikörper Fig. 4 Trispecific F (ab) 2 antibody

Abb. 5 Trispezifischer scFv-Antikörper. Fig. 5 Trispecific scFv antibody.

Die erfindungsgemäße Aufgabe zielt darauf ab, durch eine effi­ ziente T-Zell-Antwort gegen Tumorzellen eine Immunität gegen Tumore, insbesondere eine Langzeit-Tumorimmunität, zu induzie­ ren. Dies wird erreicht durch Redirektion von T-Zellen an Tu­ morzellen mittels intakter bispezifischer Antikörper (bsAk) und gleichzeitiger Bindung von Fc-Rezeptor positiven Zellen an den Fc-Teil des bsAk. Wichtig dabei ist, daß die Fc-Rezeptor positive Zelle durch Bindung von (an der T-Zelle bzw. Tumor­ zelle) immobilisierten intakten bsAk an den Fc-Rezeptor akti­ viert wird. Erfindungsgemäß wird unter "Tumor-Langzeitimmuni­ tät" ein Zeitraum verstanden, der sich über zumindest mehrere Jahre erstreckt.The object of the invention aims through an effi T-cell response against tumor cells has immunity to Tumors, especially long-term tumor immunity ren. This is achieved by redirecting T cells to Tu morocells using intact bispecific antibodies (bsAk) and simultaneous binding of Fc receptor positive cells the FC part of the BSAk. It is important that the Fc receptor positive cell by binding (to the T cell or tumor cell) immobilized intact bsAk to the Fc receptor acti fourth. According to the invention under "Tumor long-term immun "understood a period that spanned at least several Years.

Die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen bispezifischen und trispezifischen Antikörper weisen insbesondere die in den Patentansprüchen gekennzeichneten Eigenschaften auf, zumindest aber die im Anspruch 1 in den Merkmalen (a)-(e) gekenn­ zeichneten Eigenschaften. Diese Antikörper können somit zur Induktion einer Tumorimmunität, bevorzugt einer Langzeit-Tumor­ immunität, bei Mensch und Tier verwendet werden, wobei hierfür insbesondere die unter (a)-(e) des Anspruchs 1 genannten Eigenschaften verantwortlich sind.The bispecific described in the present application and trispecific antibodies have in particular those in the Characteristics characterized on claims, at least but those in claim 1 in features (a) - (e) recorded properties. These antibodies can thus be used Induction of tumor immunity, preferably a long-term tumor immunity, used in humans and animals, whereby  for this in particular that under (a) - (e) of claim 1 properties mentioned are responsible.

Zur Aktivierung der Fc-Rezeptor positiven Zelle durch den bsAk werden bevorzugt spezifische Subklassen bzw. Subklassenkombi­ nationen des bsAk oder bei trispezifischen Antikörpern ein den Fc-Rezeptor erkennender Bindungsarm eingesetzt. Wie in in vi­ tro Versuchen nachgewiesen werden konnte, sind bspw. bsAk der Subklassenkombination Maus-IgG2a/Ratte-IgG2b in der Lage, an Fc-Rezeptor positive Zellen zu binden und diese gleichzeitig zu aktivieren, was zur Hochregulation bzw. Neuausbildung (Ex­ pression) von kostimulatorischen Antigenen wie z. B. CD40, CD80 oder CD86 auf der Zelloberfläche dieser Zellen führt. Dagegen sind bsAk der Subklassenkombination Maus-IgG1/Ratte-IgG2b zwar in der Lage an Fc-Rezeptor positive Zellen zu binden (Haagen et al., Interaction of human monocyte Fcγ receptors with rat IgG2b, J. Immunology., 1995, 154 : 1852-1860), können diese aber offenbar nicht in vergleichbarem Maße aktivieren (Gast G.C., Haagen I.-A., van Houten A.A., Klein S., Duits A.J., de Weger R.A., Vroom T.M., Clark M.R., J. Phillips, van Dijk A.J.G., de Lau W.B.M., Bast B.J.E.G. CD8 T-cell activation after intravenous administration of CD3 × CD19 bispecific anti­ body in patients with non-Hodgkin lymphoma. Cancer Immunol. Immunother. 40 : 390, 1995).To activate the Fc receptor positive cell by the bsAk are preferred specific subclasses or subclass combinations nations of the bsAk or in the case of trispecific antibodies Fc receptor-recognizing binding arm used. As in vi For example, attempts could be demonstrated, for example Subclass combination mouse-IgG2a / rat-IgG2b able to Fc receptor bind positive cells and these at the same time to activate what for upregulation or new training (Ex pression) of costimulatory antigens such. B. CD40, CD80 or CD86 on the cell surface of these cells. On the other hand are bsAk of the mouse IgG1 / rat IgG2b subclass combination able to bind positive cells to Fc receptor (Haagen et al., Interaction of human monocyte Fcγ receptors with rat IgG2b, J. Immunology., 1995, 154: 1852-1860), these can but apparently not activated to a comparable extent (guest G.C., Haagen I.-A., van Houten A.A., Klein S., Duits A.J., de Weger R.A., Vroom T.M., Clark M.R., J. Phillips, van Dijk A.J.G., de Lau W.B.M., Bast B.J.E.G. CD8 T-cell activation after intravenous administration of CD3 × CD19 bispecific anti body in patients with non-Hodgkin lymphoma. Cancer Immunol. Immunother. 40: 390, 1995).

Während der intakte bsAk die T-Zelle mit einem Bindungsarm (z. B. an CD3 oder CD2) bindet und gleichzeitig aktiviert, kön­ nen kostimulatorische Signale von der an den Fc-Teil des bsAk gebundenen Fc-Rezeptor positiven Zelle an die T-Zelle übermit­ telt werden. D.h. erst die Kombination von Aktivierung der T-Zelle über einen Bindungsarm des bsAk und der gleichzeitigen Übertragung von kostimulatorischen Signalen von der Fc-Rezep­ tor positiven Zelle auf die T-Zelle führt zu einer effizienten T-Zellaktivierung (Abb. 1A). Tumorspezifische T-Zellen, die an der Tumorzelle ungenügend aktiviert wurden und deshalb anerg sind, können durch das oben beschriebene erfindungsgemäße Prinzip ebenfalls reaktiviert werden (Abb. 1B).While the intact bsAk binds the T cell with a binding arm (e.g. to CD3 or CD2) and simultaneously activates it, costimulatory signals can be sent from the Fc receptor positive cell bound to the Fc part of the bsAk to the T cell be conveyed. This means that only the combination of activation of the T cell via a binding arm of the bsAk and the simultaneous transmission of costimulatory signals from the Fc receptor positive cell to the T cell leads to efficient T cell activation ( Fig. 1A). Tumor-specific T cells that have been insufficiently activated on the tumor cell and are therefore anergic can also be reactivated using the principle according to the invention described above ( FIG. 1B).

Überraschenderweise konnte somit erfindungsgemäß eine lang an­ dauernde Tumorimmunität durch die erfindungsgemäße Anwendung intakter T-Zell-redirigierender bsAk induziert werden. Diese beruht auf der physiologischen Aktivierung von an den Tumor redirigierten T-Zellen durch 1) Bindung des bsAk an die T-Zel­ le, beispielsweise über den Zellrezeptor-Komplex, und 2) gleichzeitiger Vermittlung von kostimulatorischen Signalen durch FcR+ Zellen, die an den Fc-Teil des bsAk binden.Surprisingly, according to the invention, this was a long time permanent tumor immunity through the application according to the invention intact T cell-redirecting bsAk can be induced. This is based on the physiological activation of the tumor redirected T cells by 1) binding of the bsAk to the T cell le, for example via the cell receptor complex, and 2) simultaneous transmission of costimulatory signals by FcR + cells that bind to the Fc part of the bsAk.

