Mittel zur Bestimmung von Pankreas-Enzymen in Körperflüssigkeiten
Die Erfindung bezieht sich auf ein Mittel zur Bestimmung von Pankreas-Enzymen, insbesondere der Lipase und des Chymotrypsins, in Körperflüssigkeiten, wie Duodenalsaft und Blut.
Die Pankreas-Enzyme haben entscheidenden Einfluss auf den Stoffwechsel; die Pankreas-Lipase beispielsweise ist das für die Fettverdauung wichtige Enzym, mit dem beim Verdauungsvorgang Fettsäureester, insbesondere Triglyceride, in Alkohol- und Säurekomponenten gespalten und damit in eine resorbierbare Form überführt werden. Die Diagnostik von Pankreaserkrankungen hat bisher auf zuverlässige, rasch und einfach durchführbare Bestimmungen der Pankreas-Enzym Konzentrationen im Duodenalsaft bzw. Blut verzichten müssen. Bei der bisher bekannten Methode zur Prüfung beispielsweise der Pankreas-Lipase-Aktivität ist es notwendig, zunächst den zu prüfenden Duodenalsaft mittels einer vom Patienten zu schluckenden Schlauchsonde zu entnehmen.
Erst der so gewonnenen Körperflüssigkeit konnte dann definiert ein Substrat, z.B. Triolein oder Tributyrat, zugesetzt und das Gemisch inkubiert werden. Die dabei durch die Enzymwirkung freigesetzten Fettsäuren wurden anschliessend analytisch, beispielsweise titrimetrisch, bestimmt. Abgesehen davon, dass die Entnahme von Körperflüssigkeit mittels Schlauchsonde unangenehm und aufwendig ist, enthält diese bekannte Methode zahlreiche Fehlerquellen, so dass die damit gewinnbaren Testwerte mit einem relativ hohen Ungenauigkeitsfaktor belastet sind.
In der theoretischen Forschung sind Fluoreszeinester mit Essig-, Propion-, Chlorpropion-, Butter-, Valerian- und/oder Capronsäure zur Charakterisierung biochemisch interessierender thermodynamischer und kinetischer Enzymkonstanten eingesetzt worden, wobei die Aktivitäten verschiedener Enzyme, z.B. Steapsin, Schweinepankreaslipase, Weizenkeimlipase, Acylase und Chymotrypsin miteinander verglichen wurden. In diesen Versuchen wurden die gereinigten Enzyme in Pufferlösungen, die als Substrat Fluoreszeinester enthielten, inkubiert, und die Hydrolyse des Esters wurde an der durch das freiwerdende Fluoreszein hervorgerufenen Fluoreszenz analytisch erfasst. In keinem Falle ist bei dieser bekannten Methodik mit Körperflüssigkeiten in nativer Zusammensetzung gearbeitet worden; vor allem sind keine Versuche bekannt, die eine Anwendung der Fluoreszeinester in der klinischen Diagnostik darlegen.
Die bisherige Fragestellung bezog sich auf rein theoretische Aspekte.
Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, die bestehende Lücke in der Pankreasdiagnostik in sowohl zuverlässiger, als auch einfacher Weise zu schliessen.
Zur Lösung dieser Aufgabe ist das erfindungsgemässe Mittel dadurch gekennzeichnet, dass es einen Fluoreszein-Diester einer Fettsäure mit 8 bis 16 Kohlenstoffatomen, z.B. einen Diester der Laurin- oder Myristinsäure, und eine physiologisch verträgliche Puffersubstanz für den alkalischen pH-Bereich, z. B. Dinatriumhydrogenphosphat und/oder Natriumdihydrogenphosphat, enthält.
Man kann das erfindungsgemäss Mittel in im wesentlichen zwei grundsätzlich verschiedenen Arten anwenden: a) Das für Routineuntersuchungen am besten geeignete Verfahren besteht in der peroralen Applikation des erfindungsgemässen Mittels, das zu diesem Zweck vorteilhaft portionsweise in magen- oder dünndarmlöslichem Kapselmaterial eingekapselt eingesetzt wird. Da der im erfindungsgemässen Mittel enthaltene Fluoreszein-Diester wasserunlöslich und als Ester nicht resorbierbar ist, hat dieser Bestandteil des erfindungsgemässen Diagnostikums in dieser Hinsicht die Eigenschaften der natürlichen Nahrungsfette und kann wie diese erst nach der Hydrolyse der Esterbindungen durch die Pankreasenzyme in Form der Alkohol- und Säurekomponenten resorbiert werden.
