DE19546680A1 - Modifikation der Glykosylierung in Pilzen durch heterologe Glykosyltransferasen - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet: Die Erfindung betrifft eine Methode zur Herstellung von Pilzstämmen, in denen durch heterologe Enzyme (Glykosyltransferasen) neue Glykosylstrukturen synthetisiert werden.

Zweck: Glykosylstrukturen in Pilzen haben eine andere Struktur als Glykosylstrukturen von Säugerzellen, z. B. enthalten sie keine Galactose in β-1,4-Bindung. In dem beschriebenen Verfahren werden spezielle Glykosyltransferasen in Pilzen derartig produziert, daß neue Glykosylstrukturen entstehen. Die konstruierten Pilzstämme können z. B. für die Produktion von Säugerproteinen verwendet werden.

Stand der Technik mit Fundstellen: Viele Proteine werden während der Sekretion in eukaryonten Zellen durch Glykosylketten modifiziert. Hierbei werden Asparagin-Reste (N-Glykosylierung) oder Serin-/Threonin-Reste (O-Glykosylierung) des Proteins als Anheftungsstellen benutzt. Während die Glykosylstrukturen in Pilzen relativ einfach aufgebaut sind, können diese in Säugerzellen eine Vielzahl verschiedener Strukturen aufweisen. N- glykosidisch verknüpfte Glykosylketten der Hefe S. cerevisiae bestehen z. B. neben den zwei evolutionär invarianten N- Acetylglucosamin (GlcNAc)-Resten der Kernregion lediglich aus Mannose-Resten (Man); die Kernregion kann mit über 100 Mannose- Resten weiter modifiziert werden (Herscovics und Orlean, FASEB J. 7, 540-550, 1993). N-Glycosylketten in Säugerzellen können dagegen die zusätzlichen Zucker Galactose, Sialinsäure und Fucose enthalten (komplexer Typ) (Kornfeld und Kornfeld, Ann. Rev. Biochem. 54, 6331-664, 1985). Die Verknüpfung der Galactose in menschlichen Zellen erfordert eine UDP-Galactose:β-D- Acetylglucosaminid β-1,4-galactosyltransferase [EC 2.4.1.38) (Gal-Tf), ein Enzym, das in der Golgi-Membran verankert ist und UDP-Galactose als Substrat und N-Acetylglucosamin (GlcNAc) in Glykosylstrukturen als Akzeptor benutzt (Masri et al., Biochem. Biophys. Acta 157, 657-663, 1988).

Einige Beispiele für Proteine, deren Aktivität von der Anwesenheit spezifischer Zucker in Glykosylketten abhängt, sind bekannt. Die Entfernung von Galactose aus Glykosylketten des Erythropoietins (EPO) führt zu einem Protein, das zwar in vitro-, aber keine in vivo-Aktivität aufweist (Tsuda et al., Eur. J. Biochem. 188, 405-411, 1990). Die antennäre GlcNAc-Man-Struktur der Glykosylketten in IgG-Immunoglobulinen ist wichtig für akzessorische Antikörperfunktionen, wie zellabhängige Cytotoxizität und komplementabhängige Lyse (Koide et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 75, 838-844, 1977); schon das Fehlen der Galactose in Glykosylketten der Fc-Region des IgG führt zu einer reduzierten Bindung an C1q- und Fc-Rezeptoren (Tsuchida et al., J. Rheumatology 16, 285-290, 1989). Andere Beispiele für die Auswirkung der Zusammensetzung von Glykosylketten auf die Aktivität von Proteinen sind Sucrase- Isomaltase (Yusufi et al., J. Biol. Chem. 263, 13683-133691, 1988) und Glykoprotein-Hormone (Baenziger und Green, Biochem. Biophys. Acta 947, 287-306, 1988). Die Abwesenheit von endständigen Sialinsäureresten führt zu einer reduzierten Bioaktivität von Plasmaproteinen über eine stärkere Bindung an Rezeptoren, z. B. in der Leber (Sharon und Lis, Science 246, 227-234, 1989). Neben den erwähnten Auswirkungen der spezifischen Zuckerstruktur von Glykosylketten ist bekannt, daß auch deren An- und Abwesenheit, bzw. deren Größe, die Aktivität von Proteinen beeinflussen kann (Cumming, Glycobiology 1, 115-130, 1991).

