DE19634121C2 - Verfahren zur Herstellung von Objektträgern für die Elektronenstrahlmikroskopie - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Objektträgern für die ElektronenstrahlmikroskopieInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Objektträgern
für die Elektronenstrahlmikroskopie und danach hergestellte
Objektträger, die insbesondere zur Untersuchung biologischer Objekte im
Molekularbereich Verwendung finden.
Es ist bekannt, Lochfolien aus Metall oder Kohlenstoff im Bereich der
hochauflösenden Elektronenstrahlmikroskopie einzusetzen, um
biologische Proben zu tragen oder zu unterstützen [S. R. Glanvill,
Micron, 1980, Vol.: 11, S. 355-356]. Die der Erfindung am nächsten
kommenden Lochfolien werden in einem relativ aufwendigen Verfahren
hergestellt. Dabei werden zunächst auf einem Substrat unregelmäßig
verteilt Tröpfchen einer Flüssigkeit (z. B. Wasser, Glycerol) aufgebracht.
Darauf werden dünne Filme (z. B. durch Polyvinylformal,
Cellulosetriacetat, Cellulosetributyrat gebildet) abgeschieden, die nicht
durch den Stoff der Tröpfchen lösbar sind. Im Bereich der Tröpfchen
entstehen dabei im aufgebrachten Polymerfilm Löcher oder dünnere
Filmbereiche, letztere werden durch entsprechende Behandlungsschritte
in Löcher überführt. Der Polymerfilm wird vom Substrat gelöst, von
einem weiteren Träger erfaßt und mit Kohlenstoff oder einem Metall
bedampft und anschließend wird der Polymerfilm entfernt, so daß der
gewünschte Objektträger verbleibt. Dieses z. B. in A. Fukami, K. Adachi,
M. Katoh; Jornal of Electron Microscopy, Vol. 21, No. 2, 99-108, 1972
ausführlich beschriebene aufwendige Herstellungsverfahren ermöglicht
jedoch nur die Fertigung von irregulären Netzstrukturen. Zur Schaffung
reproduzierbarer Verhältnisse ist es im Bereich der
Elektronenstrahlmikroskopie jedoch wünschenswert über regelmäßig
verteilte Netz- oder Gitterstrukturen zu verfügen. Solche Strukturen sind
bis in den Nanometerbereich grundsätzlich durch
Mikrostrukturierungsverfahren herstellbar. Aus EP 0 169 492 A2 ist es
zwar bekannt, Fotoresistschichten auf einer Proteinschicht zum Zwecke
des Färbens dieser Schicht, also einem völlig anderen
Verwendungszweck als bei vorliegender Erfindung, herzustellen. Es sind
jedoch bislang keine Strukturierungsverfahren bekannt, die es erlauben,
größere freitragende strukturierte Bereiche in der Größenordnung von
einigen cm2 ganzflächig von einem Trägersubstrat abzulösen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, kostengünstig und mit hoher
Reproduzierbarkeit einen großflächigen Objektträger für die
Elektronenstrahlmikroskopie herzustellen, der regelmäßig verteilte, in
Größe, Form und Anordnung definiert vorgebbare Ausnehmungen
aufweist.
Die Aufgabe wird durch die kennzeichnenden Merkmale des ersten und
elften Patentanspruchs gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind durch
die nachgeordneten Ansprüche erfaßt.
Der Erfindung liegt die Entdeckung zugrunde, daß im Bereich der
Mikrostrukturierung zum Einsatz gelangende, strukturierbare
Maskierungsschichten lokal die Eigenschaften von Biopolymerfilmen
beeinflussen können. Das Wesen der Erfindung besteht in der
Verwendung von enzymatisch abbaubaren Biopolymeropferschichten.
Die Erfindung soll nachstehend anhand eines Ausführungsbeispiels
näher erläutert werden. Die schematischen Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 bis 4 verschiedene Stufen im Prozeß der Herstellung eines
freitragenden Objektträgers gemäß der Erfindung in einem
seitlichen Schnitt und
Fig. 5 eine mögliche Ausführungsform eines Objektträgers für die
Elektronenstrahlmikroskopie in perspektivischer Ansicht in
einem Teilausschnitt.
