DE19627032A1 - Non-radioactively labelling nucleoside-3'-phosphate - Google Patents
Non-radioactively labelling nucleoside-3'-phosphateInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung nicht-radioaktiv-markierter Nukleosid-3′-Phosphate sowie die Verwendung des Verfahrens zur Feststellung der Veränderung von DNA durch Substanzen.The invention relates to a method for producing non-radioactively labeled Nucleoside-3'-phosphates and the use of the method for detection the change of DNA by substances.
Krebserregende Stoffe können DNA verändern, z. B. einzelne Basen dieser alkylieren. Dadurch entstehen Alkyl-DNA-Addukte. Diese können mit dem sog. ³²P-Postlabeling-Verfahren nachgewiesen werden. Hierzu wird die DNA enzyma tisch zu Nukleosid-3′-Phosphaten abgebaut, wobei ein Gemisch von Nukleosid- 3′-Phosphaten und alkylierten Nukleosid-3′-Phosphaten erhalten wird. Diese Nukleoside werden mit γ-³²P-ATP markiert, dann voneinander getrennt und anhand der radioaktiven Markierung nachgewiesen.Carcinogenic substances can change DNA, e.g. B. individual bases of this alkylate. This creates alkyl-DNA adducts. These can be 32 P post-labeling procedures can be demonstrated. For this, the DNA enzyma degraded to nucleoside 3'-phosphates, with a mixture of nucleoside 3'-phosphates and alkylated nucleoside-3'-phosphates is obtained. This Nucleosides are labeled with γ-32 P-ATP, then separated and detected using the radioactive label.
Die radioaktive Markierung von Nukleosid-3′-Phosphaten ist nachteilig. Sie ist kosten- und zeitaufwendig. Ferner stellt sie eine Belastung für die Umwelt dar.The radioactive labeling of nucleoside 3'-phosphates is disadvantageous. she is costly and time consuming. It is also a burden on the environment.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem nicht-radioaktiv-markierte Nukleosid-3′-Phosphate, insbesondere in einem Verfahren zur Feststellung der Veränderung von DNA durch Substanzen, hergestellt werden können.The present invention is therefore based on the object of a method provide with the non-radioactive labeled nucleoside 3'-phosphates, especially in a method for detecting the change in DNA can be produced by substances.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.According to the invention, this is the subject of the claims reached.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines nicht-radioaktiv-markierten Nukleosid-3′-Phoshates, das eine Nucleobase, eine Pentose und eine Phosphat-Gruppe aufweist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:The present invention thus relates to a process for the production of a non-radioactive labeled nucleoside 3′-phosphate that contains a nucleobase, has a pentose and a phosphate group, the process being the includes the following steps:
- (a) Kopplung eines einen nicht-radioaktiven Marker aufweisenden Phosphor amidits an ein Nukleosid-3′-Phosphat, und(a) Coupling of a phosphor having a non-radioactive marker amidits to a nucleoside 3'-phosphate, and
- (b) Oxidation des Kopplungsprodukts von (a).(b) Oxidation of the coupling product of (a).
Der Ausdruck "Nukleobase" umfaßt jeden basisch reagierenden Heterocyclus, wie Purin, z. B. Adenin oder Guanin, und Pyrimidin, z. B. Cytosin, Thymidin oder Uracil, sowie Derivate davon.The term "nucleobase" encompasses any basic heterocycle, such as purine, e.g. B. adenine or guanine, and pyrimidine, e.g. B. cytosine, thymidine or Uracil, and derivatives thereof.
Der Ausdruck "Pentose" umfaßt jedes Saccharid, das 5 Kohlenstoff-Atome aufweist, wie D-Ribofuranose und 2-Desoxy-D-ribofuranose. Die Pentose kann über ihr Kohlenstoff-Atom 1 β-glykosidisch an ein Stickstoff-Atom der Nukleo base gebunden sein.The term "pentose" includes any saccharide that has 5 carbon atoms such as D-ribofuranose and 2-deoxy-D-ribofuranose. The pentose can via its carbon atom 1 β-glycosidic to a nitrogen atom of the nucleo base bound.