Die alkoholische Komponente, die dabei aus Fluoreszein besteht, wird nach ihrer Resorption im Blut und/oder Urin durch Messung der Absorption und/oder der Fluoreszenz nachgewiesen.
Vergleichende Untersuchungen haben erkennen lassen, dass eine der Enzym-Konzentration proportionale Menge an Fluoreszein freigesetzt wird und weder die Enzymwirkung noch die Fluoreszeinbildung durch die übrigen in der Körperflüssigkeit neben den Pankreas-Enzymen vorhandenen Enzyme beeinträchtigt oder verfälscht wird.
Dabei wurde gefunden, dass die Pankreasenzymempfindlichkeit der Fluoreszeinester in der Körperflüssigkeit bei Verabreichung vergleichbarer Mengen mit steigender Kettenlänge der mit dem Fluoreszeinmolekül veresterten Fettsäuren ein Optimum durchläuft; bei Einsatz von Estern der Fettsäuren mit relativ niedriger Anzahl von Kohlenstoffatomen, beispielsweise 8 und 10 C-Atomen, wird unter gleichen Untersuchungsbedingungen die maximale Fluoreszeinbildung zwar nach relativ kurzer Einwirkungsdauer, etwa 1,5 bis 2 Stunden, erreicht, jedoch liegt das Maximum mehr als halb so niedrig wie beispielsweise bei dem Diester der Laurinsäure.
Umgekehrt findet man bei Untersuchungen der Diester der Fettsäuren mit 14 bis 16 C-Atomen die optimale Fluoreszein-Freisetzung erst nach längerer Versuchsdauer, etwa 6 bis 7 Stunden, und das Maximum liegt etwa ebenso niedrig wie das bei Verwendung der kürzerkettigen Fettsäuren ermittelte. Je nachdem, welche Empfindlichkeit für einen speziellen Einzelfall für die Diagnostik erwünscht ist, kann man die spezifisch dafür geeigneten Fettsäureester einsetzen. Beispielsweise kann in der klinischen Diagnostik eine zu hohe Empfindlichkeit unerwünscht sein, wenn es darum geht, kleine Unterschiede in den Enzym-Konzentrationen zu ermitteln. In diesem Falle wird man vorteilhaft im erfindungsgemässen Mittel den Fluoreszein-di-myristinsäureester einsetzen.
Soll, beispielsweise bei Routineuntersuchungen, das Ergebnis in möglichst kurzer Zeit vorliegen, dann ist es vorteilhaft, das erfindungsemässe Mittel mit dem Diester der Laurinsäure zu verwenden. Die relativ kurze Dauer der Prüfmethode ist beim erfindungsgemässen Mittel deswegen möglich, weil, wie beobachtet wurde, das durch die Pankreas-Enzyme im Duodenalsaft freigesetzte Fluoreszein offensichtlich in hohem Masse harnpflichtig ist und sehr schnell durch die Niere eliminiert wird. Die Testergebnisse lassen sich durch Erhöhung der Testdosis und durch kontrollierte Variation der Ausscheidungszeiten verändern, so dass auch solche Ester in dem erfindungsgemässen Diagnostikum verwendbar sind, mit denen man in geringeren Mengen und kurzer Testdauer keine optimalen Testergebnisse erzielt.
Dies hat insbesondere den Vorteil, dass man das erfindungsgemässe Mittel gegebenenfalls einzelnen Spezialfällen angepasst einstellen kann.
Der erreichte technische Fortschritt besteht weiterhin darin, dass auf das zeitraubende und aufwendige Abziehen von Duodenalsaft mittels einer vom Patienten zu schluckenden Schlauchsonde auf jeden Fall verzichtet werden kann.
