DE19619255A1 - Human cytomegalovirus peptide(s) - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft die Identifizierung des Peptides C47-6 des Matrixproteins pp65 vom humanen Cytomegalievirus als Immunogen zum Einsatz in einem Impfstoff gegen HCMV, zum Einsatz bei einer adoptiven Immuntherapie der HCMV-Infektion oder zur diagnostischen Bestimmung der HCMV-spezifischen Immunreaktivität.The invention relates to the identification of the peptide C47-6 of the matrix protein pp65 of the human cytomegalovirus as an immunogen for use in a vaccine against HCMV, for use in adoptive immunotherapy for HCMV infection or diagnostic determination of HCMV-specific immunoreactivity.
Das humane Cytomegalievirus (HCMV) ist ein in unserer Bevölkerung weit verbreitetes Virus. Bis zu einem Lebensalter von 30 Jahren hat sich fast jedes zweite Individuum mit diesem Virus infiziert. Bei gesunden, in der Immunabwehr kompetenten Individuen verläuft die primäre HCMV-Infektion in der Regel asymptomatisch und bleibt daher meistens unerkannt. Die HCMV-Infektion hat jedoch eine große Bedeutung für Menschen mit kompromittierter Immunitätslage wie z. B. im Laufe einer immunsuppressiven Therapie nach Organ- oder Knochenmarktransplantation, bei Tumor- und Leukämiepatienten, Polytransfundierten sowie AIDS-Patienten. Weiterhin stellt die HCMV-Infektion eine große Gefahr für den Embryo oder Fötus durch die physiologisch bedingte Immunsuppression von Schwangeren als auch für Neugeborene, deren Immunsystem bei Geburt noch nicht vollständig differenziert ist, dar. Die Häufigkeit einer pränatalen oder kongenitalen Infektion beträgt weltweit durchschnittlich 1%. Auch Fehlgeburten im ersten Trimester sind auf HCMV-Infektionen zurückzuführen. Ob sie aber vermehrt bei HCMV-infizierten Schwangeren im Vergleich zu nicht-HCMV- infizierten Schwangeren auftreten, wird strittig diskutiert (1). Ein Impfstoff gegen das humane Cytomegalievirus ist zur Zeit noch nicht verfügbar.The human cytomegalovirus (HCMV) is a wide one in our population common virus. Up to an age of 30, almost every second Individual infected with this virus. In healthy, competent immune defense In individuals, the primary HCMV infection is usually asymptomatic and remains therefore mostly undetected. However, the HCMV infection is of great importance for People with compromised immunity, such as B. in the course of a immunosuppressive therapy after organ or bone marrow transplantation, for tumor and leukemia patients, polytransfused and AIDS patients. Furthermore, the HCMV infection is a major danger to the embryo or fetus through the physiological conditional immunosuppression of pregnant women as well as for newborns whose Immune system at birth is not yet fully differentiated. The frequency Prenatal or congenital infection averages 1% worldwide. Also Miscarriages in the first trimester are due to HCMV infections. Whether you but increased in HCMV-infected pregnant women compared to non-HCMV infected pregnant women occur is controversial (1). A vaccine against that human cytomegalovirus is not yet available.
Für eine protektive Immunantwort gegen das humane Cytomegalievirus wird vornehmlich die HCMV-spezifische zelluläre Immunantwort der humoralen Immunantwort übergeordnet (2,3,4). Sowohl HCMV-spezifische CD8⁺ zytotoxische T- Lymphozyten (CD8⁺ CTL) als auch CD4⁺ T-Helfer-Zellen (CD4⁺ TH) sind die essentiellen Effektorzellen (5, 6).For a protective immune response against the human cytomegalovirus, the HCMV-specific cellular immune response is primarily superior to the humoral immune response (2,3,4). HCMV-specific CD8⁺ cytotoxic T lymphocytes (CD8⁺ CTL) and CD4⁺ T helper cells (CD4⁺ T H ) are the essential effector cells (5, 6).
Nach heutigem allgemeinen Wissensstand ist die antigenspezifische zelluläre Immunantwort dichotom aufgegliedert:According to current general knowledge, the antigen-specific is cellular Immune response dichotomized:
- A. CD4⁺ T-Helfer-Zellen (TH) erkennen spezifisch ein Antigen-Epitop, das ihnen in Assoziation mit HLA (human leucocyte antigen) Klasse II-Molekülen auf der Oberfläche antigenpräsentierender Zellen präsentiert wird, und werden zur Proliferation stimuliert. Sie unterstützen folgende Funktionen: 1. die Generierung antigenspezifischer CD8⁺ zytotoxischer T-Zellen (CTL), 2. die Generierung antigenspezifischer B-Zellen der humoralen Immunantwort für die Produktion von spezifischen Antikörpern, 3. die Produktion antiviraler Zytokine. 4. Für einige Antigene wie z. B. das Masernvirus sind auch spezifische, HLA Klasse II restringierte CD4⁺ CTL beschrieben worden, die virusinfizierte Zellen lysieren können (7).A. CD4⁺ T helper cells ( TH ) specifically recognize an antigen epitope that is presented to them in association with HLA (human leucocyte antigen) class II molecules on the surface of antigen presenting cells and are stimulated to proliferation. They support the following functions: 1. the generation of antigen-specific CD8⁺ cytotoxic T cells (CTL), 2. the generation of antigen-specific B cells of the humoral immune response for the production of specific antibodies, 3. the production of antiviral cytokines. 4. For some antigens such as B. the measles virus, specific HLA class II restricted CD4⁺ CTL have been described, which can lyse virus-infected cells (7).
