DE19627032C2 - Process for the degradation of potentially modified nucleic acids - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abbau von potentiell veränderten Nukleinsäuren sowie die Verwendung des Verfahrens zur Feststellung der Ver änderung von Nukleinsäuren durch Nukleinsäuren-modifizierende Substanzen.The invention relates to a method for breaking down potentially modified Nucleic acids and the use of the method for determining the ver Modification of nucleic acids by nucleic acid-modifying substances.
Krebserregende Stoffe können DNA verändern, z. B. einzelne Basen dieser alkylieren. Dadurch entstehen DNA-Alkyl-Addukte. Diese können mit dem sog. 32P-Postlabeling-Verfahren nachgewiesen werden. Hierzu wird die DNA enzyma tisch zu Nucleosid-3'-Phosphaten abgebaut, wobei ein Gemisch von Nucleosid- 3'-Phosphaten und alkylierten Nucleosid-3'-Phosphaten erhalten wird. Die Nucleoside werden mit y-32P-ATP markiert, dann voneinander getrennt und anhand der radioaktiven Markierung nachgewiesen.Carcinogenic substances can change DNA, e.g. B. alkylate individual bases of these. This creates DNA-alkyl adducts. These can be demonstrated using the so-called 32 P post-labeling method. For this purpose, the DNA is enzymatically broken down to nucleoside 3'-phosphates, a mixture of nucleoside 3'-phosphates and alkylated nucleoside 3'-phosphates being obtained. The nucleosides are labeled with y- 32 P-ATP, then separated from each other and detected using the radioactive label.
Die radioaktive Markierung von Nucleosid-3'-Phosphaten ist nachteilig. Sie ist kosten- und zeitaufwendig. Ferner stellt sie eine Belastung für die Umwelt dar.Radioactive labeling of nucleoside 3'-phosphates is disadvantageous. she is costly and time consuming. It is also a burden on the environment.
DE-C-40 23 212 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung fluoreszenzmarkierter Nukleoside, Nukleotide und Oligonukleotide, die als Sonden und Primer für die Sequenzanalyse einsetzbar sind. Dabei wird ein Fluorophor aus einem fluoreszie renden Farbstoff, der über einen Linker an ein Phosphoramidit gebunden ist, eingesetzt. Diese Verbindung wird mit Nukleosiden oder Nukleotiden umgesetzt.DE-C-40 23 212 describes a method for producing fluorescence-labeled Nucleosides, nucleotides and oligonucleotides that act as probes and primers for the Sequence analysis can be used. This turns a fluorophore from a fluoreszie dye which is bound to a phosphoramidite via a linker, used. This connection is implemented with nucleosides or nucleotides.
Azadnia et al., Anal. Biochem. 218 (1994), S. 444-448 beschreibt die Her stellung von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden, wobei zuerst eine Phosphat gruppe eines Nukleotids, das keine Phosphatgruppe an der 3'-OH-Gruppe auf weist, in ein stabiles 5'-Phosphoramidat umgewandelt wird, an das dann ein Fluoreszenzmarker gebunden wird. Die so erhaltenen fluoreszenzmarkierten Nukleosid-5'-Phosphate werden als Markierungen in einem Fluoreszenz-Postlabe ling-Verfahren zum Nachweis von DNA-Schäden eingesetzt.Azadnia et al., Anal. Biochem. 218 (1994), pp. 444-448 describes the Her Position of fluorescence-labeled nucleotides, first a phosphate group of a nucleotide that has no phosphate group on the 3'-OH group shows, is converted into a stable 5'-phosphoramidate, to which then Fluorescent marker is bound. The fluorescent labeled thus obtained Nucleoside 5'-phosphates are used as labels in a fluorescent postlabe Ling method used to detect DNA damage.
CA 119 (1993) 181159c beschreibt fluoreszenzmarkierte Phosphoramidite, die an ein Oligonukleotid gebunden und nachfolgend oxidiert werden.CA 119 (1993) 181159c describes fluorescent-labeled phosphoramidites that bound to an oligonucleotide and subsequently oxidized.
CA 119 (1993) 181145v beschreibt fluoreszenzmarkierte Phosphoramidite, die an die 5'-OH-Gruppe von Oligonukleotiden gebunden werden.CA 119 (1993) 181145v describes fluorescence-labeled phosphoramidites that be bound to the 5'-OH group of oligonucleotides.
