DE19701177A1 - Verfahren zur Abtrennung und/oder Bestimmung von Cholesterin aus Lipoproteinfraktionen - Google Patents
Verfahren zur Abtrennung und/oder Bestimmung von Cholesterin aus LipoproteinfraktionenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung
und/oder Bestimmung von Cholesterin aus Lipoproteinfraktionen,
bei dem einzelne Lipoproteinfraktionen differenziert werden,
indem Lipoproteinfraktionen selektiv mit zugesetzten Reagenzien
in Wechselwirkung treten.
Ein solches gattungsgemäßes Verfahren ist besonders bedeutsam zur
Diagnose von koronaren Herzkrankheiten. Die koronare
Herzkrankheit (KHK) ist nach wie vor die häufigste Todesursache
in Deutschland und den westlichen Industrienationen. Ein
bedeutender Risikofaktor, der streng mit dem Auftreten der KHK
assoziiert ist, ist die Cholesterinkonzentration im Serum.
Darüberhinaus konnte in einer Reihe von epidemiologischen und
klinischen Studien herausgearbeitet werden, daß die Analyse der
Lipoproteinfraktionen eine bessere Möglichkeit bietet, Personen
zu identifizieren, die ein erhöhtes Risiko haben, an der KHK zu
erkranken.
Die Fette werden unterteilt in verestertes Cholesterin, nicht
verestertes Cholesterin, Triglyzeride und Phospholipide. Sie sind
im Blut Bestandteil der Lipoproteine. Die Lipoproteine werden in
vier Hauptklassen eingeteilt: Chylomikronen, VLDL (engl.: very
low density lipoproteins), LDL (engl.: low density lipoproteins)
und HDL (engl.: high density lipoproteins). Die Namensgebung der
Lipoproteine beruht auf der unterschiedlichen Dichte, die zur
Auftrennung bei der Ultrazentrifugation genutzt wird.
Die Lipoproteine unterscheiden sich in ihrer Zusammensetzung, der
Herkunft, dem Abbau und ihrer spezifischen Funktion.
Die Bedeutung der einzelnen Lipoproteinfraktionen für die
Entstehung der KHK hat sich in sogenannten Konsensus-Konferenzen
niedergeschlagen, die sowohl von der Europäischen
Atherosklerosegesellschaft als auch in den USA erarbeitet wurden.
Die Unterschiede zwischen diesen beiden Empfehlungen sind gering.
LDL-Cholesterinkonzentrationen über 155 mg/dl (160 mg/dl) werden
als gefährlich bezüglich der KHK eingestuft. Ebenfalls gelten
HDL-Chol.-Werte unter 35 mg/dl als weiterer Risikofaktor für die
KHK. Andererseits sind HDL-Chol.-Spiegel über 65 bzw. 60 mg/dl
ein negativer Risikofaktor, der also vor dem Auftreten der KHK
schützt. In den Konsensus-Konferenzen werden auch Zielwerte für
die atherogenen Lipoproteine LDL angegeben: Patienten mit dem
Vorliegen einer KHK sollten LDL-Chol.-Werte unter 135 bzw. 130
mg/dl anstreben.
Es ist davon auszugehen, daß diese Werte in Zukunft noch weiter
nach unten korrigiert werden, da Studien der jüngsten Zeit
gezeigt haben, daß selbst die Cholesterinsenkung bei Patienten
mit KHK und relativ normalen Cholesterinspiegeln mit einer
geringeren Sterblichkeit an der KHK und der Gesamtmortalität
verbunden ist. Aufgrund der Richtlinien der Konsensus-Konferenzen
erscheint die exakte Bestimmung der Lipoproteinkonzentrationen
außerordentlich wichtig, um Patienten als Risikopatienten zu
identifizieren und eine zuverlässige Therapiekontrolle durchführen
zu können.
Heutzutage erfolgt die routinemäßige quantitative
Cholesterinbestimmung am häufigsten mit der enzymatischen CHOD-
PAP Methode (Allain C. C. et al. in Clin. Chem. 20, 470-475,
1974). Dieser Test kann an unfraktioniertem Vollserum
durchgeführt werden. Um aber eine bessere diagnostische Aussage
zu ermöglichen, sollten die einzelnen Lipoproteinfraktionen mit
ihren jeweiligen Cholesteringehalten quantitativ in Beziehung
gesetzt werden.