- B. CD8⁺ zytotoxische T-Zellen (CTL) erkennen spezifisch ein Antigen-Epitop, das ihnen in Assoziation mit HLA Klasse I-Molekülen auf der Oberfläche antigenpräsentierender Zellen präsentiert wird und lysieren direkt virusinfizierte Zellen.B. CD8⁺ cytotoxic T cells (CTL) specifically recognize an antigen epitope that they in association with HLA class I molecules on the surface presenting antigen Cells are presented and directly lyse virus-infected cells.
CD4⁺ T-Helfer-Zellen als auch CD8⁺ CTL werden aus peripheren mononukleären Blutzellen gewonnen.CD4⁺ T helper cells as well as CD8⁺ CTL are made from peripheral mononuclear Blood cells won.
Kurze, lineare Peptide, die als Antigene den antigenpräsentierenden Zellen exogen hinzugefügt werden, können direkt an unbesetzte Stellen von HLA-Molekülen sowohl der Klasse I als auch der Klasse II binden und somit T-Zellen aktivieren. Die Mehrzahl von Peptiden, die mit HLA Klasse I-Molekülen assoziieren, ist in der Regel 8 bis 10 Aminosäuren lang. Peptide, die mit HLA Klasse II-Molekülen assoziieren, haben in der Regel eine Länge von 10 bis 34 Aminosäuren (8).Short, linear peptides that are exogenous to the antigen-presenting cells as antigens can be added directly to vacant sites of HLA molecules of both the Bind class I and class II and thus activate T cells. The majority of Peptides that associate with HLA class I molecules are typically 8 to 10 Amino acids long. Peptides that associate with HLA class II molecules have been found in the Usually a length of 10 to 34 amino acids (8).
Es sind verschiedene HCMV-Proteine identifiziert worden, die als Antigene für die zelluläre Immunantwort gegen HCMV verantwortlich gemacht wurden. Die viralen Regulatorproteine immediate early-Antigen 1 [pUL123] und 2 [pUL122] (9,10,11,12), das MHC-Klasse-I-Homolog [gpUL18] (12), die Glycoproteine gB [gpUL55] (13,14,15, 16, 17) und gH [gpUL75] (18) sowie die internen Strukturproteine der Virusmatrix pp71 [ppUL82] (12) und pp65 [ppUL83] (18,19,20) konnten eine Proliferation peripherer mononukleärer Blutzellen oder von CD4⁺ TH-Zell-Linien im Lymphozytenproliferationstest stimulieren. Eine spezifische CD8⁺ CTL-Antwort ist bislang für die Proteine pp65 [ppUL83] (21,22,23), pp150 [ppUL132] (21), immediate early-Antigen 1 [pUL123] (9, 10,21), gB [gpUL55] (15) und das MHC-Klasse-I-Homolog [gpUL18] (24) beschrieben worden.Various HCMV proteins have been identified that have been blamed as antigens for the cellular immune response to HCMV. The viral regulatory proteins immediate early antigen 1 [pUL123] and 2 [pUL122] (9,10,11,12), the MHC class I homologue [gpUL18] (12), the glycoproteins gB [gpUL55] (13, 14,15, 16, 17) and gH [gpUL75] (18) as well as the internal structural proteins of the virus matrix pp71 [ppUL82] (12) and pp65 [ppUL83] (18,19,20) were able to proliferate peripheral blood mononuclear cells or CD4 ⁺ Stimulate T H cell lines in the lymphocyte proliferation test. A specific CD8⁺ CTL response has so far been found for the proteins pp65 [ppUL83] (21,22,23), pp150 [ppUL132] (21), immediate early antigen 1 [pUL123] (9, 10,21), gB [ gpUL55] (15) and the MHC class I homologue [gpUL18] (24).
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Aufgabe der Erfindung ist es, immunogene Sequenzen von T-Zell-Epitopen innerhalb des Matrixproteins pp65 (HCMV pp65) des humanen Cytomegalievirus (HCMV), die eine Proliferation von peripheren mononukleären Blutzellen bewirken, zu identifizieren und auf einen minimalen Bereich einzugrenzen, um die besagten immunogenen Sequenzen von T-Zell-Epitopen in HCMV pp65 als hochspezifische Komponenten in einem Impfstoff gegen das humane Cytomegalievirus oder im Sinne einer adoptiven Immuntherapie zur Expansion epitopspezifischer T-Zellen zur Prävention von HCMV- Infektionen oder zur diagnostischen Bestimmung der HCMV-spezifischen Immunreaktivität einzusetzen. Diese Aufgabe wird durch die Gegenstände der Ansprüche gelöst. The object of the invention is to immunogenic sequences of T cell epitopes within of the matrix protein pp65 (HCMV pp65) of human cytomegalovirus (HCMV), the cause proliferation of peripheral blood mononuclear cells and narrow it down to a minimal range to allow said immunogenic Sequences of T cell epitopes in HCMV pp65 as highly specific components in a vaccine against the human cytomegalovirus or in the sense of an adoptive one Immunotherapy for the expansion of epitope-specific T cells for the prevention of HCMV Infections or for the diagnostic determination of HCMV-specific Use immunoreactivity. This task is accomplished by the subject matter of the claims solved.
