DE1961983C - Substrate for the determination of lipase activity and method for the preparation of the substrate - Google Patents
Substrate for the determination of lipase activity and method for the preparation of the substrateInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Substrat zur Bestimmung der Lipase-Aktivität, bestehend aus schutzkollo;'-haltigem Olivenöl, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Substrats.The invention relates to a substrate for determination the lipase activity, consisting of protective collo; '- containing Olive oil, as well as a method of production this substrate.
Das Enzym Lipase spaltet Fette in Fettsäuren un-: Diglyzeride:The enzyme lipase breaks down fats into fatty acids: Diglycerides:
CH2O-CO-RCH 2 O-CO-R
CHO-CO-R + H„OCHO-CO-R + HO "O
CH2O — CO — RCH 2 O - CO - R
e^ CH _ O —COR + RCOOHe ^ CH _ O + RCOOH -COR
CH2- O — CORCH 2 - O - COR
Die Diglyzeride werden weiter abgebaut zu Monoglyzeriden und schließlich zu Glyzerin.The diglycerides are broken down further into monoglycerides and finally to glycerine.
In der klinischen und pharmazeutischen Chemie, der Biochemie und der Lebensmittelchemie ist die Lipasebestimmung von Interesse. Bekannt ist hierfür ein Verfahren, bei welchem die aus Fetten freigesetzten Fettsäuren titriert werden. Hierbei wird zuerst Olivenöl mit einer Gummiarabicum-Lösung emulgiert und die Emulsion mit einer Natrium-desoxycholat-Lösung vermischt. Die erhaltene Mischung wird mit Natronlauge bekannter Konzentration auf pH 9 eingestellt. Nach Zusatz einer Lipaseprobe wird weitere Natronlauge zudosiert, so daß der pH-Wert auf 9 gehalten wird. Aus der in der Zeiteinheit verbrauchten NaOH-Menge kann die Lipase-Aktivität errechnet werden, jjas Substrat Olivenöl bietet den Vorteil der Spezifität; bei Verwendung wasserlöslicher Glyzerinester ist nämlich nicht zu unterscheiden, ob die hydrolytische Spaltung durch Lipase oder durch Esterase bewirkt wird.In clinical and pharmaceutical chemistry, biochemistry and food chemistry, the lipase determination is of interest. For this purpose, a method is known in which the fat released from fats Fatty acids are titrated. Here, olive oil is first emulsified with a gum arabic solution and the Emulsion mixed with a sodium deoxycholate solution. The mixture obtained is washed with sodium hydroxide solution known concentration adjusted to pH 9. After adding a lipase sample, more sodium hydroxide solution is used metered in so that the pH value is kept at 9. From the amount of NaOH consumed in the unit of time the lipase activity can be calculated, jjas substrate olive oil offers the advantage of specificity; When using water-soluble glycerol esters, it is not possible to distinguish whether the hydrolytic Cleavage is effected by lipase or by esterase.
Ein wesentlicher Nachteil des bekannten Verfahrens liegt darin, daß die Ölemulsion nicht lange stabil bleibt und deshalb stets frisch bereitet werden muß. Der Emulgiergrad ist außerdem abhängig von der Herstellungsmethode und kann deshalb variieren. Da die gemessene Lipase-Aktivität jedoch vom Verteilungsgrad der Öltröpfchen in der Emulsion abhängt, ist eine Standardisierung nur schwer zu erreichen.A major disadvantage of the known process is that the oil emulsion does not remain stable for long and must therefore always be freshly prepared. The degree of emulsification also depends on the manufacturing method and can therefore vary. However, since the measured lipase activity depends on the degree of distribution of the oil droplets in the emulsion, is a Difficult to achieve standardization.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die beschriebenen Nachteile durch ein vorgefertigtes Trockensubstrat, welches nach Mischen mit Wasser eine Substratemulsion ergibt, die unmittelbar zum Test eingesetzt werden kann, beseitigt werden können.Surprisingly, it has now been found that the disadvantages described by a prefabricated Dry substrate which, when mixed with water, produces a substrate emulsion that can be used immediately for the test can be used, can be eliminated.
Das erfindungsgemäße Substrat für die Bestimmung der Lipase-Aktivität, bestehend aus schutzkolloidhaitigem Olivenöl, isi. dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat als eine bei Wasseizugabe eine Emulsion bildende Festsubstanz ausgebildet ist, die aus 1 Volumteil Olivenöl und 0,3 Gewichtsteile organischer Schutzkolloide besteht.The substrate according to the invention for the determination of lipase activity, consisting of protective colloid-containing Olive oil, isi. characterized in that the substrate forms an emulsion when water is added Solid substance is formed, which consists of 1 part by volume of olive oil and 0.3 parts by weight of organic protective colloids consists.