Eine wichtige Voraussetzung für eine wirksame Induktion einer Tumorimmunität ist demnach ein bsAk mit einem Fc-Teil, der in der Lage ist, FcR+ Zellen zu binden, die durch dieses Ereignis selbst aktiviert werden und dadurch kostimulatorische Signale an die T-Zelle vermitteln können.An important prerequisite for an effective induction of a Tumor immunity is therefore a bsAk with an Fc part that is in is able to bind FcR + cells by this event themselves activated and thereby costimulatory signals can mediate to the T cell.

Aufgrund dieses Mechanismus können ebenfalls in Anergie be­ findliche tumorspezifische T-Zellen (besitzen einen T-Zell-Rezeptor [TCR], welcher tumorspezifische Peptide in Verbindung mit MHC-Molekülen auf der Tumorzelle erkennt) an der Tumorzel­ le reaktiviert werden und dadurch eine Toleranz gegen den Tu­ mor aufgehoben werden.Because of this mechanism can also be in anergy sensitive tumor-specific T cells (have a T cell receptor [TCR], which tumor-specific peptides in association with MHC molecules on the tumor cell) on the tumor cell le reactivated and thereby a tolerance against the Tu be canceled.

Da die tumorspezifischen T-Zellen vollkommen andere Peptide/- Proteine über ihren TCR erkennen können als der bsAk mit sei­ nem anti-Tumor-Bindungsarm, können ebenfalls, nach Aktivierung derartiger T-Zellen durch den bsAk, Tumorzellen erkannt und zerstört werden, die von dem bsAk ursprünglich nicht erkannt werden konnten. D.h. der verwendete bsAk muß nicht alle Tumor­ zellen erkennen, um eine Tumorimmunität zu induzieren, die später alle Tumorzellen erreicht. Aus dieser Erkenntnis folgt weiterhin, daß relativ wenig intakter bsAk (100 µg-5 mg/Pa­ tient) ausreicht, um die erfindungsgemäße Tumorimmunität zu erlangen. Da die Induktion einer derartigen Tumorimmunität eine gewisse Zeit benötigt, sollte der Patient sich, bei Beginn der Therapie, in einer minimal residual disease (MRD)-Situa­ tion mit wenigen verbliebenen Tumorzellen befinden. Unter MRD versteht man den Zeitraum nach der Reduktion von größeren Tu­ mormengen mit geeigneten Methoden, wie z. B. der Entfernung des Primärtumors durch chirurgische Maßnahmen, in dem noch residu­ elle Tumorzellen existieren, die zwar unter Umständen nicht nachweisbar sind, aber nach einer gewissen Zeit zum Rezidiv führen.Since the tumor-specific T cells are completely different peptides / - Can recognize proteins via their TCR as the bsAk with it anti-tumor binding arm, can also, after activation such T cells recognized by the bsAk, tumor cells and destroyed by the bsAk originally not recognized could become. I.e. The BSA used does not have to be all tumors Detect cells to induce tumor immunity that later reached all tumor cells. From this knowledge follows furthermore that relatively little intact bsAk (100 µg-5 mg / Pa tient) is sufficient to the tumor immunity according to the invention  gain. Because the induction of such tumor immunity needed a certain amount of time, the patient should start at the therapy, in a minimal residual disease (MRD) situation tion with a few remaining tumor cells. Under MRD one understands the period after the reduction of larger Tu Mor quantity with suitable methods, such as. B. the removal of the Primary tumor through surgical measures, in which still residu All tumor cells exist, which may not are detectable, but after a certain period of relapse to lead.

Diese hat für die hier beschriebene Therapieform folgende Vor­ teile:
This has the following parts for the form of therapy described here:

  • - Die Anzahl der Tumorzellen und damit das mögliche Auftau­ chen von sogenannten "Escape-Mutanten", d. h. von Tumorva­ rianten, welche z. B. ein tumorspezifisches Peptid, das vom Immunsystem erkannt wird, nicht mehr präsentieren, ist stark reduziert.- The number of tumor cells and thus the possible thawing Chen from so-called "escape mutants", d. H. by Tumorva Rianten, which z. B. a tumor-specific peptide that is recognized by the immune system, no longer present, is greatly reduced.
  • - Selbst sehr schnell wachsende und aggressive Tumorvarian­ ten haben nach erfolgter Immunisierung eine geringere Chance, das Immunsystem quasi zu überrennen.- Even very fast growing and aggressive tumor variants Ten have a lower rate after immunization Chance to overrun the immune system.

Die Hauptunterschiede zu einer konventionellen Krebstherapie mit bsAk liegen
The main differences from conventional cancer therapy with bsAk are

  • 1. in der geringen Menge von verabreichtem Antikörper (5 µg-10 mg, bevorzugt 10 µg-100 µg, weiterhin 100 µg-5 mg/Patient); und1. in the small amount of antibody administered (5 µg-10 mg, preferably 10 µg-100 µg, furthermore 100 µg-5 mg / patient); and
  • 2. im Zeitpunkt der Gabe des bsAk, bezogen auf das Krank­ heitsstadium (bevorzugt in einer MRD-Situation). Es wird bei dieser Form der Therapie nicht abgewartet, bis Tumor­ zellen, z. B. nach Entfernung eines Primärtumors, wieder nachweisbar sind, sondern es wird prophylaktisch durch Gabe des intakten bsAk eine Art Impfung des Patienten gegen seine Krebszellen durchgeführt;2. at the time of the bsAk administration, based on the patient stage (preferred in an MRD situation). It will with this form of therapy not waited until tumor cells, e.g. B. after removal of a primary tumor, again  are detectable, but it is taken prophylactically Administration of the intact bsAk a kind of vaccination of the patient carried out against his cancer cells;
  • 3. dies ist möglich, da bei derart geringen Mengen von ver­ abreichten intakten bsAk keine schwerwiegenden Nebenwir­ kungen zu erwarten sind, die den enormen Vorteil - näm­ lich das Ausbleiben von nicht mehr behandelbaren Metasta­ sen - neutralisieren würden;3. This is possible because with such small amounts of ver did not deliver any serious side effects to intact BSA Expectations that have the enormous advantage - näm the absence of metasta that can no longer be treated sen - would neutralize;
  • 4. in der Induktion einer humoralen Immunantwort mit Komple­ ment-fixierenden Antikörpern (beim Menschen die Isoptypen IgG1, IgG2 und IgG3), die in der Lage sind, Tumorzellen zu zerstören.4. induction of a humoral immune response with Komple ment-fixing antibodies (in humans the isoptypes IgG1, IgG2 and IgG3), which are able to tumor cells to destroy.

Bei den erfindungsgemäß einsetzbaren Antikörpern handelt es sich vorzugsweise um monoklonale, chimäre, rekombinante, synthetische, halbsynthetische oder chemisch modifizierte intakte Antikörper mit beispielsweise Fv-, Fab-, scFv- oder F(ab)2-Fragmenten.The antibodies which can be used according to the invention are preferably monoclonal, chimeric, recombinant, synthetic, semisynthetic or chemically modified intact antibodies with, for example, Fv, Fab, scFv or F (ab) 2 fragments.

Sind die erfindungsgemäß einsetzbaren Antikörper für eine in­ vivo-Therapie vorgesehen, werden bevorzugt Antikörper oder Derivate oder Fragmente vom Menschen verwendet, oder solche, die derart verändert sind, daß sie sich für die Anwendung beim Menschen eignen (sogenannte "humanized antibodies") (siehe z. B. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175 (1992), 217; Mocikat et al., Transplantation 57 (1994), 405).Are the antibodies which can be used according to the invention for an in In vivo therapy provided, antibodies or are preferred Derivatives or fragments used by humans, or those which are changed so that they are suitable for use in People are suitable (so-called "humanized antibodies") (see e.g. B. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217 (1992); Mocikat et al., Transplantation 57 (1994), 405).