Die Gegenstände der Erfindung betreffen bzw. sind gerichtet aufThe objects of the invention relate to or are directed to
-
1. auf den therapeutischen und diagnostischen Einsatz des Peptides C47-6 vom
Matrixprotein pp65 des humanen Cytomegalievirus (HCMV) mit folgenden
Eigenschaften:
- 1.1. Molekülart: Peptid von HCMV pp65-Protein,
- 1.2. Grob-Lokalisation: im C-terminalen Bereich innerhalb des HCMV pp65- Proteins, Stamm AD169 (Aminosäure 1 bis einschließlich Aminosäure 561) im Sequenzbereich ab Aminosäure 477 bis einschließlich Aminosäure 561 des HCMV pp65-Subfragmentproteins C47 (Aminosäure 389 bis einschließlich Aminosäure 561), der nicht von den HCMV pp65-Subfragmentproteinen C74 (ab Aminosäure 297 bis einschließlich Aminosäure 458) und C35 (ab Aminosäure 303 bis einschließlich Aminosäure 476) abgedeckt wird,
- 1.3. Fein-Lokalisation: Das Protein pp65 von HCMV (Stamm AD 169) ist 561 Aminosäuren lang. Die Aminosäuresequenz des immunogenen Peptides C47-6 innerhalb von pp65 beginnt einschließlich ab Aminosäure 509 und endet mit einschließlich Aminosäure 524,
- 1.4. chemische Natur des Fragmentes: Peptid, aus Aminosäuren zusammengesetzt,
- 1.5. Länge: 16 Aminosäuren,
- 1.6. Funktion: induziert die HCMV-spezifische Proliferation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC),
- 1.7. Identifizierung der Sequenz und Funktion: experimentell wie beschrieben,
- 1.8. Auflistung der Aminosäuresequenz des Peptides C47-6 (ab Aminosäure 509 bis einschließlich Aminsoäure 524) im 1-Buchstaben-Code: K Y C E F F W D A N D I Y R I F
- 1.1. Molecule type: peptide of HCMV pp65 protein,
- 1.2. Coarse localization: in the C-terminal region within the HCMV pp65 protein, strain AD169 (amino acid 1 to including amino acid 561) in the sequence range from amino acid 477 to amino acid 561 of the HCMV pp65 subfragment protein C47 (amino acid 389 to amino acid 561), which is not covered by the HCMV pp65 subfragment proteins C74 (from amino acid 297 up to and including amino acid 458) and C35 (from amino acid 303 up to and including amino acid 476),
- 1.3. Fine localization: The protein pp65 from HCMV (strain AD 169) is 561 amino acids long. The amino acid sequence of the immunogenic peptide C47-6 within pp65 starts from and includes amino acid 509 and ends with and including amino acid 524,
- 1.4. chemical nature of the fragment: peptide composed of amino acids,
- 1.5. Length: 16 amino acids,
- 1.6. Function: induces HCMV-specific proliferation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC),
- 1.7. Identification of the sequence and function: experimentally as described,
- 1.8. List of the amino acid sequence of the peptide C47-6 (from amino acid 509 up to and including amino acid 524) in the 1-letter code: KYCEFFWDANDIYRIF
- 2. auf einen Impfstoff (Vakzine) gegen das humane Cytomegalievirus, in dem die Sequenz des Peptides C47-6 aus Anspruch 1 enthalten ist und als Immunogen eingesetzt wird, um die Proliferation humaner peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC) zu induzieren,2. on a vaccine (vaccine) against the human cytomegalovirus in which the Sequence of the peptide C47-6 from claim 1 is contained and used as an immunogen to increase the proliferation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) induce,
- 3. auf einen Impfstoff (Vakzine) gegen das humane Cytomegalievirus, in dem Teilsequenzen des Peptides C47-6 aus Anspruch 1 enthalten sind, die als Immunogene eingesetzt werden, um die Proliferation humaner peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC) zu induzieren,3. on a vaccine (vaccine) against the human cytomegalovirus in which Partial sequences of the peptide C47-6 from claim 1 are contained, which are used as immunogens used to proliferate human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) to induce
- 4. auf die Zusammensetzung eines Impfstoffes (Vakzine) gegen das humane Cytomegalievirus nach Anspruch 1., 2. und 3. für Individuen mit den HLA-Klasse I und II Haplotypen: HLA-Al, HLA-B8, HLA-DR3 und HLA-DQ2,4. on the composition of a vaccine (vaccine) against the human Cytomegalovirus according to claim 1., 2. and 3. for individuals with HLA class I and II haplotypes: HLA-Al, HLA-B8, HLA-DR3 and HLA-DQ2,
- 5. auf die ex vivo Anzüchtung und Expansion HCMV-spezifischer T-Zellen aus mononukleären Zellen von allogenen oder autologen Spendern mit der Sequenz des Peptides C47-6 oder Teilsequenzen des Peptides C47-6 aus Anspruch 1., 2., 3. und 4. als Immunogen, um Peptid C47-6-spezifische T-Zellen im Sinne einer adoptiven Immuntherapie einer HCMV-Infektion einzusetzen,5. on the ex vivo cultivation and expansion of HCMV-specific T cells mononuclear cells from allogeneic or autologous donors with the sequence of the Peptides C47-6 or partial sequences of the peptide C47-6 from claims 1, 2, 3 and 4. as an immunogen to peptide C47-6-specific T cells in the sense of an adoptive Use immunotherapy for HCMV infection,
- 6. auf die Zusammensetzung eines Immunogens für die adoptive Immuntherapie einer HCMV-Infektion nach Anspruch 1., 2., 3., 4. und 5. bei Individuen mit den HLA-Klasse I und II Haplotypen: HLA-Al, HLA-B8, HLA-DR3 und HLA-DQ2.6. on the composition of an immunogen for adoptive immunotherapy HCMV infection according to claim 1, 2, 3, 4 and 5 in individuals with the HLA class I and II haplotypes: HLA-Al, HLA-B8, HLA-DR3 and HLA-DQ2.
- 7. auf den diagnostischen Einsatz des Peptides C47-6 oder Teilsequenzen des Peptides C47-6 zur Bestimmung der HCMV-spezifischen Immunreaktivität.7. on the diagnostic use of the peptide C47-6 or partial sequences of the peptide C47-6 for the determination of HCMV-specific immunoreactivity.