AIf organisches Schutzkolioid werden vorzugsweise Dextran, Mannit, Serumalbumin, Gummiarabicum oder/und Polyvinylpyrrolidon verwendet. Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn das Substrat Olivenöl und Schutzkolloid im Volumen- zu Gewichtsverhältnis von etv/a 1: 1 enthält.Organic protective colioids are preferably dextran, mannitol, serum albumin and gum arabic or / and polyvinylpyrrolidone used. Good results are obtained when the substrate is olive oil and Contains protective colloid in a volume to weight ratio of etv / a 1: 1.
Das erfindungsgemäße Substrat kann in Form eines Pulvtrs, als Granulat oder tablettenartig gepreßt vorliegen. Bei Einhaltung der angegebenen Grenzen zeichnet es sich dadurch aus, daß es beim Mischen mit Wasser unmittelbar eine Emulsion bildet, deren Tröpfchengröße bei Einhaltung konstanter Bedingungen allein von der Tröpfchengröße der zur Herstellung des Substrats verwendeten Olivenölemulsion bestimmtThe substrate according to the invention can be in the form of a powder, granules or pressed like tablets. If the specified limits are adhered to, it is characterized by the fact that it is mixed with Water immediately forms an emulsion, the droplet size of which is subject to constant conditions determined solely by the droplet size of the olive oil emulsion used to make the substrate
wird.will.
Außer den angegebenen essentiellen Bestandteilen Olivenöl und Schutzkolloidsubstanz enthält das erfindungsgemäße Substrat zweckmäßig noch EmulgatorExcept for the specified essential ingredients The substrate according to the invention expediently also contains an emulsifier, olive oil and protective colloid substance
oder/und Aktivator. Beispiele für geeignete Emulgatoren sind z. B. Taurocholat und Natriumdesoxycholat. Als Aktivator eignet sich z. B. Natriumchlorid. Besonders bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Substrat als Schutzkolloid Gummiarabicum zusammen mit einer kleiner· Menge Serumalbunvn.or / and activator. Examples of suitable emulsifiers are e.g. B. taurocholate and sodium deoxycholate. As an activator z. B. sodium chloride. Particularly preferably contains that according to the invention Substrate as protective colloid gum arabic together with a small amount of serum albumen.
Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung des erllndungsgemäßen Substrats besteht aus 1 Volumteil Olivenöl, 0,7 bis 1,2 Gewichtsteilen Gummiarabicum, 0.1 bis 0,2 Gewichtsteilen Natriumdesoxycholat, 0,01 bis 0,03 Gewichtsteilen Serumalbumin und 0,01 bis 0,03 Gewichtsteilen Natriumchlorid.A particularly preferred composition of the substrate according to the invention consists of 1 part by volume Olive oil, 0.7 to 1.2 parts by weight gum arabic, 0.1 to 0.2 parts by weight sodium deoxycholate, 0.01 up to 0.03 parts by weight of serum albumin and 0.01 to 0.03 parts by weight of sodium chloride.
Es ist völlig überraschend, daß es möglich ist, aus Olivenöl und einem Schutzkolloid in den angegebenen Verhältnissen eine Festsubstanz herzustellen, die ohne Veränderung lange Zt. !agerfähig isi und jederzeit durch einfaches Zugeben von Wasser wieder zu einer Emulsion bestimmter Tröpfchengröße rekonstituiert werden kanu.It is completely surprising that it is possible from olive oil and a protective colloid in the specified Conditions to produce a solid substance which can be stored for a long time without change and at any time reconstituted by simply adding water to an emulsion of a certain droplet size become canoe.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des neuen Substrats zur Bestimmung der Lipase-Aktivität besteht darin, daß Olivenöl, Schutzkolloid und gegebenenfalls Emulgator oder/und Aktivator in Wasser emulgiert bzw. gelöst werden und die erhaltene Emulsion lyophilisiert wird. Vorzugsweise wird vor der Lyophilisierung auf einen pH-Wert im Bereich von 8 bis 10 eingestellt.The method according to the invention for the preparation of the new substrate for determining the lipase activity consists in the fact that olive oil, protective colloid and optionally emulsifier and / or activator in Water emulsified or dissolved and the emulsion obtained is lyophilized. Preferably before the Lyophilization adjusted to a pH in the range of 8-10.
Die Herstellung der Emulsion erfolgt zweckmäßig mittels Ultra; -hall oder durch mechanische Einwirkung. Vorzugsweise wird auf -ine mittlere Tröpfchengröße von veniger als 3/t emulgiert.The emulsion is expediently produced by means of Ultra; -hall or by mechanical action. A medium droplet size is preferred emulsified by less than 3 / t.