In der Hefe S. cerevisiae kann die Struktur von Glykosylketten durch Mutationen beeinflußt werden. Durch Mutationen der MNN-, ALG-, GDA1- und OCH1-Gene kommt es zu einer Verkürzung der N-Glykosylketten (Ballou, Meth. Enzymol. 185, 440-470, 1990; Huffaker und Robbins, J. Biol. Chem. 257, 3203-3210, 1982; Abeÿon et al., J. Cell. Biol., 122, 307-323, 1993; Nakanishi et al., 1993); Mutationen der PMT und MNT1-Gene führen zur Abwesenheit, bzw. Verkürzung von O-Glykosylketten (Lussier et al., J. Biol. Chem. 270, 2770-2775, 1995; Häusler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6846-6850, 1992). Bei Säugerzellen, z. B. CHO-Zellen, kann durch die Einführung und Expression von Genen für spezifische Säuger-Glykosyltransferasen die Struktur von Glykosylketten verändert werden (Youakim und Shur, Annals of the New York Acad. Sci. 745, 331-345, 1994). Für Pilze ist die Bio­ synthese veränderter Glykosylstrukturen, die zusätzliche, in der betreffenden Pilzart natürlicherweise nicht vorkommende Zucker enthalten, bisher nicht beschrieben worden. Eine Methode zur Konstruktion derartiger Pilzstämme wird in der vorliegenden Erfindung durch heterologe, modifizierte Glykosyltransferasen erreicht.

Die Aktivität von Glykosyltransferasen in Zellen beruht auf ihrer Lokalisation im Lumen von Sekretionsorganellen, wie z. B. dem Golgi (Machamer, Curr. Op. Cell Biol. 5, 606-612, 1993). Die Membrananker-Region der menschlichen Galactosyltransferase enthält essentielle Sequenzen für die Lokalisation im trans- Golgi (Aoki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 43319-4323, 1992). In ähnlicher Weise wird in der Hefe S. cerevisiae die Golgi-Lokalisation durch die Membrananker-Region bestimmt; dieser Sachverhalt ist für eine α-1,2-Mannosyltransferase (Mnt1) und eine α-1,3-Mannosyltransferase (Mnn1) bekannt (Chapman und Munro, EMBO J. 13, 4896-4907, 1994; Graham und Krasnov, Mol. Biol. Cell 6, 809-824, 1995). Kürzlich wurde gezeigt, daß auch die Membrananker-Region eines Säugerproteins die Golgi-Lokalisation eines Proteins in Hefe bewirkt (Schwientek et al., J. Biol. Chem. 270, 5483-5489, 1995).

Kritik des Standes der Technik: Proteine, die von Pilzzellen sekretiert werden, enthalten Pilz-spezifische Glykosylstrukturen, die z. B. überwiegend aus Mannose-Resten bestehen. Die Abwesenheit von Zuckern, z. B. Galactose, in Glykosylstrukturen kann die in vitro oder in vivo-Aktivität der produzierten Proteine negativ beeinflussen.

Aufgabe: Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, in einem Pilzstamm Glykosylstrukturen zu produzieren, welche zusätzliche Zucker enthalten, z. B. Galactose, die in den Glykosylstrukturen des Pilzes natürlicherweise nicht vorkommen.

Lösung: Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß in dem zu verwendenden Pilzstamm heterologe modifizierte Glykosyltransferasen produziert und in den Sekretionsweg des Pilzes eingebaut werden, so daß die Glykosylstrukturen des Pilzes verändert werden können. Der Pilz-Wirtsstamm trägt hierbei vorzugsweise Mutationen, welche die Glykosylstrukturen so verändern, daß Akzeptorsubstrate für die heterologen Glykosyltransferasen entstehen.