Nachstehend wird die Erfindung beispielhaft näher erläutert:
Tabelle 2 zeigt eine spezifische Stimulation von peripheren mononukleären Blutzellen
durch Peptid C47-6 bei den Spendern Nr. 1, 2 und 3 (Auflistung der cpm-Mittelwerte von
mit den Peptiden C47-1 bis C47-11 behandelten Kulturen, Mediumkontrolle und HCMV-
stimulierten Kulturen);
Abb. 1 zeigt eine graphische Darstellung der spezifischen Stimulation von PBMC durch
Peptid C47-6 bei Spender Nr. 1;
Abb. 2 zeigt eine graphische Darstellung der spezifischen Stimulation von PBMC durch
Peptid C47-6 bei Spender Nr. 2;
Abb. 3 zeigt eine graphische Darstellung der spezifischen Stimulation von PBMC durch
Peptid C47-6 bei Spender Nr. 3 und
Tabelle 3 zeigt die HLA-Haplotypassoziation der spezifischen Stimulation von PBMC
durch Peptid C47-6 (Auflistung der HLA-Haploytpen von reagierenden Spendern mit
Stimulationsindizes HCMV- und Peptid C47-6 stimulierter Kulturen).The invention is explained in more detail below by way of example:
Table 2 shows a specific stimulation of peripheral mononuclear blood cells by peptide C47-6 in the donor numbers 1, 2 and 3 (listing of the cpm mean values of cultures treated with the peptides C47-1 to C47-11, medium control and HCMV-stimulated Cultures);
Fig. 1 shows a graphical representation of the specific stimulation of PBMC by peptide C47-6 in donor No. 1;
Fig. 2 shows a graphical representation of the specific stimulation of PBMC by peptide C47-6 in donor No. 2;
Fig. 3 shows a graphical representation of the specific stimulation of PBMC by peptide C47-6 in donor No. 3 and
Table 3 shows the HLA haplotype association of the specific stimulation of PBMC by peptide C47-6 (list of the HLA haploytpen from reacting donors with stimulation indices HCMV and peptide C47-6 stimulated cultures).
Die Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) erfolgte aus buffy coats von gesunden, HLA-typisierten, 9 HCMV-seropositiven und 2 HCMV- seronegativen Blutspendern über Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll (Biochrom, Berlin). Nach der Isolierung wurden die PBMC in Kulturmedium, zusammengesetzt aus RPMI 1640 (Gibco BRL, Eggenstein), 10% humanes HCMV-seronegatives AB-Serum, 2mM L-Glutamin, Penicillin und Streptomycin, resuspendiert.Peripheral mononuclear blood cells (PBMC) were isolated from buffy coats of healthy, HLA-typed, 9 HCMV-seropositive and 2 HCMV- seronegative blood donors via density gradient centrifugation with Ficoll (biochrom, Berlin). After isolation, the PBMC were composed in culture medium RPMI 1640 (Gibco BRL, Eggenstein), 10% human HCMV seronegative AB serum, 2mM L-glutamine, penicillin and streptomycin, resuspended.
Als Antigene zur Groblokalisation von T-Zell-Epitopen innerhalb des Matrixproteins pp65 (Aminosäure 1 - 561) des humanen Cytomegalievirus wurden die drei rekombinant in Escherichia coli produzierten, an β-Galaktosidase gebundenen HCMV pp65- Subfragmentproteine C74 (Aminosäure 297 - Aminosäure 458 vom Gesamtprotein pp65), C35 (Aminosäure 303 - Aminosäure 476 vom Gesamtprotein pp65) und C47 (Aminosäure 389 - Aminosäure 561 vom Gesamtprotein pp65) eingesetzt. Als Negativkontrolle diente β-Galaktosidase vom Klonierungsvektor PEXStuI ohne HCMV- Insert. Diese rekombinanten Proteine wurden von Dr. Werner Lindenmaier, Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH, Braunschweig zur Verfügung gestellt. Die Expression und Produktion in Escherichia coli sowie die gelchromatographische Aufreinigung der drei HCMV pp65-Subfragmentproteine C74, C35, C47 und des Kontrollproteins β-Galaktosidase erfolgte nach Lindenmaier, W. et al. ((25), Archives of Virology 113, 1-16, 1990). In Folge wurden die Fraktionen durch Gelelektrophorese analysiert, HCMV pp65-Subfragmentprotein enthaltende Fraktionen gepoolt und die Proteinkonzentration bestimmt.As antigens for the localization of T cell epitopes within the matrix protein pp65 (amino acid 1-561) of the human cytomegalovirus became the three recombinant HCMV pp65- produced in Escherichia coli and bound to β-galactosidase Subfragment proteins C74 (amino acid 297 - amino acid 458 of the total protein pp65), C35 (amino acid 303 - amino acid 476 of the total protein pp65) and C47 (Amino acid 389 - amino acid 561 from the total protein pp65). As Negative control served β-galactosidase from the cloning vector PEXStuI without HCMV Insert. These recombinant proteins were developed by Dr. Werner Lindenmaier, society for Biotechnological Research mbH, Braunschweig. The Expression and production in Escherichia coli as well as the gel chromatography Purification of the three HCMV pp65 subfragment proteins C74, C35, C47 and des Control protein β-galactosidase was carried out according to Lindenmaier, W. et al. ((25), Archives of Virology 113, 1-16, 1990). As a result, the fractions were by gel electrophoresis analyzed, fractions containing HCMV pp65 subfragment protein pooled and the Protein concentration determined.