Die Auftrennung der Lipoproteine kann mit unterschiedlichen
Verfahren erfolgen.
Als Referenzmethode gilt die Auftrennung der Lipoproteine mittels
der Technik der Ultrazentrifugation (Havel RJ, Eder HA, Bragdon
JH in J. Clin. Invest. 34, 1345-1353, 1955). Hierbei wird das
Serum bzw. Plasma nacheinander auf bestimmte Dichten eingestellt
und anschließend zentrifugiert. Dabei flotieren die leichteren
Lipoproteine nach oben, währenddessen der Rest sedimentiert.
Durch aufeinanderfolgende Ultrazentrifugationsschritte bei
unterschiedlichen Dichten können so die Lipoproteine voneinander
aufgetrennt werden. Dieses Verfahren ist sehr personal- und
zeitintensiv und kann daher nur in Speziallaboratorien
durchgeführt werden.
Ein grundsätzlich anderes Verfahren besteht darin, die
Lipoproteine elektrophoretisch auf zutrennen. Neben der
ursprünglichen Auftrennung mittels der Papierelektrophorese hat
sich unterdessen die Auftrennung in Agarosegelen durchgesetzt
(Lees RS, Fredrickson DS in: J. Clin. Invest. 44, 1968-1977,
1965; Neubeck W, Wieland H, Habenicht A, Huller P, Baggio G,
Seidel D. in: Clin. Chem. 23, 1296-1300, 1977; und Nauck M,
Winkler K, März W, Wieland H. in: Clin. Chem., 41, 1761-1767,
1995).
Die heutzutage am häufigsten angewandten Abtrennungs- bzw.
Differenzierungsverfahren von Lipoproteinfraktionen, zu dem auch
das gegenständliche Verfahren gattungsgemäß zugeordnet wird,
beruhen jedoch auf einem ganz anderen Prinzip. Bei diesen
Abtrennungs- bzw. Differenzierungsverfahren treten
Lipoproteinfraktionen selektiv mit zugesetzten Reagenzien in
Wechselwirkung, um eine Differenzierung der Lipoproteinfraktionen
herbeizuführen.
Hierzu gehören zunächst einmal die Präzipitationsverfahren
Polyanionen (z. B. Heparin, Phosphorwolframsäure, Dextransulfat,
usw.) bzw. Polyethylenglykol lagern sich an die Oberfläche der
Lipoproteine an und führen so zu einer stark negativen Ladung der
Partikel. Durch die Zugabe von zweiwertigen Kationen (z. B. Mg2+,
Mn2+, Ca2+) entstehen unlösliche Komplexe, die im allgemeinen
mittels Zentrifugation abgetrennt werden können (s. Burstein M,
Scholnick HR, Morfin R. in: J. Lipid Res. 11, 583-595, 1970;
Burstein M, Scholnick HR in: Adv. Lipid Res. 11, 67-108, 1973).
Durch unterschiedliche Reagenzien, bzw. verschiedene
Konzentrationen sowie pH Verschiebungen können die einzelnen
Lipoproteinfraktionen voneinander getrennt werden.
Dabei gibt es Reagenzien, mit denen alle Lipoproteine mit
Ausnahme der HDL präzipitiert werden (Bachorik PS, Wood PD,
Albers JJ, Steiner P, Dempsey M, Kuba K, Warnick R, Karlsson L
in: Clin. Chem. 22, 1828-1834, 1976; Demacker PNM, Vos-Janssen
HE, Hijmans AGM, van't Laar A, Janssen AP. In: Clin. Chem. 26,
1780-1786, 1980; Viikari J. in: Scand. J. Clin. Lab. Invest. 36,
265-268, 1976; und Kostner GN, Molinari E, Pichler P in: Clinica
Chimica Acta 148 : 139-147, 1985). Bei diesem Vorgehen kann nach
Präzipitation und Abzentrifugation der LDL, VLDL und
Chylomikronen durch die Bestimmung des Cholesteringehalts im
Überstand das HDL-Cholesterin direkt bestimmt werden.
Andererseits gibt es auch Reagenzien, mit denen nur die LDL
präzipitiert werden (Wieland H u. Seidel D in: J. Lipid Res. 24,
904-909, 1983; Assmann G, Jabs HU, Nolte W, Schriewer H in: J.