Weitere Ausgestaltung der Erfindung: Um den Zucker Galactose in die Glykosylstrukturen der Hefe Saccharomyces cerevisiae einzubauen, wird das Gen für eine modifizierte menschliche β-1,4- Galactosyltransferase in Hefe exprimiert. Die hierbei benutzte Galactosyltransferase erhält ihre Funktion durch Fusion an die Lokalisierungssequenz des Mnt1-Proteins der Hefe. In dem Hefe- Wirtsstamm liegen wegen einer alg1-Mutation Akzeptor- Glykosylstrukturen vor, auf die Galactose-Reste übertragen werden.

Erzielbare Vorteile: Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß die konstruierten Pilzstämme als Wirtsstämme für die Produktion von Proteinen verwendet werden können, deren in vitro und/oder in vivo-Aktivität von der Anwesenheit spezifischer Zucker in Glykosylstrukturen abhängt, die natürlicherweise in der betreffenden Pilzart in Glykosylstrukturen nicht vorkommen.

Beschreibung eines Ausführungsbeispiels

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in den Abb. 1 und 2 dargestellt und wird im folgenden näher beschrieben. Es zeigen:

Abbildungen

Fig. 1A Die bei der Konstruktion des Hefestammes verwendete Genfusion für eine modifizierte Galactosyltransferase. Das hierdurch kodierte Protein besteht aus den Resten 1-82 der Mem­ brananker-Sequenz der α-1,2-Mannosyltransferase (MNT1) und den Resten 77-400 der menschlichen β-1,4-Galactosyltransferase. Die Genfusion befindet sich auf Plasmid phMGT1 und wird durch den GAL10-Promotor der Hefe transkribiert.

Fig. 1B Enzymatische in vitro-Aktivität der in Hefe produzierten modifizierten Galactosyltransferase (∎) im Vergleich zu authentischer menschlicher Galactosyltransferase (+).

Fig. 2 Nachweis der Modifikation von Glykosylstrukturen (Galactose-Addition) durch die in vivo-Aktivität der in Hefe produzierten Galactosyltransferase. Eine Kontrolltransformante (Spuren 1-3) und eine phMGT1-Transformante (Spuren 4-6) wurden zunächst mit ³⁵S markiert. Glykosylierte Proteine wurden dann mit den Lectinen Concanavalin A (Mannose-spezifisch; Spuren 1, 4), WGA (GlcNAc-spezifisch; Spuren 2, 5) oder RCA (Galactose­ spezifisch; Spuren 3, 6) präzipitiert und durch SDS- Gelelektrophorese getrennt. Die erhaltenen Proteine wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht.

Versuchsbeschreibung

Im folgenden wird die Modifikation der Glykosylstrukturen eines speziellen Hefestammes beschrieben, der eine modifizierte Galactosyltransferase produziert. Die Beschreibung ist aufgeteilt in (a), Konstruktion einer Genfusion für eine modifizierte Galactosyltransferase in Plasmid phMGT1, (b), Konstruktion einer Hefe-Transformante mit Plasmid phMGT1, (c), Nachweis der in vitro-Aktivität der durch die Hefetransformante produzierten Galactosyltransferase und (d), Nachweis des Einbaus von Galactose in Glykosylstrukturen.