Der Ausdruck "Phosphat-Gruppe" umfaßt organische und anorganische Phospha te jeglicher Art, z. B. Mono-, Di-, oder Triphosphat. Die Phosphat-Gruppe kann an das Kohlenstoff-Atom 3 der Pentose gebunden sein.The term "phosphate group" includes organic and inorganic phospha te of any kind, e.g. B. mono-, di- or triphosphate. The phosphate group can be on the carbon atom 3 of the pentose must be bound.
Bevorzugte Nukleosid-3′-Phosphate sind Adenosin-, Guanosin-, Cytidin-, Uridin-, 2′-Desoxyadenosin-, 2′-Desoxyguanosin-, 2′-Desoxycytidin- und Thymidin-3′- Phosphat, wobei deren Monophosphate ganz besonders bevorzugt sind.Preferred nucleoside 3'-phosphates are adenosine, guanosine, cytidine, uridine, 2'-deoxyadenosine, 2'-deoxyguanosine, 2'-deoxycytidine and thymidine-3'- Phosphate, the monophosphates of which are particularly preferred.
Ein Nukleosid-3′-Phosphat kann an der Nucleobase verändert, z. B. alkyliert, sein, insbesondere an einem O- und/oder N-Atom. Ein verändertes Nukleosid-3′- Phosphat kann ein solches sein, das z. B. bei einer Alkylierung von DNA durch krebserregende Stoffe entsteht. Auch kann es durch ein Verfahren hergestellt sein, wie in der deutschen Patentanmeldung 196 18 727.3 des Anmelders beschrieben. Auf diese Patentanmeldung wird hiermit ausdrücklich verwiesen.A nucleoside-3'-phosphate can be changed at the nucleobase, e.g. B. alkylated, be, in particular on an O and / or N atom. An altered nucleoside-3′- Phosphate can be one that e.g. B. in an alkylation of DNA carcinogenic substances are created. It can also be made by a process be, as in the applicant's German patent application 196 18 727.3 described. We hereby expressly refer to this patent application.
Der Ausdruck "nicht-radioaktiver Marker" umfaßt jegliche, nicht-radioaktive Verbindungen, die als Marker verwendet werden können. Beispiele solcher Verbindungen sind Enzyme, Antikörper, metallhaltige Marker und Fluoreszenz marker. Von letzteren sind inbesondere solche zu nennen, die sich zur laserindu zierten Fluoreszenz-Detektion eignen. Beispiele solcher sind Fluorescein, Rhoda min und Derivate von diesen.The term "non-radioactive marker" includes any non-radioactive one Compounds that can be used as markers. Examples of such Compounds are enzymes, antibodies, metal-containing markers and fluorescence marker. Of the latter, there are particularly those that are laser indu decorated fluorescence detection. Examples of such are fluorescein, Rhoda min and derivatives of these.
Der Ausdruck "Phosphoramidit" umfaßt jegliches Phosphoramidit, das einen nicht-radioaktiven Marker aufweisen kann. Phosphoramidite sind Diesteramide des 3-wertigen Phosphors. Sie können die allgemeine Struktur (1) aufweisenThe term "phosphoramidite" includes any phosphoramidite that has one may have non-radioactive markers. Phosphoramidites are diester amides of trivalent phosphorus. They can have the general structure (1)
in der
R eine Schutzgruppe, wie eine Cyanoethyl-Gruppe oder ein Derivat
davon, ist und
Alkyl eine Alkylgruppe, wie iso-Propyl, ist.in the
R is a protecting group such as a cyanoethyl group or a derivative thereof, and
Alkyl is an alkyl group such as iso-propyl.