Da Resorptions- und Ausscheidungsstörungen die Erfassung der durch Pankreas-Enzyme freigesetzten Fluoreszeinmengen beeinträchtigen können, kann es von Nutzen sein, durch eine zeitlich verschobene Verabreichung einer der Testdosis an Fluoreszeinester äquimolaren Menge unveresterten Fluoreszeins den für den einzelnen Patienten zutreffenden individuellen 100%-Wert festzulegen und die durch die Enzymwirkung erreichte Fluoreszeinfreisetzung darauf zu beziehen.
In der beiliegenden Zeichnung ist die Wirksamkeit des erfindungsgemässen Mittels beispielsweise veranschaulicht. Es zeigen:
Fig. 1 Die Ausscheidung von Fluoreszein (Ordinate: 10-4 mMol) nach oraler Verabreichung einer Menge von 0,005 mMol pro kg Körpergewicht des erfindungsgemässen Mittels in Abhängigkeit von der Zeit (Abszisse), Parameter ist die Kettenlänge der Fettsäurekomponente in dem Diester,
Fig. 2 Verlauf der Ausscheidung von Fluoreszein (Ordinate) nach Verabreichung eines erfindungsgemässen Mittels, das Fluoreszein-di-laurinester enthält, in einer Menge von 0,005 mMol Ester je kg Körpergewicht in Abhängigkeit von der Zeit (Abszisse).
Aus Fig. 1 erkennt man, dass das Maximum der Extinktion bei einer Wellenlänge von 492 mu bei Verwendung von einem Fluoreszein-di-laurinsäureester enthaltenden erfindungsgemässen Mittel mehr als doppelt so hoch liegt als bei Verwendung eines sowohl C8-Fettsäure-Diester als auch C14-Fettsäure-Diester enthaltenden Mittels. Die integrale Fluoreszein-Freisetzung nach 6 bis 10 Stunden ist in der nachfolgenden Tabelle wiedergegeben. Dabei ist die Ausscheidung in Prozent von je 0,005 mMol Ester je kg Körpergewicht, als 100% berechnet, bezogen.
Tabelle
C8 C10 C12 C14 C16 nach 6 Std. 11% 14,2% 17,3% 7,0% 1,3% nach 10 Std. 13,2% 17,9% 21,1% 13,4% 1,5%
Aus Fig. 2 erkennt man, dass die Fluoreszein-Konzentra tion im Urin nach oraler Verabreichung eines erfindungsgemässen Mittels, das 0,005 mMol an Fluoreszein-di-laurinester je kg Körpergewicht enthielt, nach einer Wirkungsdauer von rund 2 Stunden den optimalen Wert erreicht, was dieses
Mittel besonders geeignet für Reihenuntersuchungen macht.
Eine weitere Methode, mit der das erfindungsgemässe Mittel vorteilhaft anwendbar ist, wird nachfolgend beschrie ben: b) Da ein kleiner Anteil der Pankreasenzyme direkt von den Pankreaszellen in das Blut übertritt, was insbesondere bei einer pathologischen Erhöhung der Permeablilität der Zellmembranen, z.B. bei Pankreatitiden, der Fall ist, können die Pankreasenzyme im Blut durch Inkubation von Plasma oder Serum mit einer zugesetzten Lösung des erfindungsgemässen Mittels, die vorzugsweise durch Aufschlämmen und/oder Lösen in Wasser, insbesondere in einer Menge von
10 ml, erhalten wird, an der spektrophotometrisch und/oder fluorometrisch erfassbaren Menge des freigesetzten Fluor eszeins erkannt und quantitativ bestimmt werden. Die Fluor eszein-Difettsäureester sind farblos und fluoreszeieren nicht.
Man kann das erfindungsgemässe Mittel, sofern dies gewünscht wird, auch mit üblichen Füllstoffen tablettiert oder als Dragee einsetzen, und es ist ferner ohne weiteres möglich, übliche Farb- und/oder Geschmacksstoffe zuzusetzen.
Als besonders vorteilhafte Puffersubstanz-Kombination hat sich eine Mischung aus 419 mg Na2HPO4 12 H2O und
9 mg NaH2PO4 H2O erwiesen. Wenn man das erfindungs gemässe Mittel mit dieser Mischung im Gemisch mit
0,35 mMol des betreffenden Fluoreszein-Diesters einsetzt, dann erhält man nach Zugabe von 10 ml Wasser das erfin dungsgemässe Mittel mit dem im Duodenum vorherrschen den pH-Wert von 8,0.