Clin. Chem. Clin. Biochem. 22, 781-785, 1984; Armstrong V, Seidel
D. in: Ärztl. Lab. 31, 325-333, 1985; Demacker PN, Hijmans BJ,
Jansen AP, van't Laar A. in: Clin. Chem. 30, 1797-1800, 1984;
Mainard F, Madec Y. in: Clin. Chim. Acta 162, 141-146, 1987;
Siekmeier R, März R, Gross W. in: Clin. Chim. Acta 177, 221-230,
1988; und Hoffmann GE, Hiefinger R, Weiss L, Poppe W. in: Clin.
Chem. 31, 1729-1730, 1985). Die Differenz aus Vollserum-Cho
lesterin und dem Überstand-Cholesterin nach Abzentrifugation
der komplexierten LDL ergibt das LDL-Cholesterin.
Diese Präzipitationsverfahren sind relativ einfach anwendbar,
erfordern aber einen Trennungsschritt, der im allgemeinen mit
Hilfe einer Zentrifugation erfolgt. Kürzlich wurde auch ein
Verfahren publiziert, bei dem das Präzipitationsreagenz an
magnetisierbare Partikel gebunden ist (US-Patenschrift Nr. 5 242
833 und N. Harris et al., Clin. Chem. 42, 738-743, 1996). Dadurch
kann der Trennungsschritt mit Hilfe dieser Partikel und einem
Magnetfeld erfolgen.
Es sind auch Verfahren beschrieben worden, bei denen die
Verwendung von Antikörpern gegen bestimmte Apolipoproteine es
ermöglicht, die LDL von den anderen Lipoproteinen zu trennen und
dann dessen Cholesteringehalt zu bestimmen (Pisani T, Gebski CP,
Leary ET, Warnick GR, Ollington JF in: Arch. Pathol. Lab. Med.
119, 1127-1135, 1995).
Ein anderer Typ von Differenzierungsansatz, der auf dem
gattungsgemäßen Prinzip der selektiven Wechselwirkung einzelner
Lipoproteinfraktionen mit speziellen Wechselwirkungssubstanzen
beruht, ist in der jüngsten Zeit entwickelt worden und ermöglicht
sogenannte homogene Analyseverfahren zur Bestimmung von
Lipoproteincholesterinkonzentrationen (Nauck M, März W, Haas B,
Wieland H. in Clin. Chem. 42, 424-429, 1996; HDL-C
Automatenpackungen für unterschiedliche Autoanalyser von
Boehringer Mannheim; und homogener Test HDL-C von Genenzyme).
Diese Tests haben den Vorteil, daß keinerlei Probenvorbehandlung
notwendig ist und die Parameter HDL-C und LDL-C direkt an
Autoanalyzern bestimmt werden können. Diese Verfahren werden in
Zukunft sicherlich eine weite Verbreitung finden.
Ein solches, homogenes Analyseverfahren zur Bestimmung von HDL-C
macht von Polyethylenglycol-modifizierten Enzymen und
sulfatisiertem α-Cyclodextrin und Dextransulfat Gebrauch
(H. Sugiuchi et al., Clin. Chem. 41, 717-723, 1995). Nach
Modifizierung von Cholesterin-Esterase und Cholesterin-Oxidase
mit Polyethylenglykol zeigen diese selektive katalytische
Wirkungen gegenüber Lipoproteinfraktionen, wobei die Reaktivität
in der Reihe LDL < VLDL ∼ Chylomikronen < HDL zunehmen. In
Gegenwart von Magnesiumionen verringert sulfatisiertes α-Cy
clodextrin die Reaktivität von Cholesterin, und zwar
insbesondere das in den Chylomikronen und den VLDL vorliegende
Cholesterin. Eine Präzipitation von Lipoproteinaggregaten ist
damit nicht mehr erforderlich.
In einem anderen homogenen Ansatz (von Genenzyme Diagnostics, s.