CA 109 (1988) 226177u beschreibt ein Verfahren zur kovalenten Bindung eines Fluoreszenzmarkers an die 5'-Phosphatgruppe einer Nukleinsäure unter Beteili gung einer 5'-Phosphoramidierung mit Ethylendiamin und nachfolgender Anbin dung der freien Aminogruppe des Phosphoramidats an Dansylchlorid.CA 109 (1988) 226177u describes a method for covalently binding a Fluorescence marker on the 5'-phosphate group of a nucleic acid with participation a 5'-phosphoramidation with ethylenediamine and subsequent binding Formation of the free amino group of phosphoramidate on dansyl chloride.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem nicht-radioaktiv-markierte Nucleosid-3'-Phosphate, insbesondere Nucleosid-3',5'-Biphosphate, in einem Verfahren zur Feststellung einer potentiellen Veränderung von DNA, hergestellt werden können.The present invention is therefore based on the object of a method provide with the non-radioactive labeled nucleoside 3'-phosphates, especially nucleoside-3 ', 5'-biphosphates, in a detection method a potential change in DNA.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.According to the invention, this is the subject of the claims reached.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zum Abbau von
potentiell veränderten Nukleinsäuren, umfassend die folgenden Schritte:
The present invention thus relates to a process for the degradation of potentially modified nucleic acids, comprising the following steps:
- 1. Spaltung der potentiell veränderten Nukleinsäure zu Nucleosid-3'- Phosphaten,1. Cleavage of the Potentially Modified Nucleic Acid to Nucleoside-3'- Phosphates,
-
2. Markierung der Nukleosid-3'-Phosphate am 5'-Ende umfassend die
folgenden Schritte:
- a) Kopplung eines einen nicht-radioaktiven Marker auf weisenden Phosphoramidits an das Nukleosid-3'-Phos phat, und
- b) Oxidation des Kopplungsprodukts von (a),
- a) coupling of a non-radioactive marker pointing phosphoramidite to the nucleoside 3'-phosphate, and
- b) oxidation of the coupling product of (a),
- 3. Trennung und Nachweis der nicht-radioaktiv markierten Nukleosid- 3',5'-Biphosphate.3. Separation and detection of the non-radioactive labeled nucleoside 3 ', 5'-biphosphates.
Bevorzugte Nucleosid-3'-Phosphate sind Adenosin-, Guanosin-, Cytidin-, Uridin-, 2'-Desoxyadenosin-, 2'-Desoxyguanosin-, 2'-Desoxycytosin- und Thymidin-3'- Phosphat, wobei deren Monophosphate ganz besonders bevorzugt sind.Preferred nucleoside 3'-phosphates are adenosine, guanosine, cytidine, uridine, 2'-deoxyadenosine, 2'-deoxyguanosine, 2'-deoxycytosine and thymidine-3'- Phosphate, the monophosphates of which are particularly preferred.
Ein Nucleosid-3'-Phosphat kann an der Nucleobase alkyliert sein, insbesondere an einem O- und/oder N-Atom. Ein alkyliertes Nucleosid-3'-Phosphat kann z. B. ein solches sein, das bei der Alkylierung von DNA durch kebserregende Stoffe entsteht. Auch kann es durch ein Verfahren hergestellt sein, wie in der deut schen Patentanmeldung 196 18 727.3 des Anmelders beschrieben. Auf diese Patentanmeldung wird hiermit ausdrücklich verwiesen.A nucleoside 3'-phosphate may be alkylated on the nucleobase, particularly on an O and / or N atom. An alkylated nucleoside 3'-phosphate can e.g. B. be one that occurs in the alkylation of DNA by carcinogenic substances arises. It can also be produced by a method, as in the German described patent application 196 18 727.3 of the applicant. To this Patent application is hereby expressly referenced.
Der Ausdruck "nicht-radioaktiver Marker" umfaßt jegliche, nicht-radioaktive Verbindungen, die als Marker verwendet werden können. Beispiele solcher Verbindungen sind Enzyme, Antikörper und Fluoreszenzmarker. Von letzteren sind inbesondere solche zu nennen, die sich zur laserinduzierten Fluoreszenz- Detektion eignen. Beispiele solcher sind Fluorescein, Rhodamin und Derivate von diesen.The term "non-radioactive marker" includes any non-radioactive one Compounds that can be used as markers. Examples of such Compounds are enzymes, antibodies and fluorescent markers. From the latter in particular, those are to be mentioned which are suitable for laser-induced fluorescence Suitable detection. Examples of such are fluorescein, rhodamine and derivatives of this.