In Fig. 1 wird auf einen gereinigten Siliziumwafer 1 eine dünne
Biopolymerschicht 2 mit einer Schichtdicke von ca. 200 nm durch
Aufschleudern aufgebracht. Im Beispiel wird diese Schicht durch in
Wasser gelöste 10%ige Gelatine, die mit 5% Glutardialdehyd versetzt
wird gebildet. Diese Schicht ist nicht wasserlöslich und gegen übliche
Fotolackentwickler resistent. Im Beispiel erfolgt eine anschließende
Beschichtung mit einem handelsüblichen Fotoumkehrresist. Die
Fotoresistschicht 3 wird nach Vorschrift behandelt, entsprechend der
später gewünschten Gitter- oder Netzstruktur des Objektträgers für die
Elektronenstrahlmikroskopie maskiert, belichtet und strukturiert. Es liegt
selbstverständlich im Rahmen der Erfindung, für die Schicht 3 auch eine
elektronenstrahlstrukturierbare Lackschicht, bspw. auf PMMA-Basis
einzusetzen, die die Erzeugung noch feinerer Strukturen bis in den
Nanometerbereich ermöglicht. Im Rahmen dieses Beispiels, unter
Verwendung eines Fotoresists, sind relativ problemlos Ausnehmungen 4
(vgl. Fig. 2) mit Kantenlängen bzw. Durchmessern von 1 µm bis 50 µm
in die Fotoresistschicht 3 einbringbar. Der gesamte Schichtverbund
bestehend aus dem Siliziumwafer 1, der quervernetzten Gelantieschicht
2 und der strukturierten Fotoresistschicht 3 wird in einen Behälter 5 mit
einem enzymatisches Bad 6 eingebracht. Im Falle der Verwendung von
Gelatine für die Biopolymerschicht 2 besteht das enzymatische Bad
bevorzugt aus einem Protease K-Puffer, der im wesentlichen durch 10%
SDS, 10 mM NaCl, 10 mM EDTA und Tris-HCI gebildet wird und dem
10 mg/ml Protease K zugegeben sind. Der pH-Wert dieses Bades beträgt
8,5. Unter Einsatz eines solchen enzymatischen Bades erfolgt der
vollständige Abbau einer ca. 200 nm dicken Gelantineschicht 2 bei
Raumtemperatur innerhalb von ca. 8 h. Die nunmehr ganzflächig vom
Siliziumwafer 1 abgelöste Fotoresistschicht 3 wird in destilliertes Wasser
überführt und auf einen Träger 7, bevorzugt in Form eines
Kupfernetzchens aufgeschwemmt. Nach einem entsprechenden
Trocknungsprozeß wird auf die auf dem Träger 7 befindliche
Fotoresistschicht 3 eine elektrisch leitfähige Schicht 8 aufgebracht, die
für den vorgesehenen Verwendungszweck bevorzugt aus Kohlenstoff,
mit entsprechend des späteren Verwendungszweckes frei wählbaren
Schichtdicken im Bereich 1-100 nm, besteht (Fig. 4). Anschließend
erfolgt die Auflösung der Fotoresistschicht 3 mittels Ethanol, so daß ein
in Fig. 5 schematisch dargestellter Objektträger verbleibt.
Der auf dem Gebiet der hochauflösenden Elektronenstrahlmikroskopie
von Biomolekülen (z. B. Cryoelektronenmikroskopie) als auch
zunehmend in der biotechnologischen Nanostrukturtechnik grundsätzlich
bestehende Bedarf nach 1-100 nm dünnen Folien (Membranen) mit
Ausnehmungen, deren Größe, Form und Anordnung quantitativ definiert
vorgebbar und reproduzierbar sind, wird durch vorliegende Erfindung
erstmals befriedigt. Ebenso ist die gezielte Variation der Gitterparameter
innerhalb eines Objektträgers problemlos möglich. Die gemäß der
Erfindung geschaffenen Objektträger bieten den Vorteil, präparative
Standardisierungen durchführen zu können, deren Anwendung zu einer
beträchtlichen Zeitersparnis führt, da jeweils ein optimal angepaßter
Objektträger bereitstellbar ist.
Die gemäß der Erfindung herstellbaren Objektträger weisen regelmäßig
verteilte Netz- oder Gitterstrukturen mit Ausnehmungen für den
vorgesehenen Anwendungsfall in der Größenordnung von 1 nm-50 µm,
Stegbreiten in der Größenordnung von einem Zehntel der Größe der
Ausnehmungen und einer Foliendicke im Bereich von 1 nm bis 1 µm auf
und sind gehaltert durch ein Netz oder Gitter 7, dessen Maschenweiten
bis zu einem Tausendfachen über der Größe genannter Ausnehmungen
festgelegt sind. Es lassen sich im wesentlichen freitragende, flexible und
stabile Objektträger mit einer flächenmäßigen Ausdehnung in der
Größenordnung des eingesetzten Trägersubstrates, bspw. 25 cm2, mit
beliebigen äußeren Berandungsgeometrien herstellen.