Die Herstellung der verschiedenen oben genannten Antikörperty­ pen und -fragmente ist dem Fachmann geläufig. Die Herstellung monoklonaler Antikörper, die ihren Ursprung vorzugsweise in Säugetieren, z. B. Mensch, Ratte, Maus, Kaninchen oder Ziege, haben, kann mittels herkömmlicher Methoden erfolgen, wie sie z. B. in Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495), in Har­ low und Lane (Antibodies, A Laboratory Manual (1988), Cold Spring Harbor) oder in Galfre (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3) beschrieben sind.The production of the various antibodies mentioned above The skilled worker is familiar with pen and fragments. The production monoclonal antibodies, which originate preferably in Mammals, e.g. B. human, rat, mouse, rabbit or goat, have, can be done using conventional methods such as e.g. B. in Köhler and Milstein (Nature 256 (1975), 495), in Har low and Lane (Antibodies, A Laboratory Manual (1988), Cold  Spring Harbor) or in Galfre (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3) are described.

Ferner ist es möglich, die beschriebenen Antikörper mittels rekombinanter DNA-Technologie nach dem Fachmann geläufigen Techniken herzustellen (siehe Kurucz et al., J. Immunol. 154 (1995), 4576; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA 90 (1993), 6444).It is also possible to use the antibodies described recombinant DNA technology familiar to those skilled in the art Techniques (see Kurucz et al., J. Immunol. 154 (1995), 4576; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA 90 (1993), 6444).

Die Herstellung von Antikörpern mit zwei verschiedenen Spezi­ fitäten, den sogenannten bispezifischen Antikörpern, ist zum einen durch Anwendung rekombinanter DNA-Technologie möglich, aber auch durch die sogenannte Hybrid-Hybridoma-Fusionstechnik (siehe z. B. Milstein et al., Nature 305 (1983), 537). Hierbei werden Hybridomazellinien, die Antikörper mit jeweils einer der gewünschten Spezifitäten produzieren, fusioniert und re­ kombinante Zellinien identifiziert und isoliert, die Antikör­ per mit beiden Spezifitäten produzieren.The production of antibodies with two different types the so-called bispecific antibodies possible by using recombinant DNA technology, but also through the so-called hybrid hybridoma fusion technology (See, e.g., Milstein et al., Nature 305 (1983), 537). Here are hybridoma cell lines, the antibodies with one each produce the desired specificities, merged and re Combined cell lines identified and isolated the antibody per produce with both specificities.

Das der Erfindung zugrunde liegende Problem kann sowohl durch bispezifische als auch trispezifische Antikörper gelöst wer­ den, sofern sie die im Anspruch 1 gekennzeichneten Eigenschaf­ ten und Wirkungen aufweisen. Nachfolgend wird die Herstellung von Antikörpern mit Zwei- und Dreispezifitäten näher beschrie­ ben. Die Bereitstellung derartiger bispezifischer und trispe­ zifischer Antikörper gehört zum Stand der Technik, und auf die derartige Herstellungstechniken beschreibende Literatur wird hier voll inhaltlich Bezug genommen.The problem underlying the invention can be solved both by bispecific as well as trispecific antibodies the, provided that they have the property characterized in claim 1 and have effects. Below is the manufacture of antibodies with two and three specificities ben. The provision of such bispecific and trispe zifischer antibody belongs to the state of the art, and on the literature describing such manufacturing techniques fully referenced here.

Die Herstellung von Antikörpern mit drei Spezifitäten, soge­ nannten trispezifischen Antikörpern, durch die das der Erfin­ dung zugrundeliegende Problem ebenfalls lösbar ist, kann bei­ spielsweise derart erfolgen, daß an eine der schweren Ig-Ket­ ten eines bispezifischen Antikörpers eine dritte Antigenbin­ dungsstelle mit einer weiteren Spezifität, z. B. in Form eines "single chain variable fragments" (scFv), angekoppelt wird. Das scFv kann beispielsweise über einen
The production of antibodies with three specificities, so-called trispecific antibodies, by means of which the problem on which the invention is based can also be solved, can be carried out, for example, in such a way that a third antigen binding site with another is attached to one of the heavy Ig chains of a bispecific antibody Specificity, e.g. B. in the form of a "single chain variable fragment" (scFv). The scFv can, for example, use a

-S-S(G4S)nD-I-Linker
-SS (G 4 S) n DI linker

an eine der schweren Ketten gebunden sein (S = Serin, G = Gly­ cin, D = Aspartat, I = Isoleucin).be bound to one of the heavy chains (S = serine, G = Gly cin, D = aspartate, I = isoleucine).

Analog dazu können trispezifische F(ab)2-Konstrukte hergestellt werden, indem die CH2-CH3-Regionen der schweren Kette einer Spezifität eines bispezifischen Antikörpers ersetzt werden durch ein scFv mit einer dritten Spezifität, während die CH2-CH3-Regionen der schweren Kette der anderen Spezifität bei­ spielsweise durch Einbau eines Stopcodons (am Ende der "Hin­ ge"-Region) in das codierende Gen, z. B. mittels homologer Re­ kombination, entfernt werden (siehe Abb. 4).Analogously, trispecific F (ab) 2 constructs can be made by replacing the CH2-CH3 regions of the heavy chain of a specificity of a bispecific antibody with an scFv with a third specificity, while the CH2-CH3 regions of the heavy chain of the other specificity in example by incorporating a stop codon (at the end of the "Hin ge" region) in the coding gene, for. B. by means of homologous recombination, be removed (see Fig. 4).

Möglich ist auch die Herstellung trispezifischer scFv-Kon­ strukte. Hierbei werden drei VH-VL-Regionen, die drei ver­ schiedene Spezifitäten repräsentieren, hintereinander in Reihe angeordnet (Abb. 5).The production of trispecific scFv constructs is also possible. Here, three VH-VL regions, which represent three different specificities, are arranged in a row one after the other ( Fig. 5).

Erfindungsgemäß werden z. B. intakte bispezifische Antikörper verwendet. Intakte bispezifische Antikörper sind aus zwei An­ tikörper-Halbmolekülen (je eine H- und L-Immunglobulinkette), die jeweils eine Spezifität repräsentieren, zusammengesetzt, und besitzen darüber hinaus, wie normale Antikörper auch, ei­ nen Fc-Teil mit den bekannten Effektorfunktionen. Sie werden bevorzugt durch die Quadrom-Technologie hergestellt. Dieses Herstellungsverfahren ist beispielhaft in der DE-A-44 19 399 beschrieben. Auf diese Druckschrift, auch bzgl. einer Defini­ tion der bispezifischen Antikörper, wird zur vollständigen Of­ fenbarung vollinhaltlich Bezug genommen. Selbstverständlich sind auch andere Herstellungsverfahren einsetzbar, solange sie zu den erfindungsgemäß notwendigen intakten bispezifischen Antikörpern der obigen Definition führen. According to the z. B. intact bispecific antibodies used. Intact bispecific antibodies are of two types antibody half-molecules (one H and one L immunoglobulin chain), each representing specificity, put together, and, like normal antibodies, also have egg Nc part with the known effector functions. you will be preferably manufactured by Quadrom technology. This Manufacturing process is exemplified in DE-A-44 19 399 described. On this document, also regarding a definition tion of the bispecific antibodies, is the complete Of full reference. Of course other manufacturing processes can be used as long as they to the intact bispecific intact necessary according to the invention Antibodies of the above definition lead.  