Der Ausdruck " Phosphoramidit" umfaßt jegliches Phosphoramidit, das einen
nicht-radioaktiven Marker aufweisen kann. Phosphoramidite sind Diesteramide
des 3-wertigen Phosphors. Sie können die allgemeine Struktur (1) aufweisen
The term "phosphoramidite" includes any phosphoramidite that may have a non-radioactive label. Phosphoramidites are diesteramides of trivalent phosphorus. They can have the general structure (1)
in der
R eine Schutzgruppe, wie eine Cyanoethyl-Gruppe oder ein Derivat
davon, ist und
Alkyl eine Alkylgruppe, wie iso-Propyl, ist.in the
R is a protecting group such as a cyanoethyl group or a derivative thereof, and
Alkyl is an alkyl group such as iso-propyl.
R kann in üblicher Weise abgespalten werden. Günstigerweise erfolgt dies nach der Oxidation in Schritt 2(b) des erfindungsgemäßen Verfahrens. Ist R eine Cyanoethyl-Gruppe oder ein Derivat davon, so kann die Abspaltung mit Ammoni ak erfolgen.R can be split off in the usual way. This is conveniently done after the oxidation in step 2 (b) of the process according to the invention. If R is one Cyanoethyl group or a derivative thereof, the elimination with ammoni ak done.
Die Bindung zwischen dem Phosphoramidit und dem nicht-radioaktiven Marker kann direkt oder über einen Linker, z. B. eine Alkylgruppe, wie Hexyl, erfolgen. Der Fachmann kennt Materialien und Verfahren eine solche Bindung zu erhalten.The bond between the phosphoramidite and the non-radioactive marker can directly or via a linker, e.g. B. an alkyl group such as hexyl. The person skilled in the art knows materials and processes for obtaining such a bond.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird in Schritt 2(a) ein einen nicht-radioaktiven Marker aufweisendes Phosphoramidit an ein Nucleosid-3'-Phosphat gekoppelt. Die Kopplung erfolgt günstigerweise in Lösung, d. h. das Phosphoramidit und das Nucleosid-3'-Phosphat sind nicht an einen Träger gebunden. Geeignete Lö sungsmittel sind wäßrige Lösungsmittel. Vorteilhafterweise wird die Kopplung in Gegenwart eines Kopplungskatalysators, z. B. Tetrazol, durchgeführt.In step 2 (a) of the method according to the invention, a is a non-radioactive one Phosphoramidite containing markers coupled to a nucleoside 3'-phosphate. The coupling is advantageously carried out in solution, i.e. H. the phosphoramidite and that Nucleoside 3'-phosphate are not attached to a support. Suitable Lö solvents are aqueous solvents. The coupling is advantageously in Presence of a coupling catalyst, e.g. B. tetrazole performed.
Ferner ist es günstig, das Phosphoramidit an die 5'-OH-Gruppe der Pentose des Nucleosid-3'-Phosphates zu koppeln. Hierzu kann es vorteilhaft sein, andere OH- Gruppen der Pentose durch Schutzgruppen abzudecken. Beispiele solcher Schutzgruppen sind Dimethoxytrityl-Silyl- und/oder Acylgruppen, wie Phenyla cetyl- und Acetylgruppen. Die Schutzgruppen können nach Schritt (b) in üblicher Weise abgespalten werden.It is also favorable to attach the phosphoramidite to the 5'-OH group of the pentose To couple nucleoside-3'-phosphates. For this purpose it can be advantageous to use other OH Cover groups of the pentose with protective groups. Examples of such Protecting groups are dimethoxytrityl silyl and / or acyl groups, such as phenyla cetyl and acetyl groups. The protective groups can be used in step (b) in the usual way Be split off.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist das Nucleosid-3'-Phosphat an einzelnen bis allen OH-Gruppen der Phosphat- Gruppe Schutzgruppen auf. Beispiele solcher Schutzgruppen sind Cyanoethyl gruppen und Derivate davon. Die Schutzgruppen können nach Schritt (b) in üblicher Weise abgespalten werden.In a preferred embodiment of the method according to the invention the nucleoside 3'-phosphate on individual to all OH groups of the phosphate Group protecting groups. Examples of such protective groups are cyanoethyl groups and derivatives thereof. After step (b), the protective groups can be in be split off in the usual way.