Um die Aminosäuresequenz innerhalb des HCMV pp65-Subfragmentproteins C47, die eine Proliferation peripherer mononukleärer Blutzellen HCMV-seropositiver Blutspender induzierte, näher einzugrenzen, wurden 10 je 8 Aminosäuren (= aa) mit dem folgenden Peptid überlappende Hexadecapeptide (C47-1 bis C47-10 : 1. aa 469 - aa 484; 2. aa 477 - aa492; 3. aa485 - aa500; 4. aa493 - 508; 5. aa501 - aa516; 6. aa509 - aa524; 7. aa 517 - aa 532; 8. aa 525 - aa 540; 9. aa 533 - aa 548; 10. aa 541 - aa 556) und ein Tridecapeptid (C47-1 1: aa 549 - aa 561), das eine 8 Aminosäuren überlappende Sequenz mit dem vorhergehenden Peptid C47-10 besitzt, aus der Gesamtsequenz des HCMV pp65-Proteins (aa 1 - aa 561) abgeleitet und synthetisch hergestellt. Der Anfang von Peptid C47-1 wurde derartig gewählt, daß die ersten 8 Aminosäuren (aa 469 - aa 476) vor dem Beginn der ausschließlich vom HCMV pp65-Subfragmentprotein C47 abgedeckten Sequenz, beginnend ab aa 477, liegen.To the amino acid sequence within the HCMV pp65 subfragment protein C47, the a proliferation of peripheral mononuclear blood cells from HCMV-seropositive blood donors were induced to narrow down, 10 each 8 amino acids (= aa) with the following Peptide overlapping hexadecapeptides (C47-1 to C47-10: 1. aa 469 - aa 484; 2. aa 477 - aa492; 3. aa485 - aa500; 4. aa493-508; 5. aa501 - aa516; 6. aa509 - aa524; 7. aa 517 - aa 532; 8. aa 525 - aa 540; 9. aa 533 - aa 548; 10. aa 541 - aa 556) and a Tridecapeptide (C47-1 1: aa 549 - aa 561), which has an 8 amino acid overlapping sequence with the previous peptide C47-10, from the total sequence of the HCMV pp65 protein (aa 1 - aa 561) derived and synthesized. The beginning of Peptide C47-1 was chosen such that the first 8 amino acids (aa 469 - aa 476) before the start of the HCMV pp65 subfragment protein C47 only covered sequence, starting from aa 477.
Die Peptide wurden chemisch mit einem AMS 222 Multiple Synthesiser (ABIMED Analysen-Technik, Langenfeld) nach einem standardisierten Fmoc/tert-Butyl-Verfahren durch Aktivierung mit TBTU/NMM (O-benzotriazolyl-N,N,N′,N′-Tetramethyluronium Terafluoroborat/N-methyl-Morpholin) auf Tentagel-SAC Resin (Rapp Polymere, Tübingen) von Ronald Frank, Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH, Braunschweig synthetisiert. Folgend wurden die Peptidketten entschützt und vom Resin mit Trifluoressigsäure (TFA)/2% Triisobutylsilan und 3% H₂O gespalten. Die Präzipitation erfolgte in kaltem Äther. Die Rohpeptide wurden durch präparative HPLC mit einer Reversed-phase C₁₈-Säule gereinigt, wobei ein Acetonitril/Wasser-Gradient mit 0,1% TFA eingesetzt wurde. Der Peptid-Gehalt der Fraktionen wurde durch analytische Reversed-phase HPLC und mit Laserdesorptionmassenspektrometrie (MALDI-MS) analysiert. Reine Peptidfraktionen wurden gepoolt, konzentriert und lyophilisiert.The peptides were chemically processed using an AMS 222 multiple synthesizer (ABIMED Analysis technology, Langenfeld) according to a standardized Fmoc / tert-butyl method by activation with TBTU / NMM (O-benzotriazolyl-N, N, N ′, N′-tetramethyluronium Terafluoroborate / N-methyl-morpholine) on Tentagel-SAC Resin (Rapp Polymers, Tübingen) by Ronald Frank, Society for Biotechnological Research mbH, Braunschweig synthesized. The peptide chains were then deprotected and the resin cleaved with trifluoroacetic acid (TFA) / 2% triisobutylsilane and 3% H₂O. The Precipitation was done in cold ether. The crude peptides were prepared by preparative HPLC cleaned with a reversed-phase C₁₈ column, using an acetonitrile / water gradient 0.1% TFA was used. The peptide content of the fractions was determined by analytical Reversed-phase HPLC and with laser desorption mass spectrometry (MALDI-MS) analyzed. Pure peptide fractions were pooled, concentrated and lyophilized.
Anschließend wurden die Peptide mit einer Stammkonzentration von 2 mg/ml in PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) gelöst.The peptides were then mixed with a stock concentration of 2 mg / ml in PBS (Phosphate-buffered saline) dissolved.
Als Positivkontrolle wurde HCMV-Gesamtantigen, Stamm AD169 des humanen Cytomegalievirus eingesetzt. Hierfür wurden subkonfluente Monolayer von diploiden MRC-5-Fibroblasten mit dem Stamm HCMV AD169 infiziert, bis ein zytopathischer Effekt von 100% zu beobachten war. Die infizierten Zellen wurden gewaschen, in RPMI ohne Serum aufgenommen und zum Zellaufschluß drei Mal eingefroren und aufgetaut. Das Lysat wurde zentrifugiert (5000 × g, 20 min, 40°C) und der resultierende Virus-Überstand in Aliquots bei 700°C gelagert. Vor dem Einsatz im Lymphozytenproliferationstest wurde der in Folge als HCMV-Gesamtantigen benannte Virusüberstand bei 600°C über 45 min inaktiviert. Je nach Viruspräparation erfolgten weitere Verdünnungen von HCMV-Gesamtantigen bis 1 : 10.HCMV total antigen, strain AD169 of human, was used as a positive control Cytomegalovirus used. For this, subconfluent monolayers of diploids were used MRC-5 fibroblasts infected with the HCMV strain AD169 until a cytopathic Effect of 100% was observed. The infected cells were washed in RPMI was taken without serum and frozen three times for cell disruption and thawed. The lysate was centrifuged (5000 x g, 20 min, 40 ° C) and the resulting Virus supernatant stored in aliquots at 700 ° C. Before use in The lymphocyte proliferation test was subsequently named the HCMV total antigen Virus supernatant inactivated at 600 ° C for 45 min. Depending on the virus preparation further dilutions of total HCMV antigen to 1:10.