Beispielsweise können in einem neu entwickelten Herstellungs­ verfahren (8) intakte bispezifische Antikörper in ausreichen­ der Menge produziert werden. Die Kombination von 2 bispezifi­ schen Antikörpern gegen 2 unterschiedliche tumorassoziierte Antigene (z. B. c-erb-B2, ep-cam, beispielsweise GA-733-2 = C215) auf den Mammakarzinomzellen minimiert die Gefahr, daß Tumorzellen, die nur ein Antigen exprimieren, unerkannt blei­ ben.For example, in a newly developed manufacturing procedure (8) intact bispecific antibodies are sufficient of the quantity to be produced. The combination of 2 bispecific antibodies against 2 different tumor-associated Antigens (e.g. c-erb-B2, ep-cam, e.g. GA-733-2 = C215) on the breast cancer cells minimizes the risk that Tumor cells that only express an antigen remain undetected ben.

Bispezifische Antikörper können mit einem Bindungsarm an den T-Zellrezeptor-Komplex der T-Zelle, mit dem zweiten Bindungs­ arm an tumorassoziierte Antigene auf der Tumorzelle binden. Sie aktivieren dabei T-Zellen, die durch Freisetzung von Cyto­ kinen oder Apoptose-vermittelnde Mechanismen die Tumorzellen zerstören. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, daß T-Zel­ len im Rahmen der Aktivierung mit bispezifischen Antikörpern tumorspezifische Antigene über ihren Rezeptor erkennen und dadurch eine dauerhafte Immunisierung eingeleitet wird (Abb. 1B). Von besonderer Bedeutung ist dabei der intakte Fc-Teil des bispezifischen Antikörpers, der die Bindung an akzes­ sorische Zellen wie z. B. Monozyten/Makrophagen/Dendriten ver­ mittelt und diese veranlaßt, selbst zytotoxisch zu werden und/oder gleichzeitig wichtige kostimulatorische Signale an die T-Zelle weiterzugeben (Abb. 1).Bispecific antibodies can bind with one binding arm to the T cell receptor complex of the T cell, with the second binding arm to tumor-associated antigens on the tumor cell. They activate T cells that destroy the tumor cells by releasing cytokines or apoptosis-mediating mechanisms. In addition, there is the possibility that T-cells recognize tumor-specific antigens via their receptor as part of the activation with bispecific antibodies, thereby inducing permanent immunization ( Fig. 1B). Of particular importance is the intact Fc part of the bispecific antibody, which binds to accessory soric cells such. B. monocytes / macrophages / dendrites mediated and this causes them to become cytotoxic and / or at the same time pass on important costimulatory signals to the T cell ( Fig. 1).

Auf diese Weise kann auch eine T-Zellantwort gegen bislang unbekannte, tumorspezifische Peptide induziert werden.In this way, a T cell response can also be counteracted so far unknown, tumor-specific peptides can be induced.

Durch Redirektion von u. U. anergisierten, tumorspezifischen T-Zellen an Tumorzellen mittels bsAk bei gleichzeitiger Kostimu­ lation derartiger T-Zellen durch akzessorische Zellen, welche an den Fc-Teil des bsAk binden, wird die Anergie der CTLs auf­ gehoben werden. D.h. eine im Patienten gegen den Tumor exi­ stierende T-Zell-Toleranz wird erfindungsgemäß mittels intak­ ter bsAk gebrochen und damit eine dauerhafte Tumorimmunität induziert.By redirecting u. U. anergized, tumor-specific T cells on tumor cells by means of bsAk with simultaneous costs lation of such T cells by accessory cells, which bind to the Fc part of the bsAk, the anergy of the CTLs will increase be lifted. I.e. one in the patient against the tumor exi According to the invention, constant T cell tolerance is determined by means of intact ter bsAk broken and thus permanent tumor immunity  induced.

Hierfür gibt es erste in vivo-Daten aus Mausversuchen, die auf eine derartige dauerhafte Tumorimmunität nach Behandlung mit einem syngenen Tumor und intakten bsAk hinweisen. In diesen Versuchen überlebten insgesamt 14 von 14 Tieren, die nach ei­ ner ersten Tumorinjektion erfolgreich mit bsAk behandelt wer­ den konnten, eine weitere Tumorinjektion 144 Tage nach der ersten - ohne eine erneute Gabe von bsAk (siehe Beispiel 1).For this, there are first in vivo data from mouse experiments based on such permanent tumor immunity after treatment with a syngeneic tumor and intact BSA. In these Experiments survived a total of 14 out of 14 animals, which according to egg He successfully treated the first tumor injection with BSAk could, another tumor injection 144 days after the first - without giving bsAk again (see example 1).

Bei der erfindungsgemäßen Immunisierungsstrategie werden bei­ spielsweise intakte bsAk verwendet, die in der Lage sind, FcγRI+ Zellen über ihren Fc-Teil zu binden. Außerdem besitzen die erfindungsgemäß verwendeten bsAk als zweite Spezifität beispielsweise anti-CD3 neben der tumorzellbindenden Spezifi­ tät, d. h. sie sind befähigt, durch den zweiten Bindungsarm an T-Zellen zu binden. Mit den erfindungsgemäß verwendeten bsAk werden also T-Zellen aktiviert und gegen die Tumorzellen redi­ rigiert.In the immunization strategy according to the invention for example intact bsAk that are able to Bind FcγRI + cells via their Fc part. Also own the bsAk used according to the invention as a second specificity for example anti-CD3 in addition to the tumor cell-binding specific act, d. H. they are able to attach through the second binding arm To bind T cells. With the bsAk used according to the invention T cells are activated and redi against the tumor cells rigged.

Es wurde auch versucht, durch Behandlung mit bispezifischen F(ab')2-Fragmenten mit den Spezifitäten anti-c-erb-B2 × antiCD64 eine Tumorimmunität zu erreichen. Der Hauptnachteil von bsF(ab')2-Fragmenten liegt darin, daß aufgrund der verwen­ deten Spezifitäten lediglich FcγRI+ Zellen an den Tumor redi­ rigiert werden. T-Zellen werden durch diesen bispezifischen Antikörper nicht an den Tumor redirigiert. Die bsF(ab')2-Frag­ mente besitzen zwar auch das Potential zur direkten Tumorzer­ störung, sind aber nicht in der Lage, selber eine Tumorimmuni­ tät zu etablieren. Dazu ist nur die T-Zelle mit ihrem spezifi­ schen T-Zellrezeptor befähigt. Die FcγRI+ Zellen können zwar indirekt durch Präsentation von tumorspezifischen Peptiden (über MHC I bzw. MHCII) nach z. B. Phagozytose von Tumorzell­ bestandteilen tumorspezifische T-Zellen aktivieren, die Effi­ zienz der Induktion einer Tumorimmunität ist hier aber nicht ganz so hoch (nur bei 30% der Patienten).It has also been tried through treatment with bispecific F (ab ') 2 fragments with specificities anti-c-erb-B2 × antiCD64 to achieve tumor immunity. The main disadvantage of bsF (ab ') 2 fragments is that due to the use specificities only FcγRI + cells redi to the tumor be rigged. T cells are bispecific by this Antibodies were not redirected to the tumor. The bsF (ab ') 2 question elements also have the potential for direct tumor destruction disorder, but are unable to immunize the tumor themselves to establish activity. This is only the T cell with its specifi enabled T cell receptor. The FcγRI + cells can indirectly by presenting tumor-specific peptides (via MHC I or MHCII) after z. B. Tumor cell phagocytosis components activate tumor-specific T cells, the Effi However, the induction of tumor immunity is not ciency here  quite as high (only in 30% of patients).

