DE1961983A1 - Reagent for the determination of the lipase activity - Google Patents

Reagent for the determination of the lipase activity

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Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Weickmann, I "61983Patent attorneys Dipl.-Ing. F. Weickmann, I "61983

Dipl.-Ing. H..Weickmann, D1PL.-PHYS. Dr. K. Fincke Dipl.-Inc. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. HuberDipl.-Ing. H. Weickmann, D1PL.-PHYS. Dr. K. Fincke Dipl.-Inc. F. A. Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

8 MÜNCHEN S6, DEN HZW POSTFACH 860 8208 MUNICH S6, THE HZW POSTBOX 860 820

int. Nr. 1659 möhlstrasse 22, rufnummer 433921/22int. no. 1659 möhlstrasse 22, phone number 433921/22

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH., MannheimBOEHRINGER MANNHEIM GMBH., Mannheim

Reagens zur Bestimmung der Lipase-AktivitätReagent for determining lipase activity

Die Erfindung betriffx ein Reagens zur Bestimmung der Mpase-Aktivität sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Reagens.The invention relates to a reagent for the determination of Mpase activity and a method for producing this reagent.

Das Enzym Idpase spaltet Fette in Fettsäuren und Diglysoride: CH9O-CC-R CH0OHThe enzyme Idpase breaks down fats into fatty acids and diglysorides: CH 9 O-CC-R CH 0 OH

OH 0-CO-R + H2O ü±üS2ä* CH-O-COR + RCOOH CH2O-CO-R CH2-O-COSOH 0-CO-R + H 2 O ü ± üS2ä * CH-O-COR + RCOOH CH 2 O-CO-R CH 2 -O-COS

Die Diglyzeride werden weiter abgebaut zu Monoglyzeriden und schließlich zu Glyzerin.The diglycerides are further broken down into monoglycerides and finally to glycerine.

In der klinischen und pharmaseutisehen Chemie, der Biochemie und der Lebensmittelchemie ist die Lipasebestimmiing von Interet^e. Bekannt ist hierfür ein Verfahren, bei welchem die aus Fetten freigesetzten fettsäuren titriert werden. Hierboi v/ird zuerst Olivenöl iuit einer G^mmiarabicum-Löaung emulgisrt xma. die Emulsion min; einer Natriiim-desoxycholat-Lösunn; ■"■ß.rm:'schfc. Die einhalten β Ilicchung v/ivci mit Hatronlaußs bekainitor Konzentration auf ρίί 9 eingestellt. Nach Znsata einer Liipasefn obe wird v/ettore Uai.con.1 auge k,adosiert, so daß der pH-Wert nut 9In clinical and pharmaceutical chemistry, biochemistry and food chemistry, lipase determination is of interest. A method is known for this in which the fatty acids released from fats are titrated. Hierboi first emulsifies olive oil in a G ^ mmiarabicum solution. the emulsion min; a sodium deoxycholate solution; ■ "■ ß.rm: schfc 'is set to ρίί 9 comply β Ilicchung v / IVCI bekainitor with Hatronlaußs After concentration Znsata a Liipasefn obe v / Ettore Uai.con.1 eye is k, adosiert, so that the pH.. Value only 9

109829/0677109829/0677

gehalten wird. Aus der in der Zeiteinheit verbrauchten ITaOH-Menge kann die Lipase-Aktivität errechnet werden. Das Substrat Olivenöl bietet den Vorteil der Spezifität; bei Verwendung wasserlöslicher Glyzerinester ist nämlich nicht zu unterscheiden, ob die hydrolytische Spaltung durch Lipase oder durch »is held. The lipase activity can be calculated from the amount of ITaOH consumed in the unit of time. The olive oil substrate has the advantage of specificity; When using water-soluble glycerol esters, it is not possible to distinguish whether hydrolytic cleavage by lipase or by »

Esterasen bewirkt wird.Esterases is effected.