R kann in üblicher Weise abgespalten werden. Günstigerweise erfolgt dies nach der Oxidation in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens. Ist R eine Cyanoethyl-Gruppe oder ein Derivat davon, so kann die Abspaltung mit Ammoni ak erfolgen.R can be split off in the usual way. This is conveniently done after the oxidation in step (b) of the process according to the invention. If R is one Cyanoethyl group or a derivative thereof, the elimination with ammoni ak done.
Die Bindung zwischen dem Phosphoramidit und dem nicht-radioaktiven Marker kann direkt oder über einen Linker, z. B. eine Alkylgruppe, wie Hexyl, erfolgen. Der Fachmann kennt Materialien und Verfahren eine solche Bindung zu erhalten.The bond between the phosphoramidite and the non-radioactive marker can directly or via a linker, e.g. B. an alkyl group such as hexyl. The person skilled in the art knows materials and processes for obtaining such a bond.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird in Schritt (a) ein einen nicht-radioaktiven Marker aufweisendes Phosphoramidit an ein Nukleosid-3′-Phosphat gekoppelt. Die Kopplung erfolgt günstigerweise in Lösung, d. h. das Phosphoramidit und das Nukleosid-3′-Phosphat sind nicht an einen Träger gebunden. Geeignete Lö sungsmittel sind wäßrige Lösungsmittel und nicht-wäßrige Lösungsmittel, wie DMF, DMSO und Butanaol. Vorteilhafterweise wird die Kopplung in Gegenwart eines Kopplungskatalysators, z. B. Tetrazol, durchgeführt. In the method according to the invention, a non-radioactive one is used in step (a) Phosphoramidite containing markers coupled to a nucleoside-3'-phosphate. The coupling is advantageously carried out in solution, i.e. H. the phosphoramidite and that Nucleoside 3'-phosphate are not bound to a support. Suitable Lö solvents are aqueous solvents and non-aqueous solvents such as DMF, DMSO and butanaol. The coupling is advantageously in the presence a coupling catalyst, e.g. B. tetrazole performed.
Ferner ist es günstig, das Phosphoramidit an die 5′-OH-Gruppe der Pentose des Nukleosid-3′-Phosphates zu koppeln. Hierzu kann es vorteilhaft sein, andere OH- Gruppen der Pentose durch Schutzgruppen abzudecken. Beispiele solcher Schutzgruppen sind Dimethoxytrityl-, Silyl- und/oder Acylgruppen, wie Phenyla cetyl- und Acetylgruppen. Die Schutzgruppen können nach Schritt (b) in üblicher Weise abgespalten werden.It is also advantageous to add the phosphoramidite to the 5′-OH group of the pentose To couple nucleoside-3'-phosphates. For this purpose it can be advantageous to use other OH Cover groups of the pentose with protective groups. Examples of such Protecting groups are dimethoxytrityl, silyl and / or acyl groups, such as phenyla cetyl and acetyl groups. The protective groups can be used in step (b) in the usual way Be split off.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist das Nukleosid-3′-Phosphat an einzelnen bis allen OH-Gruppen der Phosphat- Gruppe Schutzgruppen auf. Beispiele solcher Schutzgruppen sind Cyanoethyl gruppen und Derivate davon. Die Schutzgruppen können nach Schritt (b) in üblicher Weise abgespalten werden.In a preferred embodiment of the method according to the invention the nucleoside 3'-phosphate on individual to all OH groups of the phosphate Group protecting groups. Examples of such protective groups are cyanoethyl groups and derivatives thereof. After step (b), the protective groups can be in be split off in the usual way.