Weitere Vorteile von intakten bsAk mit der Fähigkeit zur Redi­ rektion von T-Zellen gegenüber den o.g. bsF(ab')2 Fragmenten sind im einzelnen:
Further advantages of intact bsAk with the ability to redirect T cells compared to the above-mentioned bsF (ab ') 2 fragments are:

  • 1. An intakte bsAk können Fc-Rezeptor positive Zellen binden und einerseits über ADCC (antibody-dependent cell-media­ ted cytotoxicity) direkt zur Tumorzerstörung beitragen sowie andererseits wie oben näher ausgeführt zur T-Zell­ aktivierung.1. Fc receptor can bind positive cells to intact bsAk and on the one hand via ADCC (antibody-dependent cell-media ted cytotoxicity) contribute directly to tumor destruction and on the other hand, as detailed above for the T cell activation.
  • 2. bsAk mit Fc-Anteil besitzen eine wesentlich längere Zir­ kulationszeit als z. B. bsF(ab')2 oder bs(scFv) Antikör­ perfragmente, so daß wesentlich geringere Dosen intakter Ak-Moleküle für eine vergleichbare anti-Tumorwirkung not­ wendig sind.2. bsAk with Fc content have a much longer zir calculation time as z. B. bsF (ab ') 2 or bs (scFv) antibody perfragmente, so that much lower doses intact Ak molecules for a comparable anti-tumor effect not are agile.
  • 3. Durch die erfindungsgemäße Verwendung intakter bispezi­ fischer Antikörper sollen insbesondere residuelle Tumor­ zellen/Mikrometastasen zerstört werden. Im Gegensatz zur Behandlung solider Tumoren oder größerer Metastasen, bei denen die oben erwähnten Antikörperfragmente Vorteile be­ sitzen könnten, da sie aufgrund ihrer geringeren Größe eine bessere Tumorpenetration ermöglichen.3. Through the use of intact bispezi according to the invention Fischer antibodies are said to be, in particular, residual tumors cells / micrometastases are destroyed. In contrast to Treatment of solid tumors or major metastases, in which the above-mentioned antibody fragments have advantages could sit because of their smaller size enable better tumor penetration.
  • 4. Durch intakte T-Zell-redirigierende bsAk werden auch anergisierte tumorspezifische T-Zellen an die Tumorzelle herangeführt, die erfindungsgemäß direkt am Tumor reakti­ viert werden können. Dies kann durch ein bsF(ab')2-Frag­ ment mit den Spezifitäten anti-CD64Xanti-tumorassoziier­ tes Antigen nicht erreicht werden.4. By intact T cell redirecting bsAk will also anergized tumor-specific T cells to the tumor cell introduced that react according to the invention directly on the tumor can be fourth. This can be done with a bsF (ab ') 2 question anti-CD64X anti-tumor association antigen cannot be reached.
  • 5. Ein bsF(ab')2-Fragment mit den Spezifitäten anti-CD64Xan­ ti-tumorassoziiertes Antigen kann lediglich eine Tumorim­ munität in 30% der Patienten erzielen, während erfin­ dungsgemäß in Mausversuchen mit T-Zell-redirigierenden intakten bsAk ein Schutz in 100% der Tiere erzielt werden konnte.5. A bsF (ab ') 2 fragment with specificities anti-CD64Xan ti-tumor-associated antigen can only be a tumor  achieve immunity in 30% of patients while inventing accordingly in mouse experiments with T cell redirecting Intact BSA protection can be achieved in 100% of the animals could.

Die Bindung des bsAk an Fcγ-RI besitzt zwei wesentliche Vor­ teile im Hinblick auf eine optimale anti-Tumorwirksamkeit:
Fcγ-RI positive Zellen besitzen die Fähigkeit mittels ADCC Tumorzellen zu eliminieren (11) und können insofern synergi­ stisch zur anti-Tumorwirkung der durch den bsAk an die Tumor­ zelle herangeführten cytotoxischen T-Zellen beitragen (13).The binding of the bsAk to Fcγ-RI has two major advantages with regard to optimal anti-tumor activity:
Fcγ-RI positive cells have the ability to eliminate tumor cells using ADCC (11) and can therefore synergistically contribute to the anti-tumor effect of the cytotoxic T cells brought to the tumor cell by the bsAk (13).

  • 1. Fcγ-RI positive Zellen (wie z. B. Monozyten/Makrophagen/- Dendriten) sind in der Lage, wichtige kostimulatorische Signale, ähnlich wie bei der Antigen-Präsentation, der T-Zelle zu liefern und damit eine Anergisierung der T-Zelle zu verhindern. Wie in Abb. 1 gezeigt können weiter­ hin, als erwünschtes Nebenprodukt, aufgrund der durch in­ takten bsAk vermittelten Interaktion von T-Zelle mit ak­ zessorischer Zelle und Tumorzelle sogar T-Zellen, deren T-Zellrezeptor tumorspezifische Peptide (über MHC Antige­ ne auf der Tumorzelle präsentiert) erkennt, stimuliert werden. Die für eine korrekte Aktivierung der T-Zelle notwendigen Kostimuli würden in dieser Konstellation von der akzessorischen Zelle (z. B. Monocyt) geliefert werden. Insofern sollte der erfindungsgemäßen Lösung neben der direkten T-Zellrezeptor-unabhängigien durch bsAk vermit­ telten Tumorzerstörung (Abb. 1A), ebenfalls tumorspezifi­ sche T-Zellen aktivieren und generieren (Abb. 1B), die nach Abbau der bsAk weiterhin im Patienten patrouillie­ ren. D.h. mittels intakter bsAk kann ähnlich wie bei gen­ therapeutischen Ansätzen (z. B. durch Einbau von kostimu­ latorischen Antigenen wie B-7 in die Tumorzelle) die Tu­ mortoleranz im Patienten durchbrochen werden.1. Fcγ-RI positive cells (such as, for example, monocytes / macrophages / dendrites) are able to deliver important costimulatory signals, similar to the antigen presentation, to the T cell and thus anergization of the T cell. To prevent cell. As shown in Fig. 1, even as a desired by-product, due to the intact bsAk mediated interaction of T cell with accessory cell and tumor cell, even T cells whose T cell receptor are tumor-specific peptides (via MHC antigen on the Tumor cell presented) recognizes, stimulates. In this constellation, the costimuli necessary for a correct activation of the T cell would be supplied by the accessory cell (e.g. monocyte). In this respect, in addition to the direct T cell receptor independencies mediated by bsAk-mediated tumor destruction ( Fig. 1A), the solution according to the invention should also activate and generate tumor-specific T cells ( Fig. 1B) that continue to patrol the patient after the bsAk has been broken down. In other words, using intact BSAc, similar to gene therapeutic approaches (e.g. by incorporating costimulatory antigens such as B-7 into the tumor cell), the tumor tolerance in the patient can be broken.

Günstig in diesem Zusammenhang ist weiterhin, daß die Expres­ sion von Fcγ-RI nach G-CSF-Behandlung auf den entsprechenden Zellen hochreguliert wird.In this context it is also favorable that the express sion of Fcγ-RI after G-CSF treatment on the corresponding Cells is upregulated.