Preparations for the determination of pancreatic enzymes in body fluids
The invention relates to a means for determining pancreatic enzymes, in particular lipase and chymotrypsin, in body fluids such as duodenal juice and blood.
The pancreatic enzymes have a decisive influence on the metabolism; pancreatic lipase, for example, is the enzyme that is important for fat digestion, with which fatty acid esters, especially triglycerides, are broken down into alcohol and acid components during the digestion process and thus converted into an absorbable form. The diagnosis of pancreatic diseases has hitherto had to forego reliable, quick and easy determinations of the pancreatic enzyme concentrations in the duodenal juice or blood. In the previously known method for testing the pancreatic lipase activity, for example, it is necessary to first remove the duodenal juice to be tested by means of a tube probe to be swallowed by the patient.
Only the body fluid obtained in this way could a substrate be defined, e.g. Triolein or tributyrate, added and the mixture incubated. The fatty acids released by the enzyme action were then determined analytically, for example titrimetrically. Apart from the fact that the removal of body fluid by means of a tube probe is unpleasant and time-consuming, this known method contains numerous sources of error, so that the test values that can be obtained with it are burdened with a relatively high inaccuracy factor.
In theoretical research, fluorescein esters with acetic, propionic, chloropropionic, butyric, valeric and / or caproic acid have been used to characterize thermodynamic and kinetic enzyme constants of biochemical interest, the activities of various enzymes, e.g. Steapsin, porcine pancreatic lipase, wheat germ lipase, acylase and chymotrypsin were compared. In these experiments, the purified enzymes were incubated in buffer solutions which contained fluorescein ester as substrate, and the hydrolysis of the ester was determined analytically from the fluorescence caused by the fluorescein released. In no case has body fluids in their native composition been used in this known method; Above all, no experiments are known that demonstrate an application of the fluorescein esters in clinical diagnostics.
The previous question related to purely theoretical aspects.
It is the aim of the present invention to close the existing gap in pancreatic diagnostics in both a reliable and simple manner.
To achieve this object, the agent according to the invention is characterized in that it contains a fluorescein diester of a fatty acid having 8 to 16 carbon atoms, e.g. a diester of lauric or myristic acid, and a physiologically acceptable buffer substance for the alkaline pH range, e.g. B. disodium hydrogen phosphate and / or sodium dihydrogen phosphate contains.
The agent according to the invention can be used in essentially two fundamentally different ways: a) The most suitable method for routine examinations consists in the oral application of the agent according to the invention, which for this purpose is advantageously used in portions encapsulated in gastric or small-intestinal-soluble capsule material. Since the fluorescein diester contained in the agent according to the invention is insoluble in water and not resorbable as an ester, this component of the diagnostic agent according to the invention has the properties of natural dietary fats in this regard and, like these, can only be used after hydrolysis of the ester bonds by the pancreatic enzymes in the form of alcohol and Acid components are absorbed.
The alcoholic component, which consists of fluorescein, is detected after its absorption in the blood and / or urine by measuring the absorption and / or the fluorescence.
Comparative studies have shown that an amount of fluorescein proportional to the enzyme concentration is released and neither the enzyme action nor the fluorescein formation is impaired or falsified by the other enzymes present in the body fluid in addition to the pancreatic enzymes.
It was found that the pancreatic enzyme sensitivity of the fluorescein esters in the body fluid, when administered in comparable amounts, passes through an optimum with increasing chain length of the fatty acids esterified with the fluorescein molecule; when using esters of fatty acids with a relatively low number of carbon atoms, for example 8 and 10 carbon atoms, the maximum fluorescein formation is achieved under the same test conditions after a relatively short exposure time, about 1.5 to 2 hours, but the maximum is more than half as low as, for example, the diester of lauric acid.