Ein wesentlicher Nachteil des bekannten Verfahrens liegt darin, daß die Ölemulsion nicht lange stabil bleibt und deshalb stets frisch bereitet werden muß. Der Emulgiergrad ist außerdem abhängig von der Herstellungsmethode und kann deshalb variieren. Da die gemessene Lipase-Aktivität jedoch vom Verteilungsgrad der Öltröpfchen in der Emulsion abhängt, ist eine Standardisierung nur schwer zu erreichen.A major disadvantage of the known method is that the oil emulsion does not remain stable for long and must therefore always be freshly prepared. The degree of emulsification also depends on the production method and can therefore vary. However, since the measured lipase activity depends on the degree of dispersion of the oil droplets in the emulsion, standardization is difficult to achieve.

Die beschriebenen Nachteile werden erfindungsgemäß beseitigt durch die Schaffung eines vorgefertigten Trockenreagens, welches nach Mischen mit Wasser eine Substra+emulsion ergibt, die unmittelbar zum Test eingesetzt werden kann.The disadvantages described are eliminated according to the invention by the creation of a prefabricated dry reagent which after mixing with water, a Substra + emulsion results that can be used immediately for the test.

Das erfindungsgemäße Reagens zur Bestimmung der Lipase unter Verwendung von Olivenöl als Substrat ist gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Pestsubstanz, die Olivenöl und mindestens 0,3 Gew.-Teile, bezogen auf 1 Vol.-Teil Olivenöl, eines organischen Schutzkolloids enthält, welche bei Wasserzugabe eine Emulsion bildet.The reagent according to the invention for the determination of lipase under Use of olive oil as a substrate is characterized by a content of a plague substance, the olive oil and at least 0.3 part by weight, based on 1 part by volume of olive oil, of an organic protective colloid, which when water is added forms an emulsion.

Als organisches Schutzkolloid werden vorzugsweise Dextran, Mannit, Serumalbumin , Gummiarabicum oder/und Polyvinylpyrrolidon verwendet. Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn das Reagens Olivenöl und Schutzkolloid im Volumen-zu Gewichtsverhältnis von etwa 1:1 enthält.The organic protective colloid used is preferably dextran, mannitol, serum albumin, gum arabic and / or polyvinylpyrrolidone used. Good results have been obtained when the reagent is olive oil and protective colloid in a volume-to-weight ratio of about 1: 1.

Das erfindungsgemäße Reagens kann in Form eines Pulvers, a.ls . Granulat oder tablettenartig gepreßt vorliegen. Bei Einhaltung der angegebenen Grenzen zeichnet es sich dadurch aus, daß esThe reagent according to the invention can be in the form of a powder, a.ls. Granules or in the form of tablets are available. If the specified limits are adhered to, it is characterized in that it

109829/0077 - —~109829/0077 - - ~

ORIGINALORIGINAL

beim Mischen mit Wasser unmittelbar eine Emulsion bildet, deren Tröpfchengröße bei Einhaltung konstanter Bedingungen allein von der Tröpfchengröße der zur Herstellung des Reagens verwendeten Olivenölemulsion bestimmt wird. when mixed with water, an emulsion forms immediately, the droplet size of which is determined solely by the droplet size of the olive oil emulsion used to prepare the reagent, provided that the conditions are kept constant .

Außer den angegebenen essentiellen Bestandteilen Olivenöl und Schutzkolloidsubstanz enthält das erfindungsgemäße Reagens zweckmäßig noch Emulgator oder/und Aktivator. Beispiele für geeignete Emulgatoren sind z.B. Taurocholat und Natriumdesoxycholat. Als Aktivator eignet sich z.B. Natriumchlorid. Besonders bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Reagens als Schutzkolloid Gummiarabicum zusammen mit einer kleinen Menge .SerumalbuminIn addition to the specified essential constituents olive oil and protective colloid substance, the reagent according to the invention expediently also contains emulsifier and / or activator. Examples of suitable emulsifiers are, for example, taurocholate and sodium deoxycholate. Sodium chloride, for example, is suitable as an activator. The reagent according to the invention particularly preferably contains gum arabic as protective colloid together with a small amount of serum albumin

Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Reagens besteht aus 1 Vol.-Teil Olivenöl, 0,7 bis 1,2 Gew.-Teilen Gummiarabicum, 0,1 bis 0,2 Gew.-Teilen Natriumdesoxycholat, 0,01 bis 0,03 Gew.-Teilen Serumalbumin and 0,01 bis 0,03 Gew,-Teilen Natriumchlorid.A particularly preferred composition of the reagent according to the invention consists of 1 part by volume of olive oil, 0.7 to 1.2 parts by weight Gum arabic, 0.1 to 0.2 parts by weight sodium deoxycholate, 0.01 to 0.03 parts by weight of serum albumin and 0.01 to 0.03 parts by weight Sodium chloride.

Es ist völlig überraschend, daß es möglich ist, aus Olivenöl und einem Schutzkolloid in den angegebenen Verhältnissen eine Eestsubstanz herzustellen, die ohne Veränderung lange Zeit lagerfähig ist und jederzeit durch einfaches Zugeben von Wasser wieder zu einer Emulsion bestimmter Tröpfchengröße rekonstituiert werden kann.It is completely surprising that it is possible to produce an ester substance from olive oil and a protective colloid in the specified proportions, which can be stored for a long time without change and can be reconstituted at any time by simply adding water to an emulsion of certain droplet size.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des neuen Reagens zur Bestimmung der Lipase besteht darin, daß Olivenöl, Schutzkolloid und gegebenenfalls Emulgator oder/und Aktivator in Wasser emulgiert bzw. gelöst werden und die erhaltene Emulsion lyophilisiert wird. Vorzugsweise wird vor der Lyophilisierung auf einen pH-7/ert im Bereich von 8 bis 10 eingestellt.The inventive method for producing the novel reagent for the determination of lipase is that olive oil, protective colloid and if appropriate an emulsifier and / or activator is emulsified or dissolved in water and the resulting emulsion is lyophilized. The pH is preferably adjusted to a pH of 7 in the range from 8 to 10 before the lyophilization.

Die Herstellung dör Emulsion erfolgt zweckmäßig mittels Ultraschall oder durch mechanische Einwirkung. Vorzugsweise wird aufThe production of the emulsion is expediently carried out by means of ultrasound or by mechanical action. Preferably will be on

109829/0677109829/0677

•»AD OHtGlNAL• »AD OHtGlNAL

Pr-Pr-

eine mittlere Tröpfchengröße von weniger als 3 μ emulgiert.emulsifies an average droplet size of less than 3 μ.

Das erfindungsgemäße Reagens schafft die Möglichkeit, die für die Lipasebestimmung benötigte Ölemulsion jederzeit in der ge--: wünschten Menge und im gewünschten Verteilungsgrad der öltröpfchen herzustellen, ohne daß jeweils die Ölemulsion durch ■umständliches Emulgieren des Olivenöls frisch zubereitet werden muß. Außerdem ermöglicht es eine Standardisierung der Bestim-; mung, was die Exaktheit und Reproduzierbarkeit der Bestimmung wesentlich verbessert. ' . ·The reagent according to the invention creates the possibility of the oil emulsion required for the lipase determination at any time in the following: desired amount and in the desired degree of distribution of the oil droplets without having to freshly prepare the oil emulsion by laboriously emulsifying the olive oil got to. In addition, it enables standardization of the determination; mung, what the accuracy and reproducibility of the determination much improved. '. ·

Außer zur Bestimmung der Lipase-Aktivität kann das erfin- ' dungsgemäße Reagens auch zur Herstellung von Fettinfusionslösungen verwendet werden.In addition to determining lipase activity, the invention can be used appropriate reagent can also be used for the preparation of fat infusion solutions.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung weiter. BeispielThe following example further illustrates the invention. example

1 ml Olivenöl (neutralisiert mit O,1n NaOH; 3,~~3 ?° v/v)1 ml olive oil (neutralized with 0.1n NaOH; 3, ~~ 3 ? ° v / v)