Im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt in Schritt (b) die Oxidation des Kopp lungsprodukts von Schritt (a). Dabei wird der 3-wertige Phosphor des Phosphor amidits zum 5-wertigen Phosphor oxidiert, d. h. es entsteht ein Phosphat-Derivat. Als Oxidationsmittel können jegliche Verbindungen verwendet werden, die 3- wertigen Phosphor zum 5-wertigen Phosphor oxidieren können. Ein Beispiel solcher Verbindungen ist Cumolhydroperoxid. Liegt nach Schritt (a) ein Kopp lungsprodukt vor, bei dem das Phosphoramidit an die 5′-OH-Gruppe der Pentose des Nukleosid-3′-Phosphats gekoppelt ist, wird nach Oxidation in Schritt (b) ein Nukleosid-3′,5′-bisphosphat erhalten.In the process according to the invention, the oxidation of the coupling takes place in step (b) product of step (a). The trivalent phosphorus becomes the phosphorus amidits oxidized to the 5-valent phosphorus, d. H. a phosphate derivative is formed. Any compounds which are 3- can oxidize valuable phosphorus to 5-valent phosphorus. An example such compounds is cumene hydroperoxide. After step (a) there is a coupling Lung product before, in which the phosphoramidite to the 5'-OH group of the pentose of the nucleoside-3'-phosphate is coupled, after oxidation in step (b) Nucleoside 3 ', 5'-bisphosphate obtained.
Der Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann direkt nach dem Schritt (a) erfolgen. Andererseits kann auch zwischen den Schritten (a) und (b) ein Reinigungs- und/oder Trennschritt in üblicher Weise erfolgen.Step (b) of the method according to the invention can be carried out directly after the step (a) take place. On the other hand, there can also be between steps (a) and (b) Cleaning and / or separation step take place in the usual way.
Beispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Fig. 1 und 2 darge stellt.Examples of the method according to the invention are shown in FIGS . 1 and 2 Darge.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, nicht-radioaktiv-markierte Nukleosid-3′-Phosphate herzustellen. Diese Nukleosid-3′-Phosphate sind somit auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung.With the method according to the invention it is possible to use non-radioactive labels To produce nucleoside 3'-phosphates. These nucleoside 3'-phosphates are thus also the subject of the present invention.
Ferner zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, daß kaum Nebenprodukte entstehen. Auch ist es einfach durchzuführen, wobei die Bela stung für die Umwelt verschwindend gering ist. Insbesondere eignet sich die vorliegende Erfindung dazu, ein Schritt in jeglichem Verfahren zu sein, bei dem nicht-radioaktiv-markierte Nukleosid-3′-Phosphate erhalten werden sollen. Ein solches Verfahren ist z. B. jenes, bei dem die Veränderung einer Nukleinsäure durch Substanzen bestimmt werden soll. Dieses Verfahren, nachstehend mit Nachweisverfahren bezeichnet, umfaßt vorzugsweise die folgenden Schritte:Furthermore, the inventive method is characterized in that hardly By-products arise. It is also easy to do, taking the Bela environmental impact is negligible. The is particularly suitable present invention to be a step in any process in which non-radioactive labeled nucleoside 3'-phosphates are to be obtained. A such a method is e.g. B. that in which the change of a nucleic acid to be determined by substances. This procedure, below with Designation method preferably includes the following steps:
- (1) Inkubation einer Nukleinsäure mit einer Substanz,(1) incubation of a nucleic acid with a substance,
- (2) Abbau der Nukleinsäure zu Nukleosid-3′-Phosphaten,(2) degradation of the nucleic acid to nucleoside-3'-phosphates,
- (3) Markierung der Nukleosid-3′-Phosphate mit einem nicht-radioaktiven Marker nach vorstehendem, erfindungsgemäßen Verfahren, und(3) Labeling the nucleoside 3'-phosphates with a non-radioactive Markers according to the above method according to the invention, and
- (4) Trennung sowie Nachweis der nicht-radioaktiv-markierten Nukleosid-3′- Phosphate.(4) Separation and detection of the non-radioactive labeled nucleoside-3'- Phosphates.
Das Nachweisverfahren ist in Fig. 3 dargestellt.The detection method is shown in Fig. 3.