Harris N., Galpchian V., Thomas J., Iannotti E., Law T. und Rifai
N. in Clin. Chem. 1997 (im Druck)) werden zunächst die LDL-,
VLDL- und Chylomikronen-Lipoproteinfraktionen durch synthetische
Polymere und Polyanionen selektiv stabilisiert. In einem
folgenden Schritt zerstört ein zugesetztes Detergens dann die
HDL-Struktur, wodurch das HDL-Cholesterin freigesetzt wird. Das
HDL-Cholesterin wird dann durch ein geeignetes System aus Enzym
(Cholesterin-Esterase, Cholesterin-Oxidase, Peroxidase) und
Chromogen quantitativ bestimmt. Die Detektionsenzyme reagieren
nicht mit den stabilisierten LDL-, VLDL- und Chylomikronen-Li
poproteinfraktionen.
Wie oben ausgeführt, ist eine exakte Bestimmung der
Lipoproteincholesterin-Konzentrationen für eine korrekte
Diagnosestellung und Therapiekontrolle notwendig.
Bei den Verfahren zur Abtrennung und ggf. Bestimmung von
Cholesterin, die auf dem Prinzip einer selektiven Wechselwirkung
der Lipoproteinfraktionen mit verschiedenen Reagenziensubstanzen
beruhen, treten jedoch häufig Störungen auf, die zu einer
falschen Bestimmung der Lipoproteincholesterin-Konzentrationen
führen können.
Zum einen betreffen solche Störungen nur den Cholesterinnachweis,
der erst erfolgt, nachdem die Lipoproteine voneinander getrennt
sind. Dies trifft z. B. bei lipämischen oder ikterischen Proben
zu. Solche problematischen Proben können aber leicht anhand einer
Trübung bzw. Gelbfärbung des Serums erkannt werden. Proben sind
dann lipämisch, wenn große Konzentration an Chylomikronen oder
VLDL oder beiden vorliegen. Die Präzipitation selbst kann
ebenfalls durch lipämischen Proben gestört sein.
Anders sieht das hingegen bei Seren aus, bei denen die
Konzentration an freien Fettsäuren erhöht ist. Seren mit einer
hohen Konzentration an freien Fettsäuren fallen bei der
Betrachtung des Serums bzw. Plasmas nicht auf.
Die freien Fettsäuren können durch unterschiedliche Ursachen auf
Konzentrationen auf über 2 mmol/l ansteigen. Dazu gehört bei
stationären Patienten die Gabe von Heparin, einer Substanz, die
häufig angewendet wird, um die Thromboseneigung zu reduzieren bzw.
eine Thrombose zu therapieren, und dabei die intravasale
Aktivität der Lipoproteinlipase stimuliert. Weitere Ursachen für
erhöhte Konzentrationen an freien Fettsäuren sind ketoazidotische
Stoffwechsellagen, wie sie im Rahmen bestimmter Grundkrankheiten
auftreten können. Dazu gehören z. B. ausgeprägte
Hypertriglyzeridämien, der insulinpflichtige Diabetes mellitus,
Übergewicht, das nephrotische Syndrom oder der
Hyperthyreoidismus.
Als Folge davon sind Störungen der Cholesterinbestimmung aus
Lipoproteinfraktionen auf der Basis von Präzipitationsverfahren
berichtet worden (V. Amstrong und D. Seidel, Ärzt. Lab. 31, 325-330,
1985; Siekmeier et al., Clin. Chem. 36, 2109-2113, 1990; und
Nauk et al. Klin. Lab. 40, 167-176, 1994).
Aufgabe vorliegender Erfindung ist es daher, eine exakte
Auftrennung und Bestimmung von Cholesterin aus
Lipoproteinfraktionen zu ermöglichen, wobei Störungen der
Cholesterin-Bestimmung weitestgehend beseitigt sind.
Die Aufgabe wird gemäß Anspruch 1 durch ein Verfahren zur
Abtrennung und/oder Bestimmung von Lipoprotein-Cholesterin, bei
dem einzelne Liporoteinfraktionen differenziert werden, indem
Lipoproteinfraktionen selektiv mit zugesetzten Reagentien in
Wechselwirkung treten, dadurch gelöst, daß der
Differenzierungsschritt in Gegenwart von Trägerprotein erfolgt.
Ein weiterer Gegenstand vorliegender Erfindung besteht in einer
Zusammensetzung, die neben den üblichen Reagenzien, die zur
Differenzierung von Cholesterin-haltigen Lipoproteinen mit diesen
in Wechselwirkung treten können, ferner Trägerprotein enthält.
Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die
anbeiliegenden Fig. 1 und 2 näher erläutert, wobei
Fig. 1 die Resultate einer LDL-Cholesterinbestimmung in
Abhängigkeit von der Konzentration an freien Fettsäuren bei einem
erfindungsgemäßen, Trägerprotein-haltigen Abtrennungs- und
Bestimmungssystem im Vergleich zu einem herkömmlichen
Abtrennungs- und Bestimmungssystem zeigt, und
Fig. 2 die Resultate einer erfindungsgemäßen LDL-Cho
lesterinbestimmung gegenüber der Konzentration an
Trägerprotein bei verschiedenen Konzentrationen an freien
Fettsäuren zeigt.
Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß in dem Fall,
daß bei dem Abtrennungs- und ggf. Bestimmungsverfahren zumindest
während des Differenzierungsschrittes erfindungsgemäß ein
Trägerprotein vorliegt, die Störungen der Lipoprotein
differenzierung und Cholesterinbestimmung weitestgehend beseitigt
werden können und eine exakte Quantifizierung von Cholesterin in
den betreffenden Lipoproteinfraktionen des Blutserums erlaubt.
Wird die Menge des zugesetzten Trägerproteins besonders hoch
gewählt, vorzugsweise in einer Menge von 50 mg oder mehr auf 1 ml
untersuchtes Blutserum, kann sogar eine vollständige Beseitigung
der Störung durch freie Fettsäuren erreicht werden.
Insbesondere bietet eine Menge an Trägerprotein von mindestens
100 mg auf 1 ml Blutserum den besonderen Vorteil, daß selbst
ungewöhnlich hohe Konzentrationen an freien Fettsäuren von 6
mmol/l und mehr keine Störungen mehr verursachen. Dies bietet die
Gewähr, daß auch ohne vorhergehende Überprüfung der individuellen
Situation des betreffenden Patienten hinsichtlich des Vorliegens
erhöhter Konzentrationen an freien Fettsäuren stets ein exakter
und tatsächlicher Cholesterinwert der betreffenden
Lipoproteinfraktion erhalten wird. Wie eingangs bereits erwähnt,
sind Störungen aufgrund des Vorliegens freier Fettsäuren von
vorneherein nicht ohne weiteres feststellbar.
Eine geeignete Obergrenze für die Zugabe von Trägerprotein kann
beispielsweise bei etwa 300 mg auf 1 ml Blutserum liegen, da bei
diesem Wert eine vollständige Erfassung der Lipoprotein-Cho
lesterinmenge selbst bei besonders hohen Konzentrationen an
freien Fettsäuren gewährleistet ist.
Somit werden durch die Erfindung für jeden Einzelfall
reproduzierbar richtige und exakte Ergebnisse erzielt, was für
die danach geeigneten diagnostischen und therapeutischen
Entscheidungen von großer Bedeutung ist.
Als Trägersubstanz können gemäß der vorliegenden Erfindung an
sich für solche Zwecke bekannte Substanzen eingesetzt werden, und
zwar insbesondere Trägerproteine. Sehr gut geeignet ist
Serumalbumin als Trägerprotein, wie das bovine und das humane
Serumalbumin BSA und HSA. Weitere Beispiele für Trägersubstanzen
sind Ionenaustauscher, wie DOWEX® (z. B. DOWEX®50W).
Zu den Verfahren zur Abtrennung und/oder Bestimmung von
Lipoprotein-Cholesterin aus den entsprechenden Fraktionen,
insbesondere des LDL- und des HDL-Cholesterins, gehören die
bereits eingangs erwähnten, an sich bekannten Verfahren, in
dessen Verlauf mindestens ein Differenzierungsschritt erfolgt,
bei dem die Cholesterin-haltige Lipoproteinfraktion mit - je nach
Art des speziellen Abtrennungs- bzw. Bestimmungsverfahrens
ausgewählten - Reagenzien in Wechselwirkung tritt und auf diese
Dazu gehören beispielsweise die eingangs erwähnten
Präzipitationsverfahren. In diesem Fall sind die Fällungsmittel,
wie Heparin, Phosphorwolframsäure, Polyvinylsulfat, anionische
Polymere, Dextransulfat und dergleichen, ggf. zusammen mit Co-Fäl
lungsmitteln wie zweiwertige Kationen, die mit den jeweiligen
Lipoproteinfraktion in Wechselwirkung tretenden Reagenzien.