Für den Lymphozytenproliferationstest wurden 1 × 10⁵ periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC)/100 µl Kulturmedium pro Loch in einer 96-Loch- Rundbodenkulturplatte (NUNC, Wiesbaden, F.R.G.) ausgesät und 100 µl Kulturmedium mit den HCMV pp65-Subfragmentproteinen C74, C35 und C47 bzw. den Hexadecapeptiden C47-1 bis C47-11 als Antigenen zugefügt. Die Konzentration für die HCMV pp65-Subfragmentproteine (MG: pp65 C74 = 137 kD, pp65-C35 = 138 kD, pp65-C47 = 137 kD) lag bei 5 µg/ml Kulturmedium, für die Hexadecapeptide bei 50 µg/ml Kulturmedium. Es wurden drei Negativkontrollen angelegt: Negativkontrolle I. = PBMC + 100 µl Kulturmedium ohne Antigenzusatz; Negativkontrolle II. für die HCMV pp65-Subfragmentproteine = PBMC + 100 µl Kulturmedium mit 5 µg/ml β- Galaktosidase aus Escherichia coli mit Klonierungsvektor ohne HCMV-Insert; Negativkontrolle III. für die Hexadecapeptide = PBMC + 100 µl Kulturmedium mit einem 50 µg/ml entsprechenden Volumen PBS. Als Positivkontrolle wurde HCMV- Gesamtantigen eingesetzt. Für jede dieser beschriebenen Behandlungsarten wurden Triplikat- bis Pentaplikatansätze angelegt. Die PBMC wurden bei 370°C, 95% Luftfeuchtigkeit und 5% CO₂-Begasung über 6 Tage kultiviert und in den letzten 18 Stunden pro Loch mit 1 MCi [³H]-Methylthymidin/50 µl Kulturmedium ohne Serumzusatz inkubiert (AMERSHAM, Braunschweig). Nach dem Einbau von [³H]-Methylthymidin in Gesamt-DNA proliferierender Zellen erfolgte die Ernte auf Glasfaserfilter und eine Flüssigkeitsszintillationszählung der counts pro Minute im β-Counter.For the lymphocyte proliferation test 1 × 10⁵ peripheral mononuclear Blood cells (PBMC) / 100 µl culture medium per well in a 96-well Round soil culture plate (NUNC, Wiesbaden, F.R.G.) sown and 100 µl culture medium with the HCMV pp65 subfragment proteins C74, C35 and C47 and den Hexadecapeptides C47-1 to C47-11 added as antigens. The concentration for that HCMV pp65 subfragment proteins (MG: pp65 C74 = 137 kD, pp65-C35 = 138 kD, pp65-C47 = 137 kD) was 5 µg / ml culture medium, for the hexadecapeptides 50 µg / ml culture medium. Three negative controls were created: negative control I. = PBMC + 100 µl culture medium without added antigen; Negative control II. For the HCMV pp65 subfragment proteins = PBMC + 100 µl culture medium with 5 µg / ml β- Escherichia coli galactosidase with cloning vector without HCMV insert; Negative control III. for the hexadecapeptides = PBMC + 100 µl culture medium a volume of PBS corresponding to 50 µg / ml. As a positive control, HCMV Total antigen used. For each of these types of treatments have been described Triplicate to pentaplace approaches. The PBMC were at 370 ° C, 95% Humidity and 5% CO₂ fumigation cultivated over 6 days and in the last 18 Hours per well with 1 MCi [³H] -methylthymidine / 50 µl culture medium without serum addition incubated (AMERSHAM, Braunschweig). After the incorporation of [3 H] -methylthymidine in Total DNA from proliferating cells was harvested on glass fiber filters and a Liquid scintillation counting of counts per minute in the β counter.
Der Einbau von [³H]-Methylthymidin als counts pro Minute (cpm) wurde wie folgt angegeben: entweder sind die Mittelwerte der cpm ± Standardfehler (SEM) angegeben oder es erfolgte die Berechnung der Stimulationsindizes (SI) ausgedrückt als Verhältnis der cpm-Mittelwerte von PBMC-Kulturen mit Antigen-Behandlung zu den cpm- Mittelwerten unbehandelter Kontrollkulturen.The incorporation of [3 H] methylthymidine as counts per minute (cpm) was as follows specified: either the mean values of the cpm ± standard errors (SEM) are given or the stimulation indices (SI) were calculated as a ratio the cpm mean values of PBMC cultures with antigen treatment to the cpm Averages of untreated control cultures.
Die antigenspezifische Erkennung durch Inkubation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) von 11 gesunden Blutspendern mit den HCMV pp65- Subfragmentproteinen C74, C35 und C47 sowie dem Kontrollprotein β-Galaktosidase (β- gal) vom Klonierungsvektor PEXStuI ohne HCMV-Insert wurde im Lymphozytenproliferationstest mittels Einbau von [³H]-Methylthymidin in die Gesamt- DNA proliferierender peripherer mononukleärer Blutzellen getestet (Tabelle 1).Antigen-specific detection by incubation of peripheral mononuclear Blood cells (PBMC) from 11 healthy blood donors with the HCMV pp65- Subfragment proteins C74, C35 and C47 as well as the control protein β-galactosidase (β- gal) from the cloning vector PEXStuI without HCMV insert was in Lymphocyte proliferation test by incorporating [3 H] methylthymidine into the total DNA proliferating peripheral blood mononuclear cells tested (Table 1).