Beispielexample

Zur Prüfung der Frage, ob bispezifische Antikörper eine Tumor­ immunität induzieren können, wurden C57BL/6 Mäusen zunächst 5 × 103 syngene B16 Tumorzellen injiziert. Zwei Tage später wurde eine Gruppe von Mäusen (Anzahl 18) mit einem mittels Quadrom-Technologie (8) hergestellten intakten bsAk behandelt, welcher eine Zielstruktur epCAM (C215 = tumorassoziiertes Antigen) auf der Tumorzelle sowie CD3 auf T-Zellen erkennt. Dieser bsAK hat die Subklassenkombination IgG2a/Ratte IgG2b. Eine zweite Grup­ pe (Anzahl 6) erhielt lediglich eine äquimolare Menge von Fab-Fragmenten der beiden im bsAk enthaltenen Spezifitäten. Wäh­ rend alle Tiere der Fab-Kontrollgruppe innerhalb von 56 Tagen verstarben oder eingeschläfert werden mußten, überlebten 14 der 18 mit bsAk behandelten Tiere. 144 Tage nach der ersten Injektion von Tumorzellen wurde den überlebenden 14 Tieren erneut eine Dosis von 750 B16 Tumorzellen, diesmal ohne Gabe von bsAk, i.p. injiziert. Zur Kontrolle wurde 5 unbehandelten Tieren dieselbe Tumorzellzahl verabreicht. Während das letzte Tier der unbehandelten Kontrollgruppe 66 Tage nach Tumorinjek­ tion eingeschläfert werden mußte, überlebten alle mit bsAk behandelten Tiere (Überwachungszeitraum: 120 Tage nach zweiter Tumorzell-Injektion). Siehe auch Abb. 2A und B: Überle­ benskurven der beiden aufeinanderfolgenden, oben be­ schriebenen, Experimente.To test the question of whether bispecific antibodies can induce tumor immunity, C57BL / 6 mice were first injected with 5 × 10 3 syngeneic B16 tumor cells. Two days later, a group of mice (number 18) was treated with an intact bsAk produced using Quadrom technology (8), which recognizes a target structure epCAM (C215 = tumor-associated antigen) on the tumor cell and CD3 on T cells. This bsAK has the subclass combination IgG2a / rat IgG2b. A second group (number 6) received only an equimolar amount of Fab fragments of the two specificities contained in the bsAk. While all animals in the Fab control group died or had to be put to sleep within 56 days, 14 of the 18 animals treated with bsAk survived. 144 days after the first injection of tumor cells, the surviving 14 animals were again injected with a dose of 750 B16 tumor cells, this time without administration of bsAk, ip. As a control, 5 untreated animals were given the same number of tumor cells. While the last animal in the untreated control group had to be put to sleep 66 days after tumor injection, all animals treated with bsAk survived (monitoring period: 120 days after the second tumor cell injection). See also Fig. 2A and B: survival curves of the two successive experiments described above.

Diese Versuche zeigen, daß es möglich ist, mit den erfindungs­ gemäß bereitgestellten bispezifischen Antikörpern, aber auch mit den trispezifischen Antikörpern, eine lang andauerende Tumorimmunität zu induzieren. Es ist davon auszugehen, daß diese Ergebnisse auch auf den Menschen zu übertragen sind, wobei hier von einer Tumor-Langzeitimmunität zumindest über mehrere Jahre hinweg auszugehen ist.These experiments show that it is possible with the Invention according to provided bispecific antibodies, but also with the trispecific antibodies, a long lasting To induce tumor immunity. It is assumed that  these results can also be transferred to humans, whereby here from at least a long-term tumor immunity to go out for several years.

Nachweis der Induktion einer humoralen Immunantwort mittels intakter bsAk und deren prognostische Bedeutung für das Überleben von Patienten oder TierenEvidence of the induction of a humoral immune response by means of intact bsAk and its prognostic significance for the survival of patients or animals Beschreibungdescription

Neben der zellulären Immunität, die hauptsächlich von den T-Zellen getragen wird, spielt die humorale Immunität bei der Tumor-Erkennung und -Zerstörung eine ebenso wichtige Rolle. Dies belegen eine Reihe von Untersuchungen, beispielsweise eine Arbeit von Rodolfo et al. (J. Immunol. 157, 5536, 1996). Rodolfo et al. konnten zeigen, daß (1) durch die Gabe von IL-12 bzw. IL-2 transduzierter Tumorzell-Vakzine tumorspezifische T-Zellen induziert werden; (2) eine effektive humorale Immun­ antwort mit Komplement-fixierenden Antikörpern nur mit den IL-12 transduzierten Tumorzellen erzeugt werden konnte. Interes­ santerweise überlebten in diesen Versuchen nur Tiere, die Kom­ plement-fixierende Antikörper mit anti-Tumorspezifität entwic­ kelt hatten.In addition to cellular immunity, which is mainly determined by the T cells are carried, the humoral immunity plays at Tumor detection and destruction play an equally important role. This is proven by a number of studies, for example a work by Rodolfo et al. (J. Immunol. 157, 5536, 1996). Rodolfo et al. were able to show that (1) by the administration of IL-12 or IL-2 transduced tumor cell vaccine tumor-specific T cells are induced; (2) an effective humoral immune answer with complement-fixing antibodies only with the IL-12 transduced tumor cells could be generated. Interes only animals surviving in these experiments, the com plement-fixing antibodies with anti-tumor specificity develop had celt.

In erfindungsgemäß durchgeführten in vitro-Versuchen konnte gezeigt werden, daß mittels der hier beschriebenen intakten bispezifischen Antikörper aufgrund der Bindung und Aktivierung von Fcγ-Rezeptor positiven Zellen (siehe Abb. 1) von diesen Cytokine, beispielsweise IL-12, gebildet und sezerniert werden (siehe Anhang Tabelle 1). Insofern konnte mit den hier be­ schriebenen intakten bsAk ohne Gentransfer- die Produktion von Cytokinen induziert werden, die ansonsten nur mit Gentransfer im Rahmen von gentherapeutischen Ansätzen zur Expression ge­ bracht werden können. Die Beobachtung ist deshalb so wichtig, weil IL-12 offensichtlich eine wichtige Rolle bei der Induk­ tion einer anti-Tumor-Immunität spielt.In vitro experiments carried out according to the invention have shown that by means of the intact bispecific antibodies described here, due to the binding and activation of Fcγ receptor positive cells (see FIG. 1) are formed and secreted by these cytokines, for example IL-12 ( see Appendix Table 1). In this respect, the intact bsAk described here without gene transfer could induce the production of cytokines, which can otherwise only be brought to expression with gene transfer in the context of gene therapy approaches. The observation is so important because IL-12 obviously plays an important role in inducing anti-tumor immunity.

In den im obigen Bsp. 1 gezeigten Tierversuchen konnten in den überlebenden Mäusen, nach bsAk-Behandlung, am Tag 143 nach Tu­ mor-Gabe im Schwanzblut tumorreaktive Komplement-fixierende Antikörper nachgewiesen werden. Dies zeigt, daß für das Über­ leben der Tiere derartige Antikörper zumindest mit verantwort­ lich waren, da in verstorbenen Tieren keine oder nur geringe Mengen dieser Antikörper nachgewiesen werden konnten (Tab. 2).In the animal experiments shown in Example 1 above, the surviving mice, after bsAk treatment, on day 143 after Tu Mor administration in the tail blood of tumor-reactive complement-fixing Antibodies are detected. This shows that for the over the animals live such antibodies at least with responsibility were, since in deceased animals little or no Amounts of these antibodies could be detected (Tab. 2).

Die vorstehend beschriebenen Versuche wurden anhand bispezifi­ scher Antikörper durchgeführt. Anstelle der bispezifischen können aber auch die in der Anmeldung beschriebenen trispezi­ fischen Antikörper mit den gleichen Ergebnissen eingesetzt werden.The experiments described above were based on bispecific shear antibodies performed. Instead of the bispecific but can also the trispezi described in the application fish antibodies used with the same results will.

Wie beschrieben werden durch die Behandlung mit den erfin­ dungsgemäß bereitgestellten bispezifischen und trispezifischen Antikörpern tumorreaktive Komplement-bindende Antikörper gene­ riert, die für die Induktion einer humoralen Immunantwort stehen. Dies und die Anregung der Produktion von Cytokinen wie IL-12, dürfte für die erfindungsgemäße Induktion einer Langzeit-Tumorimmunität zumindest mit verantwortlich sein. Es ist deshalb auch möglich, die Menge an Komplement-bindenden tumorreaktiven Antikörpern, die durch Behandlung mit bispezifischen oder trispezifischen Antikörpern gemäß der Erfindung induziert wurden, zur Beurteilung des Krankheitsverlaufs (Prognostik) eines Tumorpatienten zu verwenden. Je höher die Menge an tumorreaktiven Komplement­ fixierenden Antikörpern ist, desto günstiger die Prognostik des Tumorpatienten.As described by treatment with the inventions provided according to bispecific and trispecific Antibodies tumor-reactive complement-binding antibodies genes for induction of a humoral immune response stand. This and the stimulation of the production of cytokines like IL-12, should be one for the induction according to the invention Long-term tumor immunity may at least be responsible. It is therefore also possible to set the amount of complement-binding tumor reactive antibodies by treatment with bispecific or trispecific antibodies according to the Invention were induced to evaluate the Course of the disease (prognosis) of a tumor patient use. The higher the amount of tumor reactive complement fixing antibodies, the cheaper the prognosis of the tumor patient.