Geeignet zur Anwendung vorliegender Erfindung sind auch die
Abtrennungs- bzw. Bestimmungsverfahren, bei denen die
Differenzierung durch eine Auftrennung im magnetischen Feld mit
Hilfe der Wechselwirkung der Lipoproteinfraktionen mit
modifizierten magnetischen Partikeln erfolgt, wie sie in der US-Pa
tenschrift Nr. 5 242 833 und in der Literaturstelle N. Harris
et al., Clin. Chem. 42, 738-743 (1996), beschrieben sind.
Es hat sich herausgestellt, daß das erfindungsgemäße Verfahren
besonders dann zu überraschend guten Resultaten führt, wenn das
Trägerprotein bei Wechselwirkungsabhängigen Lipoportein-Dif
ferenzierungsschritten eingesetzt wird, welche auf den
eingangs beschriebenen homogenen Ansätzen beruhen. Neben dem
besonders guten Ansprechen dieser Differenzierungssysteme auf die
Störungsfreiheit durch Trägerprotein haben diese homogenen
Ansätze zuätzlich den Vorteil, daß alle Schritte in Lösung
erfolgen können, ohne daß es eines Zentrifugationsschrittes
bedarf.
Nach dieser bevorzugten Ausführungsform vorliegender Erfindung
werden die mit den Cholesterin-haltigen Lipoproteinen in
Wechselwirkung tretenden Reagenzien demnach so ausgewählt, daß
ein vorstehend bezeichneter homogener Differenzierungsansatz in
flüssigem Medium ohne Zentrifugation, d. h. in-situ, erfolgt.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darauf
zu achten, daß das Trägerprotein zumindest während des
eigentlichen Differenzierungsschrittes vorliegt. Dies kann
dadurch erreicht werden, daß das Trägerprotein bereits zu Beginn
zu der untersuchten Probe, in der Regel Blutserum, zugesetzt
wird.
Alternativ hierzu kann das Trägerprotein auch gleichzeitig mit
dem Differenzierungsreagenz dem Differenzierungsschritt zugefügt
werden. Vorzugsweise geschieht dies derart, daß das Trägerprotein
in die Zusammensetzung des - je nach Art des
Differenzierungsansatzes betreffenden - Differenzierungsreagenzes
eingeschlossen wird.
Folglich besteht ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erindung in einem Cholesterin-Bestimmungsreagenz, welches neben
den üblichen, für den betreffenden, auf einer Wechselwirkung mit
den Lipoproteinfraktionen beruhenden Differenzierungsansatz
erforderlichen Bestandteilen ferner das Trägerprotein enthält.
Der Gehalt des Trägerproteins wird dann in Übereinstimmung mit
der obigen Beschreibung zum Verfahren vorzugsweise so gewählt,
daß beim Verbinden des Reagenzes mit dem zu untersuchenden
Probenmaterial (Blutserum) ein Verhältnis von mindestens 50 mg,
insbesondere mindestens 100 mg Trägerprotein auf 1 ml Blutserum
gebildet wird.
Falls der Lipoprotein-Differenzierungsschritt aus zwei oder mehr
Einzelschritten besteht, sollte das Trägerprotein bereits im
ersten Schritt zugefügt werden, damit es seine Wirkung am besten
entfalten kann. Für das beanspruchte Cholesterin-
Bestimmungsreagenz bedeutet dies, daß das Trägerprotein in der
zuerst zum Einsatz kommenden Reagenzienmischung enthalten ist.
Demnach wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform vorliegender
Erfindung das Trägerprotein zu der zu untersuchenden Probe zu
Beginn des Verfahrens und/oder dem zuerst zugesetzten
Differenzierungsreagenz zugesetzt.
Im Anschluß an den Lipoproteinabtrennungsschritt- bzw. -diffe
renzierungsschritt kann die vorzugsweise quantitative
Bestimmung des Cholesteringehalts des (der) betreffenden
Lipoproteins(e) erfolgen. Dies geschieht wiederum auf an sich
bekannte, herkömmliche Weise, und zwar enzymatisch und
chromatographisch durch die geeigneten Enzym- und
Farbstoffsysteme, beispielsweise durch die CHOD-PAP-Methode.
Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. das erfindungsgemäße
Cholesterin-Bestimmungsreagenz ist mit den bestehenden
automatischen Systemen voll kompatibel, und ist somit für die
klinische Routineuntersuchung einsetzbar.
Die vorliegende Erfindung wird anhand folgender Beispiele unter
Bezugnahme auf die beigefügten Fig. 1 und 2 näher erläutert.
20 Seren wurden entweder unbehandelt oder nach der Methode von
Spector und Hoak (Anal. Biochem. 32, 297-302, 1969) künstlich
mit freien Fettsäuren unterschiedlicher Konzentrationen
angereichert. Aus diesen Seren wurden anschließend durch drei
unterschiedliche Verfahren, die nachstehend genannt sind, die
LDL-Lipoproteinfraktion von den anderen Lipoproteinfraktionen
getrennt. Aus diesen LDL-Lipoproteinfraktionen wurden dann der
LDL-Cholesteringehalt mit der bekannten CHOD-PAP Methode
bestimmt.
- a) Zunächst wurde ein Referenzverfahren zur Abtrennung von Lipoproteinen mit einer Kombination aus Ultrazentrifugation und Präzipitation durchgeführt. Dieses Referenzverfahren ist unempfindlich für hohe Konzentrationen an freien Fettsäuren.
- b) Daneben wurden zur Abtrennung ein herkömmliches Präzipitationsverfahren mit Dextransulfat als Fällungsreagenz durchgeführt (Quantolip®-LDL der Firma Immuno; es wurde die Originalvorschrift des Herstellers angewandt).
- c) Schließlich wurde nach dem vorstehenden Verfahren b) gearbeitet, wobei jedoch zu Beginn 900 µl der fällmittelhaltigen Reagenzienlösung 100 µl einer 24gewichtsprozentigen BSA-Lösung zugegeben wurde. Anschließend wurde wie mit dem Originalreagenz die Trennung der Lipoproteine durchgeführt. Dies entsprach einem Verhältnis von 240 mg BSA pro ml untersuchte Serumprobe.
Abb. 1 zeigt die Ergebnisse der Referenzmethode im Vergleich
mit dem herkömmlichen Präzipitationsverfahren und dem analogen
Verfahren unter Zusatz von Trägerprotein. Es zeigt sich, daß die
Referenzmethode unabhängig von der Konzentration der freien
Fettsäuren im Mittel dieselbe LDL-Cholesterinkonzentration ergibt
(∎. . .∎). Im Gegensatz dazu findet sich bei Verwendung des
trägerproteinfreien Fällungsreagenzes eine erhebliche Störung
mit freien Fettsäuren (○ - ○). Die LDL-Cholesterinkonzentration
sinkt mit steigender Konzentration der freien Fettsäuren,
insbesondere oberhalb 2 mMol/l freien Fettsäuren, bis auf sehr
geringe Werte um 2 mg/dl ab.
Wird das Reagenz Quantolip®-LDL aber zuvor mit einer
ausreichenden Menge Trägerprotein wie z. B. BSA versetzt, so
stören die freien Fettsäuen den Präzipitationsschritt nicht mehr
(⚫ - ⚫).
Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei die Abtrennungs- und
Bestimmungsverfahren nach der Referenzmethode (Verfahren a))
sowie nach dem erfindungsgemäßen Verfahren c) ausgeführt wurden.
Dabei wurden in den Probeseren zuvor unterschiedliche
Konzentrationen an freien Fettsäuren eingestellt, nämlich unter
2, etwa 3 sowie etwa 6 mMol/l. Das Präzipitationsverfahren wurde
einmal zum Vergleich ohne Zusatz von BSA ausgeführt, so daß nur
die der Serumprobe inhärente Menge Serumalbumin vorlag. Ferner
erfolgte das erfindungsgemäße Verfahren unter bewußtem Zusatz
von BSA als Trägerprotein verschiedener Mengenverhältnisse,
nämlich mit 10, 50, 100, 140, 190 und 240 µg Albumin pro µl
untersuchtes Serum.