825 mg Gummiarabicum (2,75 $> w/v)825 mg gum arabic ( $ 2.75> w / v)

160 mg Natriumdesoxycholat (0,533 % w/v)160 mg sodium deoxycholate (0.533 % w / v)

20 mg 'Serumalbumin (0,067 # w/v) 18,7 mg ITaCl (0,062 # w/v) ;20 mg 'serum albumin (0.067 # w / v) 18.7 mg ITaCl (0.062 # w / v);

werden mit Wasser auf 30 ml aufgefüllt.are made up to 30 ml with water.

Nach lösen von Guramiarabicum, Desoxycholat, Serumalbumin und Natriumchlorid \νχτ& die Mischung mit Hilfe von Ultraschall homogenisiert, bis der mittlere Durchmesser der JPetttröpfchen etwa 2 μ beträgt (Meßmikroskop).After dissolving Guramiarabicum, deoxycholate, serum albumin and sodium chloride \ & νχτ the mixture by means of ultrasonic homogenized until the average diameter of about 2 μ JPetttröpfchen is (measuring microscope).

Die milchig aussehende Emulsion wird tiefgefroren und durch Gefriertrocknen entwäsüert, wobei ein woißes Troc.'cenpräparat entsteht. Die erhaltene Reagenar.enge reicht aus für eine Bestimmung im Makrotest nach G.MarcJiis-Mnuron, L.Sarda und The milky-looking emulsion is frozen and dehydrated by freeze-drying, with a white Troc.'cen preparation arises. The amount of reagent obtained is sufficient for a determination in the macro test according to G.MarcJiis-Mnuron, L.Sarda and

109829/06 7 7 ~109829/06 7 7 ~

BAD ORIGINALBATH ORIGINAL

P.Desnuelle in Arch. Biochem. Biophys. 83, 309 (1959) bzw. 150 Bestimmungen im Mikrotest nach Y.P.Dole, J. of clinical Investigation ,35, 150 bis 154 (1956).P. Desnuelle in Arch. Biochem. Biophys. 83, 309 (1959) and 150 determinations in the microtest according to Y.P. Dole, J. of clinical Investigation, 35, 150-154 (1956).

Zur Ausführung einer LipasebeStimmung wird das obige Reagens mit 30 ml Wasser versetzt, kurz aufgeschüttelt oder mit dem Magnetrührer gerührt und ist dann gebrauchsfertig. Die Petttröpfchen im rekonstituierten Reagens haben zu 90 $ eine Größe von 3 μ.To carry out a lipase determination, the above reagent is used 30 ml of water are added, shaken briefly or stirred with a magnetic stirrer and is then ready for use. The Pett droplets in the reconstituted reagent at $ 90 are 3μ in size.

Versuche haben gezeigt, daß anstelle von Gummiarabicum auch andere Schutzkolloide wie verschiedene Dextransorten (z.B. T 70, T 20, T 25Ο), Mannit, Serumalbumin , Polyvinylpyrrolidon verwendet werden können.Tests have shown that instead of gum arabic too other protective colloids such as various types of dextran (e.g. T 70, T 20, T 25Ο), mannitol, serum albumin, polyvinylpyrrolidone can be used.

Emulgator, Serumalbumin und Aktivator können auch weggelassen werden. Die Tröpfchengröße ist in diesem Falle jedoch nach der Rekonstitution nicht so fein wie in der beschriebenen Ausführungsform. The emulsifier, serum albumin and activator can also be omitted. In this case, however, the droplet size is according to the Reconstitution not as fine as in the described embodiment.

Bei einer Abänderung des oben beschriebenen Verfahrens wird die Emulsion vor dem Gefriertrocknen durch Zugabe von Lauge, vorzugsweise Natronlauge, auf einen pH-Wert zwischen 8 und 10, vorzugsweise von etwa 9, eingestellt.If the method described above is modified, the emulsion is pre-freeze-drying by adding lye, preferably sodium hydroxide solution, adjusted to a pH value between 8 and 10, preferably of about 9.