Die erfindungsgemäß offenbarte Verwendung z. B. intakter bispe­ zifischer Antikörper erfolgt nach der Behandlung eines Primär­ tumors, bevorzugt bei Patienten in einer minimal residual disease (MRD)-Situation. Nur bei Patienten mit wenigen ver­ bliebenen Tumorzellen, bei denen allerdings die Gefahr eines Rezidivs hoch ist, wird die erfindungsgemäße Verwendung intak­ ter bispezifischer Antikörper Bedeutung erlangen. The use disclosed according to the invention, for. B. intact bispe specific antibody occurs after the treatment of a primary  tumors, preferred in patients in a minimal residual disease (MRD) situation. Only in patients with few ver remained tumor cells, but with the risk of Recurrence is high, the use according to the invention is intact ter bispecific antibody gain importance.  

Anstieg von Oberflächenantigenen auf CD14+Zellen (Makrophagen, Monozyten) bzw. Sekretion von Cytokinen nach in vitro Inkubation von PBMC mit intakten bsAk und Tumorzellen nach 20hIncrease in surface antigens on CD14 + cells (macrophages, monocytes) or secretion of cytokines after in vitro incubation of PBMC with intact bsAk and tumor cells after 20 hours

Anstieg von Oberflächenantigenen auf CD14+Zellen (Makrophagen, Monozyten) bzw. Sekretion von Cytokinen nach in vitro Inkubation von PBMC mit intakten bsAk und Tumorzellen nach 20hIncrease in surface antigens on CD14 + cells (macrophages, monocytes) or secretion of cytokines after in vitro incubation of PBMC with intact bsAk and tumor cells after 20 hours

B16-Melanom Rechallenge Versuch (siehe Bsp. 1). Testung der Seren (aus Schwanzblut) von überlebenden Tieren (1-13) sowie am Tumor verstorbener Tiere (14-17) auf tumorreaktive AntikörperB16 melanoma rechallenge experiment (see Example 1). Testing the sera (from tail blood) of surviving animals (1-13) and animals who died from the tumor (14-17) for tumor-reactive antibodies

B16-Melanom Rechallenge Versuch (siehe Bsp. 1). Testung der Seren (aus Schwanzblut) von überlebenden Tieren (1-13) sowie am Tumor verstorbener Tiere (14-17) auf tumorreaktive AntikörperB16 melanoma rechallenge experiment (see Example 1). Testing the sera (from tail blood) of surviving animals (1-13) and animals who died from the tumor (14-17) for tumor-reactive antibodies

Literaturliterature

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  • 2. Fields et al. Cytokeratin 19 in bone marrow detected by PCR predicts relapses in patients with chemoresponsive metastatic breast cancer undergoing high dose chemothera­ py and autologous stem cell rescue. Experimental Hemato­ logy 1995, 23 (8), 785 (abstract #158)2. Fields et al. Cytokeratin 19 in bone marrow detected by PCR predicts relapses in patients with chemoresponsive metastatic breast cancer undergoing high dose chemothera py and autologous stem cell rescue. Experimental hemato logy 1995, 23 (8), 785 (abstract # 158)
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Claims (15)