(a) Konstruktion einer Genfusion für eine modifizierte Galactosyltransferase

Eine Genfusion bestehend aus dem MNT1-Gen der Hefe S. cerevisiae, das für eine α-1,2-Mannosyltransferase kodiert (Häusler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 6846-6850, 1992), und dem Gen für die menschliche Gal-Tf wurde wie folgt konstruiert:
Zunächst wurde das 5′-Ende von MNT1, das für die Membrananker-Region kodiert (Häusler und Robbins, Glycobiology 2, 77-84, 1992) durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit den Oligonukleotiden 5′-TTACCATGGCCCTCTTTCTCAG-3′ und 5′- TCTGGTCCTGGCTTCGGAGTCTTCG-3′ aus genomischer S. cerevisiae DNA amplifiziert (die neu hinzugefügten NcoI- und AvaII- Schnittstellen sind unterstrichen; die NcoI-Schnittstelle enthält die ATG-Translationsinitiationssequenz). Das PCR-Fragment wurde mit NcoI und AvaII geschnitten und mit einem 602 bp BamHI-NcoI- Fragment, das den GAL10-Promotor von S. cerevisiae trägt (Johnston und Davis, Mol. Cell. Biol. 4, 1440-1448, 1984) und dem großen BamHI-RsrII-Fragment von pCT7/J20 (Masri et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 157, 657-663, 1988) ligiert. Aus dem erhaltenen Plasmid pGTÜ1 wurde das BamHI-HindIII-Fragment (MNT1::Gal-Tf) isoliert und zwischen die BamHI und HindIII- Schnittstellen des S. cerevisiae-Vektors pJDB207 (Beggs, J. F., Molecular Genetics in Yeast, Munksgaard, Kopenhagen 16, 383-395, 1981) inseriert.

Die Expressionseinheit des erhaltenen Plasmids phMGT1 ist in Fig. 1A abgebildet. Zusätzlich wird die Verbindungssequenz der produzierten Proteinfusion gezeigt, die zwischen Aminosäure 82 von Mnt1 und Aminosäure 77 von Gal-Tf liegt.

(b) Konstruktion einer Hefe-Transformante mit Plasmid phxGT1

Das erhaltene Plasmid phMGT1 wurde in die S. cerevisiae Stämme BJ1991 (Jones, Meth. Enzymol. 185, 372-386, 1990) und ATS594-1B transformiert. Stamm ATS594-1B wurde aus einer Kreuzung der alg1-Mutante PRY57 (Huffaker und Robbins, J. Biol. Chem. 257, 3203-3210, 1982) mit einem Laborstamm von S. cerevisiae gewonnen.

Als Kontrollstamm wurde eine Transformante von Stamm ATS594-1B mit Plasmid pJDB207 verwendet. Hefe-Transformanten wurden selektiv in SD-Minimalmedium (Sherman et al., Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) angezogen. Zur Induktion des GAL10-Promotors und somit der Produktion der Mnt1- Gal-Tf-Fusion wurden die Zellen in SGal-Medium angezogen, das 2% Galactose und 0.2% Glucose enthält (Schwientek und Ernst, Gene 145, 299-303, 1994).

Die erhaltene S. cerevisiae-Transformante ATS594-1B (phMGT1) produziert bei einer erhöhten Temperatur von 37°C verkürzte Glykosylketten der Struktur GlcNAc-GlcNAc (Huffaker und Robbins, J. Biol. Chem. 257, 3203-3210, 1982), die als Akzeptoren für Gal- Tf dienen können.

(c) Nachweis der in vitro-Aktivität der modifizierten Galactosyltransferase

Zum Nachweis der enzymatischen Aktivität der modifizierten Galactosyltransferase (Mnt1/Gal-Tf-Fusion) wurde überprüft, ob Zellextrakte der Hefetransformanten Galactose aus UDP-Gal auf ein Akzeptorsubstrat (Ovalbumin) übertragen können.