Das erfindungsgemäße Substr t schafft die Möglichkeit, die für die Lipasebestimmung benötigte Ölemulsion jederzeit in der gewünschten Menge und im gewünschten Verteilungsgrad der Öltröpfchen herzustellen, ohne daß jeweils die ölemulsion durch umständliches Emulgieren des Olivenöls frisch zubereitet werden muß. Außerdem ermöglicht es eine Standardisierung der Bestimmung, was die Exaktheit und Reproduzierbarkeit der Bestimmung wesentlich verbessert.The substrate according to the invention creates the possibility of the oil emulsion required for the lipase determination to produce the oil droplets in the desired amount and in the desired degree of distribution at any time, without the oil emulsion being freshly prepared by laborious emulsification of the olive oil must become. It also enables a standardization of the determination, what the accuracy and reproducibility the determination significantly improved.
Außer zur Bestimmung der Lipase-Aktivitäl kann das erfindungsgemäße Substrat auch zur Herstellung von Fettinfusionslösungen verwendet werden.In addition to determining the lipase activity, the substrate according to the invention can also be used for production be used by lipid infusion solutions.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung weiter. BeispielThe following example further illustrates the invention. example
I ml Olivenöl (neutralisiert mit 0,In NaOH; 3,3% v/v)I ml of olive oil (neutralized with 0, In NaOH; 3.3% v / v)
825 mg Gummiarabicum (2,75% w/v)
160 mg Natriumdesoxycholat (0,533% w/v)
2C mg Serumalbumin (0,067% w/v)
18,7 mg NaCI (0,062% w/v)
ίο werden mit Wasser auf 30 ml aufgefüllt.825 mg gum arabic (2.75% w / v)
160 mg sodium deoxycholate (0.533% w / v)
2C mg serum albumin (0.067% w / v)
18.7 mg NaCI (0.062% w / v)
ίο are made up to 30 ml with water.
Nach Lösen von Gummiarabicum, Desoxycholat. Serumalbumin und Natriumchlorid wird die Mischung mit Hilfe von Ultraschall homogenisiert, bis der mittlere Durchmesser der Fetttröpfchen etwa 2 μ. beträgt (Meßmikrosk'jp).After dissolving gum arabic, deoxycholate. Serum albumin and sodium chloride make the mixture Homogenized with the help of ultrasound until the mean diameter of the fat droplets is about 2 μ. amounts to (Meßmikrosk'jp).
Die milchig aussehende Emulsion wird tiefgefroren und durch Gefriertrocknen entwässert, wobei ein weißes Trockenpräparat entsteht. Die erhaltene Substratmenge reicht aus für eine Bestimmung im Makrotest nach G. Marchis-Mouren, L. Sarda und P. Desnuellein Arch. Biochem. Biophys. 83, S. 309 (1959) bzw. 150 Bestimmungen im Mikro.est nach V.P. D ο I e, J. of clinical Investigation 35, S. 150 bis 154 (1956).The milky-looking emulsion is frozen and dehydrated by freeze-drying, whereby a white dry preparation is produced. The amount of substrate obtained is sufficient for a determination in the macro test after G. Marchis-Mouren, L. Sarda and P. Desnuellein Arch. Biochem. Biophys. 83, S. 309 (1959) or 150 determinations in the micro.est according to V.P. D ο I e, J. of clinical Investigation 35, p. 150 to 154 (1956).
Zur Ausführung einer Lipasebestimmung wird das obige Substrat mit 30 ml Wasser versetzt, kurz aufgeschüttelt oder mit dem Magnetrührer gerührt und ist dann gebrauchsfertig. Die Fetttröpfchen im rekonstituierten Reagens haben zu 90% eine Größe von 3 μ. Versuche haben gezeigt, daß an Stelle von Gummiarabicum auch andere Schutzkolloide wie verschiedene Dextransorten (z. B. T 70, T 20, T 250), Mannit, Serumalbumin, Polyvinylpyrrolidon verwendet werden ' können.To carry out a lipase determination, the above substrate is mixed with 30 ml of water and shaken briefly or stirred with a magnetic stirrer and is then ready for use. The fat droplets in the reconstituted 90% of the reagents are 3μ in size. Experiments have shown that instead of gum arabic also other protective colloids such as various types of dextran (e.g. T 70, T 20, T 250), mannitol, Serum albumin, polyvinylpyrrolidone 'can be used.
Emulgator, Serumalbumin und Aktivator können auch weggelassen werden. Di-; Tröpfchengröße ist in diesem Falle jedoch nach der Rekonstitution nicht so fein wie in der beschriebenen Ausführungsform.The emulsifier, serum albumin and activator can also be omitted. Di-; Droplet size is in in this case, however, after reconstitution, it is not as fine as in the embodiment described.
Bei einer Abänderung des oben beschriebenen Verfahrens wird die Emulsion vor dem Gefriertrocknen durch Zugabe von Lauge, vorzugsweise Natronlauge, auf einen pH-Wert zwischen 8 und 10, vorzugsweise von etwa 9, eingestellt.In a modification of the method described above, the emulsion is pre-freeze-drying by adding lye, preferably sodium hydroxide solution, to a pH value between 8 and 10, preferably of about 9, set.
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