1. Verwendung eines intakten bispezifischen oder trispezifi­ schen Antikörpers mit den nachfolgenden Eigenschaften und Wirkungen:
  • (a) bindet an eine T-Zelle und vermittelt ihr ein 1. Ak­ tivierungssignal;
  • (b) bindet an tumorassoziierte Antigene auf einer Tumor­ zelle;
  • (c) bindet durch seinen Fc-Teil (bei bispezifischen Anti­ körpern) oder eine dritte Spezifität (bei trispezifi­ schen Antikörpern) an den Fc-Rezeptor von Fc-Rezeptor positiven Zellen;
  • (d) aktiviert die Fc-Rezeptor positive Zelle durch seine Bindung an die Fc-Rezeptor positive Zelle, wodurch die Expression von Cytokinen und/oder von kostimula­ torischen Antigenen initiiert oder erhöht wird;
  • (e) die kostimulatorischen Antigene übertragen an die T-Zelle zumindest ein 2. Aktivierungssignal, das für eine physiologische Aktivierung der T-Zelle benötigt wird, wobei sich diese Aktivierung in der Hochregula­ tion von Aktivierungsmarkern, der Zerstörung der Tu­ morzelle und/oder in einer Proliferation der T-Zelle zeigt;
zur Induktion einer Tumorimmunität bei Mensch und Tier.1. Use of an intact bispecific or trispecific antibody with the following properties and effects:
  • (a) binds to a T cell and conveys it a 1st activation signal;
  • (b) binds to tumor-associated antigens on a tumor cell;
  • (c) binds through its Fc part (for bispecific antibodies) or a third specificity (for trispecific antibodies) to the Fc receptor of Fc receptor positive cells;
  • (d) activates the Fc receptor positive cell by binding to the Fc receptor positive cell, thereby initiating or increasing the expression of cytokines and / or costimulatory antigens;
  • (e) the costimulatory antigens transmit to the T cell at least a second activation signal which is required for a physiological activation of the T cell, this activation being found in the upregulation of activation markers, the destruction of the tumor cell and / or in shows proliferation of the T cell;
for induction of tumor immunity in humans and animals. 2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper weiterhin zur Reaktivierung von in Anergie befindlichen, tumorspezifischen T-Zellen befähigt ist.2. Use according to claim 1, characterized, that the antibody continues to reactivate in Anergic tumor-specific T cells is. 3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper weiterhin befähigt ist, die tumorspezi­ fischen T-Zellen, die über den T-Zell-Rezeptor ein tumor­ spezifisches Peptid, welches über MHC Klasse I und/oder Klasse II auf Tumorzellen präsentiert wird, erkennen, nach Bindung durch den bispezifischen oder trispezifischen An­ tikörper wie unter (e) beschrieben ebenfalls zu aktivie­ ren.3. Use according to claim 1 or 2, characterized, that the antibody is still capable of tumor speci fish T cells that have a tumor via the T cell receptor specific peptide, which via MHC class I and / or Class II is presented on tumor cells, recognize after Binding by the bispecific or trispecific type antibody as described under (e)  ren. 4. Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper zur Induktion von tumorreaktiven Kom­ plement-bindenden Antikörpern und damit zur Induktion ei­ ner humoralen Immunantwort befähigt ist.4. Use according to claim 1, 2 or 3, characterized, that the antibody for induction of tumor-reactive com plement-binding antibodies and thus for induction egg is capable of a humoral immune response. 5. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper über CD3 oder CD2, CD5, CD28 und/oder CD44 an die T-Zelle bindet.5. Use according to one or more of the preceding Expectations, characterized, that the antibody via CD3 or CD2, CD5, CD28 and / or CD44 binds to the T cell. 6. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper zur Bindung an Fc-Rezeptor positive Zellen befähigt ist, die einen Fcγ-Rezeptor I, II oder III aufweisen.6. Use according to one or more of the preceding Expectations, characterized, that the antibody is positive for binding to the Fc receptor Cells is capable of an Fcγ receptor I, II or III exhibit. 7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper zur Bindung an Monozyten, Makrophagen und/oder Dendriten als Fcγ-Rezeptor I positive Zellen be­ fähigt ist.7. Use according to claim 6, characterized, that the antibody binds to monocytes, macrophages and / or dendrites as Fcγ receptor I positive cells is capable. 8. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression von CD40, CD80, CD86, ICAM-1 und/oder LFA-3 als kostimulatorische Antigene oder/und die Sekre­ tion von Cytokinen durch die Fc-Rezeptor positive Zelle initiiert oder erhöht wird.8. Use according to one or more of the preceding Expectations, characterized, that the expression of CD40, CD80, CD86, ICAM-1 and / or LFA-3 as costimulatory antigens and / or the secretion tion of cytokines by the Fc receptor positive cell is initiated or increased. 9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Zytokine IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12 und/oder TNF-α sind.9. Use according to claim 8, characterized,  that the cytokines IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12 and / or Are TNF-α. 10. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung an die T-Zelle über den T-Zell-Rezeptor-Komplex der T-Zelle erfolgt.10. Use according to one or more of the preceding Expectations, characterized, that binding to the T cell via the T cell receptor complex the T cell. 11. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der bispezifische Antikörper ein anti-CD3 X anti-Tu­ mor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD2 X anti-Tumor­ assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD5 X anti-Tumor-asso­ ziiertes Antigen- und/oder anti-CD28 X anti-Tumor-assozi­ iertes Antigen- und/oder anti-CD44 X anti-Tumor-assoziier­ tes Antigen-Antikörper ist.11. Use according to one or more of the preceding Expectations, characterized, that the bispecific antibody is an anti-CD3 X anti-Tu mor-associated antigen and / or anti-CD2 X anti-tumor associated antigen and / or anti-CD5 X anti-tumor asso cited antigen and / or anti-CD28 X anti-tumor association ized antigen and / or anti-CD44 X anti-tumor associated antigen antibody. 12. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der bispezifische Antikörper ein heterologer Ratte/- Maus bispezifischer Antikörper ist.12. Use according to one or more of the preceding Expectations, characterized, that the bispecific antibody is a heterologous rat / - Mouse is bispecific antibody. 13. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der bispezifische Antikörper ein heterologer bispezi­ fischer Antikörper ist, ausgewählt aus einer oder mehreren der nachfolgenden Isotypkombinationen:
Ratte-IgG2b/Maus-IgG2a,
Ratte-IgG2b/Maus-IgG2b,
Ratte-IgG2b/Maus-IgG3,
Ratte-IgG2b/Human-IgG1,
Ratte-IgG2b/Human-IgG2,
Ratte-IgG2b/Human-IgG3[orientaler Allotyp G3m(st) = Bin­ dung an Protein A],
Ratte-IgG2b/Human-IgG4,
Ratte-IgG2b/Ratte-IgG2c,
Maus-IgG2a/Human-IgG3 [kaukasische Allotypen G3m(b+g) = keine Bindung an Protein A, im folgenden mit * gekenn­ zeichnet]
Maus-IgG2a/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]- Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2a/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2a/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]- Human-IgG1-[Hinge]-Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human- IgG4-[Hinge]-Human-IgG4 [N-terminale Region von CH2]-Human- IgG3* [C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Hu­ man-IgG3* [CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge-CH2-CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG2-[Hinge-CH2-CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG3-[Hinge-CH2-CH3, orientaler Allotyp]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge-CH2-CH3]- Human-IgG1/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]- Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG4 [N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3* [C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Human-IgG3* [CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG4 [N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3* [C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Human-IgG3* [CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG2 [N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3* [C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Human-IgG3* [CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG2 [N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3* [C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Human-IgG3* [CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG2/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG2-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG4/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG4/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge]-Human- IgG4 [N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3* [C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Human-IgG3* [CH3]
Maus-IgG2b/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2b/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2b/Maus-[VH,CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3].13. Use according to one or more of the preceding claims, characterized in that the bispecific antibody is a heterologous bispecific antibody selected from one or more of the following isotype combinations:
Rat IgG2b / mouse IgG2a,
Rat IgG2b / mouse IgG2b,
Rat IgG2b / mouse IgG3,
Rat IgG2b / human IgG1,
Rat IgG2b / human IgG2,
Rat IgG2b / human IgG3 [oriental allotype G3m (st) = binding to protein A],
Rat IgG2b / human IgG4,
Rat IgG2b / rat IgG2c,
Mouse IgG2a / Human IgG3 [Caucasian allotypes G3m (b + g) = no binding to protein A, marked with * in the following]
Mouse IgG2a / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -Human IgG1- [Hinge] - Human IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse-IgG2a / Rat- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse IgG2a / Human- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -human IgG1 / rat- [VH-CH1, VL-CL] - human-IgG1- [Hinge] -human-IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -human IgG4 / rat- [VH-CH1, VL-CL] -human- IgG4- [hinge] -human-IgG4 [N-terminal region of CH2] -human- IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS position 251] -Human-IgG3 * [CH3]
Rat IgG2b / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG1- [Hinge-CH2-CH3]
Rat IgG2b / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG2- [Hinge-CH2-CH3]
Rat IgG2b / Mouse [VH-CH1, VL-CL] Human IgG3 [Hinge CH2-CH3, oriental allotype]
Rat-IgG2b / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG4- [Hinge-CH2-CH3] - Human-IgG1 / Human- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge ] - Human IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG1 / Rat- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG1 [Hinge] Human IgG4 [N-terminal region of CH2] Human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Human IgG1 / mouse [VH-CH1, VL-CL] human IgG1 [hinge] human IgG4 [N-terminal region of CH2] human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Human IgG1 / Rat- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] -Human-IgG2 [N-terminal region of CH2] -Human-IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Human IgG1 / mouse- [VH-CH1, VL-CL] -human IgG1- [hinge] -human IgG2 [N-terminal region of CH2] -human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Human IgG1 / Rat- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG1- [Hinge] Human IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG1 / Mouse- [VH-CH1, VL-CL] -Human IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG2 / Human- [VH-CH1, VL-CL] -Human IgG2- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG4 / Human- [VH-CH1, VL-CL] Human IgG4- [Hinge] Human IgG3 * - [CH2-CH3]
Human IgG4 / Human [VH-CH1, VL-CL] Human IgG4 [Hinge] Human IgG4 [N-terminal region of CH2] Human IgG3 * [C-terminal region of CH2: <AS -Position 251] -human IgG3 * [CH3]
Mouse IgG2b / Rat- [VH-CH1, VL-CL] -Human-IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse IgG2b / Human- [VH-CH1, VL-CL] -Human IgG1- [Hinge] -Human- IgG3 * - [CH2-CH3]
Mouse IgG2b / Mouse- [VH, CH1, VL-CL] Human IgG1- [Hinge] Human IgG3 * - [CH2-CH3]. 14. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der trispezifische Antikörper ein anti-CD3 X anti-Tu­ mor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD2 X anti-Tumor­ assoziiertes Antigen- und/oder anti-CDS X anti-tumor-asso­ ziiertes Antigen- und/oder anti-CD28 X anti-Tumor-assozi­ iertes Antigen- und/oder anti-CD44 X anti-Tumor-assoziier­ tes Antigen-Antikörper mit einem zusätzlichen anti-Fc-Re­ zeptor-Bindungsarm ist.14. Use according to one or more of the preceding Expectations, characterized, that the trispecific antibody is an anti-CD3 X anti-Tu mor-associated antigen and / or anti-CD2 X anti-tumor associated antigen and / or anti-CDS X anti-tumor asso cited antigen and / or anti-CD28 X anti-tumor association ized antigen and / or anti-CD44 X anti-tumor associated antigen antibody with an additional anti-Fc-Re is low in binding. 15. Verwendung eines Antikörpers nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche in einer Menge von 5 µg-10 mg/Pa­ tient in einer minimal residual disease (MRD)-Situation.15. Use of an antibody according to one or more of the preceding claims in an amount of 5 µg-10 mg / Pa tient in a minimal residual disease (MRD) situation.
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