Conversely, in investigations of the diesters of fatty acids with 14 to 16 carbon atoms, the optimal fluorescein release is only found after a longer test period, about 6 to 7 hours, and the maximum is about as low as that determined when using the shorter-chain fatty acids. Depending on the sensitivity required for diagnostics in a specific individual case, the fatty acid esters specifically suitable for this can be used. For example, too high a sensitivity can be undesirable in clinical diagnostics when it comes to determining small differences in the enzyme concentrations. In this case, the fluorescein di-myristic acid ester will advantageously be used in the agent according to the invention.
If, for example in the case of routine examinations, the result is to be available in the shortest possible time, then it is advantageous to use the agent according to the invention with the diester of lauric acid. The relatively short duration of the test method is possible with the agent according to the invention because, as has been observed, the fluorescein released by the pancreatic enzymes in the duodenal juice is obviously highly urinary and is eliminated very quickly by the kidneys. The test results can be changed by increasing the test dose and by controlled variation of the elimination times, so that those esters can also be used in the diagnostic agent according to the invention, with which one does not achieve optimal test results in smaller amounts and with a short test duration.
This has the particular advantage that the means according to the invention can optionally be adjusted to individual special cases.
The technical progress achieved consists in the fact that the time-consuming and laborious removal of duodenal juice by means of a tube probe to be swallowed by the patient can in any case be dispensed with.
Since absorption and excretion disorders can impair the detection of the fluorescein quantities released by pancreatic enzymes, it can be useful to determine the individual 100% value applicable to the individual patient by administering an amount of unesterified fluorescein that is equal to the test dose of fluorescein ester at a different time related to the fluorescein release achieved by the enzyme action.
The effectiveness of the agent according to the invention is illustrated, for example, in the accompanying drawing. Show it:
Fig. 1 The excretion of fluorescein (ordinate: 10-4 mmol) after oral administration of an amount of 0.005 mmol per kg body weight of the agent according to the invention as a function of time (abscissa), the parameter is the chain length of the fatty acid component in the diester,
2 shows the course of the excretion of fluorescein (ordinate) after administration of an agent according to the invention which contains fluorescein di-laurine ester in an amount of 0.005 mmol ester per kg body weight as a function of time (abscissa).
From FIG. 1 it can be seen that the maximum of the extinction at a wavelength of 492 μm when using an agent according to the invention containing fluorescein di-lauric acid ester is more than twice as high as when using both a C8 fatty acid diester and a C14 fatty acid diester. Agent containing fatty acid diesters. The integral fluorescein release after 6 to 10 hours is shown in the table below. The excretion is based on a percentage of 0.005 mmol of ester per kg of body weight, calculated as 100%.
table
C8 C10 C12 C14 C16 after 6 hours 11% 14.2% 17.3% 7.0% 1.3% after 10 hours 13.2% 17.9% 21.1% 13.4% 1.5 %
From Fig. 2 it can be seen that the fluorescein concentration in the urine after oral administration of an agent according to the invention, which contained 0.005 mmol of fluorescein di-laurin ester per kg of body weight, reached the optimum value after a duration of action of around 2 hours, which this
Makes means particularly suitable for screening tests.
Another method with which the agent according to the invention can advantageously be used is described below: b) Since a small proportion of the pancreatic enzymes pass directly from the pancreatic cells into the blood, which is particularly important when there is a pathological increase in the permeability of the cell membranes, e.g. in pancreatitis, the pancreatic enzymes in the blood by incubation of plasma or serum with an added solution of the agent according to the invention, preferably by slurrying and / or dissolving in water, in particular in an amount of
10 ml, is obtained, recognized by the spectrophotometrically and / or fluorometrically detectable amount of the released fluoro-eszein and determined quantitatively. The fluoro eszein difatty acid esters are colorless and do not fluoresce.
If desired, the agent according to the invention can also be tabletted with customary fillers or used as a coated tablet, and it is furthermore possible to add customary colorants and / or flavorings.
A mixture of 419 mg Na2HPO4 and 12 H2O has proven to be a particularly advantageous buffer substance combination
9 mg NaH2PO4 H2O proven. If you use the fiction, contemporary agent with this mixture in a mixture with
0.35 mmol of the fluorescein diester in question is used, then, after adding 10 ml of water, the agent according to the invention is obtained with a pH of 8.0 in the duodenum.