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Claims (12)

PatentansprücheClaims Reagens zur Bestimmung der Lipase unter Verwendung von Olivenöl als»Substrat, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Pestsubstanz, die Olivenöl und mindestens 0,3 Gew.-Teile, bezogen auf 1 Vol.-Teil des Olivenöls, eines organischen ■Schutzkolloids enthält, welche bei Y/asserzugabe eine Emulsion bildet.Reagent for the determination of lipase using Olive oil as a »substrate, characterized by a content of a pest substance, the olive oil and at least 0.3 parts by weight, based on 1 part by volume of the olive oil, contains an organic protective colloid, which, when Y / water is added, forms an emulsion forms. 2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Schutzkolloid Dextran, Mannit, Serumalbumin , Gummiarabicum oder/und Polyvinylpyrrolidon enthält.2. Reagent according to claim 1, characterized in that it is dextran, mannitol, serum albumin, gum arabic as the protective colloid or / and contains polyvinylpyrrolidone. 3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es Olivenöl und Schutzkolloid im Gewichtsverhältnis von etwa 1:1 enthält.3. Reagent according to claim 1 or 2, characterized in that it is olive oil and protective colloid in a weight ratio of contains about 1: 1. 4. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3i dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Emulgator enthält.4. Reagent according to one of claims 1 to 3i, characterized in that that it also contains an emulsifier. 5. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als Schutzkolloid Gummiarabicum und eine kleine Menga Serumalbumin enthält.5. Reagent according to one of the preceding claims, characterized in that it is used as a protective colloid and gum arabic a small Menga contains serum albumin. 6. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Aktivator anthält.6. reagent according to any one of the preceding claims, characterized in that it also contains an activator. 7. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es aus 1 Vol.-Teil Olivenöl, 0,7 bis 1,2 Gew.-Teilen Gummiarabicum, 0,1 bis 0,2 Gew.-Teilen Nabriumdesoxycholat, 0,01 bis 0,03 Gew.-Teilen Seruraalbumin und 0,01 bis 0,03 Gew.-Teilen Natriumchlorid besteht.7. Reagent according to one of the preceding claims, characterized in that it consists of 1 part by volume of olive oil, 0.7 to 1.2 Parts by weight of gum arabic, 0.1 to 0.2 parts by weight of nabrium deoxycholate, 0.01 to 0.03 parts by weight of serural albumin and 0.01 to 0.03 parts by weight of sodium chloride. BAD ORIGINAL 109829/067 7 BATH ORIGINAL 109829/067 7 8. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche in Form von Pulver oder Tablette.8. Reagent according to one of the preceding claims in the form of powder or tablet. 9. Verfahren zur Herstellung des Reagens. ;näch Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Olivenöl, Schutzkolloid und gegebenenfalls Emulgator und Aktivator in Wasser emulgiert bzw. gelöst werden und die Emulsion lyophilisiert wird.9. Method of preparation of the reagent. ; next claim 1 up to 8, characterized in that olive oil, protective colloid and optionally emulsifier and activator are emulsified in water or be dissolved and the emulsion is lyophilized. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Lyophilisierung auf einen pH-Wert im Bereich von 8 bis 10 gestellt wird.10. The method according to claim 9, characterized in that is adjusted to a pH in the range of 8 to 10 prior to lyophilization. 11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß mit Ultraschall oder mechanisch emulgiert wird.11. The method according to claim 9 or 10, characterized in that emulsification is carried out with ultrasound or mechanically. 12. Verfahren nach Anspruch 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß auf eine mittlere Tröpfchengröße von weniger als 3 μ emulgiert wird.12. The method according to claim 9 to 11, characterized in that that is emulsified to an average droplet size of less than 3 μ. 109829/0677 ^^^0000^ copy109829/0677 ^^^ 0000 ^ copy bad or'ginalbad or'ginal
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