Von diesen 11 gesunden Spendern waren 9 HCMV-seropositiv und 2 HCMV- seronegativ. Bei 7 von 9 HCMV-seropositiven und 2 von 2 HCMV-seronegativen Spendern konnten die Haplotypen der HLA-Klasse I determiniert werden. Hierbei differierten die Haplotypen der HLA-Klasse I. Bei 8 von 9 HCMV-seropositiven und 2 von 2 HCMV-seronegativen Spendern konnten die Haplotypen der HLA Klasse II determiniert werden. 8 von 9 HCMV-seropositiven und 2 von 2 HCMV-seronegativen Individuen exprimierten gemeinsam die Superspezifität HLA-DR3 und die Superspezifität HLA-DQ2.Of these 11 healthy donors, 9 were HCMV seropositive and 2 HCMV seronegative. In 7 out of 9 HCMV-seropositive and 2 out of 2 HCMV-seronegative The HLA class I haplotypes could be determined. Here differentiated the haplotypes of HLA class I. In 8 of 9 HCMV-seropositive and 2 HLA class II haplotypes were obtained from 2 HCMV-seronegative donors be determined. 8 out of 9 HCMV seropositive and 2 out of 2 HCMV sero negative Individuals together expressed the superspecificity HLA-DR3 and the superspecificity HLA-DQ2.
Die Untersuchungen ergaben, daß bei 6 von 9 HCMV-seropositiven Spendern (Nr. 1 - 6) das HCMV pp65-Subfragmentprotein C47 eine spezifische Stimulation der Proliferation peripherer mononukleärer Zellen induziert. Der Medianwert der Stimulationsindizes dieser 6 auf das HCMV pp65-Subfragmentprotein C47 reagierenden Individuen lag bei 13,6 (maximal: 67,9 und minimal: 3,6). Die zwei weiteren HCMV pp65-Subfragmentproteine C74 und C35 konnten bei den Spendern Nr. 1 - 6 keine Proliferation von PBMC induzieren. Die PBMC von 3 von 9 HCMV-seropositiven (Nr. 7 - 9) und 2 von 2 HCMV-seronegativen Spendern (Nr. 10 - 11) wurden von keinem der drei HCMV pp65-Subfragmentproteine stimuliert. Zwei von diesen 3 Individuen (Nr. 7 und 8) wiesen jedoch eine HCMV-spezifische Stimulation gegen HCMV-Gesamtantigen auf und einer dieser drei Spender reagierte weder auf HCMV-Gesamtantigen noch auf die drei HCMV pp65-Subfragmentproteine. Als Negativkontrolle reagierten 2 HCMV- seronegative Individuen (Nr. 10 und 11) weder auf die drei HCMV pp65- Subfragmentproteine noch auf das HCMV-Gesamtantigen.The investigations showed that 6 out of 9 HCMV-seropositive donors (No. 1 - 6) the HCMV pp65 subfragment protein C47 specifically stimulates the Proliferation of peripheral mononuclear cells induced. The median of the Stimulation indices of these 6 responding to the HCMV pp65 subfragment protein C47 Individuals were 13.6 (maximum: 67.9 and minimum: 3.6). The two other HCMV pp65 subfragment proteins C74 and C35 failed in donor numbers 1-6 Induce proliferation of PBMC. The PBMC of 3 out of 9 HCMV seropositive (No. 7-9) and 2 out of 2 HCMV seronegative donors (No. 10-11) were none of the stimulated three HCMV pp65 subfragment proteins. Two of these 3 individuals (No. 7 and 8) demonstrated HCMV-specific stimulation against total HCMV antigen and one of these three donors did not respond to HCMV total antigen or to three HCMV pp65 subfragment proteins. As a negative control, 2 HCMV seronegative individuals (No. 10 and 11) neither on the three HCMV pp65- Subfragment proteins still on the total HCMV antigen.
Daraus wird gefolgert, daß von peripheren mononukleären Blutzellen HLA-DR3/DQ2 exprimierender, HCMV-seropositiver Blutspender eine Aminosäuresequenz innerhalb des HCMV pp65-Subfragmentproteins C47 erkannt wird und diese Zellen dadurch zur Proliferation stimuliert werden. Diese Aminosäuresequenz liegt innerhalb des Bereiches des HCMV pp65-Subfragmentproteins C47 (ab Aminosäure 477 bis einschließlich Aminosäure 561), der sich nicht mit den zwei weiteren HCMV pp65- Subfragmentproteinen C74 (ab Aminosäure 297 bis einschließlich Aminosäure 458) und C35 (ab Aminosäure 303 bis einschließlich Aminosäure 476) überschneidet. Die beiden HCMV pp65-Subfragmentproteine C74 und C35 konnten keine Stimulation der Proliferation induzieren. Somit wurde die Groblokalisation eines T-Zell-Epitopes innerhalb des HCMV pp65-Subfragmentproteins C47 durchgeführt.It is concluded that peripheral mononuclear blood cells HLA-DR3 / DQ2 expressing HCMV seropositive blood donor an amino acid sequence within the HCMV pp65 subfragment protein C47 is recognized and these cells thereby Proliferation can be stimulated. This amino acid sequence is within the range of the HCMV pp65 subfragment protein C47 (from amino acid 477 up to and including Amino acid 561), which is not compatible with the two other HCMV pp65- Subfragmentproteins C74 (from amino acid 297 up to and including amino acid 458) and C35 (from amino acid 303 up to and including amino acid 476) overlaps. The two HCMV pp65 subfragment proteins C74 and C35 failed to stimulate the Induce proliferation. Thus the rough localization of a T cell epitope performed within the HCMV pp65 subfragment protein C47.