In Schritt (1) des Nachweisverfahrens wird eine Nukleinsäure mit einer Substanz inkubiert. Der Ausdruck "Nukleinsäure" umfaßt Nukleinsäuren jeglicher Art, z. B. DNA und RNA. Die Nukleinsäure kann in Zellen oder als solche vorliegen. Für die Inkubation der Nukleinsäure mit der Substanz können übliche Bedingungen gewählt werden.In step (1) of the detection method, a nucleic acid with a substance incubated. The term "nucleic acid" includes nucleic acids of any kind, e.g. B. DNA and RNA. The nucleic acid can be present in cells or as such. For the Incubation of the nucleic acid with the substance can be common conditions to get voted.
In Schritt (2) des Nachweisverfahrens wird die Nukleinsäure zu Nukleosid-3′- Phosphaten abgebaut. Vorzugsweise geschieht dies enzymatisch, beispielsweise mit Nukleasen, wie Exonukleasen, z. B. Kalbs-Milz-Phosphodiesterase oder Endonukleasen, z. B. Mikrokokkus-Nuklease. Die Bedingungen für den Abbau sind dem Fachmann bekannt. Es werden Nukleosid-3′-Phosphate erhalten, die verändert, z. B. alkyliert sein können, wenn die Substanz eine verändernde Wirkung auf die Nukleinsäure hat. Günstig kann es sein, vor dem Abbau der Nukleinsäure diese mit Restriktionsenzymen zu behandeln. Damit wird die Nukleinsäure in Fragmente gespalten, die voneinander getrennt werden können. Dies kann durch übliche Verfahren, wie Gelelektrophorese, erfolgen. Durch den Abbau der Fragmente können veränderte Nukleosid-3′-Phosphate bestimmten Bereichen der Nukleinsäure zugeordnet werden. Ferner kann es günstig sein, veränderte Nukleosid-3′-Phosphatevor ihrer Markierung anzureichern. Dies kann in üblicher Weise, z. B. durch Extraktion, wie Extraktion mit n-Butanol, und/oder durch Chromatographie, erfolgen.In step (2) of the detection method, the nucleic acid is converted to nucleoside-3'- Degraded phosphates. This is preferably done enzymatically, for example with nucleases, such as exonucleases, e.g. B. calf-spleen phosphodiesterase or Endonucleases, e.g. B. Micrococcus nuclease. The conditions for mining are known to the person skilled in the art. Nucleoside 3'-phosphates are obtained which changed, e.g. B. may be alkylated if the substance is changing Has an effect on the nucleic acid. It can be cheap before the dismantling of the Treat nucleic acid with restriction enzymes. With that the Nucleic acid cleaved into fragments that can be separated. This can be done by conventional methods such as gel electrophoresis. By the Degradation of the fragments can determine modified nucleoside 3'-phosphates Areas of the nucleic acid are assigned. It can also be beneficial Enrich modified nucleoside 3′-phosphates before labeling. This can in the usual way, e.g. B. by extraction, such as extraction with n-butanol, and / or by chromatography.
In Schritt (3) des Nachweisverfahrens werden die Nukleosid-3′-Phosphate mit einem nicht-radioaktiven Marker markiert. Dies erfolgt mittels des vorstehenden, erfindungsgemäßen Verfahrens.In step (3) of the detection method, the nucleoside-3'-phosphates with marked a non-radioactive marker. This is done using the above, inventive method.
In Schritt (4) des Nachweisverfahrens erfolgt die Trennung und der Nachweis der nicht-radioaktiv-markierten Nukleosid-3′-Phosphate. Die Trennung kann in üblicher Weise erfolgen. Günstig ist, sie mittels Kapillargelelektrophorese durch zuführen. Für den Nachweis können ebenfalls übliche Verfahren verwendet werden. Es bietet sich an, den Nachweis auf den einzelnen Marker der Nukleo sid-3′-Phosphate abzustellen. Im Falle eines Fluoreszenmarkers kann es günstig sein, den Nachweis mittels laserinduzierter Fluoreszenzdetektion durchzuführen.In step (4) of the detection procedure, the separation and detection takes place of the non-radioactive labeled nucleoside 3'-phosphates. The separation can be in done in the usual way. It is favorable to use capillary gel electrophoresis respectively. Usual methods can also be used for the detection will. It lends itself to the detection of the individual marker of the nucleo turn off sid-3'-phosphates. In the case of a fluorescence marker, it can be cheap be carried out by means of laser-induced fluorescence detection.