Im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt in Schritt 2(b) die Oxidation des Kopp lungsprodukts von Schritt 2(a). Dabei wird der 3-wertige Phosphor des Phospho ramidits zum 5-wertigen Phosphor oxidiert, d. h. es entsteht ein Phosphat-Deri vat. Als Oxidationsmittel können jegliche Verbindungen verwendet werden, die 3-wertigen Phosphor zum 5-wertigen Phosphor oxidieren können. Ein Beispiel solcher Verbindungen ist Cumolhydroperoxid. Liegt nach Schritt 2(a) ein Kopp lungsprodukt vor, bei dem das Phosphoramidit an die 5'-OH-Gruppe der Pentose des Nucleosid-3'-Phosphats gekoppelt ist, wird nach Oxidation in Schritt 2(b) ein Nucleosid-3',5'-diphosphat erhalten.In the method according to the invention, the oxidation of the coupling takes place in step 2 (b) product of step 2 (a). The trivalent phosphorus of the phospho ramidits oxidized to the 5-valent phosphorus, d. H. a phosphate deri is formed vat. Any compound that can be used as the oxidizing agent Can oxidize trivalent phosphorus to trivalent phosphorus. An example such compounds is cumene hydroperoxide. If there is a buck after step 2 (a) tion product in which the phosphoramidite is attached to the 5'-OH group of the pentose of the nucleoside-3'-phosphate is coupled after oxidation in step 2 (b) Nucleoside 3 ', 5'-diphosphate obtained.
Der Schritt 2(b) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann direkt nach dem Schritt (a) erfolgen. Andererseits kann auch zwischen den Schritten 2(a) und 2(b) ein Reinigungs- und/oder Trennschritt in üblicher Weise erfolgen.Step 2 (b) of the method according to the invention can be carried out directly after the Step (a). On the other hand, between steps 2 (a) and 2 (b) a cleaning and / or separation step is carried out in the usual way.
Beispiele von Verbindungen, die im erfindungsgemäßen Verfahren entstehen, sind in den Fig. 1 und 2 dargestellt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist in Fig. 3 dargestellt.Examples of compounds which arise in the process according to the invention are shown in FIGS. 1 and 2. The method according to the invention is shown in FIG. 3.
Ferner zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, daß kaum Nebenprodukte entstehen. Auch ist es einfach durchzuführen, wobei die Bela stung für die Umwelt verschwindend gering ist.Furthermore, the inventive method is characterized in that hardly By-products arise. It is also easy to do, taking the Bela environmental impact is negligible.
Eine potentiell veränderte Nukleinsäure kann beispielsweise dadurch entstehen, daß eine Nucleinsäure mit einer Substanz inkubiert wird, die ein Nukleinsäure modifizierendes Potential haben könnte. Der Ausdruck "Nucleinsäure" umfaßt Nucleinsäuren jeglicher Art, z. B. DNA und RNA. Die Nucleinsäure kann in Zellen oder als solche vorliegen. Für die Inkubation der Nucleinsäure mit der Substanz können übliche Bedingungen gewählt werden.A potentially modified nucleic acid can arise, for example, by that a nucleic acid is incubated with a substance that is a nucleic acid could have modifying potential. The term "nucleic acid" includes Nucleic acids of any kind, e.g. B. DNA and RNA. The nucleic acid can be in cells or exist as such. For the incubation of the nucleic acid with the substance usual conditions can be selected.
In Schritt (1) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Nucleinsäure zu Nucleosid-3'-Phosphaten abgebaut. Vorzugsweise geschieht dies enzymatisch, z. B. mit Exonucleasen, wie Mikrokokkus-Nuclease oder Kalbs-Milz-Phosphodie sterase. Die Bedingungen für den Abbau sind dem Fachmann bekannt. Es werden Nucleosid-3'-Phosphate erhalten, die verändert, z. B. alkyliert sein können, wenn die Substanz eine verändernde Wirkung auf die Nucleinsäure hat. Günstig kann es sein, vor dem Abbau der Nucleinsäure diese mit Restriktions enzymen zu behandeln. Damit wird die Nucleinsäure in Fragmente gespalten, die voneinander getrennt werden können. Dies kann durch übliche Verfahren, wie Gelelektrophorese, erfolgen. Durch den Abbau der Fragmente können veränderte Nucleosid-3'-Phosphate bestimmten Bereichen der Nucleinsäure zugeordnet werden. Ferner kann es günstig sein, veränderte Nucleosid-3'-Phosphate vor ihrer Markierung anzureichern. Dies kann in üblicher Weise, z. B. durch Extrak tion, wie Extraktion mit n-Butanol, und/oder durch Chromatographie, erfolgen.In step (1) of the method according to the invention, the nucleic acid becomes Nucleoside 3'-phosphates degraded. This is preferably done enzymatically, e.g. B. with exonucleases such as micrococcus nuclease or calf-spleen phosphody sterase. The conditions for the breakdown are known to the person skilled in the art. It nucleoside-3'-phosphates are obtained which are modified, e.g. B. be alkylated can, if the substance has a changing effect on the nucleic acid. It may be advantageous to restrict the nucleic acid before breaking it down to treat enzymes. This cleaves the nucleic acid into fragments that can be separated from each other. This can be done by common methods such as Gel electrophoresis. By breaking down the fragments can be changed Nucleoside-3'-phosphates assigned to certain areas of the nucleic acid become. It may also be beneficial to pre-alter nucleoside 3'-phosphates to enrich their mark. This can be done in the usual way, e.g. B. by Extrak tion, such as extraction with n-butanol, and / or by chromatography.