Die Ergebnisse sind in Fig. 2 zusammenfassend graphisch
dargestellt. Es ist ersichtlich, daß je nach Gehalt an freier
Fettsäure entsprechende Zusätze an Albumin-Trägerprotein-Zusatz
störungsmindernd auf das Abtrennungs- und Bestimmungsverfahren
wirken. Danach wird vorzugsweise eine Menge Trägerprotein in
einem Verhältnis von mindestens 50 µg pro 41 Serum eingesetzt, um
eine weitgehende Unterdrückung zu erreichen. Insbesondere ein
Verhältnis von mindestens 100 µg pro µl Serum führt besonders
vorteilhaft dazu, daß unabhängig von der nicht ohne weiteres
vorhersehbaren Konzentration an freien Fettsäuren, das heißt auch
bei sehr hohen Werten, eine nahezu vollständige Störungsfreiheit
sichergestellt ist.
Claims (11)
1. Verfahren zur Abtrennung und/oder Bestimmung von Lipoprotein-Cho
lesterin, bei dem einzelne Liporoteinfraktionen differenziert
werden, indem Lipoproteinfraktionen selektiv mit zugesetzten
Reagenzien in Wechselwirkung treten, wobei der Differenzierungs
schritt in Gegenwart von Trägerprotein erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Differenzierung der Lipoproteinfraktionen im Differenzierungs
schritt auf einem homogenen Differenzierungsansatz in flüssigem
Medium ohne Zentrifugation, einer Präzipitation oder einer
Inkubation mit magnetischen Partikeln oder mit Lipoprotein-An
tikörpern beruht.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß
die Abtrennung und/oder Bestimmung von Lipoprotein-Cholesterin
aus Blutserum erfolgt und das Trägerprotein in einer Menge von
mindestens 50 mg pro ml untersuchtes Blutserum eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das
Trägerprotein in einer Menge von 100 bis 300 mg pro ml
untersuchtes Blutserum eingesetzt wird.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß das Trägerprotein zu der zu untersuchenden
Probe zu Beginn des Verfahrens und/oder dem zuerst zugesetzten
Differenzierungsreagenz zugesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der Vorangehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß als Trägerprotein Serumalbumin verwendet
wird.
7. Zusammensetzung, die neben den üblichen Reagenzien, die zur
Differenzierung von Cholesterin-haltigen Lipoproteinen mit diesen
in Wechselwirkung treten können, ferner Trägerprotein enthält.
8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
die Reagenzien aus einem homogenen Differenzierungsansatz für
flüssige Medien stammen oder Fällungsmittel, magnetische Partikel
oder Lipoprotein-Antikörper umfassen.
9. Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch
gekennzeichnet, daß das Trägerprotein Serumalbumin ist.
10. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6
oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zur
quantitativen Bestimmung von Lipoproteine
Cholesterinkonzentrationen.
11. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6
oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zur
Diagnose koronarer Herzkrankheiten.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1997101177 DE19701177C2 (de) | 1997-01-15 | 1997-01-15 | Verfahren zur Abtrennung und/oder Bestimmung von Cholesterin aus Lipoproteinfraktionen |
Applications Claiming Priority (1)
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DE1997101177 DE19701177C2 (de) | 1997-01-15 | 1997-01-15 | Verfahren zur Abtrennung und/oder Bestimmung von Cholesterin aus Lipoproteinfraktionen |
Publications (2)
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DE19701177A1 true DE19701177A1 (de) | 1998-07-16 |
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ID=7817445
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DE1997101177 Expired - Lifetime DE19701177C2 (de) | 1997-01-15 | 1997-01-15 | Verfahren zur Abtrennung und/oder Bestimmung von Cholesterin aus Lipoproteinfraktionen |
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---|---|
DE (1) | DE19701177C2 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109507437A (zh) * | 2007-06-08 | 2019-03-22 | 奎斯特诊断投资公司 | 通过差分带电荷微粒迁移率进行脂蛋白分析 |
-
1997
- 1997-01-15 DE DE1997101177 patent/DE19701177C2/de not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Patent Abstracts of Japan, Vol. 5, Nr. 36 (P-51), März 1981, Abstract-Nr. 55-159158A * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109507437A (zh) * | 2007-06-08 | 2019-03-22 | 奎斯特诊断投资公司 | 通过差分带电荷微粒迁移率进行脂蛋白分析 |
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