In Schritt (4) des Nachweisverfahrens werden die üblichen, d. h. vier, Nukleosid- 3′-Phosphate nachgewiesen, wenn die Substanz keine verändernde Wirkung auf die Nukleinsäure hat. Werden weitere Nukleosid-3′-Phosphate nachgewiesen, ist dies ein Zeichen für das Vorliegen veränderter Nukleosid-3′-Phosphate, was besagt, daß die Substanz eine verändernde Wirkung auf die Nukleinsäure hat. Die quantitative Bestimmung der veränderten Nukleosid-3′-Phosphate sowie deren Strukturaufklärung ist durch den Vergleich mit den üblichen, d. h. vier, Nukleosid-3′-Phosphaten als Standard möglich. In step (4) of the detection procedure, the usual, i.e. H. four, nucleoside 3'-phosphates detected when the substance has no changing effect has the nucleic acid. If more nucleoside 3'-phosphates are detected, is this is a sign of the presence of modified nucleoside-3'-phosphates, what states that the substance has a changing effect on the nucleic acid. The quantitative determination of the modified nucleoside 3'-phosphates as well their structure elucidation is by comparison with the usual, i.e. H. four, Nucleoside-3'-phosphates possible as standard.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, geringste durch eine Substanz hervorgerufene Veränderungen einer Nukleinsäure nachzuweisen. Dieser Nach weis erfolgt ohne Verwendung von Radioaktivität. Die vorliegende Erfindung eignet sich daher bestens für ein groß-angelegtes Screening von Substanzen jeglicher Art, insbesondere Arzneistoffe, die hinsichtlich ihrer Nukleinsäure- schädigenden Wirkung untersucht werden sollen.With the present invention, it is possible to do the least by one substance detected changes in a nucleic acid. This after white is done without the use of radioactivity. The present invention is therefore ideal for large-scale screening of substances of any kind, in particular medicinal substances, which with regard to their nucleic acid harmful effects should be investigated.
Fig. 1 zeigt die Herstellung von fluoreszenz-markiertem N3-Alkyl-dT- 3′,5′-bisphosphat, Fig. 1 shows the production of fluorescence-labeled N3-alkyl-dT-3 ', 5'-bisphosphate,
Fig. 2 zeigt die Herstellung von Fluorescein-markiertem N³Butyldesoxy thymidin-3′,5′-bisphosphat, und Fig. 2 shows the preparation of fluorescein-labeled N³butyldeoxy thymidine-3 ', 5'-bisphosphate, and
Fig. 3 zeigt ein Verfahren zur Feststellung der Veränderung von DNA durch Substanzen. Fig. 3 shows a method for determining the change of DNA by substances.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.The following example illustrates the invention.
Die Herstellung und die Struktur von 4 sind in Fig. 2 dargestellt.The manufacture and structure of 4 are shown in FIG. 2.
30 µl einer 0,1 M Tetrazol-Lösung (7 mg/ml in Acetonitril) und 500 µl des cyanoethylgeschützten Thymidin-Derivates 2 (2 µmol in 500 ml trockenem Acetonitril) wurden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. 30 µl einer 0,1 M Lösung des Fluoresceinamidits 1 wurden zugegeben und unter Rühren während einer Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt.30 ul of a 0.1 M tetrazole solution (7 mg / ml in acetonitrile) and 500 ul of cyanoethyl protected thymidine derivative 2 (2 µmol in 500 ml dry Acetonitrile) were placed in a reaction vessel. 30 µl of a 0.1 M solution of fluorescein amidite 1 were added and with stirring during a Hour at room temperature.