Es liegt selbstverständlich an Rahmen der Erfindung auch andere
enzymatisch abbaubare Biopolymere für die Schicht 2, wie bspw. Lipide,
Agarose und diese abbauende Enzyme, wie etwa Lipase, Agarase
einzusetzen. Die beschriebene Ausführungsform stellt jedoch eine
besonders kostengünstige Variante für eine Massenfertigung von
Objektträgern im Sinne der Erfindung dar.
Claims (11)
1. Verfahren zur Herstellung von gitter- oder netzartigen Objektträgern
für die Elektronenstrahlmikroskopie, dadurch gekennzeichnet, daß
- 1. auf einem Trägersubstrat (1) eine dünne Schicht aus einem Biopolymer (2) aufgebracht wird,
- 2. daran anschließend eine an sich übliche Fotoresist- oder strukturierbare Lackschicht (3) aufgebracht und selektiv gegen die Biopolymerschicht in gewünschter, der gitter- oder netzartigen Struktur des zu erzeugenden Objektträgers entsprechend vorgebbarer Weise strukturiert wird,
- 3. der gesamte Schichtverbund (1; 2; 3) mit den in die Fotoresist- oder Lackschicht (3) eingebrachten Ausnehmungen (4) in ein die Biopolymerschicht angreifendes enzymatisches Bad (6) solange eingebracht wird, bis die Biopolymerschicht (2) abgebaut ist,
- 4. die strukturierte Fotoresist- oder Lackschicht (3) von einem Träger (7) aufgenommen und einseitig mit einer elektrisch leitfähigen Schicht (8) beschichtet wird und danach
- 5. die verbliebene Fotoresist- oder Lackschicht (3) selektiv von der elektrisch leitfähigen Schicht (8) abgelöst wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
enzymatisch abbaubare Biopolymerschicht (2) durch eine
aufgeschleuderte Gelatineschicht gebildet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der
enzymatisch abbaubaren Biopolymerschicht (2) eine Dicke in der
Größenordnung von 200 nm gegeben wird.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß die enzymatisch abbaubare Biopolymerschicht (2)
vernetzt, insbesondere quervernetzt wird.
5. Verfahren nach mindestens einem der Anspruch 2 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß die durch Gelatine gebildete enzymatisch
abbaubare Blopolymerschicht (2) durch Zugabe eines Agens vernetzt
wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die
Biopolymerschicht (2) durch eine in Wasser gelöste 10%ige
Gelantinelösung, die mit 5% Glutardialdehyd versetzt wird, gebildet
wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das,
die durch Gelatine gebildete Biopolymerschicht, angreifende
enzymatische Bad (6) durch einen Protease K-Puffer, der mit
Protease K versetzt wird, gebildet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der
Protease K-Puffer SDS, NaCl, EDTA und Tris-HCl enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das
enzymatische Bad durch 10% SDS, 10 mM NaCl, 10 mM EDTA und
Tris-HCl und einer Zugabe von 10 mg/ml Protease K gebildet wird und
der pH-Wert im basischen Bereich eingestellt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-
Wert auf etwa 8,5 eingestellt wird.
11. Objektträger für die Elektronenstrahlmikroskopie hergestellt nach
Anspruch 1 oder 2 und einem der Ansprüche 3 bis 10 mit einer
regelmäßig verteilten Netz- oder Gitterstruktur mit Ausnehmungen in
der Größenordnung von 1 nm-50 µm, Stegbreiten in der
Größenordnung von einem Zehntel des Durchmessers der
Ausnehmungen und einer Foliendicke im Bereich von 1 nm bis 1 µm
gehaltert durch ein Netz oder Gitter (7), dessen Maschenweiten bis zu
einem Tausendfachen der Größe der Ausnehmungen betragen.
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP0169492A2 (de) * | 1984-07-25 | 1986-01-29 | Hoechst Japan Kabushiki Kaisha | Verfahren und Material zur Herstellung mehrfarbiger Reproduktionen |
| US5212050A (en) * | 1988-11-14 | 1993-05-18 | Mier Randall M | Method of forming a permselective layer |
| EP0562371A2 (de) * | 1992-03-23 | 1993-09-29 | Siemens Aktiengesellschaft | Immobilisierung biochemischer Substanzen |
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1996
- 1996-08-23 DE DE1996134121 patent/DE19634121C2/de not_active Expired - Fee Related
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| DE19634121A1 (de) | 1998-02-26 |
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