Zur Gewinnung von Zellextrakten wurden Transformanten zunächst in SGal-Medium angezogen und mit Hilfe von Glasperlen in einem Braun-Homogenisator wie beschrieben aufgeschlossen (Schwientek und Ernst, Gene 145, 299-303, 1994). Der Überstand einer nachfolgenden Zentrifugation bei 100.000 × g wurde als Mikrosomenextrakt bezeichnet und in Enzymtests verwendet. Der Gehalt des Mikrosomenextraktes an Gal-Tf wurde mit dem anti-Gal- Tf-Antikörper MAb8628 (Uemura et al., Cancer Res. 52, 6153-6157, 1992) im Vergleich zu gereinigter Gal-Tf (Boehringer Mannheim) in Immunoblot-Experimenten abgeschätzt. Die Aktivität der Gal-Tf wurde nach Verdon und Berger (Methods of Enzymatic Analysis, Vol. III, 3. Edition, Verlag Chemie, pp. 374-381) bestimmt. Der Reaktionsansatz enthielt, in einem Gesamtvolumen von 50 µl: 50 mM HEPES, pH 7.35; 10 mM MnCl₂; 1.5 mg Ovalbumin; 54 mM NaCl; 5 µl UDP-[¹⁴C]galactose (2.5 µmol; 25 nCi) und 5 µl Enzymverdünnung oder Mikrosomenextrakt. Der Ansatz wurde 60 min bei 30°C inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von 2.5% eiskalter Phosphowolframsäure (w/v) in 1 M HCl abgestoppt. Nicht eingebautes UDP-[¹⁴C]Gal wurde durch Filtration mit Whatman GF/C Glasfiberfiltern abgetrennt. Die Filter wurden mit 2.5% Phosphowolframsäure und Ethanol gewaschen und ihre Radioaktivität wurde in einem Szintillationszähler bestimmt. 285 µg gereinigte menschliche Gal-Tf (Boehringer Mannheim) hat eine enzymatische Aktivität von 1 Einheit (U), wenn GlcNAc als Akzeptor benutzt wird; mit Ovalbumin als Akzeptor hat diese Masse an Gal-Tf eine enzymatische Aktivität von 0.2 U (spezifische Aktivität 0.7 U/mg).

Ein Vergleich der enzymatischen Aktivität der Mnt1/Gal-Tf Fusion mit gereinigter menschlicher Gal-Tf ist in Fig. 1B dargestellt. Hierbei wurde entweder 0.25 µg gereinigte Gal-Tf oder ein Mikrosomenextrakt mit dieser Mnt1/Gal-Tf-Menge verwendet. Für das Substrat UDP-Gal ergibt sich für beide Präparationen ein K_M-Wert von 44 µ; der V_max-Wert beträgt für Mnt1/Gal-Tf 0.184 µmol/min/mg und 0.7 µmol/min/mg für gereinigte Gal-Tf. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Mnt1/Gal-Tf-Protein enzymatisch voll aktiv ist; die Verringerung des V_max-Wertes wird möglicherweise durch den Mnt1-Anker hervorgerufen.

(d) Nachweis des Einbaus von Galactose in Glycosylstrukturen

In den folgenden Versuchen sollte nachgewiesen werden, daß die in Hefetransformanten produzierte, modifizierte Gal-Tf in der Lage ist, in vivo den Zucker Galactose auf Akzeptor- Glycosylstrukturen zu übertragen.

Die Transformante ATS594-1B[phMGT1] wurde bei 26°C in SGal-Minimalmedium mit niedrigem Sulfatgehalt (Schwientek et al. J. Biol. Chem. 270, 5483-5489, 1995) angezogen. 10 OD_600nm- Einheiten wurden geerntet und in denselben Medium, ohne Glucose und mit 0.24% Rinderserumalbumin resuspendiert. Nach Präinkubation bei 37°C wurden 26 µl Tran³⁵S-label (ICN Biomedicals) (300 µCi) zugegeben und die Probe wurde bei 37°C für 60 min weiter inkubiert. 20 µl "chase"-Lösung (50 mM (NH₄)₂SO₄, 250 mM L-Methionin, 50 mM L-Cystein) wurde zugegeben und 15 min weiter inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4000 Upm/5 min geerntet, zweimal in 2 ml eiskaltem 10 mM NaN₃, 10 mM DTT gewaschen, und in 450 µl LIP- Puffer (50 mM Tris-HCl/pH 7.4, 1% Triton-X-100, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA) resuspendiert. Nach Zugabe von 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid wurden die Zellen mit einem gleichen Volumen Glasperlen in einem Braun-Homogenisator aufgeschlossen.