Danach wurden 30 µl einer 0,1 M Lösung von Cumolhydroperoxid (140 µl einer
70%igen Lösung von Cumolhydroperoxid + 860 µl trockenes Acetonitril) zu
gegeben und 1 Minute umgesetzt. Dann wurde die Oxidation durch Zugabe von
100 µl Isopropanol gestoppt. Es wurde 3 erhalten. Die Reinigung von 3 erfolgte
mittels präperativer HPLC in üblicher Weise.
Charakterisierung von 3:
ESI+Q1 MS (C₅₈H₆₈N₆O₁₉P₂ 1214,4 g/mol): m/z 1237,3 ([M+Na]⁺, 50%)
3 wurde in 500 µl konzentriertem wäßrigen Ammoniak aufgenommen und 16
Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde 4 erhalten. Die Reinigung von
4 erfolgte mittels HPLC.
Charakterisierung von 4:
ESI-Q1 MS (C₄₁H₄₇N₃O₁₇P₂, 914,4 g/mol): m/z 914,2 ([M-H]⁺, 20%),
456,8 ([M-2H]2-, 100%).Then 30 ul of a 0.1 M solution of cumene hydroperoxide (140 ul of a 70% solution of cumene hydroperoxide + 860 ul dry acetonitrile) were added and reacted for 1 minute. The oxidation was then stopped by adding 100 μl of isopropanol. 3 was obtained. 3 was purified by preparative HPLC in the usual way.
Characterization of 3:
ESI + Q1 MS (C₅₈H₆₈N₆O₁₉P₂ 1214.4 g / mol): m / z 1237.3 ([M + Na] ⁺, 50%)
3 was taken up in 500 ul concentrated aqueous ammonia and incubated for 16 hours at room temperature. 4 were obtained. 4 was purified by HPLC.
Characterization of 4:
ESI-Q1 MS (C₄₁H₄₇N₃O₁₇P₂, 914.4 g / mol): m / z 914.2 ([MH] ⁺, 20%), 456.8 ([M-2H] 2- , 100%).
Claims (15)
- (a) Kopplung eines einen nicht-radioaktiven Marker aufweisenden Phosphoramidits an ein Nukcleosid-3′-Phosphat, und
- (b) Oxidation des Kopplungsprodukts von (a).
- (a) coupling a phosphoramidite containing a non-radioactive marker to a nuccleoside-3'-phosphate, and
- (b) Oxidation of the coupling product of (a).
- (1) Inkubation einer Nukleinsäure mit einer Substanz,
- (2) Abbau der Nukleinsäure zu Nukleosid-3′-Phosphaten,
- (3) Markierung der Nukleosid-3′-Phosphate mit einem nicht-radioakti ven Marker nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, und
- (4) Trennung und Nachweis der nicht-radioaktiv-markierten Nukleosid- 3′-Phosphate.
- (1) incubation of a nucleic acid with a substance,
- (2) degradation of the nucleic acid to nucleoside-3'-phosphates,
- (3) Labeling the nucleoside-3'-phosphates with a non-radioactive marker according to the method according to any one of claims 1-9, and
- (4) Separation and detection of the non-radioactive labeled nucleoside 3'-phosphates.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1996127032 DE19627032C2 (en) | 1996-07-04 | 1996-07-04 | Process for the degradation of potentially modified nucleic acids |
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| DE (1) | DE19627032C2 (en) |
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| WO2001083502A1 (en) * | 2000-04-28 | 2001-11-08 | Aclara Biosciences, Inc. | Tag library compounds, compositions, kits and methods of use |
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| DE4023212C2 (en) * | 1989-07-28 | 1991-11-07 | Fzb Biotechnik Berlin Gmbh, O-1017 Berlin, De |
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1996
- 1996-07-04 DE DE1996127032 patent/DE19627032C2/en not_active Expired - Fee Related
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
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Ipc: C07H 19/20 |
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