Die antigenspezifische Erkennung durch Inkubation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) von gesunden Blutspendern mit den Peptiden C47-1 bis C47-11 wurde wiederum im Lymphozytenproliferationstest mittels Einbau von [³H]- Methylthymidin in Gesamt-DNA proliferierender peripherer mononukleärer Blutzellen untersucht.Antigen-specific detection by incubation of peripheral mononuclear Blood cells (PBMC) from healthy blood donors with the peptides C47-1 to C47-11 was again in the lymphocyte proliferation test by incorporating [3 H] - Methylthymidine in total DNA proliferating peripheral blood mononuclear cells examined.
In Tabelle 2 wurde die erfindungsgemäße Wirkung derart gezeigt, daß PBMC von drei HCMV-seropositiven Spendern (Nr. 1, Nr. 2 und Nr. 3) durch das Peptid C47-6 spezifisch und signifikant zur Proliferation stimuliert wurden. Es ergab sich abhängig vom Individuum ein Stimulationsindex von 6,0 für Spender Nr. 1, ein Stimulationsindex von 74,6 für Spender Nr. 2 und ein Stimulationsindex von 20,1 für Spender Nr.3. Die dem Peptid C47-6 benachbarten und mit diesem je 8 Aminosäuren überlappenden Peptide C47-5 und C47-7 wie auch die Peptide C47-1, -2, -3, -4, -8, -9, -10, -11 konnten keine signifikante Stimulation der Proliferation von PBMC der drei Spender induzieren. Abb. 1 zeigt die graphische Darstellung der spezifischen Stimulation von PBMC durch Peptid C47-6 bei Spender Nr. 1, Abb. 2 die graphische Darstellung der spezifischen Stimulation von PBMC durch Peptid C47-6 bei Spender Nr. 2 und Abb. 3 die graphische Darstellung der spezifischen Stimulation von PBMC durch Peptid C47-6 bei Spender Nr. 3.In Table 2 the effect according to the invention was shown in such a way that PBMC from three HCMV-seropositive donors (No. 1, No. 2 and No. 3) were specifically and significantly stimulated for proliferation by the peptide C47-6. Depending on the individual, there was a stimulation index of 6.0 for donor No. 1, a stimulation index of 74.6 for donor No. 2 and a stimulation index of 20.1 for donor No. 3. The peptides C47-5 and C47-7 which are adjacent to the peptide C47-6 and which overlap them with 8 amino acids each, as well as the peptides C47-1, -2, -3, -4, -8, -9, -10, -11 could not induce significant stimulation of PBMC proliferation from the three donors. Fig. 1 shows the graphical representation of the specific stimulation of PBMC by peptide C47-6 in donor No. 1, Fig. 2 shows the graphical representation of the specific stimulation of PBMC by peptide C47-6 in donor No. 2 and Fig. 3 shows the graphical representation Illustration of the specific stimulation of PBMC by peptide C47-6 in donor No. 3.
Erfindungsgemäß wurde somit die immunogene Sequenz eines T-Zell-Epitopes innerhalb des pp65-Proteins von HCMV durch die spezifische Stimulation peripherer mononukleärer Blutzellen gesunder, HCMV-seropositiver Spender mit dem Peptid C47-6 identifiziert und auf eine kleine Sequenz von 16 Aminosäuren beginnend ab Aminosäure 509 bis einschließlich Aminosäure 524 vom pp65-Protein des humanen Cytomegalievirus eingegrenzt.The immunogenic sequence of a T cell epitope was thus according to the invention within the pp65 protein of HCMV by the specific stimulation peripheral mononuclear blood cells of healthy, HCMV-seropositive donors with the peptide C47-6 identified and a small sequence of 16 amino acids starting from amino acid 509 up to and including amino acid 524 from the pp65 protein of the human cytomegalovirus narrowed down.
Erfindungsgemäß wurde weiterhin in Tabelle 3 gezeigt, daß drei auf das Peptid C47-6 reagierende Spender Nr. 1, 2 und 3 folgende gemeinsame HLA-Haplotypmerkmale aufweisen: HLA-A1, HLA-B8, HLA-DR3 und HLA-DQ2. Der HCMV-seronegative Spender Nr. 11 wies keine Stimulation sowohl durch HCMV-Gesamtantigen als auch durch Peptid C47-6 auf.According to the invention it was further shown in Table 3 that three relate to the peptide C47-6 responsive donors # 1, 2, and 3 following common HLA haplotype traits have: HLA-A1, HLA-B8, HLA-DR3 and HLA-DQ2. The HCMV seronegative Donor # 11 showed no stimulation from either total HCMV antigen or by peptide C47-6.
Claims (5)
- - mononukleäre Zellen von allogenen oder autologen Spendern einsetzt,
- - daraus T-Zellen mit dem Peptid und/oder Teilpeptid stimuliert,
- - danach T-Zellen anzüchtet und vermehrt, die für das Peptid und/oder Teilpeptid spezifisch sind,
- - T-Zellen gewinnt, die für das Peptid und/oder Teilpeptid spezifisch sind, und
- - ggf. die gewonnenen T-Zellen im Sinne einer adoptiven Immun therapie einer HCMV-Infektion einsetzt.
- - uses mononuclear cells from allogeneic or autologous donors,
- stimulates T cells with the peptide and / or partial peptide therefrom,
- then growing and multiplying T cells which are specific for the peptide and / or partial peptide,
- - T cells, which are specific for the peptide and / or partial peptide, and
- - The T cells obtained may be used in the context of adoptive immunotherapy for an HCMV infection.
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| DE19619255A1 true DE19619255A1 (en) | 1996-11-28 |
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| DE19910044A1 (en) * | 1999-03-08 | 2000-09-14 | Bodo Plachter | Viral particles released after infection by human cytomegalovirus and their use as a vaccine |
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1996
- 1996-05-13 DE DE19619255A patent/DE19619255A1/en not_active Ceased
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