Nach Inaktivierung der Gal-Tf bei 95°C (5 min) wurden die Extrakte auf Eis gekühlt und dann 2 min bei 5000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Gefäß transferiert und 50% (NH₄)₂SO₄ wurde bis zu einem Volumen von 1.5 ml zugegeben; der Ansatz wurde auf Eis für 3 h stehen gelassen. Die Suspension wurde 5 min bei 14000 Upm zentrifugiert, danach wurde der Überstand verworfen und das Proteinpräzipitat wurde mit 500 µl eiskaltem 25% (NH₄)₂SO₄ gewaschen. Das Präzipitat wurde dann in 50-100 µl 0.2% Triton-X-100 solubilisiert und das Volumen wurde mit LIP-Puffer auf 1.5 ml vergrößert. Die Lösung wurde vorgereinigt durch Zugabe von 30 µl 50% Sephacryl S-200 (Pharmacia) und leichtes Schütteln bei 4°C (1-2 h), danach wurde bei 14000 Upm für 2 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in 3 Aliquots von 500 µl geteilt, zu denen entweder 40 µl 20% ConA-Sepharose 4B (Sigma), oder 40 µl an Agarose gekoppeltes Weizenkeim-Agglutinin (WGA) (Sigma), oder 40 µl 50% an Agarose gekoppeltes Agglutinin RCA₁₂₀ (RCA) (Sigma) gegeben wurde. Nach Inkubation bei 4°C über Nacht wurden die Suspensionen zentrifugiert (14000 Upm, 4°C), die Überstände wurden verworfen und die Niederschläge wurden zweimal mit LIP- Puffer gewaschen. Die Proteine in den Niederschlägen wurden durch SDS-Gelelektrophorese in einem Polyacrylamidgel aufgetrennt und durch Autoradiographie nachgewiesen.

In Fig. 2 wird gezeigt, daß in der Kontrolltransformante (Stamm ATS594-1B[pJDB207]) einige Proteine durch die Lectine ConA und WGA präzipitiert werden (Spuren 1, 2); diese Lectine reagieren spezifisch mit den Zuckern Mannose bzw. GlcNAc. Keine Proteine konnten durch das Lectin RCA präzipitiert werden, welches spezi­ fisch mit Galactose reagiert (Spur 3). Im Gegensatz hierzu rea­ gierte Lectin RCA in der Transformante ATS594-1B[phMGT1] mit einigen Proteinen (Spur 6). Durch diese Experimente wird gezeigt, daß die in Transformanten produzierte, modifizierte Gal-Tf in der Lage ist, die durch die alg1-Mutation bereitgestellten Akzeptor- Glykosylstrukturen zu erkennen und darauf den Zucker Galactose zu übertragen.

Claims (10)

1. Ein Pilzstamm, dadurch gekennzeichnet, daß er eine oder mehrere heterologe Glykosyltransferasen produziert, die die Proteinglykosylierung in diesem Pilzstamm, insbesondere von heterologen Proteinen, modifizieren.

2. Ein Pilzstamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er der taxonomischen Gruppe der Ascomyceten, einschließlich Arten von Saccharomyces, Candida und Aspergillus angehört.

3. Ein Pilzstamm nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er der Art Saccharomyces cerevisiae angehört.

4. Ein Pilzstamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er die heterologe Glykosyltransferase als Fusionsprotein produziert, welches den Membrananker eines Pilzproteins enthält, welches im Golgi lokalisiert ist.

5. Ein Pilzstamm nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er β-1,4-Galactosyltransferase produziert.

6. Ein Pilzstamm nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe Glykosyltransferase als Fusion an die Membrananker- Region des Mnt1-Proteins der Hefe S. cerevisiae produziert wird.

7. Ein Pilzstamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er derartig mutiert ist, daß Akzeptor-Glykosylstrukturen für die produzierte heterologe Glykosyltransferasen entstehen.

8. Ein Pilzstamm nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß er Mutationen in den ALG-, MNN- oder MNT-Genen trägt.

9. Ein Pilzstamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe Glykosyltransferase die Zucker Galactose, N- Acetylglucosamin, N-Acetylgalactosamin, Sialinsäure oder Fucose auf Akzeptoren in Glykosylstrukturen überträgt.

10. Ein Pilzstamm nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß er als Wirtsstamm für die Produktion eines heterologen Proteins benutzt wird und die Glykosylstrukturen des produzierten heterologen Proteins modifiziert werden.