In Schritt (2) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Nucleosid-3'- Phosphate mit einem nicht-radioaktiven Marker markiert. Dies ist vorstehend ausführlich beschrieben.In step (2) of the method according to the invention, the nucleoside 3'- Phosphates marked with a non-radioactive marker. This is above described in detail.
In Schritt (3) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Trennung und der Nachweis der nicht-radioaktiv-markierten Nucleosid-3',5'-Biphosphate. Die Tren nung kann in üblicher Weise erfolgen. Günstig ist, sie mittels Kapillargelelek trophorese durchzuführen. Für den Nachweis können ebenfalls übliche Verfahren verwendet werden. Es bietet sich an, den Nachweis auf den einzelnen Marker der Nucleosid-3',5'-Biphosphate abzustellen. Im Falle eines Fluoreszenzmarkers kann es günstig sein, den Nachweis mittels laserinduzierter Fluoreszenzdetektion durchzuführen.In step (3) of the method according to the invention, the separation and the Detection of the non-radioactive labeled nucleoside-3 ', 5'-biphosphates. The doors can be done in the usual way. It is favorable to use capillary gel elec- tricity perform trophoresis. Usual methods can also be used for the detection be used. It lends itself to proof on the individual marker to turn off the nucleoside 3 ', 5'-biphosphates. In the case of a fluorescent marker it may be beneficial to use laser-induced fluorescence detection perform.
In Schritt (3) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die üblichen, d. h. vier, Nucleosid-3'-Phosphate nachgewiesen, wenn die Substanz keine verändernde Wirkung auf die Nucleinsäure hat. Werden weitere Nucleosid-3'-Phosphate nachgewiesen, ist dies ein Zeichen für das Vorliegen veränderter Nucleosid-3'- Phosphate, was besagt, daß die Substanz eine verändernde Wirkung auf die Nucleinsäure hat. Die quantitative Bestimmung der veränderten Nucleosid-3'- Phosphate sowie deren Strukturaufklärung ist durch den Vergleich mit den üblichen, d. h. vier, Nucleosid-3'-Phosphaten als Standard möglich.In step (3) of the method according to the invention, the usual, i.e. H. four, Nucleoside-3'-phosphates detected when the substance is not changing Has an effect on nucleic acid. Be more nucleoside 3'-phosphates proven, this is a sign of the presence of altered nucleoside-3'- Phosphates, which means that the substance has a changing effect on the Has nucleic acid. The quantitative determination of the modified nucleoside-3'- Phosphates and their structure elucidation can be compared with the usual, d. H. four, nucleoside 3'-phosphates possible as standard.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, geringste durch eine Substanz hervorgerufene Veränderungen einer Nucleinsäure nachzuweisen. Dieser Nach weis erfolgt ohne Verwendung von Radioaktivität. Die vorliegende Erfindung eignet sich daher bestens für ein groß-angelegtes Screening von Substanzen jeglicher Art, insbesondere Arzneistoffe, die hinsichtlich ihrer Nucleinsäure schädigenden Wirkung untersucht werden sollen.With the present invention, it is possible to do the least by one substance detected changes in a nucleic acid. This after white is done without the use of radioactivity. The present invention is therefore ideal for large-scale screening of substances of any kind, especially drugs, with regard to their nucleic acid harmful effects should be investigated.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:Brief description of the drawings:
Fig. 1 zeigt die Herstellung von fluoreszenz-markiertem N3-Alkyl-dT- 3',5'-diphosphat, Fig. 1 shows the preparation of the fluorescence-labeled N3-alkyl-dT-3 ', 5'-diphosphate,
Fig. 2 zeigt die Herstellung von Fluorescein-markiertem N3Butyldesoxy thymidin-3',5'-diphosphat, und Fig. 2 shows the preparation of fluorescein-labeled N 3 butyl deoxy thymidine-3 ', 5'-diphosphate, and
Fig. 3 zeigt ein Verfahren zur Feststellung der Veränderung von DNA durch Substanzen. Fig. 3 shows a method for determining the change of DNA by substances.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.The following example illustrates the invention.
Die Herstellung und die Struktur von 4 sind in Fig. 2 dargestellt.The manufacture and structure of 4 are shown in FIG. 2.
30 µl einer 0,1 M Tetrazol-Lösung (7 mg/ml in Acetonitril) und 500 µl des cyanoethylgeschützten Thymidin-Derivates 2 (2 µmol in 500 ml trockenem Acetonitril) wurden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. 30 µl einer 0,1 M Lösung des Fluoresceinamidits 1 wurden zugegeben und unter Rühren während einer Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt.30 ul of a 0.1 M tetrazole solution (7 mg / ml in acetonitrile) and 500 ul of cyanoethyl protected thymidine derivative 2 (2 µmol in 500 ml dry Acetonitrile) were placed in a reaction vessel. 30 µl of a 0.1 M solution of fluorescein amidite 1 were added and with stirring during a Hour at room temperature.
Danach wurden 30 µl einer 0,1 M Lösung von Cumolhydroperoxid (140 µl einer 70%igen Lösung von Cumolhydroperoxid + 860 µl trockenes Acetonitril) zu gegeben und 1 Minute umgesetzt. Dann wurde die Oxidation durch Zugabe von 100 µl Isopropanol gestoppt. Es wurde 3 erhalten. Die Reinigung von 3 erfolgte mittels präperativer HPLC in üblicher Weise. Then 30 ul of a 0.1 M solution of cumene hydroperoxide (140 ul one 70% solution of cumene hydroperoxide + 860 µl dry acetonitrile) given and implemented for 1 minute. Then the oxidation was done by adding 100 µl of isopropanol stopped. 3 was obtained. 3 was cleaned by means of preparative HPLC in the usual way.
ESI + Q1 MS (C58H68N6O19P2 1214,4 g/mol): m/z 1237,3 ([M + Na]+, 50%).ESI + Q1 MS (C 58 H 68 N 6 O 19 P 2 1214.4 g / mol): m / z 1237.3 ([M + Na] + , 50%).
3 wurde in 500 µl konzentriertem wäßrigen Ammoniak aufgenommen und 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde 4 erhalten. Die Reinigung von 4 erfolgte mittels HPLC.3 was taken up in 500 μl of concentrated aqueous ammonia and 16 Incubated for hours at room temperature. 4 were obtained. The cleaning of 4 was carried out by means of HPLC.
ESI-Q1 MS (C41H47N3O17P2, 914,4 g/mol): m/z 914,2 ([M - H]+, 20%), 456,8 ([M - 2H]2-, 100%).ESI-Q1 MS (C 41 H 47 N 3 O 17 P 2 , 914.4 g / mol): m / z 914.2 ([M - H] + , 20%), 456.8 ([M - 2H ] 2- , 100%).
Claims (10)
- 1. Spaltung der potentiell veränderten Nukleinsäure zu Nucleosid-3'- Phosphaten,
- 2. Markierung der Nukleosid-3'-Phosphate am 5'-Ende umfassend die
folgenden Schritte:
- a) Kopplung eines einen nicht-radioaktiven Marker aufwei senden Phosphoramidits an das Nukleosid-3'-Phosphat, und
- b) Oxidation des Kopplungsprodukts von (a),
- 3. Trennung und Nachweis der nicht-radioaktiv markierten Nukleosid- 3',5'-Biphosphate.
- 1. cleavage of the potentially modified nucleic acid to nucleoside-3'-phosphates,
- 2. Labeling of the nucleoside 3'-phosphates at the 5'-end comprising the following steps:
- a) coupling a phosphoramidite having a non-radioactive marker to the nucleoside 3'-phosphate, and
- b) oxidation of the coupling product of (a),
- 3. Separation and detection of the non-radioactive labeled nucleoside 3 ', 5'-biphosphates.
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Legal Events
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| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
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Ipc: C07H 19/20 |
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